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Desarrollo de mtodos de diagnstico para la
Piroplasmosis equina y su uso en animales de campo
Trabajo de tesis para optar al grado de
Doctor en Biologa Molecular y Biotecnologa de la
Universidad Nacional de General San Martn
Tesista: Gustavo Daniel Asenzo
Direccin: Mnica Ofelia Jacobsen de Florin Christensen
Co-Direccin: Silvina Wilkowsky
Instituto de Virologia, CICV y A, INTA Castelar
Junio de 2009
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1. Resumen
La Piroplasmosis equina es una enfermedad producida por dos protozoos Apicomplexa: Theileria
equi y Babesia caballi, transmitidos por garrapatas. En el equino invaden los eritrocitos provocando
anemia durante la fase aguda de la enfermedad. En nuestro pas, los datos de prevalencia encontrados
en la bibliografa son escasos y realizados con mtodos poco sensibles.
Argentina posee una industria hpica importante, exportando caballos para deportes a varios pases
de Europa. Al ser nuestro pas endmico para la piroplasmosis equina, los exportadores deben
entregar una certificacin de que los caballos estn libres de la enfermedad. En la actualidad esta
certificacin se realiza por medio de un cELISA individual para cada uno de estos parsitos.
En este trabajo de Tesis, se desarroll un ELISA indirecto para la deteccin de anticuerpos contra
cada uno de estos protozoos con valores de lo suficientemente altos como para considerarlos tiles
para el empleo en estudios epidemiolgicos. Asimismo, estos ensayos tienen potencial para su futura
utilizacin para las certificaciones necesarias para la exportacin de equinos.
Por otro lado, se realizaron 4 sondeos preliminares de Theileria equi y 3 sondeos para B. caballi para
el diseo de futuros estudios epidemiolgicos.
Se utiliz un nuevo anticuerpo IgY de huevo anti-IgG equinas conjugado a peroxidasa, elaborado en
nuestro Instituto, con resultados positivos que permitirn su utilizacin en una futura validacin de
los mtodos desarrollados en esta Tesis.
Se comprob la presencia de B. bovis en equinos de nuestro pas, confirmando a estos animales
como reservorios de este parsito.
De igual manera, se encontraron equinos positivos a Babesia bigemina, siendo este el primer reporte
de la presencia de este parsito en caballos.
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Por Marta y Rodolfo
Con Eugenia
Para Camila y Matas
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INDICE
1. Resumen........2
Indice de secciones.......3
2. Introduccin.....6
2.1. Generalidades de la piroplasmosis equina....6
2.2. Antecedentes histricos6
2.3. Distribucin geogrfica.7
2.4. Importancia de la piroplasmosis equina en Argentina..8
2.5. Clasificacin filogentica..9
2.6. Transmisin.10
2.7. Ciclo de vida ..13
2.8. Patognesis .....16
2.9. Patologa.........18
2.10. Diagnstico.......18
2.11. Inmunidad ........21
2.12. Tratamiento.......22
2.13. Prevencin................23
2.14. Equinos como resevorios de Babesia bovis y Babesia bigemina.....24
2.15. Hiptesis de trabajo...25
2.16. Objetivos del trabajo.....25
3. Materiales y mtodos .27
3.1. Anlisis bioinformtico...27
3.1.1. Seleccin in silico de regiones de los genes ema-1 y ema-2
de Theleria equi y rap-1 de Babesia caballi para la produccin
de pptidos recombinantes....27
3.1.2. Bsqueda de genes de T. equi codificantes para posibles
nuevos antgenos de diagnstico......28
3.1.3. Diseo de cebadores.29
3.2. Obtencin de muestras....30
3.3. Extraccin de ADN.31
3.4. Produccin y purificacin de formas recombinantes de antgenos
para diagnstico........33
3.4.1. Amplificacin de los genes de inters por PCR........33
3.4.2. Clonado en vector de expresin y transformacin de clulas competentes......34
3.4.3. Preparacin de clulas competentes......35
3.4.4.. Seleccin de clones positivos.......36
3.4.5. Induccin de la expresin en los clones seleccionados.....37
3.4.6. Purificacin de plsmidos.....39
3.4.7. Purificacin de protenas recombinantes.......40
3.4.7.1. Cromatografa de afinidad, buffer no desnaturalizante.......41
3.4.7.2. Cromatografa de afinidad, buffer desnaturalizante...42
3.4.7.3. Electroelucin..........42
3.5. Anlisis de antigenicidad....43
3.6. Muestreo de los animales de campo...44
3.7. cELISA para el diagnstico de Theileria equi y Babesia caballi...49
3.8. Criterios para la puesta a punto de los ELISAs..50
3.9. Determinacin del punto de corte...........53
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3.10. Anlisis de concordancia..53
3.11. Ensayo de PCR en Tiempo Real..54
3.12. Reverse Line Blot Hybridization, RLB55
4. Resultados ......59
4.1. Seleccin y produccin de antgenos..59
4.1.1. Seleccin in silico de regiones en los genes ema-1 y ema-2 de Theileria
equi y rap-1 de Babesia caballi para la produccin de pptidos recombinantes.............59
4.1.2. Bsqueda de nuevos candidatos de diagnstico para T. equi...............64
4.1.3. Produccin de formas recombinantes de los antgenos seleccionados.............70
4.1.3.1. Amplificacin por PCR de los genes de inters......70
4.1.3.2. Clonado y seleccin de clones recombinantes.73
4.1.3.3. Induccin de la expresin de las protenas recombinantes..75
4.1.3.4. Anlisis de las secuencias obtenidas...............79
4.1.4.5. Antigenicidad de los antgenos producidos.84
4.1.3.6. Purificacin de protenas recombinantes.86
4.2. ELISA indirecto (ELISAi) para T. equi..92
4.2.1. Puesta a punto de distintos parmetros del ELISAi......92
4.2.1.1. Titulacin de antgeno y suero.93
4.2.1.2. Tipo y concentracin de bloqueante...95
4.2.1.3. Concentracin de detergente....95
4.2.1.4. Temperatura de incubacin......96
4.2.1.5. Neutralizacin de los sueros....97
4.2.2. Determinacin del punto de corte.98
4.2.3. Anlisis de concordancia.....100
4.2.4. Diagnstico de Theileriosis equina en Buenos Aires, Entre Ros,
Formosa y Salta..101
4.3. ELISA indirecto para Babesia caballi..103
4.3.1. Puesta a punto del ELISAi..103
4.3.2. Determinacin del punto de corte...105
4.3.3. Anlisis de concordancia.105
4.3.4. Diagnstico de babesiosis equina en Buenos Aires, Entre Ros y Formosa...........106
4.4. Uso de un nuevo anticuerpo anti-equino conjugado a peroxidasa....106
4.5. Determinacin de co-infeccin de caballos con otros piroplsmidos...110
4.5.1. Real Time PCR....110
4.5.2. Reverse Line Blot Hybridization (RLB).....112
4.5.3. Anlisis de posibles reacciones serolgicas cruzadas.....112
5. Discusin y Conclusiones.115
6. Bibliografa125
7. Lista de abreviaturas....133
8. Agradecimientos...135
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2. Introduccin
2.1. Generalidades de la Piroplasmosis equina
La Piroplasmosis Equina es una de las enfermedades infecciosas parasitarias de caballos
ms comunes en el mundo. Los agentes etiolgicos son dos protozoos intraeritrocticos,
Theileria equi y Babesia caballi. Ambos protozoos pueden infectar a un equino en el
mismo momento. El nombre Piroplasmosis se debe a que la forma de estos parsitos al
microscopio asemeja a la de una pera. La infeccin pasa por una etapa aguda y una
crnica (Phipps 1996, Ribeiro 1999, de Waal 2004). Tambin puede haber infeccin
neonatal y causar aborto en yeguas (Heerden 1996, de Waal 2004). Caballos, burros,
mulas y cebras son susceptibles a infecciones de Theileria equi y Babesia caballi,
aunque los casos clnicos se producen principalmente en los caballos (Schein 1988,
Heerden 1996, de Waal 2004). En general, las infecciones producidas por Babesia
caballi son clnicamente leves y menos comunes que las causadas por Theileria equi
(Phipps 1996, de Waal 2004).
2.2. Antecedentes histricos
Laveran en 1901, fue el primer cientfico en describir a un parsito equino dentro de un
eritrocito al examinar con microscopio, una gota gruesa de caballos de Sudfrica. A
este microorganismo lo llam Piroplasma equi.
En 1904, Koch identific una segunda especie de Piroplasma equi, ms grande que la
descubierta por Laveran (de Waal 2004). Ms tarde, Nuttall y Strickland demostraron
que ambos parsitos eran causantes de babesiosis equina. Ellos llamaron al mayor de los
parsitos Babesia caballi y al ms pequeo Nuttallia equi. Sin embargo, como el gnero
Nuttallia ya haba sido asignado a un molusco, se lo reclasific dentro del gnero
Babesia, nombre que llev por mucho tiempo (Schein 1988).
En 1962, durante una epidemia de estos parsitos en el sur de Florida (Estados Unidos),
se demostr que la garrapata tropical del caballo Dermacentor nitens poda transmitirlos
de un animal a otro (Holbrook 1969).
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Despus de mucha controversia en los ltimos aos, por caractersticas concernientes al
ciclo de vida y estudios filogenticos, se reclasific a Babesia equi dentro del gnero
Theileria (Mehlhorn 1998, de Waal 2004, Uilenberg 2006).
En nuestro pas, el primer informe de la presencia de piroplasmosis equina fue realizado
por Bachman en 1923. No se encuentran otros informes de la enfermedad hasta 1973 y
1974, en que Ibez confirma la presencia de T. equi y de B. caballi mediante
diagnstico parasitolgico (Aguirre 2004).
2.3. Distribucin geogrfica
Al igual que otros patgenos transmitidos por garrapatas, la distribucin de T. equi y B.
caballi coincide con la distribucin geogrfica de estas ltimas. Posteriormente a los
estudios mencionados en 2.2., se comprob que estos parsitos pueden ser transmitidos
por una gran cantidad de especies de garrapatas, por lo que la distribucin de la
piroplasmosis equina es muy grande, abarcando casi todas las regiones tropicales y
subtropicales del planeta (Donnellan 2003, de Waal 2004).
Sin embargo, Gummow ha informado la falta de correlacin entre la prevalencia de la
babesiosis equina y la distribucin de garrapatas en el sur de frica (Gummow 1996), lo
que podra estar indicando otros tipos de transmisin.
Se han reportado hallazgos de T. equi y B. caballi en Espaa (Camacho 2005), Portugal,
Francia, Blgica, Polonia, gran parte de la antigua URSS (Joyner 1981) e Italia (Schein
1988, de Waal 2004). Asimismo, se han encontrado en Asia (Donnelly 1980), donde
hubo estudios recientes en China (Xu 2003) y en Mongolia (Boldbaatar 2005); y en
Medio Oriente (Hailat 1997). Del mismo modo, se distribuyen ampliamente en frica
(Gummow 1996, Heerden 1996, de Waal 2004). Se ha informado su presencia en el
Caribe (Rampersad 2003), Amrica Central (Holbrook 1968, Carbrey 1971 ) y en todos
los pases de Amrica del Sur (Ribeiro 1999).
