Desempeño fotosintético de Nothofagus pumilio a través de un gradiente de elevación en bosques sub-antárticos en la Isla Navarino (55° S) Patrocinante: Rafael Coopman Ruiz-Tagle Trabajo de Titulación II presentado como parte de los requisitos para optar al Título de Ingeniero en Conservación de Recursos Naturales BASTIÁN ALBERTO OÑATE POTTHOFF VALDIVIA 2015
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Desempeño fotosintético de Nothofagus pumilio a través
de un gradiente de elevación en bosques sub-antárticos
en la Isla Navarino (55° S)
Patrocinante: Rafael Coopman Ruiz-Tagle
Trabajo de Titulación II presentado como parte de los requisitos para optar al Título de
Ingeniero en Conservación de Recursos Naturales
BASTIÁN ALBERTO OÑATE POTTHOFF VALDIVIA
2015
ÍNDICE DE MATERIAS
i Calificación del Comité de Titulación i
ii Agradecimientos ii
iii Dedicatoria iii
iv Resumen iv
1 INTRODUCCIÓN 1
2 ESTADO DEL ARTE 3
2.1 Funcionamiento fotosintético y limitaciones fotosintéticas 3
2.2 Fotosíntesis y sequía 3
2.3 Fotosíntesis y bajas temperaturas 4
2.4 Cambios en la capacidad fotosintética con la elevación 4
2.5 Eco-fisiología de Nothofagus pumilio en bosques de elevación 5
2.6 ¿Qué preguntas puede responder este estudio? 6
3 MATERIALES Y MÉTODOS 7
3.1 Área de estudio y colecta de material vegetal 7
3.2 Caracterización micro-ambiental 8
3.3 Masa por Área de Hoja (LMA) y nitrógeno foliar (N) 8
3.4 Intercambio de gases y fluorescencia de la clorofila 9
3.5 Estimación de conductancia del mesófilo (gm), velocidad máxima de carboxilación (Vc,max) y velocidad máxima de transporte de electrones (Jmax)
9
3.6 Análisis cuantitativo de las limitaciones fotosintéticas 10
3.7 Análisis Estadístico 10
4 RESULTADOS 11
4.1 Caracterización ambiental 11
4.2 Masa por área de hoja y contenido de nitrógeno foliar 11
4.3 Intercambio de gases y fluorescencia de la clorofila 13
4.4 Limitaciones fotosintéticas 15
5 DISCUSIÓN 18
5.1 Disminución del metabolismo difusivo en el gradiente de elevación
18
5.2 Aumento de la capacidad fotosintética en el gradiente de elevación 19
5.3 Limitaciones fotosintética 20
5.4 Bosque sub-antártico y futuro 21
7 REFERENCIAS 23
Anexos Anexo 1. Abreviación de conceptos utilizados
Anexo 2. Variación en ci y cc en el gradiente de elevación
Anexo 3. Promedios netos mensuales de Temperatura y Humedad Relativa, desviación estándar, error estándar y valores mínimos en el gradiente de elevación marzo 2014 – marzo 2015.
Anexo 4. Variación altitudinal de masa por área foliar, contenido de N (%) y N en base a masa por área (g m-2).
Anexo 5. Tabla diferencia relativa porcentual de variables climáticas ente 30-270 m y 30-510 m de elevación.
Anexo 6. Variación de ETRc y ETRo en el gradiente de elevación
i
Calificación del Comité de Titulación
Nota
Patrocinante: Sr Rafael Coopman 6.0
Informante: Sr. Duncan Christie 6.0
Informante: Sr. Roke Rojas 6.1
El Patrocinante acredita que el siguiente Trabajo de Titulación cumple con los requisitos de contenido y de forma contemplados en el Reglamento de la Titulación. Del mismo modo, acredita que en el presente documento han sido consideradas las sugerencias y modificaciones propuestas por los demás integrantes del Comité de Titulación.
ii
Agradecimientos
A Loreto Morales por su apoyo en la toma de datos el verano de 2014 y ayuda en las primeras etapas
de este escrito. A Roke Rojas por su apoyo constante en el aprendizaje, utilización de los equipos de
laboratorio, apoyo en las campañas de terreno al Cerro Róbalo y desarrollo y apoyo en el modelamiento
fotosintético. Al profe Duncan Christie por sus importante correcciones y comentarios a este manuscrito.
