Desarrollo de celulas b

DESARROLLO DE CÉLULAS B

Jesús Armando Mendoza Grajeda 245501Antonio Leyva Ortega 309219

Dayanara Rentería Rentería 299492María Fernanda Tejeda Baeza 299609

Gilberto Gardea Ramírez Luis Javier Aldrete Polanco

Células B

Millones de linfocitos B son generados cada día.

El desarrollo de células B maduras tarda 2 semanas.

El desarrollo comienza en la medula ósea con la división de HSC y continua hasta la producción de progenitores linfoides comunes (CLP). Que dan lugar a células T o B.

Las células que se convertirán en B permanecen en médula ósea.

La célula B en desarrollo expresa receptor de superficie celular y moléculas de adhesión.

• Los receptores reciben señales para la diferenciación de la célula B en desarrollo, también para su proliferación y para su movimiento.

• Las células B inmaduras completan su maduración en el Bazo.

• La Fx primaria de las células B es secretar anticuerpos.

• El reordenamiento de genes que codifican para la inmunoglobulina culmina en la expresión del receptor de células pre-B.

• Las células B auto reactivas son eliminadas por apoptosis o hechas funcionalmente no reactivas o anérgicas.

• Los receptores de células B no están restringidos a MHC.

El sitio de hematopoyesis

• La hematopoyesis ocurre en la médula ósea

• Las HSC son la fuente de todas las células sanguíneas de la línea eritroide, linfoide y mieloide.

El sitio de generación de células B cambia durante la gestación

• Las medula ósea aparece en etapas relativamente avanzadas del desarrollo, por lo cual la generación de células sanguíneas cambia de sitio varias veces.

En ratones el periodo de

gestación es de 19 a 21

días.

La hematopoyesis

comienza a los 7 días después de la fecundación

en el saco vitelino (células

elitroides nucleadas).

En el día 8 se detectan HSC en la región

aorta-gonada-mesonefros

(AGM).

Hacia el día 10 se puede aislar a partir de AMG HSG maduras.

En el día 11 se encuentran HSG maduras en saco

vitelino, placenta e hígado fetal.

Entre los días 11.5 y 12.5 hay expansión rápida de HSC en la placenta y al final de este periodo la placenta tiene mas HSC que la AGM o el saco vitelino .

En el día 13.5 el numero de HSC en

la placenta comienza a

disminuir y en el hígado se comienza

a elevar.

En los días 15.5- 16.5 se alcanzan 1000 HSC en el

hígado fetal, después este

numero comienza a declinar.

• Al día 13 de gestación las células pre-B que expresan inmunoglobulinas en el citoplasma pero no en la superficie se observan por primera vez.

• Al día 17 células B positivas para IgM de superficie están ya presentes.

• Las HSC al día 15 se siembran por primera vez en la medula ósea, quedando como el principal sitio de desarrollo de células B.

La hematopoyesis en el hígado fetal difiere de la que se observa en la medula ósea de adulto.

• Las células B en desarrollo en el hígado difieren a las de la médula ósea.

• Las HSC en el hígado tiene fase de proliferación rápida mientras que en la medula ósea son relativamente quiescentes.

• Las células B del Hígado son predominantemente células B B-1 (en cavidades peritoneal y pleural).

*Las células B B-1 tienen reactividad cruzada amplia, se unen a antígenos carbohidrato.

• La expresión de desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT) es mínima y las proteínas RAG1/2 recombinasa no utilizan la gama completa del gen que codifica las regiones V,D y J.

*Las células B B-1 se renuevan en la periferia.

• En humanos los precursores de células sanguíneas aparecen en la 3ra

semana en el saco vitelino. (principalmente progenitores eritroides)

• En la región AGM y/o el saco vitelino pueden repoblar por completo el

sistema hematopoyético.

• Al tercer mes de embarazo las HSC migran al hígado fetal.

• 4to mes las HSC migran a medula ósea .

• Antes de la pubertad casi todos los huesos del esqueleto muestran actividad hematopoyética.

• 18 años solo las vertebras, costillas, esternón, cráneo , pelvis y partes del humero y fémur tienen actividad hematopoyética

Desarrollo de células B en la médula ósea

• Además de servir como fuente de células madre hematopoyéticas contiene células madre que se pueden diferenciar en :

*adipocitos *condrocitos *osteocitos *miocitos

Cada una de estas células requiere factores específicos secretados por las células del estroma.