Se estima que slo el 10% de la poblacin caballar mundial habita en regiones que estn
libres de piroplasmosis. Esto comprende solo unos pocos pases declarados ser libres de
la enfermedad: Estados Unidos, Nueva Zelanda, Canad, Europa del Norte, el Reino
Unido, Irlanda y Japn (Donnelly 1980, Phipps 1996).
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En Argentina se encuentra publicado un trabajo referido a la presencia de la enfermedad
en la localidad de Cerrillos (Salta, Argentina) (Aguirre 2004). En este artculo se hace
referencia a varios estudios de prevalencia obtenidos con anterioridad, utilizando la
tcnica de inmunodifusin en gel de agar para el diagnstico (ver Tabla 1.1).
2.4. Importancia de la piroplasmosis equina en Argentina
Segn el Censo Nacional realizado por el INDEC en el ao 2002, se estim la poblacin
equina argentina en 1.517.143 animales
(www.indec.mecon.ar/agropecuario/cna_defini.asp, cuadro 19).
La industria hpica moviliza aproximadamente de 6,7 millones de dlares por ao en
concepto de exportaciones (INDEC 2002). La Argentina es el segundo exportador
mundial de carne de caballo, detrs de los Estados Unidos. En los aos 1999, 2000 y
2001 se exportaron por ao en el orden de 30.000 toneladas de carne, por un valor de 60
millones de dlares. (Mora y Araujo 2000).
Nuestro pas ocupa actualmente el sexto lugar en el mundo en la cra de Pura Sangre de
Carrera, existiendo 11.000 caballos de esta raza en entrenamiento en los hipdromos de
San Isidro, Palermo, La Plata e hipdromos del interior del pas (Mora y Araujo 2000).
Tabla 2.1: Porcentajes de prevalencia en distintas regiones de
Argentina reportados en Aguirre 2004.
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Por su parte el polo rene aproximadamente 20.000 caballos que participan en 240
torneos anuales. La exportacin de caballos de polo ha cobrado importancia en los
ltimos aos, habindose exportado aproximadamente 15.000 caballos de polo a
diversos pases en el ao 1999 y 2000, representando un ingreso de divisas del orden de
15 millones de dlares (Mora y Araujo 2000).
La importancia que ha tomado la piroplasmosis equina en nuestro pas, se ve reflejada
en el Programa de Control y Erradicacin de las Enfermedades Equinas (Resolucin N
617/2005) que promulg la Secretara de Agricultura, Ganadera, Pesca y Alimentos en
el ao 2005. Dentro del Reglamento de Control Sanitario, cuando se refiere a
Piroplasmosis, establece en el punto 7.11.1. que La Direccin Nacional de Sanidad
Animal implementar estudios serolgicos peridicos a fin de determinar la distribucin
y prevalencia regional de la enfermedad.
Los pases libres de Piroplasmosis ante la amenaza de brotes de la enfermedad dentro de
su territorio, ponen serias restricciones al movimiento internacional de caballos. Es por
eso que es un requisito obligatorio mostrar certificados de diagnstico de piroplasmosis
que avalen la ausencia de enfermedad de todo animal que se quiera trasladar al exterior
(de Waal 1992, Friedhoff 1996). Esto constituye un importante problema veterinario en
Argentina, debido principalmente al alto valor de los mtodos de diagnstico usados
para tal fin. Actualmente la Organizacin Internacional de Sanidad Animal (OIE)
recomienda el uso de los kits Babesia equi antibody test y Babesia caballi antibody
test (VMRD, Inc.), que consisten en dos ELISAs competitivos, que deben ser
importados desde USA (ver punto 2.10)
2.5. Clasificacin filogentica
Theileria equi y Babesia caballi pertenecen ambas al super reino Eucariota; grupo
Alveolata; phylum Apicomplexa, clase Aconoidasida, subclase Piroplasmasina, orden
Piroplasmida. Luego, se diferencian, siendo T. equi un miembro de la familia
Theileriidae, gnero Theileria (Allsopp 1994) y B. caballi, miembro de la familia
Babesiidae, gnero Babesia (de Waal 2004).
Babesia equi, como se conoci por muchos aos, ha sido reclasificada como Theileria
equi (Mehlhorn 1998). Dos importantes caractersticas del ciclo de vida, marcan la
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diferencia entre estos dos protozoos y determinan la pertenencia de ambos parsitos a
sus respectivos gneros:
1. Theileria equi, como todos los miembros de ese gnero, tiene una etapa de
esquizogonia intralinfoctica en el mamfero hospedador antes de la etapa
intraeritroctica. Esto no ocurre en Babesia ssp. (Mehlhorn. 1998)
2. Babesia caballi, al igual que el resto de las Babesia ssp., en la garrapata forma
kinetos que invaden ovocitos. Por este motivo, tiene una transmisin transovrica;
caracterstica que no ocurre en Theileria ssp. (Phipps 1996, Mehlhorn 1998, Uilenberg
2006).
Adems, estudios filogenticos utilizando la secuencia de la subunidad pequea del
ribosoma (rARN) sugirieron un grupo parafiltico para T. equi (Brning 1996).
2.6. Transmisin
La transmisin de ambos protozoos se produce a travs de la picadura de una garrapata
infectada y la consiguiente inoculacin de fluidos salivales (Phipps 1996, Uilenberg
2006, Vial 2006). La garrapata slo es infectiva pocos das despus de la unin al
equino, debido a la maduracin que deben sufrir los esporozoitos dentro de la glndula
salival (Uilenberg 2006). Dependiendo de la garrapata, el perodo de incubacin vara
de 2 a 21 das (Mehlhorn 1998).
T. equi tiene solo transmisin transestadial. Es decir, cuando la larva se infecta la ninfa
es infectiva y cuando la ninfa se infecta, la garrapata adulta puede infectar (Phipps 1996,
Mehlhorn 1998, Uilenberg 2006). En B. caballi se ha visto que puede transmitirse
durante todos los estadios de Rhipicephalus evertsi evertsi y transovricamente en
Hyalomma truncatum (de Waal 2004)
Por otro lado, la infeccin puede ocurrir despus de la inoculacin de sangre infectada
en animales susceptibles. Por tal motivo, es comn la transmisin iatrognica, por el uso
de agujas o material quirrgico contaminado. Por otra parte, la transmisin mecnica
por insectos hematfagos an no ha sido demostrada (Donnellan 2003).
La infeccin de fetos equinos en el tero ha sido observada en ambos parsitos (Phipps
1996, de Waal 2004).
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Luego que un animal infectado con T. equi se recupera de la enfermedad, permanece
como portador asintomtico de por vida, lo que implica tener un permanente reservorio
del parsito para su transmisin. En estos casos solo puede diagnosticarse la infeccin
por medio de mtodos serolgicos (Schein 1988).
En general T. equi y B. caballi son transmitidas por garrapatas de la familia Ixodidae. T.
equi es transmitida por Ammblyoma cajennense, Dermacentor nitens, D. marginatus, D.
reticulatus, Hyalomma marginatum, H. uralense, H. anatolicum excavatum, H.
dromedari, Rhipicephalus bursa, R. sanguineus, R. evertsi, y R. (Boophilus) microplus
(Mehlhorn y Schein 1998). Por su parte, B. caballi es transmitida por garrapatas del
gnero Dermacentor, Hyalomma, y Rhipicephalus.
En particular, se ha comprobado que las garrapatas del gnero Dermacentor transmiten
B. caballi en Europa Central y Asia Central (Phipps 1996). Por su parte, Rhipicephalus
evertsi evertsi transmite tanto T. equi como B. caballi en frica (Heerden 1996, Phipps
1996). Tambin se ha informado que R. microplus transmite T. equi en Brasil
(Guimaraes 1998). R. bursa es vector de ambos protozoos tanto en el sur de Europa
como en Asia Menor (Phipps 1996). R. sanguineus se ha informado que transmite T.
equi y B. caballi, y R. turanicus a T. equi en el sur de frica (de Waal 2004). El gnero
Hyalomma transmite T. equi y B. caballi en el sur de Europa, Medio, Cercano y Lejano
Oriente y en frica del Norte (Phipps 1996). Hyalomma truncatum es responsable de la
transmisin transovrica de B. caballi en el sur de frica (Donnellan 2003, de Waal
2004).
En la Argentina no hay informacin de que tipo de garrapata es el principal vector de
estos parsitos, sin embargo entre las garrapatas que se acaban de mencionar, se tiene
conocimiento de su distribucin en nuestro pas para Rhipicephalus microplus, R.
sanguineus, Ammblyoma cajennense y Dermacentor nitens. La distribucin de estas
garrapatas se muestra en la Figura 1.1., junto con una foto de cada una de ellas.
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Las garrapatas, en su mayora necesitan un clima clido y hmedo para completar su
ciclo de vida. En las zonas tropicales, con lluvias regulares, alta humedad y clima
clido, se dan las condiciones ptimas para el desarrollo de varias generaciones de
garrapatas por ao, de modo que la plaga se hace sentir constantemente. En regiones
subtropicales, caracterizadas por temporadas de lluvias y sequas, la intensidad de la
plaga es fluctuante. Un aumento de infestaciones se presenta cada vez que, despus de
un perodo de condiciones climticas adversas, sobreviene una temporada calurosa y
hmeda. Es en ese momento que se produce una explosin con invasin masiva de
larvas y ninfas de garrapatas. En zonas de clima moderado, el desarrollo de las
diferentes fases se inhibe considerablemente en invierno. Sin embargo, se dan casos de
hipobiosis, (la interrupcin temporal del desarrollo de un parsito) de modo que el ciclo
evolutivo completo puede durar de uno a dos aos
(http://www.senasa.gov.ar/contenido.php?to=n&in=878&io=4547).
Desde la sancin de la ley de Polica sanitaria animal, se han desarrollado exitosas
campaas de erradicacin de R. microplus, logrando con ellas la erradicacin hasta el
lmite actual que cruza el centro de Corrientes, norte de Santa Fe y Crdoba y sur de
Santiago del Estero. Sin embargo, la situacin actual de lucha ha sufrido cambios
sustanciales con el virtual estancamiento en zonas indemnes de las provincias de
Corrientes, Entre Ros y Santa Fe. Un factor importante ha sido el incremento en la
Figura 2.1: Distribucin de Rhipicephalus microplus, R.
sanguineus, Ammblyoma cajennense y Dermacentor nitens
en nuestro pas y una foto de cada una de ellas.
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presentacin de resistencia a los plaguicidas y garrapaticidas que obliga a un cambio de
enfoque de campaa, junto a la incorporacin de nuevas opciones de control (SENASA
2009).
2.7. Ciclo de vida
Los Apicomplexa atraviesan al menos tres etapas reproductivas: gamogonia (formacin
y fusin de gametos en el interior del intestino de la garrapata.), esporogonia
(reproduccin asexual en las glndulas salivales de la garrapata) y merogonia
(reproduccin asexual en los eritrocitos del husped vertebrado) (Homer 2000). En el
caso de Theileria equi, adems, sufre una esquizogonia (reproduccin asexual en los
linfocitos del husped vertebrado)
Theileria equi:
En el equino: cuando una garrapata pica a un caballo, inocula la forma infectiva del
parsito, que es el esporozoito. Estos entran al sistema circulatorio e invaden linfocitos.