Al profe Rafael Coopman por compartir el conocimiento elemental para el entendimiento del
funcionamiento y modelamiento fotosintético, por sus correcciones a este manuscrito.
Agradezco al financiamiento entregado por el proyecto FONDECYT 1120965: “Climate variability
and ecological processes in high elevation forest from the tropical and Patagonian Andes”. Además, los
resultados que integran esta memoria de título corresponden a material original de este proyecto.
A la Fundación del Parque Etnobotánico Omora por haber dado acceso al área de estudio y facilitado
sus instalaciones para alojar al grupo de trabajo del proyecto.
iii
Dedicatoria
Para mi familia, mis padres y hermanos por su incesante e incansable compañía, en los que
tengo una fuente de amor e inspiración inagotable. A Cami con todo mi amor, a mis amigos con
harto cariño.
Lenga (Nothofagus pumilio),
creciendo en el límite arbóreo en Parque Nacional Torres del Paine.
iv
RESUMEN
La identificación de patrones ecológicos y del balance de carbono en los bosques de elevación ha ganado
gran atención en los últimos años, siendo de los límites vegetales más estudiados hasta ahora. El
desempeño fotosintético de bosques en el límite arbóreo, y sus mecanismos determinantes no han sido
documentados en climas templados y sub-antártico. Los bosques sub-antárticos son los más australes del
planeta y se consideran sensores ambientales al cambio climático, al distribuirse en el límite térmico de
distribución del bosque en el continente americano, bajo condiciones de estrés por bajas temperaturas y
fuertes vientos. Sin embargo, se ha registrado un aumento de las temperaturas al sur de la Patagonia. En
este estudio se midió el ciclo anual de la temperatura ambiental (T) y humedad relativa del aire (HR) y
el déficit de presión de vapor en 3 pisos de elevación 30, 270 y 510 m, abarcando toda la distribución
elevacional de N. pumilio en de lsla Navarino (55°S). A su vez, se caracterizó el funcionamiento
fotosintético y aspectos morfológicos en las 3 poblaciones estudiadas. Se evidencio un gradiente
altitudinal que determina una disminución en la T, una disminución de HR y consecuentemente un
aumento en le DPV. Se identificaron cambios fisiológicos, bioquímicos y morfológicos coordinados con
la elevación, manteniendo tasas de asimilación similar entre el nivel del mar y el límite arbóreo. La
asimilación fotosintética se ve restringida por la disminución altitudinal en la conductancia del mesófilo,
la cual es compensada por el aumento en el contenido de N y LMA con la elevación.
1
1. INTRODUCCIÓN
El límite altitudinal hasta el cual los bosques pueden ocurrir es denominado límite arbóreo (en inglés
treeline o timberline), siendo uno de los límites vegetacionales más llamativos y estudiados en la
naturaleza (Körner 1998, Cavieres & Piper 2004). El límite arbóreo es a un ambiente de ecotono o
gradiente ambiental que comparte un angosto umbral térmico global de 6.7°C (±0.8 SD) correspondiente
a la temperatura estacional media a nivel del suelo (Körner et al., 2004); llegando a 7 – 8 °C en zonas
mediterráneas y templadas, disminuyendo a 6 – 7 °C en zonas boreales y sub-árticas, y finalmente
llegando al mínimo de 5 – 6 °C en los trópicos.
En la Cordillera de Los Andes la ocurrencia del límite arbóreo es frecuente, variando en elevación,
de acuerdo a las especies, y disminuyendo en latitud. Nothofagus pumilio (Poepp et Endl.) Krasser
(Nothofagaceae) es una especie caducifolia que se distribuye entre los 35°35’ y 55°00’ S (Chile y
Argentina), encontrándose en climas alpinos y sub-antárticos (Veblen et al. 1996). N. pumilio y N.
antarctica regeneran en los sitios de temperaturas más bajas y mayor frecuencia de días con heladas del
género (Alberdi 1987). En particular, N. pumilio es capaz de establecerse en sitios más fríos y secos que
sus acompañantes siempreverdes (N. dombeyi y N. betuloides), dándose un gradiente ecológico
conformado por bosques de Nothofagus siempreverde-deciduo de especies mixtas en elevaciones bajas,
pasando a bosques puros de N. pumilio en elevaciones más altas (Veblen et al. 1996). Estas especies
conforman el treeline del bosque en los Andes del sur, llegando al nivel del mar en el extremo austral de
su distribución.