¿Qué son las células del estroma?*Estroma deriva del griego colchón y una célula del estroma es un termino general para una célula adherente grande que apoya el crecimiento de otras células.

Para el desarrollo de células B las células del estroma satisfacen dos fx:

*Interactúan con moléculas de adhesión sobre la superficie de HSC y células progenitoras , para retener a las células en desarrollo en nichos de la medula ósea específicos.

*Las células de estroma expresan citocinas para llevar acabo una progresión ordenada de un sitio a otro.

• Las HSC empiezan su vida en estrecho contacto con osteoblastos situados en el revestimiento endosteal.

• Una vez diferenciados en pre-pro B se requiere la quimiocina CXCL12 secretada por un grupo especializado de células del estroma para progresar a célula pro B.

• Las células pro B continuación requieren señales provenientes de la citocina IL-7 secretada por un grupo de células del estroma.

Desarrollo de células B en el individuo de edad avanzada• Las personas de edad avanzada son mas susceptibles a

infección que las jóvenes y las vacunaciones en son menos eficaces en individuos de mayor edad.

• Los individuos de edad avanzada muestran deficiencias en las funciones de las células B, además de un incremento de trastornos autoinmunitarios.

• En el caso de los ratones esto se debe a que las células del estroma de las médula ósea secretan menos citocinas (IL-7) para el desarrollo de las células B. o bien, puede ser por que las células B viejas responden con menos eficiencia a estas citocinas. Además existe una autor renovación disminuida de HSC.

• Estos individuos expresan mas genes para el desarrollo mieloide que para el linfoide, por lo que hay una reducción de células B tempranas.

• Factores de transcripción importantes, como los codificados para E2A, están reducidos en animales viejos. Además los genes Rag y el gen que codifica para el componente de cadena ligera sustituto λ5, están regulados en dirección descendente.

• En individuos de edad avanzada el tamaño del repertorio (Numero de receptores que un individuo expresa) esta drásticamente disminuido. Esto se correlaciona con una reducción de salud del paciente de edad avanzada.

• Un decrementos de células B2 inmaduras podrían brindar un la oportunidad de que células de B-B1 aumenten su porción del nicho de células B periféricas , aunque estas tengan un repertorio de receptores menos diverso que las Células B-B2.

• Las células de memoria acumuladas a través de los años reduce el espacio en los folículos de células B, reduciendo la entrada de células B recién formadas.

Las etapas de la hematopoyesis son definidas por marcadores de superficie celular, expresión de factor de transcripción y reordenamientos de gen que codifica para inmunoglobulina

• Las células en distintas etapas de diferenciación pueden distinguirse por sus moléculas de superficie, que incluyen antígenos, moléculas de adhesión, y receptores para quimiocinas y citocinas. También son definidas por los factores de trascripción que se encuentran activos. En el caso de las células B las etapas de desarrollo son definidas por el estado de los genes que codifican para cadenas pesadas y ligera de inmunoglobulina en reordenamiento.

La generación de anticuerpos contra moléculas presentes sobre la superficie de las células de la médula ósea permitió identificar moléculas presentes en cada etapa de la maduración de las células B y cuales combinaciones de antígenos parecieron definir tipos de células singulares.El cultivo de células in vitro, y su análisis mediante citometría de flujo permite describir la expansión secuencial de combinaciones particulares de moléculas de superficie celular.

Los investigadores usan la genética de deleción (knockout) para determinar los efectos sobre el desarrollo de células B de la eliminación de la expresión de genes particulares, como los que codifican para factores de transcripción particulares. El método de deleción (Knockout) solo define la primera etapa en la diferenciación en la cual se requiere el factor de transcripción.Recientemente se ha explotado la genética de introducción (Knockin) para generar animales que expresan marcadores fluorescentes bajo el control de los promotores de factor de transcripción.

Función del miRNA en el control del desarrollo de células B

• Pequeña fracción del DNA cromosómico especifica para

secuencias de proteína.

• Segmentos de DNA que no codificaba para proteínas era

llamado despectivamente “DNA basura”.

• En 1993 descubrieron que estas secuencias mostraron

transcritos primarios que fueron procesados hacia

fragmentos pequeños de RNA que fueron capaces de

ejercer control sobre la magnitud de expresión de mRNA.