Dentro de ellos, el parsito se desarrolla primero en forma de macroesquizonte (forma
de reproduccin nuclear) y ms tarde de microesquizonte (tabicamiento de los ncleos).
Los esquizontes de T. equi pueden ser encontrados en ndulo linftico 14 das despus a
la picadura de la garrapata. Los microesquizontes contienen alrededor de 200
merozoitos, los cuales, despus de la ruptura del linfocito son liberados al torrente
sanguneo para poder invadir a los eritrocitos. (Schein 1988, Brning 1996, Uilenberg
2006). Dentro de los eritrocitos, los merozoitos se dividen por fusin binaria una o dos
veces dando lugar a dos o cuatro merozoitos (Schein 1988, Vial 2006). Una
caracterstica muy llamativa cuando ocurren dos divisiones simultneas, es que los
merozoitos resultantes forman una ttrada, unidos nicamente por su extremo apical. A
esta estructura se la conoce como Cruz de Malta, por su parecido a la insignia que
lleva ese nombre. Esta peculiaridad es usada como confirmacin de especie.
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Los merozoitos pueden invadir nuevos eritrocitos, manteniendo de esta forma un ciclo
replicativo dentro del husped (Schein 1981, Melhorn 1998). Alguno de estos
merozoitos al entrar en los eritrocitos toman una forma esfrica, asemejando una
estructura en forma de anillos similar a las que se ve en Plasmodium falciparum, por lo
que son considerados gamontes (Melhorn 1998)
La estructura de los macroesquizontes y microesquizontes es similar a las vistas en otras
especies de Theileria. Sin embargo la estructura de los merozoitos es muy variada,
pueden encontrarse desde pequeas con forma de esfera de coma que van de uno a
dos m, hasta formas ameboideas con tamao de dos a tres m.
En el vector: luego de que la garrapata toma sangre de un animal portador de T. equi,
los gamontes llegan al intestino. Permanecen ah durante 48 horas, luego sufren una
gametognesis, en las que se ve que los gamontes comienzan a crecer y multiplicar su
ncleo, formando estructuras en forma de flecha conocidas como Strahlenkrper o
cuerpos rayados. Estas estructuras luego se dividen y dan formacin a las
microgametas. Los gamontes que no sufren cambios, se considera que son las
macrogametas. Las microgametas se juntan con las macrogametas y forman los zigotos.
Esto ocurre entre el da cuatro y seis despus de la entrada del parsito en la garrapata.
Los zigotos maduran y se transforman en kinetos que egresan al hemocele (aparato
circulatorio de la garrapata). Llegan a las glndulas salivales, donde invaden las clulas
tipo III. Ac sufren una esporogonia, resultando en nuevos esporozoitos infectivos
(Melhorn 1998). Como se mencion antes, a diferencia de Babesia sp. , Theileria sp.
tiene transmisin transestadial y solo de una etapa a otra, luego pierde su poder
infectivo (Uilenberg 2006).
Babesia caballi:
Figura 2.2: Eritrocitos equinos infectados con merozoitos
de T. equi, formando una Cruz de Malta.
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En el equino: en el momento que la larva de la garrapata se alimenta de la sangre del
equino, los esporozoitos presentes en las glndulas salivales pasan al torrente sanguneo.
Por los cambios morfolgicos que se observan en esta etapa del ciclo cambian el
nombre a merozoitos. A diferencia de lo que ocurre con T. equi, los merozoitos
buscarn invadir nicamente eritrocitos (Schein 1988, Brning 1996, de Waal 2004). La
entrada se produce por endocitosis en varias etapas. Los parsitos del gnero Babesia
son los nicos miembros Apicomplexa que pierden la vacuola parasitfora dentro del
eritrocito. Aqu, el merozoito comienza a dividirse por fisin binaria, formando dos
clulas hijas. Es comn observar esta divisin en un extendido de sangre al microscopio
como se muestra en la Figura 2.1, en donde se puede apreciar la estructura piriforme de
dos merozoitos unidos en su extremo apical, formando un ngulo agudo (Schein 1988;
de Waal 2004). El merozoito haciendo protrusin sobre la membrana, lisa al eritrocito y
vuelve al torrente sanguneo para invadir nuevos glbulos rojos (Igarashi 1988).
En el vector: cuando una garrapata pica un animal portador, los glbulos rojos
infectados llegan al intestino, donde el parsito comienza a sufrir gametogenesis. Como
en el caso anterior, se visualizan en esta etapa los cuerpos rayados o Strahlenkrper,
que posiblemente corresponden a las gametas. Una vez que las gametas se han
fusionado formando zigotos, estos invaden las clulas basfilas del epitelio intestinal,
donde comienzan a dividirse. Esta divisin de los zigotos no ocurre en Theileria
(Uilenberg 2006). Toman entonces una forma de bastn llamado esporoquineto. Estos
esporoquinetos son liberados a la hemolinfa que los conduce a otras clulas de la
garrapata a las cuales infecta y en las cuales vuelve a dividirse para formar nuevos
esporoquinetos. Dentro de las clulas infectadas se encuentran los oocitos. Esto
significa que hay una transmisin transovrica de la garrapata hembra a su
Figura 2.3: Eritrocitos equinos infectados con
merozoitos de B. caballi.
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descendencia. Esto tampoco sucede en T. equi. Iguales ciclos de divisin mencionados
ocurren en los estados de larva, ninfa y adulto de la garrapata. Un ltimo proceso de
divisin ocurre en las glndulas salivales, donde comienza un ciclo de mltiples
divisiones que dan lugar a la formacin de un esporoblastos multinucleados. Luego por
gemacin surgen los esporozoitos que llegarn a la madurez solo despus que la larva
comienza a alimentarse, y constituyen las formas infectivas. Es importante aclarar que
solo en el estado larval de la garrapata puede transmitirse Babesia, en estado de ninfa ya
pierde esta capacidad, a pesar de mantener la infeccin. (Friedhoff 1988).
Todos los Apicomplexa poseen en su regin apical un grupo de organelas, llamadas en
conjunto complejo apical, de ah la derivacin de su nombre. Las principales organelas
de este complejo son tres: roptrias, micronemas y grnulos densos. A diferencia del
resto de los Apicomplexa, ni T. equi , ni B. caballi poseen conoides en el extremo
apical. El contenido de las roptrias, micronemas y grnulos densos es exocitado durante
la invasin a la clula hospedadora, por lo cual se ha postulado que el complejo apical
tiene un rol fundamental en el proceso de invasin. Se han identificado algunas
protenas presentes en estas organelas, tales como la familia de protenas MIC en los
micronemas, la familia de protenas ROP y las protenas RAP en roptrias y la familia de
protenas GRA en los grnulos densos (de Sousa 2006).
2.8. Patognesis y signos clnicos
La actividad estacional de las garrapatas predispone a una mayor frecuencia de signos
clnicos durante los meses de verano (de Waal 2004). El perodo de incubacin (tiempo
transcurrido entre la infeccin y la aparicin de los sntomas de la enfermedad) de T.
equi es entre 23 y 33 das. El perodo de latencia (tiempo transcurrido entre la infeccin
con el parsito, hasta que se torna infectivo para otro hospedador) se cree que es entre
los 12 y 14 das posteriores a la infeccin, porque es cuando comienzan a encontrarse
merozoitos dentro de los eritrocitos. El perodo de incubacin de B. caballi va de 10 a
30 das (Phipps 1996, de Waal 2004).
La forma aguda de la enfermedad se caracteriza por fiebre, anorexia, depresin,
ictericia, anemia hemoltica, petequias hemorrgicas de las mucosas y aumento de la
frecuencia respiratoria (Schein 1988, de Waal 2004). La hemoglobinuria, a menudo se
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17
describe como sntoma de la babesiosis en otras especies, sin embargo es menos
frecuente en equinos con piroplasmosis (Phipps 1996).
Durante la fase crnica los animales muestran una leve inapetencia, bajo rendimiento,
prdida de peso, esplenomegalia y ocasionalmente un color rosa plido en las mucosas
(de Waal 2004).
Theileria equi es altamente patgena en la etapa aguda de la infeccin y puede infectar
hasta el 80 % de eritrocitos (Mehlhorn 1998). La salida de este parsito de adentro de
los glbulos rojos provoca la ruptura de las clulas infectadas provocando cuadros
graves de anemia (de Waal 2004). En caballos gravemente afectados, la hemlisis puede
dar lugar a hemoglobinemia, nefrosis y uremia (de Waal 2004). Diversos grados de
trombocitopenia, hipofosfatemia, hipoferronemia e hiperbilirrubinemia estn
acompaados por los picos de parasitemia (de Waal 2004).
Babesia caballi, a diferencia de T. equi, suele causar muy bajas parasitemias, con menos
del 1 % de eritrocitos infectados (de Waal 2004). Las infecciones con Babesia caballi
suelen ser clnicamente inaparentes y rara vez conducen a una anemia grave. En
ocasiones, contribuye a la inapetencia crnica, bajo rendimiento, prdida de peso
corporal, color rosa plido de las mucosas, taquicardia leve y esplenomegalia (de Waal
2004). Este parsito, por otra parte, est relacionado con la acumulacin de eritrocitos
parasitados en capilares, lo que provoca la disfuncin del rgano afectado (de Waal
2004). Las infecciones por este parsito llevan en muy pocos casos a un estado de
hipotensin aguda que puede causar la muerte. Tambin se observa desarrollo de
laminitis, es decir la detencin de los movimientos peristlticos en el intestino.
Sin embargo, ambos parsitos causan frecuentemente infecciones subclnicas, que se
presentan con una disminucin en el volumen celular y de plaquetas (de Waal 2004).
La piroplasmosis neonatal en potros se caracteriza por debilidad en el momento del
nacimiento o la rpida aparicin de apata, as como el desarrollo de la anemia, ictericia
severa, malestar general, fiebre y petequias poco despus (de Waal 2004).
Signos nerviosos son rara vez vistos en la piroplasmosis equina, pero ataxia, temblor
generalizado y de leves a moderados espasmos tnico-clnicos se han informado para
potros infectados con T. equi. Otras complicaciones de la piroplasmosis equina son la
insuficiencia renal aguda y enteritis; prdida de fertilidad en sementales y aborto en
yeguas (de Waal 2004).
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La tasa de mortalidad puede ser mayor al 20% en animales que nunca estuvieron
expuestos al parsito (de Waal 2004).
2.9. Patologa
La patologa clnica revela una disminucin en la concentracin de hemoglobina,
eritrocitos y plaquetas (de Waal 2004, Camacho 2005), as como neutropenia y
linfopenia en los casos agudos (de Waal 2004). Hay aumento en los niveles sricos de
bilirrubina, urea, aspartato aminotransferasa (AST), creatina quinasa (CK), -
glutamiltransferasa (GGT) y lactato deshidrogenasa (LDH), en particular en caballos
infectados con Theileria equi, indicando anemia hemoltica y degeneracin
centrolobular y necrosis de hepatocitos (Camacho 2005).