En una revisión global de la posición del límite arbóreo y causas de su ocurrencia, Körner (1998)
plantea que la disminución altitudinal de la temperatura limitan procesos fisiológicos tanto de ganancia
de carbono (hipótesis de limitación a la ganancia de carbono, CLH), como procesos de crecimiento o
utilización del carbono (hipótesis de limitación al crecimiento; GLH) esta última hipótesis con mayor
respaldo para las regiones fuera de los trópicos. En particular, existen estudios que han descrito el
funcionamiento fotosintético de N. pumilio en relación al cambio ambiental dado por el aumento en la
elevación (Molina-Montenegro et al. 2011, Premoli et al 2007), pero estos han sido desarrollados en las
regiones mediterráneas de la distribución de la especie, donde tanto la disponibilidad hídrica como la
temperatura tienen un rol clave en la restricción al crecimiento en el límite arbóreo (Lara et al 2005). No
obstante, varios estudios indican tasa de asimilación de CO2 sin mayores variaciones con el aumento en
la elevación (Premoli et al 2007, Molina-Montenegro et al. 2011, Fajardo et al. 2011). Lo anterior, brinda
apoyo a la GLH en la formación del treeline en esta especie. En particular, éste estudio describe el
metabolismo fotosintético de N. pumilio a los 55°S a través de su distribución altitudinal, y pretende
2
generar información relevante de las bases fisiológicas (limitaciones fotosintéticas) que modulan el
crecimiento y distribución de los bosques de elevación sub-antárticos en el extremo sur de los Andes.
El estudio plantea la siguiente hipótesis: el funcionamiento fotosintético del bosque sub-antártico
de N. pumilio en la Isla Navarino estará condicionado por el efecto de las bajas temperaturas y la alta
humedad relativa, no presentando limitaciones estomáticas en general. Por lo cual, producto del descenso
altitudinal de la temperatura y las no existentes limitaciones estomáticas, las principales limitaciones
fotosintéticas impuestas por el gradiente será una restringida conductancia del mesofilo y una baja en la
capacidad de carboxilación de la Rubisco.
Para probar la hipótesis se planteó el objetivo general de identificar las limitaciones s a la fotosíntesis
en el gradiente de elevación de un bosque de N. pumilio en la Isla Navarino.
En consecuencia, se llevarán a cabo los siguientes objetivos específicos:
1. Describir las condiciones micro-climáticas a lo largo del gradiente de elevación de la distribución de
N. pumilio en Isla Navarino.
2. Describir el desempeño fotosintético, LMA y contenido de Nitrogeno en individuos adultos de N.
pumilio a través del gradiente de elevación en I. Navarino
3. Cuantificar las limitaciones fotosintéticas impuestas por el estoma, el mesófilo y procesos bioquímicos
de N. pumilio en el gradiente de elevación en I. Navarino
3
2. ESTADO DEL ARTE
2.1 Limitaciones fotosintéticas: difusivas al CO2 y bioquímicas.
La primera válvula que regula el intercambio gaseoso en las hojas es él estoma, donde su abertura o
cierre, denominada conductancia estomática (gs) controla el paso del CO2 atmosférico hacía el espacio
intercelular (ci). Posteriormente, el CO2 debe alcanzar el sitio de carboxilación en la enzima Rubisco
dentro del cloroplasto (cc) internándose en las células del mesófilo (gm), a través de paredes y membranas
celulares, citoplasma y la membrana tilacoidal del cloroplasto (Flexas et al. 2008). Usualmente, las
limitaciones impuestas por la conductancia del mesófilo (MCL) son similares en magnitud a la
estomáticas (SL), y más frecuentes que las limitaciones bioquímicas (BL) (Flexas et al. 2012). Sin
embargo, bajo sequía leve, en las primeras etapas de la re-hidratación luego de sequía y la por exposición
a bajas temperaturas se han reportado casos en que MCL limita mayormente y hasta un 75% a la
fotosíntesis (Zhang 2010, Flexas et al. 2012). Por otro lado, las tasas de asimilación de CO2 pueden ser
limitadas por aspectos bioquímicos de la fotosíntesis (BL), tales como: la velocidad de máxima de
carboxilación de la Rubisco (Vc,max), la velocidad de regeneración de la RuBP (cuantificada como: tasa
máxima de transporte de electrones (Jmax) y la tasa de uso de las triosas fosfato (Sharkey et al. 2007).
