CENTRO DE INVESTIGACIÓN Y DE ESTUDIOS AVANZADOS DEL INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL UNIDAD DE BIOTECNOLOGÍA E INGENIERÍA GENÉTICA DE PLANTAS DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGÍA Y BIOQUÍMICA DESARROLLO DE TECNOLOGÍAS PARA LA REGENERACIÓN IN VITRO Y TRANSFORMACIÓN GENÉTICA DE MAGUEY (Agave tequilana Weber, var. azul) Tesis que presenta KARLA KARINA VALENZUELA SÁNCHEZ para obtener el Grado de Doctora en Ciencias en la Especialidad de Biotecnología de Plantas Director de Tesis: Dr. Octavio Paredes López Irapuato, Guanajuato, México Junio 2006
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DESARROLLO DE TECNOLOGÍAS PARA LA … · GENÉTICA DE MAGUEY (Agave tequilana Weber, var. azul) Tesis que presenta KARLA KARINA VALENZUELA SÁNCHEZ para obtener el Grado de Doctora
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CENTRO DE INVESTIGACIÓN Y DE ESTUDIOS AVANZADOS
DEL INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
UNIDAD DE BIOTECNOLOGÍA E INGENIERÍA GENÉTICA DE
PLANTAS
DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGÍA Y BIOQUÍMICA
DESARROLLO DE TECNOLOGÍAS PARA LA REGENERACIÓN IN VITRO Y TRANSFORMACIÓN GENÉTICA DE MAGUEY (Agave tequilana Weber,
var. azul)
Tesis que presenta
KARLA KARINA VALENZUELA SÁNCHEZ
para obtener el Grado de
Doctora en Ciencias
en la Especialidad de
Biotecnología de Plantas
Director de Tesis:
Dr. Octavio Paredes López
Irapuato, Guanajuato, México
Junio 2006
Este trabajo se realizó en el Laboratorio de Biotecnología de Alimentos en el
Departamento de Biotecnología y Bioquímica del Centro de Investigación y de
Estudios Avanzados del Instituto Politécnico Nacional, Unidad Irapuato, bajo la
asesoría del Dr. Octavio Paredes López.
DEDICATORIA
A Dios
A mis padres Socorro y Saúl
A mis hermanos Nidia y Saúl,
A mi novio Toño.
AGRADECIMIENTOS
. Al Centro de Investigación y de Estudios Avanzados Unidad Irapuato del Instituto Politécnico Nacional. Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología y al Consejo de Ciencia y Tecnología del Estado de Guanajuato por los apoyos recibidos durante la elaboración de este trabajo. Al Dr. Octavio Paredes López por haberme permitido formar parte de su equipo de investigación, por su confianza, apoyo y preciados consejos durante la realización de este doctorado. Al Dr. Andrés Cruz Hernández por formar parte de mi comité de sinodales, por sus provechosas aportaciones a la realización de este trabajo, por su ánimo y constante apoyo. Al Dr. Víctor Olalde Portugal por haber accedido a formar parte de mi comité de sinodales, por su incondicional apoyo para la realización de esta tesis, por sus atinados consejos y por abrirme las puertas de su grupo. A los Drs. Ángel Gabriel Alpuche Solís y Juan T. Frías Hernández por acceder a formar parte de mi comité de sinodales y por los útiles consejos y observaciones en la revisión de este trabajo. A la Dra. Male Valverde por su ayuda en las revisiones de los trabajos, por su ánimo y apoyo. A la M.C. Rosalinda Serrato F. por su paciencia y apoyo imprescindible en la técnica de propagación in vitro. Al Dr. Luís Parra Negrete del Instituto de Ciencias Agrícolas de la Universidad de Guanajuato y al Ing. Manuel Cárdenas del rancho el “El Pachon”, Zapopan, Jal., por proporcionar amablemente las plantas de Agave tequilana. A Raúl Juárez y Teresa García, por su valiosa colaboración en la realización del proyecto y a los estudiantes de verano Fausto Luna, Sue Ureta y Saúl Zañudo, por ese tiempo que fue de gran enseñanza para mi. A la comunidad del CINVESTAV Irapuato por su apoyo y hacer llevadero el tiempo de mi estancia. A mis compañeros del Laboratorio de Biotecnología de Alimentos por su ayuda y por hacer de mi estancia un tiempo agradable y al laboratorio de Bioquímica Ecológica por el tiempo tan grato que conviví con ellos. A mis amigos por tantos momentos inolvidables, gracias por su inigualable amistad y por ser parte importante de mi vida.
CONTENIDO
Página
CONTENIDO i
ÍNDICE DE TABLAS vi
ÍNDICE DE FIGURAS viii
ABREVIATURAS xii
RESUMEN 1
INTRODUCCIÓN 3
REVISIÓN DE LITERATURA 5
A. MEJORAMIENTO GENÉTICO DE PLANTAS 5
1. MEJORAMIENTO TRADICIONAL 5
2. MEJORAMIENTO POR INGENIERÍA GENÉTICA 6
a. Cultivo de tejidos vegetales 7
1) Organogénesis 7
2) Embriogénesis somática 9
3) Variación somaclonal 11
b. Transformación genética 12
1) Sistemas biológicos para la transferencia de genes 12
2) Sistemas físicos para la transferencia de genes 13
3) Marcadores de selección y genes reporteros 14
i
Página
B. MAGUEY: MODELO DE ESTUDIO 15
7. IMPORTANCIA DEL MAGUEY 16
a. Importancia cultural 16
b. Importancia ecológica 17
c. Importancia económica 18
2. Agave tequilana 18
a. Tequila 19
b. Plagas y enfermedades 21
c. Variabilidad genética 25
8. ANTECEDENTES DE MEJORAMIENTO GENÉTICO EN
AGAVES 26
OBJETIVOS 28
A. GENERAL 28
B. ESPECÍFICOS 28
MATERIALES Y MÉTODOS 29
A. MATERIALES 29
1. MATERIAL VEGETAL 29
2. VECTORES 29
3. CEPAS BACTERIANAS 29
B. MÉTODOS 34
1. ESTABLECIMIENTO DEL CULTIVO IN VITRO 34
2. INDUCCIÓN DE EMBRIOGENESIS SÓMATICA 34
a. Producción de embriones 34
b. Germinación de embriones 34
ii
Página
3. ESTABLECIMIENTO DEL SISTEMA DE REGENERACIÓN
MEDIANTE ORGANOGÉNESIS INDIRECTA 36
a. Inducción y mantenimiento del estado de callo 36
b. Producción de brotes 37
c. Enraizamiento y aclimatación 37
4. DETERMINACIÓN DE LA SENSIBILIDAD A AGENTES
SELECTIVOS: KANAMICINA (ANTIBIÓTICO) Y
FOSFINOTRICINA (HERBICIDA) 37
5. ENSAYOS DE TRANSFORMACIÓN VÍA Agrobacterium
tumefaciens 42
a. Transferencia de plásmidos a cepas de Agrobacterium 42
b. Evaluación de la susceptibilidad del A. tequilana a la
infección por cepas silvestres de Agrobacterium 42
c. Evaluación de la expresión transitoria para la selección
de condiciones de transformación 45
1) Respuesta al tipo de daño en el tejido vegetal 45
2) Tipo de cultivo bacteriano y tiempo de exposición con
el explante 45
3) Tiempo de cocultivo 45
d. Ensayos de transformación estable 46
6. ENSAYOS DE TRANSFORMACIÓN VÍA BIOBALÍSTICA 46
a. Purificación de plásmidos y preparación de partículas 46
b. Evaluación de la expresión transitoria para la selección
de condiciones de transformación 46
1) Medio osmótico 46
iii
Página
2) Presión 47
3) Distancia 47
4) Concentración de DNA 47
c. Ensayos de transformación estable 47
7. SELECCIÓN DE MATERIAL TRANSFORMADO 47
8. ANÁLISIS HISTOQUÍMICO 48
9. ANÁLISIS MOLECULAR DE MATERIAL TRANSFORMADO 48
a. Extracción de DNA 48
b. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) 49
c. Análisis tipo Southern blot 50
RESULTADOS Y DISCUSIÓN 51
A. ESTABLECIMIENTO DEL CULTIVO in vitro 51
B. INDUCCIÓN DE EMBRIOGENESIS SÓMATICA 51
1. PRODUCCIÓN DE EMBRIONES 51
2. GERMINACIÓN DE EMBRIONES 51
C. SISTEMA DE REGENERACIÓN VÍA ORGANOGÉNESIS
INDIRECTA 52
1. INDUCCIÓN Y MANTENIMIENTO DEL ESTADO DE CALLO 52
a. Producción de brotes 59
b. Enraizamiento y aclimatación 64
D. SENSIBILIDAD DE EXPLANTES DE A. tequilana A AGENTES
SELECTIVOS 64
1. KANAMICINA (ANTIBIÓTICO) 64
2. FOSFINOTRICINA (HERBICIDA) 67
iv
Página
E. ENSAYOS DE TRANSFORMACIÓN VÍA Agrobacterium
tumefaciens 68
1. INCORPORACIÓN DE PLÁSMIDOS EN CEPAS DE
Agrobacterium 68
2. SUSCEPTIBILIDAD DEL A. tequilana A LA INFECCIÓN DE
CEPAS SILVESTRES DE Agrobacterium tumefaciens 73
3. SELECCIÓN DE CONDICIONES DE TRANSFORMACIÓN 74
F. ENSAYOS DE TRANSFORMACIÓN VÍA BIOBALÍSTICA 82
1. SELECCIÓN DE CONDICIONES DE TRANSFORMACIÓN 82
G. SELECCIÓN DE TRANSFORMANTES 93
H. ANÁLISIS MOLECULARES 97
1. REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)
2. ANÁLISIS TIPO SOUTHERN BLOT 97
CONCLUSIONES 102
PERSPECTIVAS 105
BIBLIOGRAFÍA 106
APÉNDICE 121
v
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla Página 1. Plásmidos utilizados en ensayos de transformación vía
Agrobacterium tumefaciens 30
2. Plásmidos utilizados en ensayos de transformación mediante
Biobalística 31
3. Composición de medios de cultivo MS1 y MS-L2 en (mg/l) 35
4. Evaluación de la inducción del estado de callo en diferentes tejidos
de Agave tequilana 38
5. Evaluación de zeatina como fuente de citocininas en la inducción
del estado de callo en segmentos meristematicos de Agave
tequilana 39
6. Evaluación del efecto de las auxinas 2,4-D y NAA en el
mantenimiento del estado de callo en Agave tequilana 41
7. Evaluación de la sensibilidad de explantes de Agave tequilana al
antibiótico kanamicina y al herbicida fosfinotricina (ppt) 43
8. Evaluación de la sensibilidad de plantas de Agave tequilana al
herbicida fosfinotricina en su forma comercial (BASTA) 44
9. Organogénesis en explantes obtenidos a partir de diferentes
fracciones de meristemo 58
vi
Tabla Página
10. Capacidad de regeneración de callos de A. tequilana obtenidos de
los tratamientos de mantenimiento de callos 65
11. Efectos de la exposición al medio osmótico (sorbitol 15%) en la
expresión transitoria del gen gus A 87
12. Efectos de la distancia y presión en explantes de Agave tequilana
bombardeados con el plásmido pAHC25 utilizando el sistema de
baja presión 88
13. Efecto de la concentración de DNA de los plásmidos pAHC25 y
pBI426 en la expresión transitoria del gen gus A 89
14. Expresión transitoria del gen gus A a diferentes presiones y
distancias utilizando el sistema de alta presión 91
vii
ÍNDICE DE FIGURAS Figura Página 1. Esquematización de la anatomía del Agave tequilana 20
2. Producción de tequila en México expresado en millones de litros 22
3. Consumo de miles de toneladas de Agave tequilana en México
para la producción de tequila 23
4. Exportación de tequila en México expresado en millones de litros 24
5. Representación de los plásmidos utilizados en los ensayos de
transformación vía Agrobacterium 32
6. Representación de los plásmidos utilizados en los ensayos de
transformación vía biobalística 33
7. Esquematización de los explantes obtenidos a partir de cortes en
piñas de plántulas in vitro, utilizados en los experimentos de
determinación de tamaño de explante mínimo regenerable 40
8. Establecimiento del cultivo in vitro de Agave tequilana a partir de la
ropagación de segmentos de la región meristemática de la piña 53
9. Producción de embriones a partir de segmentos de hojas de
plántulas in vitro de A. tequilana 54
10. Respuesta a la inducción del estado de callo en tejidos de hoja y
piña de A. tequilana, utilizando diferentes fuentes de citocininas 56
viii
Figura Página
11. Formación de callos en explantes obtenidos a partir de diferentes
cortes de meristemos de plántulas in vitro de A. tequilana 57
12. Crecimiento de callos de A. tequilana, en respuesta a los
tratamientos con 2,4-D solo y en combinación con BAP 60
13. Crecimiento de callos de A. tequilana, en respuesta a los
tratamientos con NAA solo y en combinación con BAP 61
14. Apariencia de callos generados en los tratamientos de
mantenimiento de callos 62
15. Regeneración completa de A. tequilana vía organogénesis
indirecta a partir de segmentos de tejido meristematico (piñas) 66
16. Sensibilidad de callos de A. tequilana al antibiótico kanamicina 69
17. Efecto en hojas de tabaco a diferentes concentraciones del
herbicida fosfinotricina (ppt), adicionado en el medio (mg/l) 70
18. Sensibilidad de callos de A. tequilana al herbicida fosfinotricina
(ppt) 71
19. Sensibilidad de plantas de A. tequilana al herbicida fosfinotricina
en su forma comercial (BASTA) 72
20. Amplificación del fragmento del gen nptII presente en los
plásmidos P35SGUS y pBIN m-gfp5-ER en cepas LBA4404 de
Agrobacterium tumefaciens después de la transformación 75
ix
Figura Página
21. Susceptibilidad de plantas de A. tequilana a la infeccion de natural
Agrobacterium tumefaciens 76
22. Sobrevivencia de explantes de A. tequilana a diferentes tipos de
daño 79
23. Sobrevivencia de explantes de A. tequilana a diferentes tiempos de
exposición con el cultivo bacteriano 80
24. Expresión transitoria del gen gus A a diferentes tiempo de cocultivo
de A. tumefaciens con callos de A. tequilana 81
25. Expresión del gen gus A en explantes de tabaco (sistema control) 86
26. Expresión transitoria del gen gus A en callos de Agave tequilana
bombardeados con el sistema de baja presión 90
27. Expresión transitoria del gen gus A en callos de Agave tequilana
bombardeados con el sistema de alta presión 92
28. Selección de callos transformados mediante biobalística (Sistema
baja presión) 95
29. Selección de callos transformados mediante biobalística (Sistema
de alta presión) 96
30. Amplificación del gen npt II en materiales de A. tequilana
regenerados en medio de selección 99
31. Amplificación del gen gus A en materiales de A. tequilana
regenerados en medio de selección 100
x
Figura Página
32. Análisis Southern blot con el gen gus A en el DNA de callos
desarrollados en medio de selección 101
xi
ABREVIATURAS
°C Grado centígrado
µg Microgramo
µl Microlitro
µM Micromolar
2,4-D Ácido 2,4-diclorofenoxiacético
ANOVA Análisis de varianza
BA Benciladenina
BAP Bencilaminopurina
C.R.T. Consejo regulador del tequila
CAM Metabolismo ácido de crasuláceas
cat Cloranfenicol acetiltransferasa
CFB Capacidad de fromación de brotes
cm Centímetro
cm2 Centímetro cuadrado
CTV Cultivo de tejidos vegetales
cv Coeficiente de variación
dms Diferencias mínimas significativas
DNA Ácido desoxirribonucleico
DO Densidad óptica
FD Factor de dilución
gfp Proteína verde fluorescente
gus A β-glucuronidasa
xii
hph Higromicina fosfotransferasa
hr Horas
IAA Ácido 3-Indolacético
IBA Ácido 3-Indolbutírico
kb Kilobase
KIN Cinetina
lux Luciferasa
l Litro
M Molar
mg Miligramo
min Minuto
mm Milímetro
mM Milimolar
MS Medio de cultivo Murashige y Skoog (1962)
MS1 Medio de cultivo Murashige y Skoog (1962) modificado
Figura 4. Exportación de tequila en México expresado en millones de litros (Consejo Regulador del Tequila, 2006).