Lesiones post-mortem: luego de una infeccin aguda, es comn encontrar edemas
subcutneos en la parte inferior del cuerpo y las extremidades, exudados serosos en
todas las cavidades corporales, esplenomegalia (Schein 1988, Phipps 1996, de Waal
2004), as como hepato y renomegalia (Schein 1988, Phipps 1996). Se observa amplio
dao renal: degeneracin del epitelio tubular con la deposicin de hemoglobina en los
tbulos renales, necrosis celular centrolobular y la infiltracin de sinusoides.
Pronunciada ictericia de las membranas serosas y edema pulmonar son ms frecuentes
en infecciones de Babesia caballi que de Theileria equi, mientras que linfodenopata
general se ha observado en el segundo (Schein 1988, Phipps 1996).
Fetos abortados y potros neonatos presentan anemia e ictericia de moderada a severa,
petequias en vsceras, hidrotrax, congestin y edema de pulmn, espleno y
hepatomegalia (de Waal 2004).
2.10. Diagnstico
El diagnstico de la piroplasmosis equina puede hacerse mediante la combinacin de
signos clnicos, examen de frotis teidos al microscopio, pruebas serolgicas,
subinoculacin de sangre a un animal sano (Phipps 1996), o xenodiagnstico (de Waal
2004) y reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) (Rampersad 2003, Alhassan 2005,
Vial 2006)
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La demostracin del parsito en frotis de sangre es a menudo muy difcil, por tal
motivo, la preparacin del portaobjeto en gota gruesa es una tcnica recomendada
para la deteccin de parsitos, sobre todo en casos de baja parasitemia (de Waal 2004).
La subinoculacin consiste en la transfusin de 500 ml de sangre de un animal infectado
a otro susceptible, preferiblemente esplenectomizado. Este animal es mantenido bajo
observacin de los signos clnicos de la enfermedad. El diagnstico es confirmado por
la presencia de parsitos en sus eritrocitos. Claramente es un mtodo muy caro y que
solo es empleado en ocasiones que se quiere confirmar la etiologa de la enfermedad.
Adicionalmente, en el xenodiagnstico, una garrapata libre del parsito se alimenta del
animal sospechado y posteriormente se analiza la presencia del protozoo en la garrapata.
El xito en la implementacin de cultivos in vitro de T. equi y B. caballi puede ser una
alternativa para complementar los mtodos arriba descritos, con el fin de confirmar la
presencia del parsito (de Waal 2004). Mediante estos mtodos se ha llevado a la
identificacin de T. equi y B. caballi en caballos microscpica y serolgicamente
negativos. Es un mtodo muy sensible, como para detectar parasitemias tan bajas como
10-10
% (de Waal 2004).
Sin embargo, para anlisis de rutina, la OIE recomienda el uso de anlisis serolgicos
como mtodo de diagnstico.
La prueba de fijacin del complemento (CF) fue una tcnica ampliamente utilizada a
nivel mundial, y solo en pocas regiones es todava empleada debido a su bajo costo
(Brning 1996, de Waal 2004). Dado que la CF no puede identificar todos los animales
infectados, especialmente los que han sido tratados; y debido a reacciones inespecficas
del complemento producidas por algunos sueros, y a la incapacidad de IgG (T) (el
principal isotipo de inmunoglobulina equina) para fijar complemento (McGuire 1971),
el IFA y las pruebas de ELISA han sido aceptados para su utilizacin como pruebas
prescritas para el comercio internacional (Waal 2004).
La inmunofluorescencia indirecta (IFA) se ha aplicado con xito para el diagnstico
diferencial de infecciones con T. equi y B. caballi (Madden 1968). El reconocimiento de
una fuerte reaccin positiva es relativamente sencillo, sin embargo cualquier
diferenciacin entre dbil positiva y reacciones negativas requiere una considerable
experiencia en la interpretacin (de Waal 2004).
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20
La produccin de antgenos recombinantes para el uso en pruebas de ELISA ha sido
descrita en varios casos. La protena recombinante EMA-1 (equi merozoite antigen-1)
se ha producido en Escherichia coli (Knowles 1992) y en clulas de insectos como
baculovirus (Xuan 2001).
Tambin ha sido producida en E. coli la protena de B. caballi RAP-1 (rhoptry
associated protein-1) (Kappmeyer 1999 y Ikadai 2002). Los antgenos recombinantes
producidos en E. coli o en baculovirus tienen la ventaja evidente de no tener que
infectar caballos para la produccin del test, y proporcionan una fuente de protenas
para diagnstico que puede ser normalizada y distribuida internacionalmente. Este
antgeno se ha utilizado en un ELISA indirecto (ELISAi) para B. caballi (Ikadai 2002) y
en un ELISA competitivo (cELISA) (Kappmeyer 1999). EMA-1 y un anticuerpo
monoclonal especfico (mAb) (Knowles 1992) se han utilizado en un cELISA para T.
equi (Knowles 1991). Este cELISA supera el problema de la pureza del antgeno, ya
que la especificidad de esta prueba slo depende del mAb utilizado. Un 94% de
correlacin fue observado entre el cELISA y la prueba de CF en la deteccin de
anticuerpos frente a T. equi. Los sueros que dieron resultados discrepantes fueron
evaluados por su capacidad de immunoprecipitar productos traducidos de mRNA de
merozoito de T. equi marcados in vitro con metionina-35
S. Las muestras que fueron
cELISA-positivas y negativas por CF, claramente precipitaron las protenas de T. equi.
Sin embargo, la inmunoprecipitacin con muestras cELISA-negativas y CF-positivas no
fueron concluyentes. Los escasos datos analizados sugieren que el cELISA es especfico
para T. equi (Knowles 1991). Este cELISA para T. equi tambin se valid en
Marruecos e Israel, donde dieron una concordancia de 91% y 95,7% con la prueba de
IFA, respectivamente (Rhalem 2001 y Shkap 1998 respectivamente).
De manera similar se ha desarrollado un cELISA utilizando la protena recombinante de
B. caballi RAP-1 y un mAb especfico. Los resultados de 302 muestras de suero
diagnosticadas con este cELISA y con la prueba del CF mostraron un 73% de
concordancia. De las 72 muestras que fueron CF negativas y cELISA positivas, 48
(67%) mostraron ser positivas con IFA, mientras que cuatro de las cinco muestras que
fueron CF positivas y cELISA negativas fueron positivas en el IFA (Kappmeyer 1999).
La especificidad aparente de los cELISA para T. equi y B. caballi mostr ser de 99,2%
y 99,5%, respectivamente, cuando se analizaron sueros de 1.000 caballos provenientes
de zonas presumiblemente libres de piroplasmosis. Otros mil caballos de distintos
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orgenes y con estado de infeccin desconocido fueron probados por el cELISA y la
prueba de CF con una aparente mayor sensibilidad de cELISA. Los resultados
mostraron un incremento del 1,1% (T. equi) y un 1,3% (B. caballi) para los animales
seropositivos detectados por cELISA comparado con los detectados por CF. Los
resultados positivos adicionales fueron confirmados por IFA. Ocho caballos infectados
experimentalmente (cuatro para T. equi, cuatro de B. caballi) fueron probados durante
90 das post-infeccin. Los dos cELISA detectaron la presencia de anticuerpos ms
tempranamente que CF. Ambas pruebas fueron altamente reproducibles entre pocillos,
entre placas y en distintos das, con una variacin global de 1,2% y 1,6% para el B.
equi y B. caballi, respectivamente (OIE ).
Tambin se han desarrollado sondas para la deteccin directa de ADN de Babesia spp.
tanto en sangre del animal infectado (Phipps 1996), como en la garrapata (Brning
1996). Parasitemias de T. equi equivalentes a menos del 0.0025% son detectables con
sondas de ADN (Posnett 1991).
Una multiplex PCR para la deteccin simultnea de T. equi y B. caballi, tambin se ha
desarrollado, pareciendo ser una herramienta muy prometedora para el diagnstico de
laboratorio de rutina de la piroplasmosis equina (Alhassan 2005).
Ms recientemente, ha aparecido una nueva tcnica para la amplificacin de ADN
llamada Loop-mediated isothermal amplification (LAMP amplificacin isotrmica
mediada por loop), que solo emplea cuatro primers y una ADN polimerasa a una
temperatura fija, sin la necesidad de un termociclador. Esta tcnica ha sido usada
exitosamente para el diagnstico de la piroplasmosis equina (Alhassan 2007).
2.11. Inmunidad
Los caballos pueden permanecer portadores por un mximo de cuatro aos despus de
una infeccin con B. caballi o probablemente de por vida despus de una infeccin con
T. equi (Phipps 1996, de Waal 2004). Como reservorios para la infeccin de garrapatas,
estos animales juegan un papel importante en la epidemiologa de la piroplasmosis
equina (de Waal 2004).
Se pueden detectar anticuerpos maternos en potros de hasta cinco (de Waal 2004) o seis
(Phipps 1996) meses de edad. Los potros son protegidos por inmunidad pasiva
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transmitida en el calostro de la madre (de Waal 2004). Las picaduras de garrapatas
portadoras suelen producir enfermedades subclnicas slo durante este tiempo,
conduciendo a una inmunidad estable con constantes infecciones (Phipps et al. 1996).
En un estudio realizado en Brasil, encontraron anticuerpos en caballos de todas las
edades, aunque fueron menos frecuentes en potros de seis meses de edad o ms jvenes
(Ribeiro 1999).
No se ha informado inmunidad cruzada (Schein 1988, Donnellan 2003, de Waal 2004),
pero puede ocurrir la infeccin simultnea con ambas especies (Donnelly 1980).
2.12. Tratamiento
T. equi es generalmente ms resistente al tratamiento que B. caballi (Kuttler 1980 y
1988, Schein 1988, Lindsay 2001). Se encontr que diferentes frmacos como
derivados del quinuronio, derivados de acridina y azul tripn son eficaces en la
eliminacin de ambos parsitos (Kuttler 1988, Brning 1996, de Waal 2004). Por otra
parte, el tratamiento de infecciones por T. equi con clorhidrato de tetraciclina y
oxitetraciclina o parvacuona no fue tan efectivo (de Waal et al. 2004).
Otro nuevo enfoque en el tratamiento son las drogas que se dirigen a las vas
biosintticas de fosfolpidos (Vial 2006). Triclosn es un ter sinttico que ha mostrado
tener efecto inhibidor en el crecimiento de B. caballi y T. equi en un estudio in vitro. Su
papel se cree apunta a la biosntesis de cidos grasos de tipo II dentro de estos parsitos
(Vial 2006).
Diamidinas aromticas y compuestos relacionados, incluyendo aceturato de diminazeno,
amicarbalida y dipropionato de imidocarb han demostrado ser los ms eficientes
piroplasmicidas (Schein 1988, Brning 1996, de Waal 2004). Los tratamientos repetidos
pueden ser necesarios para el control de T. equi, ya que la mayora de estos compuestos
no pueden esterilizar la infeccin (Kumar 2003, Donnellan 2003, de Waal 2004). De
igual manera, el tratamiento nunca debera tratar de esterilizar la infeccin en reas
endmicas, a menos que los caballos vayan a ser trasladados a un rea libre de la
enfermedad (Kuttler 1988, Heerden 1996, de Waal 2004).