Comúnmente estas limitaciones se activan bajo sequía severa, ej. contribuyendo con un 15% al total de
las limitaciones en árboles de una plantación forestal de la cuenca mediterránea (Grassi y Magnani, 2005)
y bajo exposición a bajas temperaturas (4.1% de las limitacions a 10°C) y altas temperaturas (10,6% de
las limitaciones a 30°C) en una especie de alta montaña del Himalayas (Zhang 2010).
2.2 Fotosíntesis y sequía
El flujo de CO2 que ingresa a la hoja por el estoma permite la asimilación de CO2, pero produce
inevitablemente la pérdida de agua y disminución del contenido relativo de agua de la hoja si el
abastecimiento a través de las raíces no reestablece la pérdida por transpiración (Kubiske et al. 2000,
Lambers 2008). El cierre estomático limita la difusión de CO2 dentro de la hoja, pero en ocasiones puede
aumentar la eficiencia fotosintética en el uso del agua (Lambers 2008). La sequía reduce la asimilación
fotosintética restringiendo el ingreso de CO2 al espacio intercelular, y también el ingreso de moléculas
de CO2 al cloroplasto, producto de la disminución progresiva de la conductancia del mesófilo (gm) por
sequía (Flexas et al. 2004, Grassi & Magnani, 2005). El protagonismo en las limitaciones fotosintéticas
varía según la severidad del estrés hídrico, generando limitaciones estomáticas (gs) bajo sequía moderada,
y de ambos componentes difusivos en serie (gs y gm) bajo sequía severa (Grassi & Magnani, 2005). En
adición, como la condición de sequía generalmente es acompañada de una alta carga lumínica, el aparato
4
fotosintético puede sobreexcitarse al no poder liberar el exceso de energía lumínica absorbida, dando
cabida a la síntesis de compuestos reactivos de oxígeno y finalmente a fotoinhibición crónica (Taiz &
Zeiger, 2010).
2.3 Fotosíntesis y bajas temperaturas
La formación del límite arbóreo en zonas no tropicales es atribuida principalmente a la disminución de
la temperatura ambiental por el aumento en la elevación, lo que impacta directamente el crecimiento
(Körner 1998, Körner 2003, Piper et al. 2006, Hoch & Körner 2008, Fajardo et al. 2010, 2012, Molina-
Montenegro et al. 2011). Esto se ha explicado porque a temperaturas congelantes, la división celular es
más sensibles al frío que la fotosíntesis en sí, documentándose que el tiempo requerido para la
reproducción celular supera las 300 h a temperaturas de 1-2 °C, inclusive en plantas adaptadas al frío
(Körner 2003). Por otro lado, plantas de hábitats termales contrastantes reflejan un desempeño
fotosintético adaptado al régimen de temperaturas que imperan en sus ecosistemas de origen (Xiong et
al. 1999), reflejando un ajuste entre la demanda de uso de fotosíntatos y cambios en la maquinaria
fotosintética por procesos de aclimatación (Lambers 2008). Warren et al (2006), sometieron plántulas de
Quercus canariensis a temperaturas que variaron entre los 10 y 35°C identificando el óptimo de Amax a
los 25°C, disminuyendo su valor hacia los extremos termales; 10 y 35°C. A nivel difusivo del CO2, la
conductancia del mesófilo fue máxima entre los 20 y 35°C, disminuyendo a la mitad a los 10°C. Flexas
et al. (2008) reporta el efecto negativo sobre la conductancia de mesófilo (gm), al reducirse ésta en más
de un 75% en plantas que se desarrollaron a 5°C en relación a aquellas desarrolladas a 20°C. A nivel
bioquímico, Vc,max y Jmax fueron más sensibles a la baja temperatura disminuyendo un 90% con la
exposición de la planta a 10°C.