RNA por completo cubiertos y poliadenilados

Dividen

RNAasa nuclear

Procesa hacia dúplex de 18 a 30

nucleótidos

miRNA maduro monocatenario

Complejo silenciador inducido por RNA

El miRNA opera mediante unión complementaria de una región “semilla” a una región sobre su mRNA

blanco

mRNA blanco puede ser directamente establecido como objetivo para división.

El mRNA puede ser desestabilizado

Puede reprimirse la traducción desde el mRNA.

Bloqueo del desarrollo en la transición de células pro-B a células pre-B

La ablación de Dicer en progenitoras de células B tempranas

Destruye toda capacidad para sintetizar miRNA maduro.

La pérdida condicional del gen que codifica para nucleasa Dicer

Molécula proapoptótica Bim expresada a concentraciones mas altas en progenitoras de células B

con ablación de Dicer

HSC

Se renuevan por sí mismas y son multipotenciales

Mantienen un numero relativamente grande de genes en un estado llamado “preparado”

Estímulos ambientales pueden impulsar a las células por varias vías de desarrollo posibles.

Durante el proceso de maduración siguiente son desactivadas las regiones de cromatina preparadas.

En las HSC destinadas a ser células B

Los factores de transcripción Ikaros, factor de secuencia de Purina (PU.1) Y E2A, participan en las etapas mas tempranas.

Ikaros recluta complejos de remodelación de cromatina

PU.1 preside la “ley del equilibrio” leucocítico; PU.1 bajo favorece diferenciación linfoide.

E2A contribuye al mantenimiento del fondo común de HSC

MPP (células progenitoras multipotenciales)

Se generan en el momento en que se recibe la señal de SCF/c-Kit y pierden la capacidad de autorrenovación extensa.

Retienen la expresión de c-Kit y Sca-1 y expresan de manera transitoria CD34.

Expresan receptor de quimiocina CXCR4 que se une a quimiocina derivada de CXCL12

Interacción entre CXCR4 y CXCL12 asegura que la célula progenitora ocupe el nicho correcto.

LMPP (Progenitores Multipotenciales, preparados para Linfoide)Expresa el receptor de tirosina cinasa relacionado con

fms-3 (flt-3)

El flt-3 se une a su ligando flt-3 unido a membrana de las

células del estroma

Emiten señales para que se empiece a sintetizar receptor

de IL-7

El flt-3 es expresado sobre progenitores de célula B hasta la

etapa de pro-B

La expresión de flt-3 sobre la superficie

de la célula marca la perdida de potencial

de MPP

Las LMPP expresan c-Kit+,Sca-1+,flt-3+

Conforme quedan mas comprometidas

hacia la línea linfoide c-Kit y Sca-1

disminuyen

Las células destinas a convertirse en

linfocitos empiezan a expresar

RAG1/2 y desoxinucleotidil

transferasa terminal (TdT)

ELP (célula progenitora linfoide temprana)

La expresión de RAG 1/2 define a la

célula como ELP

Un subgrupo de ELP migra hacia el

timo

El resto permanece en M.O.

La expresion de c-Kit y Sca-1

disminuye conforme IL-7R aumenta

La ELP se desarrolla hacia

CLP

CLP (progenitor linfoide común) Aun retienen el

potencial de madurar hacia NK, DC

convencionales o célula T.

Señales por IL-7R promueve

supervivencia y aumenta la

producción de EBF-1

Emisión de señales por IL-7R da lugar a

Regulación ascendente de

genes C-myc, N-myc

Que emiten señales de proliferación

celular

Las CLP son c-Kit bajo, Sca-1 bajo e IL-7R+ y han perdido el potencial mieloide.

Los pasos más tardíos del desarrollo de célula B dan lugar a compromiso al fenotipo de célula

B

• En la figura se ilustra la expresión de marcadores de superficie celular, y los patrones de reordenamiento de genes que codifican para cadena pesada y para cadena ligera de inmunoglobulinas, empezando en la etapa de desarrollo de célula pre-pro-B.

Las etapas de diferenciación de las células B han sido definidas por más de un grupo de científicos y, como resultado, dos sistemas de nomenclatura están en uso común.

El primero, y más ampliamente usado, es la nomenclatura de Basel (pre-pro, pro, pre-B, B inmadura), ideada por Melchers y colegas.