24
blanda de la raíz en Agave tequilana.
Entre las principales plagas que afectan al cultivo de Agave tequilana
podemos mencionar al picudo del agave (Scyphophorus acupunctatos),
algodoncillo o piojo harinoso (Planococcus harinoso), y algunas epecies de
nemátodos, por mencionar algunos (Rodríguez y col., 2004).
En la actualidad las enfermedades en el cultivo de A. tequilana representan
grandes pérdidas económicas para México. Esta problemática en la obtención
de la materia prima para la producción de tequila, aunada a la mala planeación
en el establecimiento de los cultivos, ha creado una crisis en la industria
tequilera ya que en la actualidad la demanda de la bebida se ha incrementado
en el ámbito nacional como internacional.
c. Variabilidad genética Otro importante problema agronómico que el cultivo del agave azul presenta
es que la mayoría de los agaves cultivados son clonas estériles, algunas veces
poliploides que raramente producen semillas viables (Robert y col., 1992).
A pesar de que la reproducción sexual se da escasamente, en las plantaciones
es evitada por los mismos agricultores, ya que cortan las inflorescencias tan
pronto empiezan a desarrollarse para impedir que hagan uso de los azúcares
almacenados (Robert y col., 1992). Esta situación ha traído como consecuencia
la pérdida de variabilidad genética en el cultivo, haciéndolo más susceptible a
la proliferación de enfermedades. Debido al largo periodo de desarrollo que la
planta presenta, la supresión de la floración en los cultivos y la poca viabilidad
de las semillas, hace que las estrategias de mejoramiento genético
convencional sean de difícil aplicación (Robert, y col., 1992).
Gil-Vega y col. (2001) reportaron que de 40 selecciones de A. tequilana
analizadas mediante RAPDs, 39 fueron isogénicas, concluyeron que este
bajo nivel de polimorfismo se propone como resultado de la promoción de un
genotipo conservado durante muchos años bajo una propagación
exclusivamente vegetativa. Este problema de erosión genética también está
presente en otras especies importantes de agave que han sido manipuladas
para su industrialización, como el Agave fourcroydes utilizado en la producción
25
de fibras. En un estudio similar al anterior no se observó variación genética
entre tres variedades de esa especie mediante un análisis de isoenzimas
(Colunga-GarciaMarín y col., 1999).
La industrialización de diferentes especies de agave ha tenido como
consecuencia la pérdida de variabilidad genética y de germoplasma (Granich,
2003).
2. Antecedentes de mejoramiento genético en agaves El único reporte que se tiene de mejoramiento genético tradicional en agave es
la obtención del híbrido diploide 11648 en Tanzania producto de una cruza
entre A. angustifolia X A. amaniensis y una retrocruza con A. amaniensis. El
híbrido es un alto productor de fibras en términos de hoja, contenido y calidad
de la fibra, desafortunadamente su extremada susceptibilidad a especies de
Phytophtora ha evitado su cultivo exitoso (Robert y col., 1992). Existen algunos trabajos de cultivo de tejidos en maguey y en otras agaváceas
que se han realizado con el objetivo de propagar masivamente esta planta,
tanto para fines de producción industrial (Agave tequilana), como para
conservación (Agave victoria-reginae). En lo que respecta a especies de agave
de uso ornamental en peligro de extinción, Rodríguez-Garay y colaboradores
en 1996 lograron obtener plantas de Agave victoria-reginae a través de
embriogénesis somática directa de segmentos de hojas en medio MS
suplementado con 2,4-D (Rodríguez-Garay y col., 1996). En otro trabajo en
esta misma especie se reporta la regeneración vía embriogénesis somática y
organogénesis a partir de segmentos de tallo utilizando un medio MS
modificado suplementado con los reguladores 2,4-D y BA (Martínez-Palacios y
col., 2003) . En Agave parrasana Santacruz-Ruvalcaba y col. (1999) reportaron
haber obtenido de manera eficiente plantas propagadas a partir de la
proliferación de brotes axilares usando MS con BA. Dentro de las principales
especies utilizadas como materia prima para la producción de fibras que son
Agave fourcroydes, Agave cantala y Agave sisalana, existen reportes de
regeneración vía organogénesis a partir de tejidos de rizoma, hojas, tallos y
estolones, utilizando como reguladores de crecimiento NAA, IBA, KIN, BA, IAA
y 2,4-D en diferentes combinaciones y concentraciones para cada uno de los
26
casos (Robert y col., 1987; Binh y col., 1990; Nikam, 1997; Hazra y col., 2002).
Para la especie Agave sisalana Perr. ex. Engelm Nikam y col., (2003) reportan
la regeneración de plantas vía embriogénesis somática a partir de segmentos
de tallo de bulbillos tratados con KIN, 2,4-D y BAP. Por último en Agave
tequilana Robert y col. (1992) reportaron la propagación vía organogénesis a
partir de tallo y hojas en MS modificado (fuentes de nitrógeno) utilizando BAP
como regulador de crecimiento.
En lo que respecta a trabajos de transformación genética publicados del género
Agave, Smith y Hood (1995) sólo reportan la formación de tumores producidos
por la inserción del plásmido Ti de A. tumefaciens en Agave salmiana Otto.
Santacruz Ruvalcaba (2001) transformó callos embriogénicos de A. tequilana
mediante biobalística con el sistema PDS-1000 He® (Pistola de alta presión);
bombardeó a 800 psi, con un pretratamiento con manitol 0.2 M + sorbitol 0.2 M
y sacarosa al 12% y logró observar la expresión del gen gus A de manera mas
constante cuando usó el plásmido pBarGus respecto a otros plásmidos. Con el
análisis molecular tipo Southern reportó la integración y expresión del gen bar
en siete clonas.
27
IV. OBJETIVOS
A. General
Evaluar diferentes tecnologías para la regeneración in vitro y transformación
genética de maguey (Agave tequilana Weber var. Azul).
B. Específicos
Desarrollar un sistema de cultivo de tejidos in vitro para regenerar Agave
tequilana.
Evaluar condiciones de transformación genética para Agave tequilana
mediante biobalística y/o vía Agrobacterium tumefaciens.
Obtener y analizar molecularmente materiales transgénicos de Agave
tequilana.
28
V. MATERIALES Y MÉTODOS A. Materiales 1. Material vegetal Se utilizaron plantas de Agave tequilana Weber var. Azul de un año de edad,
donadas por el Instituto de Ciencias Agrícolas de la Universidad de Guanajuato
y por el Rancho “El Pachon”, Zapopan, Jalisco, México.
2. Vectores Para llevar a cabo los ensayos de transformación vía Agrobacterium
tumefaciens y mediante bombardeo de partículas (biobalística) se utilizaron
diferentes vectores cuyas características se encuentran descritas y
esquematizadas en la Tabla 1 y 2 y en la Figuras 5 y 6.
3. Cepas bacterianas Las cepas bacterianas que se utilizaron en este estudio fueron las siguientes:
• Cepas de Escherichia coli TOP 10’F que contenían los plásmidos
p35SGUS, pBIN m-gfp5-ER, pBI426, pAHC25 y pCATGFP.
• La cepa ayudadora HB101 también de E. coli, para la cruza triparental.
• Cepas LBA4404 de Agrobacterium tumefaciens (competentes y
conteniendo el plásmido pBI121). La cepa LBA4404 es derivada de la cepa
silvestre Ach5, que porta el plásmido pLA4404 (tipo octopina), que es
derivado del pTiAch5 (Hooykaas y Schilperoort, 1992). Este plásmido no
tiene la región del T-DNA pero contiene la región vir que actúa en trans y es
huésped de plásmidos binarios.
• Las cepas silvestres de Agrobacterium tumefaciens, C58, H63 y A281.
29
Tabla 1. Plásmidos utilizados en ensayos de transformación vía Agrobacterium tumefaciens.
Plásmido Descripción
pBI121
(Bevan, 1984)
Vector binario derivado del BIN19 que contiene las
secuencias repetidas del plásmido pTiT7 para la
transferencia del T-DNA a células vegetales, el gen
nptII de resistencia a kanamicina, así como el gen gus
A que codifica para la β-glucuronidasa (GUS), bajo el
control del promotor constitutivo 35S del mosaico del
virus de la coliflor (CaMV35S).
p35S GUS
(Vancanneyt y col.,
1990)
Derivado del BIN19 que contiene los genes nptII que
confiere resistencia a kanamicina y gus A (GUS)
interrumpido por un intron, bajo el control del promotor
35S.
pBIN m-gfp5-ER
(Haseloff y col.,
1997)
Vector binario derivado del pB121, el gen reportero
GUS se encuentra remplazado por el gen m-gfp-ER
que codifica para la proteína verde fluorescente.
30
Tabla 2. Plásmidos utilizados en ensayos de transformación mediante Biobalística.
Plásmido Descripción
pBI426
(Dalta y col.,
1991)
Plásmido basado en pUC9 que contiene la información
que codifica para la proteína fusionada de GUS-NPTII
bajo el control de un promotor doble 35S del virus del
mosaico de la coliflor (CaMV) y el terminador de la
nopalino sintetasa (NOS).
pAHC25
(Christensen y
Quail, 1996)
Plásmido derivado de pUC8 que contiene el gen de
selección bar que confiere resistencia a fosfinotricina y
el gen reportero gus A (GUS), bajo el control del
promotor constitutivo Ubi-1.
pCATgfp
(Heim y col.,
1995)
Plásmido derivado de pUC9 que contiene el gen
reportero GFP que codifica para la enzima verde
fluorescente, bajo el control del promotor constitutivo
35S.
31
NNOOSS TT
gguussAA
BamHI
XbaI SmaI EcoRI
3355SS nnppttIIII
SphI HindIII PstI
A) pBI121
B) p35SGUS
NNOOSS TT
BamHI
XbaI SmaI EcoRI
3355SS nnppttIIII
SphI HindIII PstI
)
SnaBI SnaBI
Intron PIV2 (240 pb)
C) pBIN m-gfp5-ER
Figura 5. Representación de los plásmidos utilizados en los ensayos de transformación vía Agrobacterium tumefaciens. En los esquemas se
muestran los genes reporteros (gus A y gfp), el de resistencia a kanamicina
(nptII), así como los promotores y terminadores.
NNOOSS TT
MM--ggffpp55--
BamHI XbaI
EcoRI
3355SS nnppttIIII
SphI HindIII PstI
32
D) pBI426
NNOOSS T
gguussAA •• nnppttIIII
XbaI NcoI BamHI
EcoRI
3355SS •• 3355SS
HindIII
NNOOSS T
bbaarr
E) pAHC25
gguussAA
BamHI XbaI BamHI
EcoRI
UUbbii 11
PstI SmaI
PstI EcoRI
F) pCATgfp
Figura 6. Representación de los plásmidos utilizados en los ensayos de transformación mediante biobalística. En los esquemas se muestran los
genes reporteros (gus A y gfp), los de resistencia a agentes selectivos (bar y
nptII), así como los promotores y terminadores.
NNOOSS T
ggffpp
XbaI NcoI BamHI
nnppttIIII
HindIII EcoRI
3355SS
33
B. Métodos 1. Establecimiento del cultivo in vitro El cultivo in vitro de Agave tequilana se estableció a partir de hijuelos de
plantas de aproximadamente un año de edad. A estos hijuelos se les
eliminaron las hojas hasta llegar a la obtención de la “piña”, la cual fue
desinfestada mediante lavados consecutivos con detergente comercial.
Posteriormente se lavaron con etanol al 70% y finalmente con hipoclorito de
sodio comercial (Clorox) al 2.4%, el proceso se llevó a cabo en condiciones
asépticas en una campana de flujo laminar.
Una vez desinfestadas las piñas se obtuvieron segmentos de la región
meristemática utilizando un sacabocados de 8 mm y se colocaron en medio
MS1 (Tabla 3) en presencia de cefotaxima. Las condiciones de incubación
fueron: temperatura de 25º C y un fotoperíodo de 18 horas luz por 6 horas de
oscuridad.
2. Inducción de embriogénesis somática a. Producción de embriones Para llevar a cabo la producción de embriones somáticos de Agave tequilana,
se usaron como explantes segmentos de hojas de plántulas regeneradas in
vitro, fueron colocados en medio MS-L2 (Tabla 3), suplementado con 2,4-D,
basándonos en la metodología descrita para Agave victoria-reginae
(Rodríguez-Garay, 1996). Las concentraciones que se evaluaron fueron: 0.07,
0.15, 0.3, 0.46 y 0.62 mg/l de 2,4-D.
b. Germinación de embriones Los embriones producidos fueron transferidos a medio de regeneración (1/2
MS sin reguladores de crecimiento) para la germinación, esto se hizo siguiendo
el protocolo descrito para Agave victoria-reginae (Rodríguez-Garay, 1996).