2.4 Cambios en la capacidad fotosintética con la elevación
Las respuestas en la capacidad fotosintética en gradientes de elevación son variadas. Desde una
disminución en la asimilación neta de CO2 (AN) con el aumento de la elevación en montañas tropicales,
Cabrera et al (1998) registró una disminución en AN desde ~5 a ~3 µmol CO2 m-2s-1 entre los 3500 a 4200
m de elevación en los Andes venezolanos (Acaena cylindrostachya y Senecio formosus). Hikosaka et al
(2002), registró una variación similar entre los 600 y los 3700 m de elevación en la Isla de Borneo en el
Sudeste Asiático en un amplio ensamble de especies, y Zhang et al (2005) registró una disminución entre
8 y 5 µmol m-2s-1 CO2 entre los 3200 y 4200 m de elevación en Quercus pannosa.
5
En contraste, en bosques de alta elevación fuera de los trópicos AN tiende a mantenerse o incrementar
con la elevación. Cordell et al (1999) reporta una mantención de AN en Metrosideros polymporha (~3
µmol CO2 m-2s-1) entre el nivel del mar y los 2500 m de elevación en Isla Mauna Loa, Hawaii. Piper et
al (2006) encuentran la misma tendencia entre los 2000 y 2200 m en Kageneckia angustifolia (AN de ~6
µmol CO2 m-2s-1), para primavera en los Andes Centrales de Chile. Por otro lado, Shi et al. (2006) registró
un leve aumento en AN en Buddleja davidii (13 y 14 µmol CO2 m-2s-1, entre 1300 y 3400 m) en montañas
del sud-este tibetano chino. Finalmente, Premoli et al (2007) y Molina-Montenegro et al (2011)
documentaron un ascenso en AN entre los 1100 y 1590 m en regiones mediterráneas para N. pumilio; el
primer autor registrando 11 y 18 µmol CO2 m-2 s-1 (41°S vertiente oriental de los Andes), y el segundo
registró 8 a 9 µmol CO2 m-2 s-1 entre los 1150 m y 1750 m (35-37°S, vertiente occidental de los Andes).
2.5 Ecofisiología de Nothofagus pumilio en bosques de elevación
En los bosques lluviosos del sur de Sudamérica, la temperatura media anual y la duración de la temporada
de crecimiento disminuyen con la latitud, al igual que la riqueza de especies vasculares y su productividad
primaria (Veblen et al. 1996). Además existe una disminución en la duración del periodo de crecimiento
vegetativo con el aumento en elevación, debido a un retraso en el rompimiento de nuevos brotes y un
adelanto en la caída de hojas (Veblen et al. 1996), conducido principalmente por el efecto de la
disminución altitudinal de la temperatura en la fenología de la brotación y floración (Rusch 1993). Varela
et al. (2012) describe óptimos térmicos de desempeño fotosintético para plantas del género Nothofagus
(N. obliqua y N. alpina) entre los 20 y 25 °C, disminuyendo su desempeño a menores temperaturas,
viéndose restringido completamente a -5°C. Lara et al. 2005, identificaron patrones espaciales y
temporales en el crecimiento anual de 13 poblaciones de N. pumilio, y su relación con la precipitación y
temperatura a lo largo de su distribución latitudinal en el límite arbóreo (35°35’ – 55°00’ S). Los autores
establecen que a lo largo de la distribución latitudinal de N. pumilio, la temperatura media anual es el
principal factor que influye en el crecimiento radial anual de los árboles en el límite arbóreo, y que la
precipitación influye significativamente solo en las 2 regiones más septentrionales con clima
Mediterráneo. Además, dentro de las 13 regiones, existen 7 sitios que se pueden agrupar en 3 grupos
según los patrones interanuales de crecimiento, teniendo un comportamiento similar con respecto al
clima; estos grupos son Vilches-Laguna del Laja (35° - 37° S), Antillanca-Volcán Yate (40° - 41° S), y
Punta Arenas-Tierra del Fuego-Isla Navarino (53° - 55° S).