Aunque hay diferentes drogas piroplasmicidas, el dipropionato de imidocarb (1,3-bis(3-
(4,5-dihidro-1H-imidazol-2-il)fenil )urea Dipropionato de 3, 3' bis-2-imidazolin-2-il-
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carbanilida) es el frmaco ms utilizado (Vial 2006). El imidocarb es una diamidina
aromtica. Un estudio demostr que el imidocarb atraviesa la placenta equina y alcanza
altas concentraciones en el feto (Lewis 1999). Se recomienda que se administre por va
intramuscular o subcutnea, pero no por va intravenosa (Vial 2006). El modo exacto de
accin contra la piroplasmosis an no se puede entender claramente (Kuttler 1988,
Brning 1996, Vial 2006). Se cree que causa el parcial desenrollamiento y
desnaturalizacin de la doble hlice de ADN del parsito. El imidocarb tambin inhibe
la entrada de inositol en los eritrocitos parasitados y, por lo tanto, conduce a la
"inanicin" del parsito (Vial 2006). La dosis teraputica del dipropionato de imidocarb
es entre 2 a 4 mg / kg de peso corporal, con una repeticin a las 24 horas (Phipps 1996).
2.13. Prevencin
Aunque se realiz una vacunacin exitosa de burros contra T. equi en un estudio
reciente (Kumar 2002), no hay vacunas para la piroplasmosis equina disponibles
comercialmente (Brning 1996, de Waal 2004). Por lo tanto, el control de la
enfermedad en zonas endmicas se realiza mediante la exposicin a las garrapatas
infectadas. Como se hizo referencia en el captulo sobre inmunidad, en el caso de los
potros menores a seis meses que tienen inmunidad pasiva, sufren la enfermedad de
manera subclnica, convirtindose en portadores crnicos. En los animales adultos, esto
se logra mediante el tratamiento preventivo con algn babesicida antes de la infeccin
natural (Kuttler 1987). Para mantener esta inmunidad natural en un animal, debe existir
una elevada tasa de transmisin (tasa de inoculacin) del parsito entre el vector y el
hospedador de manera de mantener el sistema inmune activo frente al patgeno.
Regular la aplicacin de acaricidas es la estrategia de control ms comnmente
empleada en pases desarrollados. Pero a largo plazo, el uso de esta metodologa resulta
en el desarrollo de resistencia por parte de las garrapatas. Adems de ser un mtodo
costoso, el tratamiento de acaricidas tiene como desventaja la contaminacin del medio
ambiente. Ms recientemente, nuevas estrategias biolgicas han sido empleados para el
control de garrapatas en el ganado y prometen ser de gran utilidad. Estas estrategias se
basan en inmunizar a los animales con protenas de una garrapata que despierten una
respuesta inmune, que causa el deterioro de las garrapatas que se alimentan de estos
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animales. Una de estas vacunas empleadas con gran xito es la protena Bm86 de
Rhipicephalus microplus (de la Fuente 2000).
Existe una evidente necesidad de contar con medidas de control ms fiable para T. equi
y B. caballi, especialmente para abordar la restriccin de la circulacin de caballos
seropositivos en los pases que prohben su importacin. Muchos trabajos estn
actualmente en curso para desarrollar vacunas eficaces contra varias especies de
Theileria y Babesia spp., explotando la interaccin husped-patgeno. Algunas
protenas de superficie, por ejemplo, estn siendo investigadas ampliamente para el
desarrollo de vacunas protectoras (Knowles 1992 y 1994, Hotzel 1997, Suarez 1998 y
2000, Ikadai 1999, Kumar 2002, Mosqueda 2002, Wilkowsky 2003). Sin embargo, en
nuestro pas es importante como primera medida contar con una herramienta de
diagnstico econmica y de fcil estandarizacin, con la que se puedan realizar unos
primeros estudios epidemiolgicos, como punto de partida para una campaa de
erradicacin de la enfermedad.
2.14. Equinos como reservorios de Babesia bovis y Babesia bigemina
La babesiosis bovina, tambin conocida como piroplasmosis, y/o fiebre de Texas, afecta
al ganado de vastas regiones tropicales y subtropicales del mundo, y posee diversos
agentes etiolgicos tales como Babesia bovis, B. bigemina, B. major, B. divergens, B.
jakimovi, B. ovata y B. occultans. Al igual que B. caballi, stos son parsitos
intraeritrocticos obligados, tambin llamados hemoparsitos, por albergarse en los
glbulos rojos, donde se reproducen asexualmente. La fase sexual de su ciclo de vida se
produce dentro de la garrapata transmisora de la enfermedad. En nuestro pas, esta
enfermedad es causada por B. bovis y B. bigemina, que son transmitidos por la garrapata
Rhipicephalus microplus . Las regiones afectadas incluyen el NOA y el NEA, teniendo
como lmite sur el paralelo 31 sur.
Se ha estimado que los problemas causados a la ganadera de nuestro pas por las
garrapatas de los bovinos y los patgenos que transmiten producen perdidas econmicas
del orden de los 100 millones de dlares al ao. Para un control eficiente de las
garrapatas as como de B. bovis y B. bigemina, es importante conocer otros posibles
reservorios de estos parsitos. Entre la poca informacin disponible, se ha reportado un
caso de babesiosis en ciervos de los pantanos en la provincia de Corrientes (Alcaraz
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2004). Por otra parte, trabajos realizados en nuestro laboratorio han demostrado que el
bfalo de agua (Bubalus bubalis) es positivo para B. bovis por nested PCR y por
cELISA (Dominguez 2004; Ferreri 2008); aunque no se ha demostrado que el parsito
pueda cumplir su ciclo de vida completo en bfalos como nico hospedador.
Estos resultados son consistentes con la observacin in vitro, que merozoitos de B. bovis
pueden invadir glbulos rojos humanos, ovinos, equinos, porcinos, caprinos (Gaffar
2003) y crvidos (Holman 1993). Con respecto a los equinos, se ha reportado en la
provincia espaola de Madrid el hallazgo de dos caballos positivos por PCR a B. bovis.
Siendo este el primer caso declarado de B. bovis en equinos (Criado-Fornelio 2006). Sin
embargo, no hay informacin que los equinos sean reservorios de estos parsitos en
nuestro pas.
2.15. Hiptesis de trabajo
1. Un test de ELISA indirecto para Theileria equi o para Babesia caballi puede
resultar una herramienta tan til como un ELISA competitivo para detectar
anticuerpos especficos contra estos parsitos.
2. Un test serolgico desarrollado en nuestro pas tiene un costo significativamente
menor que un test importado, lo cual lo hace adecuado para estudios
epidemiolgicos, a la vez de constituir un producto biotecnolgico de alto valor
agregado y potencial transferencia al sector privado.
3. Las provincias de Buenos Aires y Entre Ros son regiones libres de Theileria
equi y B. caballi.
4. Los caballos de Argentina podran estar infectados con piroplsmidos bovinos
transmitidos por garrapatas que parasitan tanto a bovinos como equinos.
2.16. Objetivos del trabajo
Objetivo general
El objetivo general de esta Tesis es desarrollar mtodos de diagnostico serolgico para
la piroplasmosis equina utilizando herramientas de ingeniera gentica. Asimismo, esta
Tesis se propone comparar los mtodos desarrollados con otros actualmente validados y
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aceptados internacionalmente, y usarlos para una evaluacin preliminar de la situacin
epidemiolgica de la piroplasmosis equina en varias regiones de nuestro pas.
Finalmente, otro objetivo de la Tesis es investigar si los caballos de regiones endmicas
para garrapatas de Argentina son portadores de otros piroplsmidos, y en caso positivo,
analizar la interferencia que esto puede traer en las pruebas serolgicos para
piroplasmosis equina.
Objetivos particulares:
Utilizar herramientas bioinformticas para analizar las secuencias de los
candidatos de diagnstico ya conocidos EMA-1 y EMA-2 de T. equi y RAP-1 de
B. caballi de manera de optimizar la produccin de formas recombinantes.
Identificar nuevos posibles candidatos diagnsticos para T. equi por bsqueda
en su genoma de genes con similitud a otros descriptos para otras Theilerias
spp., y producir formas recombinantes de los antgenos seleccionados.
Desarrollar un ELISA indirecto basado en uno de los antgenos de T. equi
estudiados, que haya mostrado mayor inmunogenicidad.
Desarrollar un ELISA indirecto para B. caballi basado en una forma
recombinante de RAP-1.
Comparar la sensibilidad, especificidad y eficiencia de los tests desarrollados
con ELISAs competitivos aprobados por la OIE.
Evaluar la situacin epidemiolgica de la piroplasmosis equina para T. equi y B.
caballi en algunas regiones de nuestro pas utilizando estas nuevas
metodologas.
Analizar la factibilidad de desarrollar un test dual para la piroplasmosis equina,
que detecte anticuerpos contra T. equi, contra B. caballi, o contra ambos, en un
mismo ensayo.
Investigar la utilidad en estos desarrollos de un conjugado de fabricacin
nacional, producido en yema de huevo.
Estudiar la presencia de ADN de B. bovis y/o B. bigemina en sangre de equinos
de una regin de Argentina endmica para garrapatas, por Real Time PCR y
RLB.
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Investigar mediante inmunoblots posibles interferencias que la presencia de
anticuerpos contra otros piroplsmidos podran traer en los tests para
piroplasmosis equina.
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3. Materiales y mtodos
3.1. Anlisis bioinformtico
3.1.1. Seleccin in silico de regiones de los genes ema-1 y ema-2 de
Theileria equi y rap-1 de Babesia caballi para la produccin de pptidos
recombinantes
Se recolectaron todas las secuencias conocidas de aminocidos de ema-1 y ema-2 de T.
equi y rap-1 de B. caballi depositadas en el GenBank
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/) hasta abril de 2004. Las secuencias fueron
comparadas para analizar el polimorfismo entre aislamientos. Para ello se realiz un
alineamiento con los programas ClustalW2 de acceso libre en el sitio del European
Bioinformatics Institute (http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/) y Boxshade 3.21 de
acceso libre en Embnet, Swiss Institute of Bioinformatics
(http://www.ch.embnet.org/software/BOX_form.html). Debido a que las regiones
hidrofbicas de las protenas son la principal causa de la formacin de cuerpos de
inclusin en bacterias transformadas y que estos cuerpos dificultan la purificacin de las
mismas (Villaverde 2003), se decidi buscar regiones en las secuencias aminoacdicas
que no incluyeran zonas hidrofbicas, para que al producir formas recombinantes,
aumentara la cantidad de protena en forma soluble. En primer trmino se analiz la
presencia de secuencias seal en cada una de las protenas por medio del programa
SignalP (http://www.cbs.dtu.dk/services/), ya que la prediccin de esta regin permitira
descartar ese segmento de la protena a expresar. Este programa utiliza redes neuronales
para su ejecucin. La salida grfica de SignalP muestra tres curvas que representan los
distintos valores de C, S e Y para cada uno de los aminocidos de la secuencia. El valor
C indica la probabilidad que ocurra un corte en determinado aminocido. El valor S
indica la probabilidad de que un determinado aminocido se encuentre en el sitio que
ocupa. El valor Y es la combinacin de la derivada de la puntuacin S y el valor C.