34
Tabla 3. Composición de medios de cultivo MS1 y MS-L2 en (mg/l).
Componentes del medio MS1 MS-L2
NH4NO3 825.0 1650.0
KNO3 950.0 1900.0
MgSO4 . 7 H2O 370.0 370.0
CaCl2 . 2H2O 440.0 332.2
KI 0.83 0.83
KH2PO4 170.0 170.0
m-Inositol 100.0 250.0
Sacarosa 30 000.0 30 000.0
ZnSO4 . 7H2O 8.6 8.6
MnSO4 . H2O 27.68 16.9
CuSO4 . 5H2O 0.025 0.025
CoCl2 . 6H2O 0.025 0.025
H3BO3 6.2 6.2
Na2MoO4 . 2H2O 0.25 0.25
FeSO4 . 7H2O 27.8 27.8
Na2EDTA 37.3 37.3
Tiamina . HCl 20 2.0
Ácido nicotínico - 0.5
Glicina - 2.0
Piridoxina - 0.5
2,4-D 0.025 -
BAP 10 -
35
3. Establecimiento del sistema de regeneración mediante organogénesis indirecta
a. Inducción y mantenimiento del estado de callo Para seleccionar la fuente de explante óptima para la producción de callos de
Agave tequilana, se evaluaron segmentos de hoja de plántulas de agave
enraizadas in vitro y segmentos obtenidos de la región meristemática de
plántulas in vitro y de hijuelos. Estos explantes fueron colocados en medio MS
(Murashige y Skoog, 1962) y medio MS1 suplementados con diferentes
concentraciones de BAP o zeatina como fuente de citocinina en combinación
con 2,4-D como fuente de auxina (Tabla 4 y 5). Las condiciones de incubación
fueron: temperatura de 25º C y un fotoperíodo de 18 horas luz por 6 horas de
oscuridad. La respuesta de los explantes se evaluó periódicamente hasta
completar un mes de exposición al medio (subcultivos cada 15 días) y se
determinó el porcentaje de explantes formadores de callo.
Después de haber seleccionado la fuente óptima de tejido, se realizó un
experimento para determinar el tamaño mínimo del explante. Este experimento
se llevó a cabo con diferentes tipos y número de cortes en el explante (Figura
7). Posteriormente, éstos fueron cultivados en las mismas condiciones
mencionadas anteriormente, utilizando como tratamiento el de inducción de
callo.
Para llevar a cabo el mantenimiento de los callos obtenidos, se evaluaron
diferentes tratamientos de 2,4-D o ácido naftalenacético NAA, solos o en
combinación con BAP (Tabla 6), de igual manera se evaluaron tratamientos
utilizando únicamente BAP como regulador. Los callos fueron colocados en
medio MS1 con los diferentes tratamientos e incubados en las mismas
condiciones mencionadas anteriormente. Se llevó a cabo la evaluación de la
respuesta de los callos a los diferentes tratamientos, considerando friabilidad,
oxidación, ausencia de brotación y área de crecimiento. Todos los tratamientos
se evaluaron durante 1 mes, realizando subcultivos cada 15 días.
Los experimentos se realizaron en un diseño completamente al azar con 3
repeticiones por tratamiento. Cada repetición consistió en una caja petri con 10
explantes por caja. Los datos fueron evaluados con un análisis de varianza
(ANOVA) con el paquete de diseños experimentos FAUANL versión 2.5 de la
36
Universidad Autónoma de Nuevo León. Las medias de los tratamientos fueron
separadas usando la prueba de diferencia mínima significativa (dms) (α = 0.05).
b. Producción de brotes Los callos obtenidos de los diferentes tratamientos fueron colocados en medio
MS1 e incubados en las mismas condiciones para llevar a cabo la formación de
brotes. Esta capacidad fue evaluada después de un mes, tomando en cuenta
el número de brotes producidos por explante y el número total de explantes que
presentaban producción de brotes. Estos datos se utilizaron para calcular el
índice de capacidad de formación de brotes (CFB) de acuerdo a lo reportado
por Martínez-Pulido y col. (1992):
CFB = (Número promedio de brotes por explante) X (% de explantes con
brotes)/100
c. Enraizamiento y aclimatación Una vez que los brotes producidos alcanzaron una altura de 2 cm
aproximadamente, fueron separados y transferidos a medio MS1 sin
reguladores para la elongación y producción de raíces. Las plántulas que
presentaban un sistema radical completo fueron lavadas para eliminar el agar,
transferidas a macetas que contenían suelo estéril y llevadas a invernadero
donde se completo su desarrollo.
4. Determinación de la sensibilidad a agentes selectivos: kanamicina (antibiótico) y fosfinotricina (herbicida) Para establecer un sistema de transformación en necesario contar con un
sistema de selección confiable que permita asegurar la recuperación de plantas
transgénicas, para esto es necesario determinar la sensibilidad intrínseca de
los tejidos a los agentes selectivos que se vayan a usar. Por esta razón, se
realizaron experimentos en los cuales se expuso el tejido a diferentes
concentraciones del antibiótico kanamicina y del herbicida fosfinotricina (Tabla
7); el antibiótico, esterilizado por filtración fue adicionado al medio de
regeneración (MS1). Se evaluó la tasa de supervivencia de los explantes de
forma semanal durante un mes. Con los resultados obtenidos de estos
37
Tabla 4. Evaluación de la inducción del estado de callo en diferentes tejidos de Agave tequilana.
Tratamiento
Medio
BAP
(mg/l)
2,4-D (mg/l)
1 MS - -
2 MS1 - -
3 MS 2.5 0.025
4 MS 5 0.025
5 MS 10 0.025
6 MS1 2.5 0.025
7 MS1 5 0.025
8 MS1 10 0.025
38
Tabla 5. Evaluación de zeatina como fuente de citocininas en la inducción del estado de callo en segmentos meristematicos de Agave tequilana.
Tratamiento
Zeatina (mg/l)
2,4-D (mg/l)
1 - -
2 1 0.025
3 2 0.025
4 4 0.025
39
A B C
Figura 7. Esquematización de los explantes obtenidos a partir de cortes en piñas de plántulas in vitro. Los explantes se utilizaron en los experimentos
de determinación de tamaño de explante mínimo regenerable. A) Meristemo
completo; B) Corte transversal de meristemo; C) Corte longitudinal de
meristemo.
40
Tabla 6. Evaluación del efecto de las auxinas 2,4-D y NAA en el mantenimiento del estado de callo en Agave tequilana.
Tratamiento
BAP mg/l
2,4-D mg/l
NAA mg/l
1 - - -
2 10 0.025 -
3 5 0.125 -
4 5 0.25 -
5 5 0.5 -
6 - 0.125 -
7 - 0.25 -
8 - 0.5 -
9 5 - 0.25
10 5 - 0.5
11 5 - 1
12 - - 0.25
13 - - 0.5
14 - - 1
41
experimentos se estableció la dosis letal mínima para la selección de los tejidos
una vez transformados.
Se llevó a cabo también un experimento para determinar la dosis para
seleccionar plantas de agave transformadas mediante exposición al herbicida
comercial. Se expusieron las hojas de los agaves a las siguientes
concentraciones del herbicida fosfinotricina en su forma comercial (BASTA)
(Tabla 8) y se evaluó el daño en las hojas semanalmente durante un mes.
5. Ensayos de transformación vía Agrobacterium tumefaciens a. Transferencia de plásmidos a cepas de Agrobacterium
Para realizar los ensayos de transformación vía Agrobacterium tumefaciens,
primero se llevó a cabo la transferencia del DNA plasmídico a la bacteria (cepa
LBA4404), los plásmidos que se utilizaron fueron (P35SGUS y pBIN m-gfp5-
ER) y la transferencia se hizo por medio de una cruza triparental utilizando a la
cepa HB101 como proveedora del plásmido ayudador (Shaw, 1994). Otro
método que se utilizó para la transformación de Agrobacterium fue el de tratar
las células con NaCl y CaCl2, y permitir posteriormente la transferencia del
DNA a la bacteria mediante el choque térmico por la congelación con nitrógeno
líquido (Chen y col., 1994). Mediante la selección con antibióticos, se
obtuvieron las colonias de A. tumefaciens que recibieron cada uno de los
plásmidos; la transferencia a Agrobacterium se verificó mediante PCR con
primers dirigidos al gen de resistencia al antibiótico kanamicina (nptII).
b. Evaluación de la susceptibilidad del A. tequilana a la infección por cepas silvestres de Agrobacterium tumefaciens
Con el fin de evaluar la susceptibilidad del agave a la infección natural de
Agrobacterium tumefaciens, la cual produce la enfermedad conocida como
agalla de la corona, fueron inyectadas plantas de A. tequilana de
aproximadamente 2 años de edad crecidas en invernadero con un cultivo
bacteriano concentrado de las cepas silvestres de Agrobacterium C58, H63 y
A281 de manera individual. Las inyecciones se realizaron en la región del tallo,
cercana a las raíces y posteriormente se evaluó la aparición de tumores en
dicha región.
42
Tabla 7. Evaluación de la sensibilidad de explantes de Agave tequilana al antibiótico kanamicina y al herbicida fosfinotricina (ppt).
Tratamiento
Kanamicina
mg/l
Fosfinotricina
mg/l
1 - -
2 25 -
3 50 -
4 100 -
5 200 -
6 - 1
7 - 2
8 - 3
9 - 4
10 - 5
43
Tabla 8. Evaluación de la sensibilidad de plantas de Agave tequilana al herbicida fosfinotricina en su forma comercial (BASTA).
Tratamiento
% BASTA (v/v)
1 0
2 4
3 8
4 12
5 16
44
c. Evaluación de la expresión transitoria para la selección de condiciones de transformación
Para determinar las condiciones óptimas de transformación de los callos de A.
tequilana mediante el uso de la bacteria Agrobacterium tumefaciens, se
evaluaron los siguientes parámetros, utilizando los plásmidos descritos
anteriormente:
1). Respuesta al tipo de daño en el tejido vegetal Para permitir la interacción entre Agrobacterium tumefaciens y el tejido vegetal
es necesario que se produzcan compuestos atrayentes para la bacteria en el
tejido herido, por ello es necesario determinar el tipo de daño que permita una
buena recuperación del explante. Con este fin, se dañaron callos de agave
utilizando bombardeo de micropartículas de tungsteno y agujas de 13 y 32 mm,
posteriormente se evaluó el porcentaje de sobrevivencia de los explantes.
2). Tipo de cultivo bacteriano y tiempo de exposición con el explante Para seleccionar el tipo de cultivo y el tiempo de exposición óptimos para llevar
a cabo la transformación genética, se expusieron callos de agave a cultivos
concentrados sólido y líquido de la bacteria, y se determinó la sobrevivencia.
Después de seleccionar el tipo de cultivo adecuado, se expusieron los callos
durante diferentes tiempos (0, 5, 10, 20, 30 min) y de igual manera se evaluó el
porcentaje de sobrevivencia de los explantes.
3). Tiempo de cocultivo Habiendo seleccionado los parámetros anteriores, se infectaron callos de
agave en esas condiciones y se incubaron a diferentes tiempos en cocultivo (0,
1, 2, 3, 4 y 5 días) para que se llevara a cabo la transferencia del plásmido al
tejido vegetal. El tiempo de cocultivo óptimo, se seleccionó evaluando la
expresión transitoria del gen reportero de acuerdo al plásmido utilizado (gus A
o gfp).
45
d. Ensayos de transformación estable Con los parámetros óptimos determinados se llevó a cabo la transformación
mediante Agrobacterium tumefaciens. Posterior al cocultivo, los callos
transformados fueron colocados en medio MS1 con cefotaxima 500 mg/l, para
eliminar la bacteria y después se expusieron al mismo medio pero con la dosis
letal determinada del agente de selección correspondiente. De esta forma se
permitió solo la sobrevivencia de material transformado.
6. Ensayos de transformación vía biobalística a. Purificación de plásmidos y preparación de partículas Los plásmidos fueron purificados utilizando el método de Birboim (Birboim y
Doly, 1979) de lisis alcalina y su integridad fue verificada mediante digestión
con enzimas de restricción, lo que se observó al realizar una electroforesis en
un gel de agarosa al 1% y teñirlo en bromuro de etidio.
Las partículas de tungsteno (M10) utilizadas fueron esterilizadas con alcohol,
sonicadas y enjuagadas con agua estéril (ver Apéndice). Se precipitó el DNA
de la suspensión mezclándolas con el DNA (plásmido), CaCl2 (2.5 M) y
espermidina (100 mM) (Finer y col., 1992). Una vez preparada la suspensión
se utilizaron 4μl del precipitado por bombardeo.
b. Evaluación de la expresión transitoria para la selección de condiciones
de transformación Para determinar condiciones óptimas de transformación de callos de A.
tequilana mediante bombardeo con alta y baja presión se evaluaron los
siguientes parámetros
1). Medio osmótico Para determinar el tiempo de exposición al medio osmótico se colocaron los
explantes en medio MS1 adicionado con 15% de sorbitol (agente osmótico) y
se expusieron a diferentes tiempos previo al bombardeo (4 y 8 horas),
posteriormente se llevó a cabo el bombardeo.
46
2). Presión Se utilizaron los sistemas de bombardeo de alta y baja presión. Utilizando el
sistema de baja presión, se evaluaron; 60, 80, 100 y 120 psi de presión y de
igual manera utilizando el sistema de alta presión, fueron evaluados las
presiones de 450, 900 y 1350 psi.
3). Distancia En combinación con las presiones también analizaron distancias de 17.5 a 22.5
cm en intervalos de 2.5 cm, para el sistema de baja presión. Para el sistema de
alta presión se analizaron distancias de 9 a 15 cm en intervalos de 3 cm. La
distancia corresponde a la longitud entre la posición del filtro que contiene las
partículas hasta el soporte donde se colocan los explantes.
4). Concentración de DNA Tomando en cuenta que en los protocolos de transformación se recomienda no
utilizar una concentración mayor de 1 μg/μl del plásmido, se evaluó el efecto
de la concentración del plásmido en la expresión transitoria. Se bombardearon
callos con partículas que fueron precipitadas con el plásmido a dos diferentes
concentraciones (0.1 μg/μl y 1 μg/μl).
El efecto de todos los parámetros anteriormente mencionados fue cuantificado
mediante el número de foci que presentaron, como efecto de actividad de β-
glucuronidasa.
c. Ensayos de transformación estable Después de evaluar los diferentes parámetros de transformación y seleccionar
las mejores condiciones, se bombardearon callos con las condiciones
seleccionadas utilizando ambos sistemas. Los explantes transformados se
incubaron en oscuridad durante 48 horas, para permitir la recuperación del
tejido, posteriormente fueron sometidos a selección.