Existe evidencia que respalda la hipótesis de limitación en el crecimiento (GLH) en el límite arbóreo
de N. pumilio, donde la exposición a bajas temperaturas (por alta elevación o latitud) disminuye el
6
crecimiento, sin verse restringida la provisión de carbohidratos solubles (Premoli et al. 2007, Fajardo et
al. 2011, Molina-Montenegro et al. 2011). Lo anterior indica que el crecimiento (sink activities) es
sensible en el límite arbóreo de N. pumilio en gran parte de su distribución, entre los 35° y 46°S. En
circunstancias de restricción de crecimiento, es probable que la baja fijación de carbono (source
activities) se deba a mecanismos inhibitorios “Feedback”, en específico a la baja en la disponibilidad de
fosforo estromal para la síntesis de ATP, gatillada por la baja tasa de transporte de carbohidratos hacia
fuera del cloroplasto.
2.6 Pregunta del estudio.
El posicionamiento del límite arbóreo y el desempeño de las plantas en este ambiente, es el resultado de
las interacciones micro-climáticas (clima y topografía) y la tolerancia fisiológica de las especies
(Cavieres & Piper, 2004). De esta manera, es interesante, analizar el funcionamiento fotosintético en
relación con variables ambientales claves, como disponibilidad de agua y temperatura en gradientes de
elevación. Limitaciones fotosintéticas estomáticas (SL), del mesófilo (MCL) y bioquímicas (BL) en
plantas, pueden ser calculadas a partir caracterización fotosintética (Grassi & Magnani 2005, Galmés et
al 2007, Zhang 2010). La oportunidad que este estudio que nos brinda se basa en que, N. pumilio en Isla
Navarino (55° S) habita bajo una fuerte influencia oceánica que produce una alta y constante humedad
relativa y una disminución progresiva de la temperatura ambiental con la elevación. Así, el
cuestionamiento en particular del estudio es: ¿Cómo responde el metabolismo fotosintético de la planta
al gradiente de temperatura entre el nivel del mar y el límite de elevación arbóreo, en una atmósfera de
alta humedad y bajas temperaturas?
7
3 MATERIALES Y MÉTODOS
3.1 Área de estudio y colecta de material vegetal
El trabajo en terreno del estudio se realizó desde el 23 de febrero hasta el 9 de marzo del 2014, en el
gradiente de elevación del Cerro Róbalo en árboles adultos y sanos (100 - 150 años) de N. pumilio. El
Parque Etnobotánico Omora se ubica en la Isla Navarino (Figura 1), formando parte de la Reserva de la
Biósfera Cabo de Hornos y es el sitio más austral de la Red Chilena de Estudios Socio-Ecológicos a
Largo Plazo (LTSER-Chile) (Contador et al. 2014). La isla posee un clima oceánico sub-antártico donde
la temperatura promedio es de 5.6 °C, julio y enero son los meses más frío y cálido, respectivamente, y
la precipitación promedio es del orden de 467 mm anuales (Lombardi et al 2011).
Figura 1. Imagen de localización del área de estudio en Sud-América (A). En el rectángulo blanco a
mano izquierda, se establece un acercamiento regional del área de estudio (B), indicando con una X
blanca la ubicación de la capital de la Región de Magallanes y la Antártica Chilena, Punta Arenas. En el
rectángulo blanco a mano derecha se realiza un acercamiento a la Isla Navarino, indicando la ciudad de
Puerto Williams (54° 55’S) con el círculo blanco y la ubicación del gradiente de elevación estudiado en
el Cerro Róbalo con el cuadrado blanco (C).
El gradiente de elevación del estudio comprendió todo el rango de distribución en elevación de la
especie, dentro del cual se realizaron los muestreos en 3 sitios ubicados a distinta elevación; sitio bajo a
los 30 m, sitio medio a los 270 m, y sitio alto a los 510 m. En cada sitio se eligieron de 8 a 12 árboles
X Punta Arenas
8
con ramas de orientación norte y hojas totalmente expandidas, a partir de los cuales se obtuvieron
muestras de ramas durante la mañana (7:00–9:00h AM) con un cortador de ramas telescópico. Las cuales
inmediatamente fueron introducidas en tubos sellados de PVC de 4’ llenos con agua en condiciones de
oscuridad. Para eliminar la embolia en los haces vasculares de las porciones basales de las ramas, se cortó
5 cm por sobre la base de la rama, previamente sumergida en el agua. Posteriormente el tejido fue
transportado al laboratorio, donde fueron estimuladas con un panel de luz LED (80:20% luz roja:azul)
durante media hora, antes de la medición.