Un valor extra que arroja el programa es el valor D, el cual es un promedio entre la
media de S y el mximo valor de Y. Este valor se utiliza como criterio de
discriminacin de protenas solubles de exportacin.
Para la prediccin de regiones hidrofbicas se utilizaron tres enfoques: uno de ellos fue
el del programa bioinformtico ProtScale de Hidrofobicidad, el cual se basa en los
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29
ndices de hidrofobicidad de Kyle & Doolittle
(http://www.expasy.org/tools/protscale.html). Este ndice proporciona valores
numricos a cada aminocido en base a los niveles de solubilidad de cada uno en
diferentes solventes polares y no polares. Otro enfoque fue el del programa TMpred
(http://www.ch.embnet.org/pages/services.html) para la prediccin de regiones
transmembrana. Las regiones transmembrana son predominantemente hidrofbicas, ya
que de lo contrario no podran permanecer ancladas en la membrana citoplasmtica. Se
decidi utilizar este programa, porque si bien no deja de ser predictivo, tiene la ventaja
sobre los anteriores, de emplear una base de datos de secuencias ya conocidas y por
consiguiente tiene, en nuestro parecer un valor experimental en el resultado.
3.1.2. Bsqueda de genes de T. equi codificantes para posibles nuevos
antgenos de diagnstico
Para la bsqueda de nuevos candidatos de diagnstico para T. equi se realiz una
recopilacin bibliogrfica en la base de datos MEDLINE, perteneciente a la Biblioteca
Nacional de Medicina de Estados Unidos, a travs de PUBMED
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/). Se anotaron las secuencias de aminocidos de
aquellos antgenos de diagnstico de los que ya se dispusiera informacin experimental
de que fueran antignicos y que se encontraran en protozoos evolutivamente cercanos.
Estas secuencias fueron analizadas a travs del algoritmo tblasn (bsqueda en una base
de datos de nucletidos traducidos, a partir de la secuencia de aminocidos de los
antgenos) en el genoma de T. equi. Por no encontrarse an liberada la informacin del
genoma mencionado, este anlisis fue realizado por el Dr. Carlos Suarez, de la Unidad
de Investigaciones en Enfermedades Animales (USDA) en Pullman WA, USA.
Se identificaron de esta manera tres genes en el genoma de T. equi a los que se
denomin tesp, te2 y te8 por su similitud con los genes de Theileria annulata y T. parva
tasp (Theileria annulata surface protein,), tp2 y tp8 (Theileria parva 2 y 8),
respectivamente. Sus nmeros de acceso en el Gen Bank son: AJ345067 (lnea celular
TaA1272), XP765583 (cepa Muguga) y XP764709 (cepa Muguga), respectivamente.
Para la localizacin del gen dentro de las secuencias nucleotdicas remitidas a nuestro
laboratorio, primero se buscaron los seis marcos de lectura posibles en cada secuencia y
se los tradujo.
-
30
Con las secuencias de aminocidos obtenidas se hizo un estudio de ortologa, haciendo
un anlisis de la mejor secuencia reciproca con el programa BLAST (reciprocal best-hit
analyses) (Fuchsman 2006).
Luego se realiz un alineamiento con las secuencias ortlogas, utilizando ClustalW.
Posteriormente se utiliz Boxshade para pasar el resultado a un formato de texto ms
accesible. Para corroborar los lmites exactos de los genes en estas secuencias se utiliz
el programa FGENESH 2.6 (http://www.softberry.com/berry.phtml).
Solo en el caso del segmento que finalmente se expres de la protena TESP se examin
la presencia de exones con el programa FEX del sitio SoftBerry
(http://linux1.softberry.com/berry.phtml?topic=fex&group=programs&subgroup=gfind)
En el caso de la protena TE8 y del segmento TESP, se analiz la presencia de epitopes
B putativos utilizando el programa Bepipred Linear Epitope Prediction
(http://tools.immuneepitope.org/main/jsp/menu.jsp) con el fin de justificar la
produccin de sus protenas recombinantes. Este programa se basa en el algoritmo de
Kolaskar y Tongaonkar. Es un mtodo semiemprico que hace uso de las propiedades
fisicoqumicas de los residuos de aminocidos y sus frecuencias en las secuencias de
epitopes experimentalmente conocidas. Este mtodo puede predecir determinantes
antignicos con un 75% de precisin.
3.1.3. Diseo de cebadores
Para el diseo de los cebadores se utiliz el programa PrimerQuest
(http://www.idtdna.com/SCITOOLS/Applications/PrimerQuest/Default.aspx ) usando
como parmetros de esta bsqueda la longitud y ubicacin del fragmento que se deseaba
amplificar en cada caso, as como una longitud aproximada de 25 nucletidos, una
concentracin de guanina + citosina del 50% y una temperatura mxima de
hibridizacin de 65 C. Los resultados emitidos por el programa se analizaron con el
programa OligoAnalyzer 3.0
(http://www.idtADN.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/), para la bsqueda de
auto- y hetero-dmeros que pudiesen formar los cebadores en cuestin. Tambin se
analiz la especificidad de cada uno, por medio de un anlisis BLAST (Basic Local
Alignment Search Tool) en el sitio http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi. Asimismo, se
comprob que los cebadores correspondieran a regiones conservadas entre
aislamientos, segn el anlisis descripto en el punto 3.1.1.
-
31
Las secuencias de los cebadores, as como la temperatura de hibridizacin (T.H.)
especfica para cada par de cebadores y la longitud del fragmento que amplifican est
descripto en la Tabla 3.1.
Gen Cebador Secuencia Tm Temp. de
anillado
Long.
amplif.
ema-1 ema-1 F (5-GAGGAGGAGAAACCCAAGGC-3) 58 C
58 C 687 pb ema-1 R (5-TACAACCTTGTAGTCAGCTGGG-3) 57 C
ema-2 ema-2 F (5-AAGGTTGTCTATACCGCCCA-3) 56 C
57 C 615 pb ema-2 R (5-GGAGAATCCATCGTATTGGGTCTTG-3) 57 C
rap-1 rap-1 F (5-GTTTGCCACAACAGCCGTGTTTC-3) 59 C
61 C 1176 pb rap-1 R (5- CTCGGCCCCCGTTGAC -3) 59 C
tesp tesp F (5-CCGTGCATAAAAAATATGAGAGAGCAATTCC-3) 57 C
58 C 273 pb tesp R (5-GTGACATTCCGTGTGTGCATATTCAATATC-3) 58 C
te2 te2 F (5-GCCTGCGATGGAAAATGTGG-3) 57 C
59 C 441 pb te2 R (5-CTCGGGACCCTTTGGAGTCT-3) 59 C
te8 te8 F (5-GAAATTGAAGTGGTTAAGCATGATC -3) 54 C
54 C 1224 pb te8 R (5-CATGGCAAACGAAGCTACG -3) 53 C
Los cebadores delanteros (Forward, F) fueron diseados de forma de mantener el marco
de lectura del gen de inters. Todos los cebadores reversos (R) fueron diseados de
forma de eliminar el codn de detencin (codn stop) del gen y mantener el marco de
lectura con los residuos de histidina del vector a utilizar para el clonado.
Todos los programas mencionados en esta seccin fueron utilizados con los parmetros
en que se encuentran determinados.
3.2. Obtencin de muestras
El ADN para la amplificacin de genes de Theileria equi se obtuvo gracias a la
colaboracin del Comando de Remonta y Veterinaria, perteneciente al Ejercito
Argentino, cuya dependencia se ubica en el barrio de Palermo en la Ciudad Autnoma
de Buenos Aires. Se extrajeron 10 ml de sangre en forma asptica de un equino de ese
organismo, que haba sido infectado experimentalmente con sangre de un animal
positivo para T. equi. Se utiliz citrato sdico como anticoagulante, en una relacin 1:9
Tabla 3.1.: Nombre y secuencia de los cebadores especficos para cada gen.
-
32
de citrato sdico 3,8 % : sangre. La sangre fue conservada a 4 C durante su traslado y
congelada luego a -20 C hasta su procesamiento.
Por otra parte, se obtuvieron 2 ml de sangre de un equino infectado con B. caballi
gracias a la contribucin de los Dres. Ignacio Echaide y Susana Torioni de la Estacin
Experimental del INTA de Rafaela, Santa Fe. La obtencin y preservacin de la muestra
se realiz de igual manera que la muestra de T. equi.
En ambos casos, la presencia de los piroplsmidos en la sangre de los equinos haba
sido detectada en su lugar de origen por observacin microscpica de frotis teidos con
colorante de Giemsa, pero se desconocen los datos de parasitemia o tiempo de
infeccin. La confirmacin de la identidad de los parsitos en las muestras citadas se
realiz posteriormente por secuenciacin de los fragmentos de ADN que se
amplificaron.
Las muestras de sangre utilizada para la obtencin de suero se recolectaron
aspticamente con tubos de vaco (Vacutainer, BD) de 10 ml con activador de la
coagulacin. Se conservaron a 4 C desde su recoleccin hasta su llegada a destino. En
el laboratorio se centrifugaron las muestras a 300 g y se transfiri el suero a un tubo tipo
Eppendorf. Luego se congel el material obtenido y se lo mantuvo a -20 C hasta su
procesamiento.
Las muestras de sangre entera que se utilizaron tanto en el ensayo de qPCR y RLB
(secciones 3.15.y 3.16.) provienen de equinos de la ciudad formosea de Misin San
Francisco de Laishi (ver mapa en seccin 3.10.). Fueron recolectadas aspticamente en
tubos de vaco (Vacutainer, BD) de 10 ml, conteniendo K3EDTA (1,5 mg/ml de sangre)
como anticoagulante. Estas muestras se conservaron a 4 C desde su recoleccin hasta
su destino. Luego fueron congeladas y mantenidas a -20 C hasta su procesamiento.
Se obtuvo un total de 654 sueros de equinos de Salta (n = 299), Formosa (n=129), Entre
Ros (n= 104) y Buenos Aires (n=122), ver regiones en seccin 3.10. Para estas
muestras, se extrajeron de 6 a 8 ml de sangre en tubos de vaco (Vacutainer, BD) de 10
ml, sin anticoagulantes. Las muestras fueron conservadas a 4 C hasta su procesamiento.
Para la separacin del suero, las muestras fueron centrifugadas 10 min a 1500 g y
conservadas a -20 C.
La extraccin de sangre en todos los casos fue realizada por puncin venosa en la vena
yugular externa del animal.