7. Selección de material transformado Todos los explantes provenientes de los ensayos de transformación realizados
con ambos métodos (Agrobacterium y biobalística), fueron colocados en medio
47
de regeneración MS1 suplementado con la dosis determinada del agente de
selección, de esta manera se llevo a cabo una preselección. Los callos que
sobrevivieron fueron transferidos a medio con la dosis determinada para una
segunda ronda de selección, asegurándonos de esta manera que solo se
regeneraba material transformado.
8. Análisis histoquímico Para analizar la expresión del gen gus A en los ensayos de expresión
transitoria y en los tejidos que sobrevivieron a los procesos de selección, se
llevaron a cabo ensayos histoquímicos basados en el método de Jefferson
(1987).
Al tejido transformado se le adicionaron 500 μl de regulador de reacción con el
sustrato X-gluc (5-bromo-4-cloro-indolil glucurónido), fosfato de potasio (100
mM pH 7.0), EDTA (10 mM pH 8.0), ferricianuro de potasio (0.5 mM) y
ferrocianuro de potasio (0.1 mM) (Ver apéndice). El tejido con el regulador se
incubó a 37°C en la oscuridad durante una noche. Transcurrido este tiempo se
retiró la solución y los tejidos fueron lavados tres veces con una mezcla de
metanol-acetona (3:1) para remover posibles pigmentos que pudieran interferir
con la visualización del color. Las células transformadas fueron reconocidas
fácilmente, por la producción de un precipitado azul que se registró como
número de foci.
9. Análisis molecular de material transformado a. Extracción de DNA La extracción del DNA de los materiales seleccionados de agave se llevó a
cabo basándonos en el método reportado por Keb-Llanes y col., 2002, el cual
se realizó partiendo de 0.3 gramos de tejido fresco. El tejido fue molido y
transferido aun tubo con las siguientes soluciones: solución A (CTAB 2%, Tris-
HCl 100 mM pH8, EDTA 20 mM, NaCl 1.4 M, polivinilpirrolidona 4%, ácido
ascórbico 0.1% y β-mercaptoetanol 10 mM), solución B (Tris-HCl 100 mM pH 8,
EDTA 50 mM, NaCl 100 mM y β-mercaptoetanol 10 mM) y SDS 20%; esta
mezcla se incubo a 65°C por 10 min, posteriormente se agrego acetato de
potasio (5M) previamente enfriado; se agitó vigorosamente y se centrifugó
48
(15,300 g, por 15 min, 4°C), recuperándose 1 ml de la fase acuosa a la que se
le adicionó ½ volumen de isopropanol frió, se mezclo suavemente y se dejo
precipitar en hielo por 20 min. Después se centrifugo (9600 g, por 10 min) y se
lavó con etanol al 70% (v/v); posteriormente se resuspendió en TE; después el
DNA se precipito incubando en hielo por 20 min con 1/10 de volumen de
acetato de sodio 3 M pH 5.2 y ½ de volumen de isopropanol frió,
posteriormente se centrifugo (9600g por 10 min); se repitió el procedimiento a
partir del lavado con etanol al 70%. Finalmente el DNA resuspendió en TE.
La integridad del DNA obtenido se analizó mediante electroforesis en geles de
agarosa al 1%, visualizados con bromuro de etidio; la concentración se calculó
por densidad óptica a 260 nm utilizando la siguiente fórmula:
[DNA] = DO 260 X 50 X FD / 100
[DNA] : Concentración de DNA
DO 260 : Densidad óptica leída a 260 nm de longitud de onda
FD : Factor de dilución = Volumen total / Volumen de DNA
b. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) El análisis de la amplificación del DNA del material seleccionado para
determinar la integración de los genes introducidos se llevó a cabo usando
oligonucleótidos específicos para el gen gus A y/o nptII (Jefferson y col., 1987;
Beck y col., 1982). Los oligonucleótidos fueron los siguientes:
Las condiciones de reacción fueron las siguientes:
gus A nptII 94ºC 4min 94ºC 4min
92 ºC 1min 92 ºC 1min
55 ºC 1.2 min 30 ciclos 57 ºC 1.2 min 35 ciclos
72 ºC 1.1 min 72°C 1.1 min
72 ºC 5 min 72 ºC 5 min
Los productos obtenidos fueron analizados en geles de agarosa al 1% y
visualizados mediante tinción con bromuro de etidio.
c. Análisis tipo Southern blot La determinación tanto de la integración como el posible número de copias de
los genes introducidos se llevo a cabo mediante un análisis tipo Southern de la
siguiente manera: El DNA extraído de los callos seleccionados fue digerido
mediante una doble digestión con la enzima EcoRI, la cual corta en uno de los
extremos del gen gus A en el plásmido PBI426. El DNA digerido fue calentado
a 65 °C por 15 minutos, se enfrió en hielo durante 5 minutos y el producto de la
digestión se analizó mediante electroforesis en un gel de agarosa al 1% y se
observo tiñendo con bromuro de etidio. Posteriormente el gel fue
desntaturalizado y transferido a una membrana de nylon por capilaridad. El
DNA se fijó a la membrana con luz ultravioleta. La hibridación de la membrana
se llevo a cabo utilizando como sonda el gen gus A marcado radioactivamente
(Sambrook y col., 1989).
50
VI. RESULTADOS Y DISCUSIÓN A. Establecimiento del cultivo in vitro
Se logró establecer un sistema de cultivo in vitro para Agave tequilana a partir
del cultivo de segmentos obtenidos de la región meristemática o piña, de
hijuelos de agave de aproximadamente un año de edad, en medio MS1. Como
respuesta del tejido a la exposición al medio, se obtuvo la producción de brotes
con una buena eficiencia (20 a 30 brotes por explante), llegando hasta el
establecimiento de las plantas en invernadero. En cuanto al proceso de
desinfectación el utilizado fue exitoso, ya que no se observó contaminación en
los explantes cultivados. El tiempo total que se necesitó para obtener una
plántula de Agave tequilana enraizada in vitro a partir de la desinfestación fue
de 3 meses aproximadamente (Figura 8).
B. Inducción de embriogenesis somática
1. Producción de embriones Con la finalidad de establecer un sistema de regeneración vía embriognesis en
Agave tequilana, se evaluaron segmentos de hojas obtenidas de plantas
enraizadas in vitro. Como resultado de la influencia del medio MS-L2 sobre los
segmentos, solo se observó el abultamiento del tejido y la aparición de algunas
estructuras con apariencia embrionaria (Figura 9 A, B y C). Esto se observó 6
semanas después de colocarlos en el medio. Dichas estructuras se
presentaron en un promedio de 3 por explante y aparecieron en 40% de los
mismos. A pesar de ser una eficiencia muy baja en cuanto a la producción de
este tipo de estructuras, nuestras observaciones nos indicaron la posible
producción de embriones similar a la reportada con el mismo sistema en la
especie Agave Victoria-reginae (Rodríguez-Garay, 1996).
2. Germinación de embriones
Al llevar a cabo la transferencia de las estructuras embrionarias al medio de
germinación, se observó solo muerte del tejido sin llegar a obtener en ninguna
de estas la regeneración de una plántula de Agave tequilana producto de su
germinación (Figura 9 D), contrario a lo reportado para la especie Agave
victoria-reginae (Rodríguez-Garay, 1996), donde ellos reportan la obtención de
51
plántulas regeneradas a partir de embriones. De manera similar se reporto que
a concentraciones más elevadas de 2,4-D en medio MS se obtuvo la
regeneración de plantas vía embriogénesis indirecta, mediante el cultivo de
segmentos de tallo de plántulas (Martínez-Palacios y col., 2003).
Tomando en cuenta lo anterior es importante destacar que siendo el Agave
tequilana y Agave victoria-reginae plantas pertenecientes al mismo genero, la
respuesta de sus tejidos al medio, componente y condiciones de cultivo es muy
diferente.
Es importante continuar con estudios que nos permitan desarrollar un sistema
de regeneración vía embriogénesis preferentemente indirecta y a partir de
tejido meristemático para ser utilizados como fuente de explante en trabajos de
transformación debido a la estabilidad genética que este sistema brinda
(Williams and Maheswaran, 1986; Isabel y col., 1995).
Santacruz-Ruvalcaba (2001), en su tesis doctoral reporta un sistema de
transformación utilizando callos embriogénicos, sin embargo, no existen
reportes de como esta constituido este sistema. En este sentido a pesar de no
haber obtenido la germinación de embriones, nuestros resultados son un
primer indicio de la respuesta de este tipo de tejidos para futuras evaluaciones
que sean hechas con esa finalidad.
C. Sistema de regeneración vía organogénesis indirecta
1. Inducción y mantenimiento del estado de callo
Los segmentos de hoja que fueron expuestos a medio MS y MS1
suplementado con las diferentes concentraciones de BAP y 2,4-D no mostraron
desarrollo de una estructura de callo. Se observó en cambio un leve
crecimiento del tejido; solamente los explantes obtenidos de la cabeza central
(piña) y expuestos a medio MS1 suplementado con 10 mg/l de BAP y 0.025
mg/l de 2,4-D tuvieron la capacidad de formar callos en un 100% (Figura 10B).
Para obtener mejor respuesta en el tiempo de formación de callo con los
explantes obtenidos del tejido meristemático se utilizó zeatina como fuente de
citocinina. Se observó la formación de estructuras callosas a diferentes
concentraciones de zeatina en combinación con 2,4-D; sin embargo, éstos
fueron menos friables y con una apariencia seca y dura en la superficie (Figura
10C).
52
0 12 32 60 (Días)
22 Días
0 12 32 60 (Días)
22 Días
Figura 8. Establecimiento del cultivo in vitro de Agave tequilana. El cultivo
in vitro se estableció a partir de la propagación de segmentos de la región
meristemática de la piña.
53
A B C D
Figura 9. Ensayo para la producción de embriones somáticos a partir de segmentos de hojas de plántulas in vitro de A. tequilana. A) Inducción del
estado embriogénico; B) Producción de estructuras embriogénicas; C)
Separación de estructuras; D) Germinación con embriones muertos.
54
Para la determinación del tamaño mínimo regenerable del explante, los
segmentos obtenidos a partir de los diferentes cortes de la región
meristemática de las plántulas enraizadas in vitro, fueron colocados en medio
MS1 de regeneración. Los callos presentaron una apariencia compacta y
saludable después de 15 días en incubación (Figura 11). Sin embargo, los
explantes obtenidos a partir del corte longitudinal mostraron un alto porcentaje
de formación de callo (77.5%), en comparación con los obtenidos a partir de los
otros cortes (Tabla 9) (Valenzuela-Sánchez y col., 2006)
En un experimento previo se observó que disminuyendo la concentración de
citocininas (5 mg/l) y aumentando la de auxinas (0.25 mg/l), hay un crecimiento
en los callos sin llevarse a cabo la formación de brotes. Posteriormente, se
evaluaron diferentes tratamientos con 2,4-D y NAA, (solos o en combinación
con BAP) y se observaron diferentes respuestas en las características de
crecimiento y friabilidad.
Los callos cultivados en los diferentes tratamientos de mantenimiento lograron
mantenerse sin presentar la formación de brotes durante tres meses como
mínimo (Valenzuela-Sánchez y col., 2006). En resultados preliminares se
observó que los callos expuestos en medio sin fuente de auxinas, no logran
sobrevivir, además se determinó que el tiempo entre la inducción del estado de
callo y la transferencia a los distintos tratamientos de mantenimiento fue
determinante para el efecto de la preservación de la estructura callosa. Se
observó que el tiempo máximo para hacer la transferencia después de la
inducción debe ser de 7 días, si es mayor la predeterminación del estado de
organogénesis se hace presente en los callos. De manera general, se encontró
en los primeros experimentos que una disminución en la concentración de
citocininas (BAP) y, como consecuencia un aumento en la concentración de
auxinas (2,4-D) da como resultado una mejor respuesta en el crecimiento de
los callos.
Lo anterior concuerda con lo reportado por Núñez-Palenius y col. (1999)
quienes indican que para establecer un sistema de regeneración se debe
considerar que un incremento en la concentración de auxinas y consecuente
decremento en la concentración de citocininas induce la condición de callo en
los explantes. En este sentido Robert y col. (1987) obtuvieron un extenso
55
A CA B C
Figura 10. Respuesta a la inducción del estado de callo en tejidos de hoja y piña de A. tequilana, utilizando diferentes fuentes de citocininas. A)
Segmentos de hoja; B) Callos (BAP); C) Callos (Zeatina).
56
A B C
Figura 11. Formación de callos en explantes obtenidos a partir de diferentes cortes de meristemos de plántulas in vitro de A. tequilana. A)
Meristemo completo; B) Corte transversal; C) Corte longitudinal.
57
Tabla 9. Organogénesis en explantes obtenidos a partir de diferentes fracciones de meristemo.
Tipo de corte Capacidad de formación Capacidad de formació n de callos (%) brotes (CFB)
Completo 68.6 b 15.9
Transversal 71.5 b 19.5
Longitudinal 77.5 a 7.8
Valores seguidos por la misma letra en cada columna no difieren estadísticamente a p=0.05 de acuerdo a la prueba de diferencias mínimas significativas (dms).
Tipo de corte
Capacidad de formación Capacidad de formació n
Completo 68.6 b 15.9
Transversal 71.5 b 19.5
Longitudinal 77.5 a 7.8
meristemático
58
crecimiento de callos en explantes de A. fourcroydes utilizando una relación
alta de auxinas/citocininas (2.5 mg/l IBA y 1 mg/l BAP).
Los callos crecidos en diferentes concentraciones de auxinas (2,4-D y NAA),
solas o en combinación con BAP, mostraron efectos muy contrastantes en
cuanto a crecimiento (Figuras 12 y 13). Mientras que los callos crecidos en los
tratamientos con 2,4-D tuvieron bajos índices de crecimiento, cuando fueron
expuestos a esas mismas concentraciones pero en combinación con BAP, el
crecimiento se incrementó en más de un 100% (Figura 12). En términos
generales, los callos presentaron una apariencia compacta y un color verde
brillante, además se observó poca friabilidad y pequeñas áreas de oxidación
(Figura 14A y 14C). En contraste, los tratamientos en los que se utilizó NAA
como fuente de auxinas, presentaron altos índices de crecimiento. De manera
contraria a los tratamientos con 2,4-D, cuando fueron utilizados en combinación
con BAP los niveles decrecieron drásticamente (Figura 12); sin embargo, sólo
los callos obtenidos de los tratamientos con NAA presentaron alta friabilidad
(Figura 13B y 13D) (Valenzuela-Sánchez y col., 2006). La respuesta
contrastante entre las dos auxinas puede explicarse tomando en cuenta que
la actividad auxina-citocinina en la división celular puede tener una función
antagónica ya que la auxina NAA se une a la enzima reguladora de citocininas,
llamada citocinina oxidasa, o bien, puede tener un efecto sinérgico, ya que los
niveles de auxinas libres como el 2,4-D son incrementados por la influencia de
citocininas (Coenen y Lomax., 1997). Tomando en cuenta las características de
friabilidad y crecimiento, los tratamientos con alta concentración de NAA (1.0
mg/l) fueron los que produjeron una mejor respuesta (Valenzuela-Sánchez y
col., 2006).