3.2 Caracterización micro-ambiental
La caracterización micro-ambiental de temperatura y humedad relativa por elevación, se realizó con
registradores de datos climáticos Hobo pro-v2 (OnSet Copmuter Corporation, Bourne, USA). Estas
variables se midieron desde marzo del 2014 hasta abril del 2015 con una frecuencia de una hora. Luego
se calculó las medias mensuales, desviación estándar y error estándar por elevación en valores netos, y
para la relación entre fotosíntesis y ambiente, se utilizaron los registros dentro el fotoperiodo, desde las
8:00 a las 20:00 h.
El cálculo del déficit de presión de vapor (DPV) se realizó según Murray 1967. Considerando las
variables de temperatura ambiental (T) y humedad relativa (HR), se calculó la presión de vapor (vp) en
kPa como sigue:
[1] vp=0.611(17.27*T/(T +237.3))
Finalmente, el déficit de presión de vapor (VPD) se calculó de la siguiente manera:
[2] VPD=vp-((RH/100)*vp)
3.3 Masa por área de hoja (LMA) y nitrógeno foliar (N)
De las ramas utilizadas para la medición de intercambio de gases y fluorescencia, se extrajeron entre 40
a 50 hojas por cada rama para determinación de la relación peso seco/área de hoja (LMA). Las hojas
fueron escaneadas y con el software ImageJ se calculó el área de hoja, luego las hojas fueron secadas por
60 h en un horno a 70°C para obtener su peso seco. El contenido relativo de nitrógeno foliar (N) por peso
seco se determinó en 3 muestras por elevación, del tejido usado para el LMA siguiendo el método de
Kjeldahl. Posteriormente se calculó el contenido de nitrógeno en base a peso por área (N g por m2 de
hoja), y multiplicando el contenido por área de N con los valores de LMA se obtuvo el contenido de
nitrógeno en base a la masa de la hoja.
9
3.4 Intercambio de gases y fluorescencia de la clorofila
Todas las mediciones de intercambio de gases fueron realizadas en hojas completamente expandidas en
5 árboles para cada sitio, con un IRGA Li-6400XT con una cámara con florímetro integrado (Li-6400-
40; Li-cor Inc., Nebraska, USA), durante la mañana y media tarde (9:00 a 15:00 hrs). Mediciones
preliminares permitieron definir que a densidad del flujo de fotones fotosintéticos (PPFD) de 1000 µmol
m-2 s-1 se encuentra la saturación del proceso fotosintético. El flujo de aire se fijó en 300 ml min-1, la
temperatura del bloque a 20°C y la humedad del aire se mantuvo a las condiciones ambientales (~ 40-
50%) haciendo VPD entre 1 y 1.5 kPa. Se llevaron a cabo curvas de respuesta a la luz fotosintética a una
concentración (Ca) de CO2 de 400 µmol mol-1, variando PPFD de 2000 a 0 µmol m-2 s-1 (90:10% red:blue
light). La respuesta en AN al cambio en la concentración de CO2 atmosférico (Ca), se desarrolló 20%
sobre el LSP y consistió en 13 diferentes concentraciones de CO2 entre 50 y 2000 µmol mol-1, según el
procedimiento de Galmes et al. (2011), obteniendo curvas AN-Ci. Se corrigieron las mediciones a través
de la cuantificación de fugas hacia dentro y fuera de la cubeta según Flexas et al. (2007). En aquellos
casos en que la hoja no alcanzó a cubrir la totalidad de la cubeta de medición de intercambio de gases,
se recortó el área que utilizaba la hoja con un gasket idéntico al espacio disponible en la cubeta. Luego
se calculó el área de la hoja con el mismo método utilizado previamente para el cálculo de LMA.
Finalmente se corregían los parámetros obtenidos con el área real de la hoja.