3.3 Extraccin de ADN
-
33
La extraccin de ADN a partir de las muestras de sangre entera que seran utilizadas
para la expresin de protenas, fue realizada de la siguiente manera:
Las muestras de sangre fueron descongeladas y alcuotas en 2 ml. Fueron centrifugadas
durante 10 min a 10.000 g a 4 C, y el pellet se resuspendi en 2 ml de buffer fosfato
salino PBS (137 mM NaCl / 1,5 mM H2KPO4 / 6,5 mM Na2HPO4 / 2,7 mM KCl, pH
7,4). Se repiti este procedimiento de centrifugacin y lavado con PBS varias veces,
hasta que el sobrenadante quedase transparente, libre de hemoglobina. El ltimo pellet
se resuspendi en 200 l de PBS. Luego se agreg dodecil sulfato de sodio (SDS) 1%
v/v y Proteinasa K 0,1 mg/ml, concentracin final (c.f.), y se incub a 65 C por 15 min,
y luego a 45 C durante 16 h. Se agreg NaCl 1M c.f., y 1 volumen de
fenol/cloroformo/alcohol isoamlico (25:24:1, v/v), se agit por inversin y luego se
centrifug a 10.000 g durante 10 min a 4 C para separar las fases, trasvasando la fase
superior acuosa a un nuevo tubo. Los pasos de agregado de fenol/cloroformo/ alcohol
isoamlico, agitacin y centrifugacin fueron repetidos 2 o 3 veces, hasta obtener la fase
acuosa totalmente limpia. Seguidamente, se agregaron 2 volmenes de etanol absoluto
enfriado a 4 C, y se dej a -20 C durante una hora, para luego centrifugar a 12.000 g
durante 20 min a 4 C. Se descart el sobrenadante, y el pellet conteniendo el ADN
precipitado se lav con etanol 70%, seguido de centrifugacin (12.000 g, 20 min, 4 C).
El pellet resultante se resuspendi en buffer Tris EDTA, TE (10 mM Tris HCl / 1 mM
EDTA, pH 8,0), y se conserv a -20 C. La concentracin de ADN se calcul por
lectura espectrofotomtrica a 260 nm, siendo la misma de 8 ng/l para la extraccin de
ADN de Theileria equi y de 3 ng/l para la extraccin de ADN de Babesia caballi.
El ADN utilizado para los ensayos de qPCR y RLB fue extrado con el kit QIAGEN
Flexi Gene (Manual disponible en
http://www1.qiagen.com/Products/GenomicDnaStabilizationPurification/FlexigeneDN
ASystem/FlexigeneDNAKit.aspx#Tabs=t2). Bsicamente consiste en una lisis de la
muestra, tratamiento con una proteasa y precipitacin del ADN con isopropanol. Si bien
el rendimiento de este mtodo de extraccin es inferior al obtenido con la extraccin
con fenol/cloroformo, es mucho ms rpido de realizar y por lo tanto ms til para el
procesamiento de gran cantidad de muestras.
Todas las extracciones fueron analizadas en una corrida electrofortica horizontal. Para
esto se sembraron 5 l de los productos de extraccin en un gel de agarosa al 0,8 % en
-
34
buffer TAE (40 mM Tris-acetato / 1 mM EDTA / cido actico glacial 0,001 % (v/v);
pH 8,5) conteniendo bromuro de etidio (0,5 g/ml). Luego de su separacin
electrofortica, los fragmentos de ADN fueron visualizados en un transiluminador UV y
se corrobor que el ADN genmico no hubiese sufrido degradacin.
3.4. Produccin y purificacin de formas recombinantes de antgenos
de diagnstico
3.4.1. Amplificacin de los genes de inters por PCR
A partir del ADN obtenido se amplificaron por PCR los marcos abiertos de lectura
(ORF) de los fragmentos correspondientes a los genes de T. equi: ema-1, ema-2 y de B.
caballi rap-1. As tambin a partir de la muestra de ADN de T. equi, se amplificaron las
secuencias tesp, te2 y te8 para explorar si correspondan a posibles candidatos de
diagnstico, como se describi en la seccin 3.1.2.
Se prepar la mezcla de reaccin de PCR conteniendo: 50 mM KCl / 20 mM Tris HCl
(pH 8,3) / 1,5 mM MgCl2 / 0,2 mM dNTPs / 0,5 M de cada cebador (ver Tabla 3.2.) /
0,2 ng/l de ADN templado / 2 U de Taq ADN polimerasa (Promega) y H2O milli Q
hasta llevar al volumen deseado.
El programa de PCR utilizado se describe en la Tabla 2.2. Las temperaturas de
hibridizacin (T.H.) dependieron en cada caso del par de cebadores usados, y fueron las
mostradas en la tabla 2.1.
Paso Tiempo [min] Temperatura [C] Ciclos
Desnaturalizacin Inicial 5 95 1
Desnaturalizacin 0,75 95
35 Hibridizacin 0,75 T.H.
Extensin 1,25 72
Extensin final 10 72 1
Todas las amplificaciones fueron confirmadas en una corrida electrofortica horizontal,
en un gel de agarosa al 1% en buffer TAE. El tamao de los amplicones fue calculado
por comparacin con un marcador de tamao 1 kb (Promega), corrido paralelamente.
Tabla 3.2: Condiciones usadas para la PCR (T.H.): temperatura de hibridizacin
-
35
3.4.2. Clonado en vector de expresin y transformacin de clulas
competentes
Los productos de amplificacin se clonaron para su expresin en el vector comercial
pBAD/ThioTOPO (Invitrogen).
El vector de expresin procaritico pBAD/ThioTOPO de 4454 pb permite la insercin directa de los productos de amplificacin de PCR, sin necesidad de cortar con enzimas
de restriccin. Este plsmido se comercializa linealizado y posee en sus extremos 3 un
nucletido timidina sin aparear que permite la unin con las adenosinas 3 no apareadas
del producto de amplificacin de la PCR. Adems, el vector posee, unido al mismo
extremo, una Topoisomerasa I que permite ligar covalentemente el vector al extremo 5
del segmento de ADN de inters, como est ilustrado en la Figura 3.1. El vector
contiene el origen de replicacin ori pUC y un gen para resistencia a ampicilina. En el
sitio de insercin tiene un sitio de corte para una enteroquinasa, en el caso que se
necesite escindir la Tiorredoxina fusionada de la protena de inters. Posee tambin un
epitope V5 para el reconocimiento de un anticuerpo anti-V5.
Los niveles de expresin de la protena recombinante estn regulados por la
concentracin de L-arabinosa en el medio. En ausencia de arabinosa, el regulador
negativo transcripcional AraC (gen presente en el plsmido) forma un bucle (loop) en el
ADN que impide la unin de la ADN polimerasa al promotor araBAD (PBAD) del
Figura 3.1: Mapa del vector pBAD/ TOPO, describiendo
sus componentes ms importantes.
-
36
vector. En presencia de la misma, la arabinosa se une a la regin araC, liberando el
bucle y permitiendo la transcripcin.
Estos plsmidos tienen la ventaja adicional de agregar 6 residuos histidina en la regin
C-terminal de la protena expresada, permitiendo la purificacin de sta por medio de
una cromatografa de afinidad por quelantes metlicos, como lo son las resinas de
nquel-agarosa.
El vector pBAD/thioTOPO (4.454 pb) permite fusionar a la secuencia peptdica que
uno desea expresar, una porcin de la protena Thiorredoxina. Esto aumenta la
eficiencia de transcripcin y la solubilidad de la protena a la que va fusionada, en
especial si se trata de una protena de membrana con regiones hidrofbicas. A su vez la
Tiorredoxina posee dos de sus aminocidos cambiados por histidinas. Es decir que las
protenas recombinantes producidas en este sistema contienen 6 histidinas en su
extremo carboxilo terminal y dos histidinas en su extremo amino terminal. Esto
aumenta la afinidad de la protena por los quelantes metlicos, mejorando su
purificacin por cromatografa de afinidad en nquel-agarosa.
Los pasos seguidos para la ligacin de los fragmentos de ADN en el vector y la
transformacin de las clulas fueron los siguientes: se incubaron: 4 l de producto de
PCR (amplicones), 1 l de vector pBAD/thioTOPO, 1 l de solucin de sales (1,2 M
NaCl/ 0,06 M MgCl2, pH 8,0) por el lapso de 5 min a temperatura ambiente. Se
agregaron 2 l de esta ligacin a 50 l de clulas competentes de E. coli, y se dej 30
min en hielo. Por medio de un golpe (shock) trmico de 30 a 45 segundos en bao a
42C se logr la permeabilizacin de la membrana plasmtica. Se adicionaron 250 l de
medio LB (Luria Bertani) lquido (10 g/l triptona/ 5 g/l extracto de levadura/ 5 g/l NaCl)
y se agit durante 1 hora a 37C. Se fraccionaron dos alcuotas de 50 l y 200 l para
su sembrado en dos placas de LBA-agar (LB + 15 g/l agar y 100 g/ml de Ampicilina).
Por ltimo se dej toda la noche (ON) en estufa a 37C.
3.4.3. Preparacin de clulas competentes
La cepa de E. coli utilizada para transformar fue TOP 10 [F- mcr mrr hsdRMS-
mcrBC)80lacZM15 lacX74 recA1 deoR araD139 (ara-leu)7697 galU galK rpsL
(StrR) endA1 nupG ]. Se utilizaron clulas competentes preparadas en el laboratorio.
-
37
Para estas ltimas, se utiliz el siguiente protocolo bajo condiciones de esterilidad: se
sembr por extensin en placa con LB-agar una estra de bacterias TOP 10 y se las dej
creciendo toda la noche. Se pic una colonia e inocul en 5 ml de LB. Nuevamente se
dej crecer toda la noche a 37 C. Se realiz una dilucin 1:100 en 100 ml de medio LB,
y las bacterias se incubaron a 37 C con agitacin hasta alcanzar una A600 = 0,5. Los
cultivos fueron enfriados durante 5 min en hielo, seguido de centrifugacin a 3.000 g
por 10 min a 4 C. Se resuspendi en 40 ml de Buffer TFB I (30 mM KC2H3O2/ 10 mM
KCl/ 10 mM CaCl2/ 50 mM MnCl2; pH 5,8; enfriado en hielo). Se centrifug la
suspensin nuevamente a 2.000 g por 10 min a 4C, y el precipitado fue resuspendido
en 40 ml de Buffer TFB II (10 mM MOPS/ 10 mM KCl/ 75 mM CaCl2/ 15 % v/v
glicerol estril; pH 6,5; enfriado en hielo). Luego de 5 min en hielo, las clulas se
alicuotaron en volmenes de 250 l que fueron guardados a -70C.
Se comprob la eficiencia de la competencia mezclando 1 l del plsmido pUC (0,1
ng/l) con 50 l de clulas competentes. Esta suspensin se sembr en placas de LBA-
agar slido que se cultivaron toda la noche a 37 C. Se contaron las colonias y el valor
ndice de transformacin de competencia se expres como el nmero de colonias
por masa de ADN (en g) utilizado. En nuestro caso se obtuvo un valor de 3,6 x 106
colonias por g de ADN. En general se calcula que un valor por encima de 105 es
aceptable para transformaciones en presencia de CaCl2 usando plsmidos pequeos.
3.4.4 Seleccin de clones positivos
Una vez realizado el clonado en vector de expresin descripto en el punto 3.4., se
seleccionaron los clones recombinantes que contenan la secuencia de los genes de
inters en la direccin correcta (con su extremo 5 ubicado hacia el promotor araBAD).