2. Producción de brotes Los callos obtenidos en los tratamientos con zeatina (como fuente de
citocininas) no mostraron el desarrollo de órganos (brotes). Sin embargo,
cuando se realizó la transferencia de los callos a medio de regeneración MS1
se observó bajo nivel de organogénesis, comparado con los obtenidos en
callos inducidos en el mismo medio. En este sentido, Hazra y col. (2002),
reportaron que no se obtuvo la formación de brotes en tratamientos con zeatina
de callos de Agave sisalana.
59
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7 aa
d
b
c c
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
Are
ade
cre
cim
ient
o cm
2
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7 aa
d
b
c c
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.70.
125
2,4
-D
Tratamientos mg/l
0.12
5 2
,4-D
/ 5 B
AP
0.25
2,4
-D0.
25 2
,4-D
/ 5 B
AP
0.5
2,4
-D0.
5 2
,4-D
/ 5 B
AP0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7 aa
d
b
c c
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
Área
de c
reci
mie
nto
cm2
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0
0.1
0.2
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0.4
0.5
0.6
0.7 aa
d
b
c c
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.70.
125
2,4
-D
Tratamientos mg/l
0.12
5 2
,4-D
/ 5 B
AP
0.25
2,4
-D0.
25 2
,4-D
/ 5 B
AP
0.5
2,4
-D0.
5 2
,4-D
/ 5 B
AP0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7 aa
d
b
c c
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
Are
ade
cre
cim
ient
o cm
2
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7 aa
d
b
c c
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.70.
125
2,4
-D
Tratamientos mg/l
0.12
5 2
,4-D
/ 5 B
AP
0.25
2,4
-D0.
25 2
,4-D
/ 5 B
AP
0.5
2,4
-D0.
5 2
,4-D
/ 5 B
AP0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7 aa
d
b
c c
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
Área
de c
reci
mie
nto
cm2
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
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0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7 aa
d
b
c c
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.70.
125
2,4
-D
Tratamientos mg/l
0.12
5 2
,4-D
/ 5 B
AP
0.25
2,4
-D0.
25 2
,4-D
/ 5 B
AP
0.5
2,4
-D0.
5 2
,4-D
/ 5 B
AP
Figura 12. Crecimiento de callos de A. tequilana en respuesta a los tratamientos con 2,4-D solo y en combinación con BAP. Valores seguidos
con la misma letra no difieren estadísticamente a p= 0.05 de acuerdo a la
prueba de diferencias mínimas significativas (dms).
60
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
c
a
cd
b
d
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
b
d
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
c
a
cd
b
d
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
b
d
0.25
NA
A
Áre
a de
cre
cim
ient
o cm
2
Tratamientos mg/l
0.25
NA
A/ 5
BA
P
0.5
NA
A0.
5 N
AA
/ 5 B
AP
0.1
NA
A
0.25
NA
A/ 5
BA
P0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
c
a
cd
b
d
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
b
d
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
c
a
cd
b
d
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
b
d
0.25
NA
A
Áre
a de
cre
cim
ient
o cm
2
Tratamientos mg/l
0.25
NA
A/ 5
BA
P
0.5
NA
A0.
5 N
AA
/ 5 B
AP
0.1
NA
A
0.25
NA
A/ 5
BA
P
Figura 13. Crecimiento de callos de A. tequilana en respuesta a los tratamientos con NAA solo y en combinación con BAP. Valores seguidos
con la misma letra no difieren estadísticamente a p= 0.05 de acuerdo a la
prueba de diferencias mínimas significativas (dms).
61
A B
C D
A B
C D
Figura 14. Apariencia de callos generados en los tratamientos de mantenimiento de callos. Tratamientos: A) 0.25 mg/l 2,4-D; B) 1 mg/l NAA; C)
5 mg/l BAP y 0.25 mg/l 2,4-D; D) 5 mg/l BAP y 1 mg/l NAA.
62
Los callos obtenidos a partir de las piñas o cabezas centrales (región
meristemática) completas y los explantes obtenidos de los diferentes cortes de
las mismas mostraron diferencias significativas en su coeficiente de formación
de brotes (CFB). Los callos obtenidos a partir de los cortes transversales,
presentaron los mayores índices de CFB (19.5), comparados con los
provenientes de los cortes longitudinales (Tabla 9). A pesar de que estos
últimos fueron los que mostraron los niveles más altos de capacidad de
formación de callos (Tabla 9) (Valenzuela-Sánchez y col., 2006).
Los callos obtenidos de los tratamientos con NAA y 2,4-D solos o en
combinación con BAP mostraron bajos niveles de formación de brotes,
comparados con el tratamiento control (callos en medio MS1) (Tabla 10). Es
importante mencionar que utilizando el medio MS1 la aparición de brotes es de
forma inmediata a la formación del callo, sin permitir manipular dicho estado.
Del total de los tratamientos evaluados, los que presentaron mayor nivel de
CFB fueron los que utilizaron la más alta concentración de NAA (1.0 mg/l)
como único regulador y en la concentración más baja de 2,4-D (0.125 mg/l)
combinado con BAP (4.7 y 3.19, respectivamente) (Tabla 10) (Valenzuela-
Sánchez y col., 2006).
Las condiciones de un cultivo de callos pueden favorecer la aparición de
cambios genéticos y epigenéticos en los explantes. Este fenómeno puede
causar una pérdida progresiva de la capacidad de regeneración (Gómez,
1998). En nuestros resultados se observó que en la mayoría de los casos esta
capacidad fue recuperada, mostrando brotes de apariencia y desarrollo normal.
A pesar de que los valores de CFB fueron bajos en comparación con el sistema
de regeneración usado como control (MS1), son aceptables si consideramos
que para llevar a cabo los experimentos de transformación genética el sistema
de cultivo de callos no tiene limitación en cuanto a la disponibilidad del
explante. Otra alternativa que podría brindar este sistema, es la inducción de
variabilidad genética en el cultivo al manipular el estado de callo por tiempos
prolongados (Núñez-Palenius y col., 1999).
Un sistema de transformación genética exitoso depende particularmente de un
eficiente sistema de regeneración (Birch, 1997). En este sentido, el uso de un
sistema de regeneración vía organogénesis indirecta, a partir de segmentos
meristemáticos y la manipulación del estado de callo es una buena alternativa
63
como sistema de transformación genética de Agave tequilana. Las
características celulares como estado de diferenciación y crecimiento de los
tejidos meristemáticos y el hecho de poder hacer un cultivo repetitivo de los
callos. pueden garantizar la regeneración de plantas de origen unicelular,
facilitando así, la posibilidad de una doble selección, lo cual reduciría la
frecuencia de plantas quiméras.
3. Enraizamiento y aclimatación Los brotes maduros transferidos a medios MS1 libre de reguladores de
crecimiento, mostraron la aparición de las primeras raíces después de diez días
y el sistema radical se observó completamente desarrollado a las tres
semanas, dando como resultado plántulas con apariencia fuerte y saludable
(Figuras 15C, 15D y 15E) (Valenzuela-Sánchez y col., 2006). Las plántulas
enraizadas fueron aclimatadas con un 100% de sobrevivencia y se mantuvieron
en invernadero para que continuaran su ciclo de desarrollo, y hasta las
últimas observaciones se presentaban aparentemente normales (Figura 15F).
Este proceso tomo un total de 5 meses.
D. Sensibilidad de explantes de A. tequilana a agentes selectivos 1. Kanamicina (antibiótico) A los 30 días de exposición al medio de regeneración (MS1) suplementado con
las concentraciones del antibiótico kanamicina utilizadas, los callos mostraron
diferentes porcentajes de sobrevivencia con respecto a cada una de de estas
concentraciones. Los efectos del antibiótico fueron notorios a partir de los
primeros 15 días, observándose en los callos los primeros índices de necrosis,
así como también interrupción del desarrollo, contrastando con los callos
control en los que ya se observaba la aparición de los primeros brotes. Como
se observa en la Figura 16, existe una relación inversa entre la concentración
del antibiótico en el medio y la sobreviviencia del tejido. A 25 mg/l de
kanamicina no se observó un efecto significativo del antibiótico ya que
sobrevivió un 96.7%, sin embargo, al aumentar la dosis a 50 mg/l, la
sobrevivencia disminuyó drásticamente a un 46%, finalmente con 100 mg/l
murió el 91% de los explantes. Tomando en cuenta lo anterior, se seleccionó la
64
Tabla 10. Capacidad de regeneración de callos de A. tequilana obtenidos de los tratamientos de mantenimiento de callos.
Concentración de reguladores Capacidad de formación de brotes
de crecimiento (mg/l) (BFC)
BA 2,4-D NAA
0.0 0.0 0.0 --
0.0 0.25 2.06 cd
0.0 0.5 3.34 bc
0.0 1.0 4.7 b
0.125 0.0 1.85 cde
0.25 0.0 1.05 def
0.5 0.0 0.33 ef
5 0.0 0.0 --
0.0 0.25 0.15 f
0.0 0.5 0.87 def
0.0 1.0 0.35 ef
0.125 0.0 3.19 bc
0.25 0.0 3.12 c
0.5 0.0 2.08 de
10* 0.025 -- 14.5 a
* Concentración usada en el sistema de propagación con el medio MS1. Valores seguidos con la misma letra no difieren estadísticamente a p= 0.05 de
acuerdo a la prueba de diferencias mínimas significativas (dms)
65
A B C
D E F
A B C
D E F
Figura 15. Regeneración completa de A. tequilana vía organogénesis indirecta a partir de segmentos de tejido meristematico (piñas). A)
Obtención del explante inicial; B) Inducción del estado de callo; C) Producción
de brotes; D) Separación de brotes; E) Enraizamiento; F) Aclimatación.
66
concentración de 100 mg/l como dosis para llevar a cabo una preselección de
los explantes transformados. 200 mg/l podría resultar una dosis tóxica para el
tejido al ser utilizada en la primera etapa de selección, tomando esto en cuenta
se determinó usarla como un segundo tratamiento selectivo, después de que
los explantes se hubieran recuperado al ser expuestos en el medio de
regeneración adicionado con una dosis del antibiótico más baja (100 mg/l).
Santacruz-Ruvalcaba (2001) utilizó 40 mg/l de kanamicina para seleccionar
callos embriogénicos de Agave tequilana, esto demuestra que la respuesta al
antibiótico es específica del tipo de tejido incluso dentro de la misma especie.
Este contraste resalta la importancia del análisis de sensibilidad del tejido que
vaya a ser utilizado en trabajos de transformación genética, ya que la selección
es un paso determinante en el desarrollo de este tipo de metodologías (Yang y
Christou, 1994).
2. Fosfinotricina (herbicida) Para el primer experimento de las evaluaciones de sensibilidad a fosfinotricina
(0, 0.25, 0.5, 1 y 2 mg/l) no se observó efecto alguno ya que los callos
mostraron un desarrollo normal llegando hasta la regeneración de plántulas in
vitro. En un segundo ensayo se aumentó el rango de concentración del agente,
además de forma simultánea se realizó un experimento control utilizando las
mismas concentraciones de herbicida en hojas de tabaco para verificar la
actividad de éste en el medio. A partir de la primera semana se observaron
altos índices de letalidad en las hojas de tabaco, a diferencia de las hojas
control donde la apariencia era saludable y el desarrollo fue notorio,
corroborándose así, la actividad del herbicida sobre el tejido (Figura 17). De
igual manera, al elevar las concentraciones se pudo evaluar el porcentaje de
sobrevivencia en los explantes de A. tequilana, observándose en las primeras
semanas de exposición de los callos al medio con el herbicida notorios índices
de necrosamiento. Sin embargo, a partir de la concentración de 2 mg/l de ppt,
la sobrevivencia fue importante (29%), y conforme aumentó la concentración
del herbicida esta se vio disminuida hasta llegar a 0 % (4 mg/l de ppt), por lo
que se seleccionó esta concentración como dosis letal mínima (Figura 18).
Para llevar a cabo una segunda selección en plantas ya adaptadas en
invernadero, se utilizó el herbicida ppt en su forma comercial (BASTA), al igual
67
que en los ensayos in vitro, con las primeras dosis utilizadas (0.25, 0.5, 1 y 2 %
v/v), no se observó ningún daño en las hojas de las plantas de agave. Se
decidió aumentar la dosis hasta 16 % v/v, de esta forma a la primera semana
de exposición se pudo observar el necrosamiento en las hojas a partir de la
concentración de 4%. Después de transcurrido el mes y de completar la
evaluación se determinó que 8% (v/v) era una concentración adecuada para
seleccionar plantas de agave trasformadas con el gen bar (confiere resistencia
a fosfinotricina) ya que a concentraciones menores el daño en las plantas no
era total (Figura 19). Tomando en cuenta que las dosis comerciales
recomendadas para el control de malezas se encuentran generalmente por
arriba del 1 % v/v del producto, las plantas de agave mostraron ser resistentes
a concentraciones del herbicida hasta 4 veces mayores.
En contraste con los resultados obtenidos para el antibiótico kanamicina, las
dosis determinadas para el herbicida fosfinotricina tanto in vitro como para
plantas en invernadero fueron similares a las reportadas por Santacruz-
Ruvalcaba (2001), donde reporta 3 mg/l de ppt para seleccionar callos
embriogénicos y 6% v/v de BASTA para plantas en invernadero. Para la
selección in vitro utilizando 3 mg/l de ppt se observaron todavía pequeños
índices de sobrevivencia (Figura 18), sin embargo se debe tomar en cuenta
que en este trabajo se evaluaron callos organogénicos y Santacruz-Ruvalcaba
trabajó callos embriogénicos.