3.5 Estimación de conductancia del mesófilo al CO2 (gm), velocidad máxima de carboxilación
(Vc.max) y velocidad máxima de transporte de electrones (Jmax)
Los datos fueron modelados mediante el modelo mecanistico de fotosíntesis propuesto por Farqhuar et
al. (1980). Posteriormente, se utilizaron dos métodos diferentes para estimar gm y valores de Vc,max y
Jmax. En el primero, los tres parámetros se obtuvieron simultáneamente por el método descrito por
Sharkey et al. (2007), el cual considera un ajuste iterativo de curvas por mínimos cuadrados de las curvas
AN-Ci. En el segundo método, se usó la ecuación de Harley et al. (1992), con el fin de obtener la
concentración de CO2 en el cloroplasto (Cc).
[3] CC = ᴦ*(Jflu+8(AN+Rd))/(Jflu–4(AN+Rd))
Donde ᴦ * corresponde al punto de fotocompensación del CO2 a nivel de cloroplasto (Flexas et al. 2009)
y Jflu es la tasa de transporte de electrones. Esta última obtenido como:
[4] Jflu = ϕPSIIxPPFDxLabsx0.5,
En (2), Labs la absorbancia de la hoja estándar para hoja caduca y ϕPSII es la eficiencia fotoquímica,
obtenida con la siguiente operación:
10
[5] ϕPSII = F’m – Fs/F’m,
Luego de [3], se pueden transformar curvas AN-Ci a curvas AN-CC, obteniendo gm como:
[6] gm = AN/(Ci–Cc)
Se utilizaron los parámetros de dependencia térmica de la cinética de la Rubisco descritos por Bernacchi
et al. (2002). Tasa de respiración en oscuridad (Rd), se consideró la mitad de la tas de respiración en luz
(Rn; Niinemets et al. 2005; Gallé et al. 2012). La tasa de fotorespiración (Pr) se calculó acorde a Valentini
et al. (1995), combinando mediciones de intercambio de gases y fluorescencia de la clorofila a.
3.6 Análisis cuantitativo de las limitaciones fotosintéticas
El cálculo de la contribución relativa de las limitaciones fotosintéticas de los principales procesos que la
determinan se realizó siguiendo a Grassi & Magnani (2005). Esta aproximación utiliza valores de AN, gs,
gm y Vc,max, que permite dividir las limitaciones fotosintéticas atribuibles a la vía difusiva el CO2;
(Conductancia estomática y conductancia del mesófilo; SL y MCL) y a procesos bioquímicos; (BL),
asumiendo como referencia (o tratamiento control) la elevación que registre la máxima tasa de
asimilación de CO 2 (Grassi & Magnani 2005; Flexas et al. 2013). Finalmente, las limitaciones no-
estomáticas fueron definidas acorde a Flexas et al. (2009), como la suma de la contribución entre la
conductancia del mesófilo y procesos bioquímicos (NSL = MCL + BL), mientras que las limitaciones
difusivas como la suma entre la conductancia estomática y del mesófilo (DL = SL + MCL). El total de las
limitaciones (TL) fue la suma de todos sus componentes. Para el caso del gradiente de elevación de N.
pumilio se tomó como referencia la población que presentó la mayor asimilación neta (AN) bajo
condiciones naturales de luz saturante y CO2 ambiental, correspondiente en este estudio a la población
a los 30 m de elevación.
3.7 Análisis Estadístico
Se utilizó un Análisis de Varianza (ANOVA; P < 0.05) para identificar diferencias estadísticas en los
distintos parámetros ecofisiológicos y micro-ambientales entre elevaciones. Cada media fue calculada
con al menos 5 réplicas de individuos distintos. La normalidad y homocedasticidad de los datos fue
comprobada con las pruebas de Shapiro Wilk (P < 0.05) and Levene (P < 0.05), respectivamente. Las
diferencias entre medias fueron determinadas con la prueba de Duncan (P < 0.05). Todos los análisis se
realizaron con el programa libre RStudio, acoplado con los paquetes estadísticos “agricolae”
(http://tarwi.lamolina.edu.pe) y “MASS” (http://www.stats.ox.ac.uk/pub/MASS4).