Para ello, se efectu una reaccin de colonia-PCR, utilizando el cebador trasero pBAD-
R (5-GATTTAATCTGTATCAGG-3) y los cebadores delanteros de cada uno de los
genes en cuestin, como se describen en la Tabla 1. Como templado de la reaccin se
tom una punta de escarbadientes de una colonia de bacterias y se resuspendi en la
mezcla de reaccin de PCR. En todo lo dems, la mezcla de reaccin fue como se
describe en el punto 3.3. El programa utilizado fue el descripto en la Tabla 2, con una
temperatura de hibridacin de 55 C y la adicin de 5 min a 95C en el paso de
desnaturalizacin inicial para lisar las clulas e inactivar las nucleasas.
-
38
Nuevamente todos los productos de amplificacin fueron confirmados sembrando 5 l
en un gel de agarosa al 1 % en buffer TAE y teidos con bromuro de etidio. Como
control negativo de la PCR se us mezcla de reaccin sin picar bacterias del cultivo. Se
seleccionaron 1 a 4 clones positivos (con el inserto en orientacin correcta) en cada
caso.
3.4.5. Induccin de la expresin en los clones seleccionados
Para analizar el nivel de expresin de las protenas recombinantes en cada uno de los
clones seleccionados, se inocularon tubos conteniendo 1 ml de LBA con una punta de
escarbadientes de las colonias respectivas y se incubaron toda la noche a 37C con
agitacin. Al da siguiente, 100 l de estos cultivos se utilizaron para comenzar cultivos
frescos en 2 ml de LBA, los cuales fueron incubados por 2 h a 37C con agitacin;
tiempo en el que el cultivo alcanza una Abs600 de 0,5. Luego se someti 1 ml del cultivo
a induccin con 0,2 % arabinosa (c.f.), mientras que el mililitro restante se utiliz como
control negativo. Los cultivos con y sin arabinosa fueron incubados a 37 C por 3 h con
agitacin.
Al cabo de las 3 h de incubacin, los cultivos de bacterias fueron centrifugados (1.000
g, 15 min, 37 C), y los precipitados fueron disueltos en buffer de carga (250 mM Tris-
HCl, pH 6,8/ 10% SDS/ 0,5 % azul de bromo fenol/ 50% glicerol/ 0,4% -
mercaptoetanol). Las muestras fueron hervidas por 5 min, y sonicadas en hielo, con un
sonicador de punta de titanio (Branson Ultrasonic Corporation, modelo Sonifier 250)
con dos intervalos de 15 segundos en potencia 5; luego de lo cual fueron centrifugadas
(10.000 g, 4 C, 5 min). Los sobrenadantes fueron sembrados en minigeles de
poliacrilamida. La estructura de los geles consisti en 1 ml de gel concentrador de 5%
poliacrilamida sobre 5 ml de gel separador de 12% de poliacrilamida. La composicin
del gel concentrador fue: 1M Tris, pH 6,8/ 4,93 % de acrilamida/ 0,17 % N,N-metil
bisacrilamida/ 3,5 mM SDS 10 %/ 4,3 mM persulfato de amonio (APS)/ 1 l de
TEMED (N,N,N`N`-tetra-metiletilendiamina) en un volumen final de 1 ml. La
composicin de gel separador fue 1,5 M Tris, pH 8,8/ 11,6 % acrilamida/ 0,4 % N,N-
metil bisacrilamida/ 3,5 mM SDS/ 4,3 mM APS/ 2 l de TEMED en un volumen final
de 5 ml. Los geles fueron armados en el sistema MiniProtean 3 (Bio-Rad). Luego de la
polimerizacin, fueron sumergidos en una cuba de electroforesis con buffer de corrida
-
39
Laemmli (Tris-HCl 25 mM, pH 8,8/ glicina 250 mM/ SDS 0,1 %) y las protenas fueron
separadas por electroforesis vertical (120 V). En una calle de cada uno de los geles se
sembr un marcador de peso molecular (PageRuler Prestained Protein Ladder,
Fermentas). Al cabo de la corrida, los geles fueron teidos con Coomassie blue (0,25%
p/v Coomassie Brilliant Blue R-250/ 45% metanol/ 10% acido actico glacial) y
desteidos con solucin decolorante (40% metanol/ 10% cido actico glacial). De esta
manera se analiz si los cultivos de bacterias inducidos con arabinosa presentaban
bandas que no estuvieran presentes en los cultivos no inducidos, y si el tamao de las
bandas corresponda con el esperado. El peso molecular esperado para cada una de las
protenas producidas se calcul en el sitio
http://gchelpdesk.ualberta.ca/downloads/prot_mw.html. Las protenas recombinantes
obtenidas, estn fusionadas a una porcin de la protena Tiorredoxina en el extremo N-
terminal, y a un grupo de 6 histidinas en el extremo C-terminal. De esta manera, las
protenas resultantes tienen aumentado su peso molecular en 16 kDa. Los pesos
moleculares esperados para las distintas protenas fueron los que se muestran en la
Tabla 3.3.
Gen Peso molecular de
la protena*
Peso con la
fusin**
EMA-1 26 kDa 39 kDa
EMA2tr1 13 kDa 26 kDa
RAP-1 53 kDa 66 kDa
TESP 10 kDa 23 kDa
TP2 19 kDa 32 kDa
TP8 46 kDa 59 kDa
En todos los casos, para confirmar que la banda observada correspondiera a la protena
recombinante fusionada a la secuencia de 6 histidinas, se realiz un Western blot con un
anticuerpo anti-histidina (Amersham). Para esto se separaron nuevamente las protenas
en una corrida electrofortica en iguales condiciones a las descriptas previamente.
Luego se realiz una transferencia de las mismas a una membrana de nitrocelulosa
Protran (Schleicher y Schuell) en buffer de transferencia (48 mM Tris base pH 8,3/ 39
mM glicina/ 1,28 mM SDS/ metanol 20 %). La transferencia se realiz en un equipo
Tabla 3.3: Peso molecular de las protenas producidas. * peso molecular calculado en: http://gchelpdesk.ualberta.ca/downloads/prot_mw.html
** fusin al segmento de Tiorredoxina y las 6 histidinas
-
40
MiniProtean 3 (Bio-Rad) aplicando un amperaje constante de 160 mA por 1,25 h. Se
constat que la transferencia hubiera sido satisfactoria observando que las bandas
correspondientes al marcador de peso molecular fueran ntidas. Dado que el marcador
de peso molecular utilizado es coloreado, no es necesario teir la membrana para esta
verificacin. Luego se bloque la membrana con buffer PBS/ Tween 20 0,1 %/ leche
descremada 3% (PBST-leche), durante una noche a 4 C. Se procedi a la incubacin
con el anticuerpo anti-histidina (Amersham) en una dilucin 1/2.000 en PBST-leche por
1h. Se realizaron dos lavados de 10 min y se incub por 1 h con el anticuerpo
secundario anti-IgG anti-ratn conjugado a fosfatasa alcalina diluido 1/2.000 en PBST-
leche. Luego de dos lavados finales de 10 min, se incub en buffer III - NBT - BCIP
(100 mM Tris-HCl, pH 9,5/ 100 mM NaCl/ 5 mM MgCl2/ 0,4 mM nitro blue
tetrazolium (NBT)/ 0,38 mM 5-bromo-4-cloro-3 indolil fosfato (BCIP)). Todas las
incubaciones fueron realizadas a 37 C y con agitacin. En las reacciones positivas, se
observ una banda de color negro del tamao esperado.
3.4.6. Purificacin de plsmidos
Una vez identificados los clones positivos para la expresin de las protenas de inters,
se llev a cabo una amplificacin y purificacin de plsmidos para su posterior
secuenciacin. Los cultivos de bacterias transformadas crecidos toda la noche, que se
mencionaron en el punto anterior, se guardaron a 20oC en presencia de 30% glicerol
para su crioproteccin. A partir de estos, se realizaron nuevos cultivos ON en 3 ml de
LBA para la purificacin de plsmidos. Se utiliz un kit comercial de extraccin de
plsmidos Wizard Plus SV (Promega). El mtodo utilizado consisti bsicamente en
los siguientes pasos: se centrifug el cultivo a 1.000 g por 10 min para obtener un
precipitado de bacterias, se resuspendi en un buffer de lisis, mezclando por inversin.
Se agreg una solucin con proteasa alcalina durante 5 min a temperatura ambiente y se
detuvo su actividad con una solucin neutralizante, mezclando por inversin. Se
centrifug a 10.000 g por 10 min y el sobrenadante se transfiri a una resina de
purificacin centrifugando la columna dentro de un tubo de 1,5 ml a 10.000 g durante 1
min. La columna fue lavada por centrifugacin con 2 ml de solucin de lavado y
finalmente se efectu la elucin del plsmido con 100 l de agua libre de nucleasas y se
conserv a 20 C.
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Se comprob la eficiencia de la purificacin por electroforesis horizontal en gel de 1 %
agarosa, como se describi en el punto 3.3., observndose bandas mayores a 4 kb y
menores a 6,5 kb dependiendo del largo del inserto. Las preparaciones fueron
cuantificadas por lecturas de Abs260/280 (absorbancia a 260 nm, 280 nm y su relacin)
en un espectrofotmetro Thermo Scientific NanoDropTM
1.000, para controlar que la
concentracin de ADN fuese igual o mayor a la requerida para la secuenciacin (100
ng/l) y que la relacin ADN/protenas superase el valor de 1,5.
Para la secuenciacin (Sanger, 1977) automtica de los productos de amplificacin por
PCR clonados en el vector de expresin, se enviaron 10 l de la solucin con el
plsmido a la Unidad de Genmica del Instituto de Biotecnologa, CNIA, INTA. Esta
Unidad dispone de un secuenciador automtico de capilares modelo ABI3130XL
(Applied Biosystems) para la secuenciacin de ADN. Para la reaccin de secuenciacin
se utilizaron cebadores delantero y trasero correspondientes a secuencias del plsmido
utilizado: Trx-F (5-TTCCTCGACGCTAACCTG-3) y pBAD-R (5-
GATTTAATCTGTATCAGG-3) para el vector pBAD/ThioTOPO. Las secuencias
fueron recibidas por correo electrnico en formato .ab1 y .phd y analizadas utilizando el
programa BioEdit. Luego de eliminar las regiones correspondientes al vector, las
secuencias obtenidas fueron comparadas con secuencias conocidas, depositadas en el
GenBank, utilizando los programas descriptos en la seccin 3.1.1.
3.4.7. Purificacin de protenas recombinantes
Una vez comprobada la identidad de los clones recombinantes obtenidos y demostrada
su eficiencia de expresin, se efectuaron cultivos de mayor volumen para proceder a la
purificacin de las protenas de inters.
Los protocolos de purificacin que se utilizaron en este trabajo fueron tres: (i) en
condiciones nativas, (ii) en condiciones desnaturalizantes y (iii) por electroelucin.
Cada uno de estos mtodos tiene alguna ventaja que lo diferencia de los otros. (i) La
purificacin en condiciones nativas posee la ventaja de que la protena mantiene en
cierto grado su estructura nativa, lo que permite que algunos epitopes conformacionales
sean conservados, dndole a la protena purificada ms oportunidades para que
anticuerpos especficos de la protena nativa la reconozcan. (ii) El segundo mtodo fue
utilizado en los ca