E. Ensayos de transformación vía Agrobacterium tumefaciens 1. Incorporación de plásmidos en cepas de Agrobacterium
Las cepas de Agrobacterium tumefaciens LBA4404 transformadas con los
plásmidos pBI121, p35SGUS y pBINGFP mediante congelamiento con N2
líquido crecieron satisfactoriamente en medio de selección, lo que indicó que
contenían el plásmido transferido, sin embargo utilizando el método de cruza
triparental (Ditta y col., 1980), no fue posible recuperar colonias resistentes, a
pesar de ser este un método sencillo y ampliamente utilizado para transferir
plásmidos binarios recombinantes a células de A. tumefaciens. Para corroborar
la incorporación de los plásmidos en la bacteria, se llevó a cabo un análisis tipo
68
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 25 50 100 200
% de sobrevivencia
Concentración de kanamicina mg
1.3c 9.0
c
96.7 a100
a
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 25 50 100 200
% de sobrevivencia
Concentración de kanamicina mg/l
b46
Figura 16. Sensibilidad de callos de A. tequilana al antibiótico kanamicina. Valores seguidos con la misma letra no difieren estadísticamente a p= 0.05 de
acuerdo a la prueba de diferencias mínimas significativas (dms).
69
0 2.5 5
7.5 10
Figura 17. Efecto en hojas de tabaco a diferentes concentraciones del herbicida fosfinotricina (ppt) adicionado en el medio (mg/l).
70
0 1020304050
708090
100
a
b29
cc0
c0
mg/l de PPT
0 2 3 4 5
8
mg
100
60
% de sobrevivencia
Figura 18. Sensibilidad de callos de A. tequilana al herbicida fosfinotricina (ppt). Valores seguidos con la misma letra no difieren estadísticamente a p=
0.05 de acuerdo a la prueba de diferencias mínimas significativas (dms).
71
Daño: -sin daño, + mínimo, ++ abundante, +++ total
0
4
8
12
16
Plantas evaluadas
1 2 3 4 5 6 7
- - - - - - -
+ ++ + + + ++ +
+++ ++ +++ +++ +++ +++ +++
+++ +++ +++ +++ +++ +++ +++
+++ +++ +++ +++ +++ +++ +++
- - - - - - -
+ ++ + + + ++ +
+++ ++ +++ +++ +++ +++ +++
+++ +++ +++ +++ +++ +++ +++
+++ +++ +++ +++ +++ +++ +++
% BASTA (V/V)
Figura 19. Sensibilidad de plantas de A. tequilana al herbicida fosfinotricina en su forma comercial (BASTA).
72
PCR con oligonucleotidos dirigidos al gen nptII. En el DNA obtenido de las
colonias seleccionadas se logró amplificar un fragmento correspondiente al gen
nptII, que confiere resistencia al antibiótico kanamicina, demostrando asi su
transformación. En la Figura 20, se observa la banda de 617 pb que
corresponde al fragmento del gen nptII presente en las cepas analizadas, las
cuales se muestran en los carriles 1 y 2, similar al que se observa en el carril 5
que muestra una banda correspondiente al fragmento de 617 pb amplificado
directamente del DNA plasmídico (p35SGUS) utilizado como control positivo,
esta banda no se observa en el carril 4 donde se cargó el producto de la
amplificación de agua como control negativo.
2. Susceptibilidad del A. tequilana a la infección de cepas silvestres de Agrobacterium tumefaciens
La enfermedad de la agalla de la corona producida por la transferencia del T-
DNA de Agrobacterium a la célula vegetal, es un microcosmos en donde la
bacteria puede crecer y durante este proceso ocurren principalmente dos
fenómenos, consecuencia de la expresión de los genes presentes en el T-DNA:
(a) producción de enzimas que estimulan el crecimiento del tumor, y (b)
producción de opinas, que son metabolizables solamente por la bacteria
(Valentine, 2003). Para llevar a cabo los ensayos de transformación vía
Agrobacterium se evaluó la susceptibilidad de las plantas de agave a la
infección por cepas silvestres de la bacteria, como se describió en la
metodología. No se observó la formación de agallas como síntoma de la
infección de las cepas (Figura 21), posiblemente porque, el agave es una
planta monocotiledónea y se ha reportado que este tipo de plantas no son
hospederas naturales para A. tumefaciens (Vain y col., 1995; Tzfira y Citovsky,
2002; Gelvin, 2003). La ausencia de formación de tumores en plantas
monocotiledóneas puede deberse a que no producen factores fenólicos que
activan la expresión de los genes vir en el plásmido Ti, a que no se lleva a cabo
la trascripción de los oncogenes o por diferencia en la fisiología de hormonas
endógenas comparadas con las presentes en plantas dicotiledóneas (Usami y
col., 1987; Smith y Hood, 1995). Sin embargo, De Cleene and De Ley (1976),
reportaron la formación de tumores producidos como resultado de la infección
con la bacteria A. tumefaciens en la especie Agave salmiana Otto. Con estos
73
resultados no se descartó el uso de Agrobacterium como medio de
transformación para la especie tequilana, ya que se han desarrollado exitosos
sistemas de transformación, manipulando las condiciones de infección en otros
cultivos, a pesar de que estos no presentaron la formación de tumores debido a
la infección natural de A. tumefaciens, como ejemplo podemos mencionar maiz,
(Ishida y col., 1996), arroz (Chan y col., 1993; Hiei y col., 1994; Dong y col.,
1996; Rashid y col., 1996; Toki, 1997), cebada (Tingay y col., 1997) y trigo
(Cheng y col., 1997).
Otros puntos importantes a considerar en el proceso de infección con
Agrobacterium tumefaciens y a los cuales también se le puede atribuir el que
no se haya observado la formación de tumores en las plantas de Agave
tequilana, son la edad de la planta, su estado fisiológico, así como el proceso
de infección y la cepa utilizada, ya que se ha observado la influencia de estos
factores en el desarrollo de tumores en plantas dicotiledóneas sensibles a la
infección por la bacteria (Hernalsteens y col., 1984; Vain y col., 1995).
Finalmente es importante mencionar que el primer paso en el proceso de
infección mediado por Agrobacterium, es la fijación de la bacteria a la pared
celular de la planta hospedera, el cual se ve también afectado por la edad del
tejido, el tipo de células, el estado del ciclo celular, entre otros parámetro
fisiológicos (Graves y col., 1988).
3. Selección de condiciones de transformación Para determinar las condiciones óptimas para establecer un sistema de
transformación vía Agrobacterium tumefaciens, el primer parámetro evaluado
fue el daño en el explante, ya que los azúcares y compuestos fenólicos que son
liberados como consecuencia de heridas en el tejido vegetal, además de ser
una señal de oportunidad patogénica para la bacteria, también inducen la
trascripción de los genes de virulencia (vir) responsables de la transferencia e
integración del T-DNA en la célula vegetal (Valentine, 2003). Park y col., (1996)
reportan que hiriendo sistemáticamente con aguja hipodérmica un tejido
meristemático de arroz, se favoreció su transformación genética,
probablemente porque se facilitó la penetración de la bacteria en el tejido, se
74
M 1 2 3 4 5
1,018 pb506 pb
617 pb
M 1 2 3 4 5
M 1 2 3 4 5
Figura 20. Amplificación del fragmento de 617 pb del gen nptII presente en los plásmidos P35SGUS y pBIN m-gfp5-ER en cepas LBA4404 de Agrobacterium tumefaciens después de la transformación. Carril M)
Marcador 1 Kb; 1) LBA4404 con p35SGUS; 2) LBA4404 con pBIN m-gfp5-ER;
4) Control negativo; 5) Control positivo (p35SGUS).
75
A) B) C)
D) E)
Figura 21. Susceptibilidad de plantas de A. tequilana a la infeccion de natural Agrobacterium tumefaciens. A) Infección con C58; B) Infección con
H63; C) Infección con A281; D) Infección con LBA4404; E) Ensayo con agua
(control -).
proporcionó acceso a células susceptibles y la producción de componentes que
inducen la expresión de los genes de virulencia.
76
En nuestros estudios, al evaluar los diferentes tipos de daño en callos
obtenidos de tejido meristemático y de acuerdo al porcentaje de sobrevivencia,
a el efecto que tienen las heridas en el
straron que el medio de cultivo
vía Agrobacterium y difiere dependiendo de la especie. Se ha
el daño con aguja de 13 mm fue el óptimo para realizar los ensayos de
transformación, ya que éste fue el que menos efecto negativo causó a los
explantes, ya que presentaron el mayor índice de sobreviencia comparado con
los otros dos tratamientos, los cuales no mostraron diferencias significativas al
ser comparados entre ellos (Figura 22).
Se consideró el parámetro de sobrevivencia para seleccionar un método de
daño, ya que además de tomar en cuent
tejido al favorecer los fenómenos de transferencia del T-DNA, es importante
considerar que un daño excesivo en los callos podría limitar su recuperación y
como consecuencia la regeneración de brotes.
Otro de los parámetros evaluados fue el tipo de medio de cultivo bacteriano
para llevar a cabo la infección, los resultados mo
sólido fue más agresivo para el tejido, gran porcentaje de los explantes no se
pudieron regenerar, esto se atribuye a la densidad bacteriana y a la exposición
directa con el tejido. A partir de lo anterior, se decidió utilizar medio líquido de
cultivo bacteriano para realizar los ensayos de transformación. Porque de igual
forma al evaluar los índices de sobrevivencia de exposición del cultivo
bacteriano con el tejido se determinó 10 min como tiempo óptimo (Figura 23).
Tomando en cuenta que la concentración celular y el periodo de inoculación
son variables claves en la transferencia de genes mediada por Agrobacterium
(Birch, 1997), es importante destacar que el uso de tiempos de infección
prolongados y densidades bacterianas altas, puede tener efectos adversos en
el crecimiento de los callos y su subsecuente regeneración, a pesar de que los
niveles de expresión transitoria sean altos, como lo reportaron en arroz Kumria
y col., (2001).
El periodo de cocultivo es un parámetro determinante en el proceso de
transformación
observado que largos periodos muestran mayor eficiencia en la transferencia
del plásmido Ti a la célula vegetal (Kondo y col., 2000). En explantes de un
híbrido cítrico (Citrange), los niveles de expresión transitoria del gen gus A se
incrementaron conforme se aumento el periodo de cocultivo de 1 a 5 días
(Cervera y col., 1998), de manera similar Cao y col., (1998) sugieren que la
77
baja eficiencia de transformación de manzana (James and Dandekar 1991) se
debió a un periodo insuficiente de cocultivo, ya que un prolongado periodo de 2
a 4 días incrementó la expresión gus casi 100 veces (De Bond y col, 1994).
Haciendo referencia a lo anterior, en transformación genética de ajo se reportó
que con 3 o más días de cocultivo se observaron mayores niveles de expresión
transitoria comparada con 1 y 2 días respectivamente (Kondo y col., 2000). En
este sentido, en nuestros resultados observamos que en callos de A. tequilana
los mayores niveles de expresión del gen gus A se encontraron con 4 días de
cocultivo del tejido con la bacteria (Figura 24); después de este tiempo no se
observó un diferencia notoria en la expresión del gen gus A. Tomando en
cuenta lo anterior se decidió seleccionar 4 días como tiempo óptimo de
cocultivo, además de los resultados en la expresión transitoria, también se
consideró que se ha reportado que resulta más difícil eliminar la bacteria
Agrobacterium después de largos periodos de su exposición con el tejido
vegetal teniendo como consecuencia un sobrecrecimiento de la bacteria y un
decremento en la regeneración de brotes transformados (Cervera y col., 1998;
Kondo y col., 2000). En la Figura 24 también se observa una diferencia muy
marcada en cuanto a la apariencia y desarrollo de los callos expuestos a los
diferentes tiempos de cocultivo, mientras mayor fue el tiempo de cocultivo los
callos mostraron una mejor apariencia y un desarrollo más avanzado, algunos
incluso iniciando la producción de brotes. Lo anterior puede ser explicado, si
tomamos en cuenta que un periodo adecuado de cocultivo pudo permitir una
recuperación del tejido después del tratamiento de infección con la bacteria, lo
cual hizo menos agresivo el cambio a medio con antibiótico para llevar a cabo
la eliminación de la misma.
Los resultados anteriores son los primeros reportes de obtención de expresión
transitoria del gen gus A en explantes de Agave tequilana mediante su
transferencia utilizando como sistema a la bacteria Agrobacterium tumefaciens.
Hasta la fecha no se encuentra reportado en la bibliografía ningún trabajo
similar, tomando esto en cuenta es importante destacar que estos resultados
sientan las bases para el establecimiento de un sistema de transformación
genética para la planta monocotiledónea A. tequilana vía A. tumefaciens.
78
igura 22. Sobrevivencia de explantes de A. tequilana a diferentes tipos
a 100
b 73.3 b
70
Fde daño. Valores seguidos con la misma letra, no difieren estadísticamente a
p= 0.05 de acuerdo a la prueba de diferencias mínimas significativas (dms).
01 2 3 4 5 6 7 8
10 9
Control Aguja 13 mm Aguja 32 mm Partículas
a 93.3
% de sobrevivencia
79
Figura 23. Sobrevivencia de explantes de A. tequilana a diferentes
Minutos
a91.06
b71.1 b
66.76c 49 c
39
Minutos
a91.06
b71.1 b
66.76c 49 c
39
100
tiempos de exposición con el cultivo bacteriano. Valores seguidos con la
misma letra, no difieren estadísticamente a p= 0.05 de acuerdo a la prueba de
diferencias mínimas significativas (dms).
0102030405060708090
100
0102030405060708090
0 5 10 20 300 5 10 20 30
% de sobrevivencia
80
- Sin coloración+ Intensidad de coloración
1
2
3
4
5
Explantes
1 2 3 4 5
- + - + -
Días de cocultivo
- - - + -
+ + - ++ -
++ +++ + ++ ++
- +++ +++ ++ -
Control- Sin coloración+ Intensidad de coloración
1
2
3
4
5
Explantes
1 2 3 4 5
- + - + -
Días de cocultivo
- - - + -
+ + - ++ -
++ +++ + ++ ++
- +++ +++ ++ -
Control
igura 24. Expresión transitoria del gen gus A a diferentes tiempo de
. Ensayos de transformación vía biobalística
Fcocultivo de A. tumefaciens con callos de A. tequilana.
F
81
1. Selección de condiciones de transformación ave se estandarizaron las
joradas y
en los explantes de tabaco, se
de exposición
Previo a los ensayos de transformación en ag
condiciones de bombardeo con equipos de alta y baja presión, en hojas de
tabaco como sistema control. Evaluando el número de foci (manchas o puntos
azules) como producto de la expresión transitoria del gen gus A, la cual fue
considerada como una unidad de expresión (Hagio y col., 1995) se
seleccionaron como condiciones de partida 80 psi y 20 cm de distancia para el
sistema de baja presión y 900 psi y 11.5 cm para alta presión. En la Figura 25
se observan de manera abundante y homogénea los puntos azules (foci) sobre
las hojas de tabaco como producto de la reacción enzimática llevada a cabo
por la enzima β-glucuronidasa, la cual es codificada por el gen gus A.
A partir de la última década, las técnicas de biobalística han sido me
utilizadas de manera tal que podrían ser extrapoladas a cualquier tipo de tejido
y especie vegetal (Christou, 1992; Sanford y col., 1993; Takumi y Shimada,
1996; Kim y Minamikawa, 1997). Es indispensable el establecimiento de las
condiciones de bombardeo a fin de obtener valores promedio entre células
muertas y el menor daño posible, lo cual se ve reflejado en los niveles de
expresión del transgen y la consecuente recuperación del plantas transgénicas
(Gordon-Kam y col., 1990; Kauch y col., 1995).
Tomando como base los resultados observados
hicieron evaluaciones de la expresión transitoria del gen gus A utilizando
diferentes condiciones de bombardeo, como tiempo de exposición al medio
osmótico, presión de bombardeo, distancia y concentración de DNA, lo que
permitió obtener los siguientes resultados.
Para el medio osmótico, primero se evaluaron diferentes tiempos
del medio con los explantes previo al bombardeo. Se registro el número de
explantes que presentaban foci, así como el número de foci en cada explante
para cada uno de los tratamientos evaluados. Al llevar a cabo la comparación
estadística de los resultados, nos permitió seleccionar 4 horas como tiempo
óptimo de exposición, ya que fue el que mostró una diferencia significativa con
respecto a los otros tratamientos (Tabla 11). Sin embargo esta diferencia se vio
influenciada por la disminución de la concentración del DNA plasmidico
utilizado, ya que al variar el tiempo de exposición utilizando 1 µg/µl, no se
observó diferencia significativa en cuanto a los niveles de expresión en los dos
82
tratamientos, contrastantemente a lo que se observó cuando se utilizó 0.1 µg/µl
(Tabla 11), por esta razón se llevó a cabo una evaluación posterior de la
concentración del DNA en los dos plásmidos utilizados.
La expresión tanto transitoria como estable se ve mejorada al aplicar un
e los parámetros evaluados fueron la distancia y la presión, la
bserva en la Tabla 12, al bombardear callos con el sistema de baja
de manera
concentración del DNA sobre la expresión transitoria
tratamiento osmótico, ya que se reduce el daño celular al prevenir la extrusión
del protoplasma de las células bombardeadas y de esa manera se
incrementan las posibilidades de sobrevivencia celular, este estado
plasmolizado debe ser mantenido por algunas horas antes y después del
bombardeo para que sea mas efectivo (Vain y col., 1993; Yang y Christou,
1999).
Otros d
evaluación se realizó de forma conjunta para ambos sistemas (alta y baja
presión).
Como se o
presión se observaron diferencias en los índices de expresión transitoria del
gen gus A con las diferentes combinaciones de presión y distancia. El mayor
número de foci, se observó utilizando 20 cm de distancia combinada con 80 y
90 psi de presión. Tomando en cuenta estos resultados se seleccionaron las
condiciones 80 psi de presión y 20 cm como óptimas para la expresión
transitoria del gen gus A en callos de Agave tequilana (Tabla 12).
Los niveles de expresión transitoria no se incrementaron
proporcional al incremento de la presión, esto es similar a lo reportado por Stiff,
(1995), de igual manera Santacruz-Ruvalcaba reportan un comportamiento
similar en callos embriogénicos de Agave tequilana bombardeados. Si bien
altos índices de expresión transitoria no garantiza un alto índice de
transformación estable, si establece condiciones a seguir para conseguir este
tipo de transformación.
Se evaluó el efecto de la
en los dos plásmidos pBI426 y pAHC25, y se determinó que la concentración
del plásmido, así como el tipo tienen una influencia directa sobre la expresión
transitoria del gen gus A en callos de agave. Se observaron diferencias
significativas al disminuir la concentración de ambos plásmidos, sin embargo
esta diferencia fue más notoria en los ensayos realizados con el plásmido
pBI426 al aumentar arriba del doble el número de foci contabilizados (Tabla
83
13). Al comparar todos los tratamientos evaluados se determinó que el nivel
más alto de expresión transitoria del gen gus A se observó con el plásmido
pAHC25 en 0.1µg/µl de concentración (Tabla 13). Tomando en cuenta lo
anterior, es importante cuestionar la influencia de la concentración de DNA del
plásmido en la expresión del gen gus A; ya que esta puede estar también
influenciada por el tipo de promotor bajo el cual esté regulado el gen reportero
y el tamaño del plásmido. En este sentido los índices de expresión transitoria
obtenidos con el plásmido pAHC25 fueron ligeramente mayores comparados
con el plásmido pBI426, esto se debe probablemente a que en el plásmido
pAHC25 el gen gus A esta regulado por un promotor de tipo especifico para
monocotiledóneas (Ubi) y el Agave tequilana es una planta perteneciente a
este grupo, mientras que el otro plásmido contiene un promotor constitutivo
(35S). Al igual que en otros trabajos de transformación genética de
monocotiledóneas el uso de promotores específicos para este tipo de plantas
ha resultado en mayores niveles de expresión comparados con el uso de
promotores constitutivos (Taylor y col., 1993; Sági y col., 1995). Santacruz-
Ruvalcaba (2001), recomiendan la evaluación de promotores específicos para
monocotiledóneas con la finalidad de aumentar los niveles de transformación.
Los ensayos de expresión transitoria llevados a cabo en el sistema de alta
idos
presión, también mostraron diferencias en cuanto a los parámetros de distancia
y presión analizados. Los resultados fueron muy variados y en la mayoría de
los tratamientos los valores de expresión fueron un poco más bajos
comparados con los obtenidos con el sistema de baja presión (Tabla 11, 12, 13
y 14), a diferencia del tratamiento de 1350 psi de presión y 12 cm de distancia
el cual mostró valores muy altos de expresión (Tabla 14). En este sentido se
seleccionaron tales condiciones como óptimas para llevar a cabo la expresión
transitoria en callos de A. tequilana. Esto es diferente a las selecciones
determinadas por Santacruz-Ruvalcaba (2001) en la transformación de callos
embriogénicos de A. tequilana (800 psi de presión y 7 cm de distancia),
quienes reportan la obtención de una media de 5.9 foci por 25 mg de callo.
De manera general, comparando los niveles de expresión transitoria obten
en este trabajo con trabajos similares reportados para otros cultivos incluyendo
otras monocotiledóneas (Oard y col., 1990; Bansal, y col., 1992; Kauch y col.,
1995; Sági y col., 1995 y Cruz-Hernández y col., 2000), podrían ser un poco
84
bajos a excepción de los obtenidos a 1350 psi y 12 cm, sin embargo siguen
siendo considerables, tomando en cuenta que son los primeros reportes de
expresión transitoria en este tipo de plantas, lo cual abre de manera importante
la posibilidad de seguir variando condiciones para lograr aumentar estos
niveles y de igual manera favorecer la transformación estable.
En las Figuras 26 y 27, se observa la expresión gus A en los callos de A.
nte mencionar que se llevaron a cabo ensayos de expresión
tequilana bombardeados con baja y alta presión respectivamente, es notoria la
diferencia entre ambos sistemas en cuanto a la apariencia de los foci. En los
bombardeos con el sistema de baja presión los foci, se observan como
manchas dispersas y menos definidas (Figura 26), contrario a los
bombardeados con el sistema de alta presión donde se muestran como puntos
pequeños y bien definidos (Figura 27). Lo anterior puede deberse a que la
dispersión de las partículas es diferente en ambos sistemas; en el sistema de
baja presión no se logra una buena dispersión observándose conglomerados
de partículas de tungsteno a diferencia con en el sistema de alta presión,
donde el mecanismo permite una dispersión mas homogénea de ellas; esto se
corroboro en ensayos de bombardeo hechos sobre papel filtro con ambos
sistemas.
Es importa
transitoria en los callos de Agave tequilana utilizando el gen gfp como reportero
tanto con el sistema de biobalística como vía Agrobacterium tumefaciens,
tomando en cuenta la ventaja que tiene el uso del gen gfp de la proteína verde
fluorescente como gen reportero, ya que su monitoreo no requiere la
destrucción del tejido. Pese a esto los resultados no pudieron ser evaluados en
ninguno de los dos sistemas, ya que no se pudo observar la fluorescencia de la
proteína producto de la expresión del transgen. El color verde de los callos de
A. tequilana es muy intenso lo cual indica el alto contenido de clorofila,
tomando esto en cuenta probablemente al incidir la lus uv a los callos, la
clorofila presente en el tejido se confundió con la posible fluorescencia de la
proteína. Cabe mencionar que no se debe descartar el uso de este gen
reportero para trabajos posteriores de transformación en esta especie, ya que
seria importante evaluar diferentes tejidos como fuente de explante para este
tipo de trabajos, los cuales no interfirieran con el monitoreo de la proteína.
85
igura 25. Expresión del gen gus A en explantes de tabaco. El tabaco se
Futilizó como sistema control.
86
Tabla 11. Efectos de la exposición al medio osmótico (sorbitol 15%) en la expresión transitoria del gen gus A. Se utilizó el plásmido pAHC25 (80 psi a 20 cm).
* Promedio de 10 explantes por bombardeo con 3 repeticiones. Valores
seguidos con la misma letra no difieren estadísticamente a p= 0.05 de acuerdo
a la prueba de diferencias mínimas significativas (dms).
Tiempo de exposición
(horas)
Concentración de DNA ( µg/µl)
*Número de explantes
GUS positivo
Número de
foci promedio por
explante
4
4
39 b
1
4 0.1
4.5
59 a
8
1
2.5
33 b
8 0.1
3.5
37 b
87
Tabla 12. Efectos de la distancia y presión en explantes de Agave
tequilana bombardeados con el plásmido pAHC25 utilizando el sistema de baja presión.
Distancia
(cm) Presión
(psi)
Número de explantes
GUS positivo
Número de promedio de foci por explante
17.5
80 90 100
5 9 8
12 bc 9 b
10 b
20
80 90 100
7 9 1
27 a
12 ab 1 d
22.5
80 90 100
9 7 1
9 b 8 c 2 d
* Promedio de 10 explantes por bombardeo con 3 repeticiones. Valores
seguidos con la misma letra no difieren estadísticamente a p= 0.05 de acuerdo
a la prueba de diferencias mínimas significativas (dms).
88
Tabla 13. Efecto de la concentración de DNA de los plásmidos pAHC25 y pBI426 en la expresión transitoria del gen gus A. Bombardeos a 80 psi de presión y 20 cm de distancia.
Plásmido
Concentración de DNA (µg/µl)
Número de explantes
GUS positivo
Número
promedio de foci por explante
pAHC25
1
4
47 b
pAHC25
0.1
6.5
52 a
pBI426
1
4.6
18 c
pBI426
0.1
3.3
44 b
* Promedio de 10 explantes por bombardeo con 3 repeticiones. Valores
seguidos con la misma letra no difieren estadísticamente a p= 0.05 de acuerdo
a la prueba de diferencias mínimas significativas (dms).
89
Figura 26. Expresión transitoria del gen gus A en callos de Agave
tequilana bombardeados con el sistema de baja presión.
90
Tabla 14. Expresión transitoria del gen gus A a diferentes presiones y distancias utilizando el sistema de alta presión.
Distancia
(cm) Presión
(psi)
Número de
explantes GUS positivo
Número de promedio de
foci por explante
9
450 900
1350
2 2 4
3 d 7 c 10 b
12
450 900
1350
0 3 8
0 e 15 b
106 a
15
450 900
1350
0
2.5 1
0 e 8 c 6 d
* Promedio de 10 explantes por bombardeo con 3 repeticiones. Valores
seguidos con la misma letra no difieren estadísticamente a p= 0.05 de acuerdo
a la prueba de diferencias mínimas significativas (dms).
91
Figura 27. Expresión transitoria del gen gus A en callos de Agave
tequilana bombardeados con el sistema de alta presión.
92
G. Selección de transformantes
Los ensayos de transformación estable vía Agrobacterium y biobalística en
callos de Agave tequilana se realizaron con las siguientes condiciones
seleccionadas a partir de los experimentos de expresión transitoria:
Agrobacterium tumefaciens Daño con aguja de 13 mm, 10 min de exposición con cultivo líquido
concentrado de la bacteria (+100 µM de acetocyringona), 4 días de cocultivo y
eliminación de la bacteria en medio con 500 mg/l de cefotaxima.
Biobalística Tratamiento de 4 horas en medio con 15% de sorbitol previo al bombardeo, 80
psi de presión a una distancia de 20 cm utilizando el sistema de baja presión y
1350 psi de presión y 12 cm de distancia para el sistema de alta presión y 48
horas en oscuridad para la recuperación del tejido.
Después de realizar los eventos de transformación los explantes fueron
sometidos al sistema de selección correspondiente.
En los ensayos de transformación estable vía Agrobacterium, al colocar los
callos en medio de regeneración MS1 suplementado con 100 mg/l del
antibiótico kanamicina como dosis de preselección, lograron sobrevivir varios
explantes, sin embargo al llevar a cabo la segunda ronda de selección (200
mg/l) estos explantes mostraron índices severos de oxidación y no fue posible
regenerar ningún material resistente a la selección con el antibiótico. Lo
anterior pudo deberse a que no se llevó a cabo una integración de los genes,
probablemente el mecanismo de transferencia se realizó en las células
superficiales del tejido; tomando en cuenta esto es necesario evaluar otros
tratamientos de daño que permitan una difusión más profunda de la bacteria.
El hecho de no haber seleccionado materiales de A. tequilana transformados
vía Agrobacterium tumefaciens, no descarta la posibilidad de que se llegue a
lograr con éxito este proceso, ya que los resultados en cuanto a la expresión
transitoria del gen gus A discutidos anteriormente, demuestra al menos la
presencia del gen al tejido vegetal mediante este método. En este sentido es
importante evaluar en trabajos posteriores variantes en las condiciones de
infección y cocultivo, así como otras cepas de Agrobacterium que presenten
93
más virulencia, todos estos factores han demostrado favorecer la
transformación genética en otras plantas monocotiledóneas.
En los ensayos mediante biobalística (baja presión) se lograron seleccionar
callos bombardeados con ambos plásmidos pAHC25 y pBI426, en medio MS1
de regeneración suplementado con 4 mg/ de ppt o 100 mg/l de kanamicina
respectivamente. Al llevar a cabo la segunda ronda de selección con ambos
agentes, sólo sobrevivieron los callos bombardeados con el plásmido pBI426
(Figura 28), los cuales mostraron una apariencia sana e inicios de brotación
durante los subcultivos en presencia de 200 mg/l del antibiótico kanamicina.
De un total de 150 callos bombardeados con el plásmido pBI426, se lograron
seleccionar solo 12 las cuales fueron designadas como B1 hasta B12, lo que
nos da un 8% de eficiencia de transformación en cuanto a la selección,
utilizando el sistema de baja presión.
Con alta presión, también se regeneró material bombardeado con el plásmido
pBI426 (Figura 29).
De un total de 250 explantes bombardeados se seleccionaron 22 designadas
A1 hasta A22, resultando un 8.8% similar a los obtenidos con el sistema de
baja presión.
En los resultados obtenidos en la selección de material transformado es notorio
que los niveles de expresión transitoria no fueron correspondientes a los
índices de material seleccionado, ya que al comparar los índices de expresión
transitoria entre los plásmidos pAHC25 y pBI426, la expresión fue mas alta
utilizando el primero (Tabla 12), probablemente eso de deba a la diferencia en
tamaño, ya que la integración solo se logro con el plásmido de menor tamaño
(pBI426).
Como se ha reportado, la expresión transitoria de un gen es relativamente fácil
de producirse, sin embargo la recuperación de transformantes estables se
presenta en porcentajes muy bajos (Russell y col., 1992).
Tomando en cuenta que el porcentaje de recuperación de callos en el proceso
de selección es considerable, esto no es garantía de que se conserve este
porcentaje de manera estricta en su evaluación molecular.
94
Figura 28. Selección de callos transformados mediante biobalística (Sistema de baja presión).
95
Figura 29. Selección de callos transformados mediante biobalística (Sistema de alta presión).
96
H. Análisis moleculares 1. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) Los materiales sobrevivientes a la selección, que fueron bombardeados
mediante ambos sistemas (baja y alta presión), se analizaron mediante PCR,
para corroborar la presencia de los transgenes. En la Figura 30 se observa en
los carriles 5 y 6 la amplificación de un fragmento de 617 pb correspondiente al
gen nptII, en dos de las muestras seleccionadas como posibles candidatas que
fueron transformadas con el plásmido pBI426 mediante biobalística (B3 y B7).
De manera similar en la Figura 31, se muestra la amplificación de un fragmento
de 1500 pb correspondientes al gen gus A en DNA genómico obtenido de las
mismas muestras anteriores (B3 y B7).
Las 22 muestras (A1-A22) de DNA genómico obtenidas de los callos
transformados con alta presión y que sobrevivieron al sistema de selección
durante un mes, también fueron analizadas molecularmente y de estos solo se
logro la amplificación del fragmento correspondiente al gen gus A en 7 de las
candidatas (A3, A5, A8, A9, A15, A19 y A20).
La presencia de estos fragmentos de manera preliminar sugiere que los
materiales de donde se obtuvo el DNA es transgénico. Y como se menciono
anteriormente los porcentajes de selección no fueron correspondientes a los
obtenidos mediante el análisis PCR.
Todas las muestras anteriores fueron evaluadas posteriormente mediante un
análisis tipo Southern blot para confirmar la integración del gen.
2. Análisis tipo Southern blot Para confirmar la integración del transgen producto de la transformación
estable en los callos de Agave tequilana, se realizo un análisis tipo Southern
blot en las nueve muestras de DNA genómico que dieron positivo al análisis
PCR (B3, B7, A3, A5, A8, A9, A15, A19 y A20). Como se puede observar en la
Figura 32 que muestra el autoradiograma obtenido en la hibridación con las
muestras, en el carril 2 se observa la señal positiva correspondiente a la
hibridación de la sonda (gus A) con el plásmido pBI426 utilizado como control
positivo, de manera contraria en el carril 3 no se observa señal de hibridación
con el DNA de A. tequilana sin transformar. En los carriles 6, 8, 9 y 10 se
97
observan bandas de diferentes tamaños productos de la hibridación de la
sonda con el DNA de las muestras A8, A15, A19 y A20, de manera similar en el
carril 11 se observan también señales positivas que corresponden a la muestra
B7 (Figura 32). Tomando en cuenta los diferentes tamaños de señales
observadas en el autoradiograma se puede estimar la integración de al menos
de 1 a 4 copias en las diferentes muestras positivas. Los niveles de expresión
del transgen en plantas es generalmente impredecible, esto se debe
principalmente al número de copias y/o el sitio de integración, sobre todo
plantas transgénicas generadas mediante biobalística las cuales presentan
patrones de integración que son generalmente complejos debido al propio
mecanismo de integración del sistema sobre el cual no se tiene un control
directo (Finnegan y Mc Elroy, 1994; Hansen y Wright, 1999).
Los resultados obtenidos en este último análisis nos permite demostrar la
integración estable de genes en el genoma nuclear de células de callos
organogénicos de Agave tequilana, mediante el uso de biobalística.
De manera general con los resultados de la hibridación nos permitió corroborar
aquellos obtenidos por PCR, ya que de las 9 muestras analizadas que
presentaron amplificación del transgen, en 5 de ellas se confirmo su naturaleza
transgénica.
Tomando en cuenta el número total de callos bombardeados con cada uno de
los sistemas y el número que resultaron positivos en el análisis Southern blot,
la eficiencia de transformación para el sistema de baja presión es de 0.6 y para
alta presión de 1.66.
El uso de la técnica de biobalística para la transferencia de genes en Agave
tequilana, nos produjo resultados satisfactorios. Lo que nos confirma la
universatilidad de esta técnica en cuanto al rango de hospederos susceptibles
de transformación, además de permitir el uso de más de un plásmido, ya que
se puede lograr la expresión de múltiples genes (Ellis y col., 1993; Hadi y col.,
1996).
Cabe resaltar que este trabajo es el primero en llevar a cabo la evaluación de
diferentes técnicas de transformación genética en Agave tequilana, lo que
establece bases para desarrollar futuras investigaciones con la finalidad de
modificar genéticamente este cultivo ya sea para transferirle características
especificas o bien para su estudio.
98
1 2 3 4 5 6
617 pb 500 pb 650 pb
Figura 30. Amplificación del fragmento de 617 pb del gen npt II en materiales de A. tequilana regenerados en medio de selección. Carriles
1) Marcador de peso molecular de 1Kb; 2) Control negativo (agua); 3) DNA
de A. tequilana sin transformar; 4) Control positivo plásmido pB1426; 5 y 6)
Muestras de candidatas B3 y B7 respectivamente.
99
1 2 3 4 5 6
1500 pb 1,650 pb 1,000 pb
Figura 31. Amplificación del fragmento de 1500 pb del gen gus A en materiales de A. tequilana regenerados en medio de selección. Carriles
1) Marcador de peso molecular de 1Kb; 2) Control negativo (agua); 3) Control
positivo plásmido pB1426; 4 y 5) Muestras de candidatas B3 y B7
respectivamente; 6) DNA de A. tequilana sin transformar.
100
1000 pb
1,650 pb
5,000 pb 2,000 pb
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Figura 32. Análisis Southern blot con el gen gus A en el DNA de callos desarrollados en medio de selección. Carriles 1) Marcador de peso
molecular de 1Kb; 2) Control positivo (plásmido); 3) Control negativo (DNA de
agave sin transformar); Carriles 4, 5, 6, 7, 8, 9 y 10) A3, A5, A8, A9, A15,
A19 y A20; Carriles 11 y 12) B3 y B7.
101
VII. CONCLUSIONES
1)
stablecer un sistema de cultivo in vitro con
capacidad de regeneración.
2)
das in vitro fue sencillo y con excelente porcentaje de
sobrevivencia.
3)
no permite la producción de embriones con
capacidad de germinación.
4)
ca producción de
callo pero con alta capacidad de formación de brotes.
5)
de explantes que puede manipularse para
transformación genética.
6)
r la
regeneración de brotes transformados vía organogénesis indirecta.
El tejido meristemático de hijuelos de un año de edad de Agave
tequilana fue adecuado para e
El proceso de transferencia a suelo y aclimatación de plantas de A.
tequilana regera
El uso de segmentos de hojas de plántulas de A. tequilana enraizadas in
vitro y tratadas con 2,4-D,
El corte longitudinal del meristemo de plántulas de A. tequilana
enraizadas in vitro generó explantes con alta producción de tejido no
diferenciado (callo) pero con baja capacidad de formación de brotes
(CFB). Opuestamente, el corte transversal, generó po
El uso de altas concentraciones de auxinas permitió cultivar y propagar
in vitro callos organogénicos de A. tequilana con capacidad regenerable;
sto brindó una fuente
Los mayores índices de capacidad de formación de brotes (CFB) en el
mantenimiento del estado de callo los presentaron los tratamientos con
NAA solo o 2,4-D con BAP. En los experimentos de transformación, esta
propiedad los hizo más adecuados como tejido blanco para asegura
102
7)
abo una doble selección en plantas
transformadas con el gen bar.
8)
para el desarrollo de protocolos de transformación mediante
esta vía.
9)
A. tequilana bombardeados mediante sistemas de alta y
baja presión.
10)
n
embargo, la integración de los genes sóo se logró en el segundo caso.
11)
blot se
confirmó la integración de los transgenes en el genoma vegetal.
12)
emas de baja y alta presión fueron 0.6 y 1.66
respectivamente.
El medio de regeneración suplementado con 100 mg/l (preselección) y
200 mg/l (segunda selección) del antibiótico kanamicina o 4 mg/l del
herbicida fosfinotricina, permitió seleccionar callos de Agave tequilana
transformados con los genes de selección nptII y bar respectivamente.
De igual manera el uso de una concentración de 8 % v/v del herbicida
fosfinotricina en su forma comercial (BASTA) sobre hojas de plantas de
agave, permitirá llevar a c
Tomando en cuenta que las plantas de A. tequilana no mostraron
susceptibilidad a la infección natural de cepas silvestres de
Agrobacterium tumefaciens, se cuenta con un sistema de expresión
transitoria para el gen gus A en este cultivo, sentando de esta manera
las bases
Se obtuvieron niveles aceptables de expresión transitoria del gen gus A
en callos de
Los niveles de expresión transitoria del gen (gus A) fueron mayores con
el promotor de la ubiquitina de maíz (específico de monocotiledóneas)
que con el promotor del virus del mosaico de la coliflor (constitutivo). Si
Mediante el sistema de biobalística, tanto de alta como de baja presión
y usando el plásmido pB1426, se logró obtener material seleccionado al
cual mediante análisis moleculares de tipo PCR y Southern
Las eficiencias de transformación obtenidas mediante biobalística
utilizando los sist
103
13) Este es el primer reporte de cultivo de callos organogénicos y de
evaluación de diferentes métodos de transformación genética en Agave
tequilana.
104
VIII. PERSPECTIVAS
Los resultados obtenidos en este estudio dejan abierta la posibilidad para
trabajos posteriores que permitan la manipulación genética del agave azul y
que en un momento dado puedan favorecer y/o proteger su cultivo. Por un
lado, manipulando genes que medien su resistencia a bacterias u hongos que
son los principales agentes de enfermedades en este cultivo; ya se han
reportado con éxito trabajos similares en otros cultivos. Por otro lado, sería muy
conveniente acortar su ciclo de desarrollo ya que el periodo de maduración de
esta planta es muy largo; esto quizá podría lograrse con la expresión de genes
claves en las rutas metabólicas implicadas en el desarrollo como es la ruta de
giberelinas la cual se ha manipulado con éxito acortando el tiempo de
crecimiento en algunas especies leñosas.
Otro punto clave a considerar es la manipulación del contenido de azúcares
que puede realizarse mediante la sobreexpresión de enzimas implicadas en
esta ruta. Finalmente el agave podria ser una planta atractiva como productor
de compuestos de alto valor (e.g. farmacéutico o nutracéutico) debido a su
adaptación a condiciones extremas sobre todo de sequia, tomando en cuenta
que uno de los principales problemas que atraviesa la humanidad es la falta de
agua.
Otra de las ventajas que ofrece el uso de sistemas de transformación, es que
permitiría llevar a cabo estudios de la fisiología del agave mediante la
generación de mutantes por inserción.
Finalmente tomando en cuenta que éste es el primer reporte de transformación
de una especie del género Agave, tal información podría servir de base para
trabajos similares en otras especies importantes del género en nuestro país
como son las especies mezcaleras y pulqueras, entre otras.
Es importante no dejar de lado la relevancia que estas plantas han tenido
desde los inicios de nuestra cultura y todas las bondades que nos ofrecen, para
seguir llevando a cabo estudios que permitan conocer más acerca de ellas y
aprovecharlas de manera más eficiente y ecológicamente amigable.
105
IX. BIBLIOGRAFÍA
Bansal, K. C.; Viret, J. F.; Haley, J.; Khan, B. M.; Schants, R. y L. Bogard. 1992.
Transient expression from cab-m1 and rbcS-m3 promoter sequences is
different in mesophyll and bundle sheath cells in maize leaves.
Proceedings of the National Academy of Sciences of the U. S. A.
89:3654-3658.
Beck, E.; Ludwig, G.; Auerswald, E. A.; Reiss, P. y H. Schaller. 1982.
Nucleotide sequence and exact localization of the neomycin
phosphotransferase gene from transposon Tn5. Gene 19:327-336.
Bevan, M. 1984. Binary Agrobacterium vectors for plant transformation. Nucleic
Acids Research 12:8711-8721.
Binh, L. T.; Muoi, L. T.; Oanh, H. T. K.; Thang, T. D. y D. T. Phong. 1990.
Rapid propagation of Agave by in vitro tissue culture. Plant Cell,Tissue
and Organ Culture 23:67-70.
Birboim, H. C. y J. A. Doly. 1979. A rapid alkaline extraction procedure for
screening recombinant plasmids. Nucleic Acids Research 7: 1513-1523.
Birch, R.G. 1997. Plant transformation: Problems and strategies for practical
application. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular
Biology 48:297-236.
Bye, B. R. 1994. Usos tradicionales de los Agaves en México. Primer
Simposium Internacional sobre Agaváceas. Instituto de Biología. UNAM.
México, D.F. pp. 21-22.
Cao, X.; Liu, Q.; Rowland, L. J. y F. A. Ammerschlag. 1998. GUS expression in