El segundo (A, B, C, C′, D, E) es el definido por Hardy y colaboradores.

Células pre-pro B• Con la adquisición del nuevo marcador

específico para línea de células B, B220 (CD45R), y la expresión de cifras crecientes del factor de transcripción EBF1, la célula en desarrollo entra a la etapa de célula pre-pro-B.

• El EBF1 es un factor de transcripción importante en el desarrollo linfoide y, por ende, la transcripción del gen Ebf1 está en sí bajo el control de múltiples factores de transcripción. Cada uno de éstos se une en regiones promotoras distintas y, por ende, la magnitud de transcripción del gen Ebf1 puede variar considerablemente.

• En la etapa de célula pre-pro-B, el EBF-1, junto con E2A, se une al gen que codifica para inmunoglobulina, lo cual promueve la accesibilidad del locus D-J

H y prepara a las

células para el primer paso de la recombinación del gen que codifica para Ig.

• El EBF-1 también es esencial para la expresión completa de muchas proteínas de célula B, incluso Igα, Igβ (CD79α,β), y los genes que codifican para el receptor de célula pre-B, que se expresarán cuando la recombinación vdj de cadena pesada esté completa.

Células pro-B

• Un evento de recombinación final espera la expresión del factor de transcripción de célula B

prototípico, PAX5.

• El gen Pax5 figura entre los blancos de transcripción de EBF-1, y la transcripción de genes controlados por el factor de transcripción PAX5 denota el paso a la etapa de desarrollo de célula pro-B, momento en el cual la expresión de genes que no codifican para la línea B es bloqueada permanentemente.

• PAX5 puede actuar como un represor transcripcional, y como un activador transcripcional, y bloquea la expresión del gen Notch-1, lo que termina cualquier potencial residual de la célula pro-B a desarrollarse a lo largo de la línea de células T.

• Muchos genes de células B importantes son activados en esta etapa, bajo el control de PAX5 y otros factores de transcripción. Entre éstos figura el gen que codifica para CD19, que es uno de los componentes del correceptor de célula B.

• Una vez que la proteína PAX5 es expresada, ocurre un reforzamiento mutuo entre la expresión de PAX5 y la de EBF-1; cada factor de transcripción sirve para aumentar la expresión del otro.

• La proteína PAX5 sigue siendo expresada en células B maduras en tanto la célula B no se compromete a un destino de célula plasmática después de estimulación antigénica. La expresión más alta de EBF1 inducida por PAX5 también permite un incremento de la expresión de IL-7R.

• La expresión de los componentes de emisión de señales del receptor de célula B, Igα e Igβ, también empieza en la etapa de célula pro-B, y el complejo de emisión de señales Igα,Igβ es colocado brevemente sobre la superficie celular en complejo con la proteína chaperón calnexina.

• Si bien este complejo Igα,Igβ se ha denominado un “pro-BCR”, aún no se ha establecido un ligando para él; tampoco se entiende todavía la importancia de cualquier emisión de señales que pueda emanar desde él.

• Asimismo, durante la etapa de célula pro-B, c-Kit es activado brevemente una vez más, lo que permite a la célula recibir seña- les provenientes del factor de células madre. Al inicio de la etapa de desarrollo de célula pre-B, la expresión de c-Kit es vuelta a desactivar de manera irreversible.

Células pre B• Durante la etapa de célula pre-B, la

célula expresa un receptor de célula pre-B compuesto de la cadena pesada reordenada, en complejo con los componentes VpreB y λ5 de la cadena ligera sustituto.

• La aparición de este receptor de célula pre-B señala la entrada de la célula B en desarrollo hacia la fase de célula pre-B grande o temprana.

• La expresión de la cadena pesada en la superficie de la célula es necesaria para la terminación de reordenamiento adicional de cadena pesada, y asegura la exclusión alélica de los genes que codifican para cadena pesada de Ig.

• La emisión de señales por medio del receptor de célula pre-B induce algunas rondas de proliferación en la célula pre-B.

• Esta fase proliferativa se correlaciona en el tiempo con la expresión sobre la superficie de la célula pre-B de CD25, la cadena α del receptor de IL-2 de afinidad alta, que aparece por vez primera sobre células B en la etapa de célula pro-B.

• Puesto que el proceso proliferativo de célula pre-B parece ser impulsado principalmente por IL-7, no está clara la importancia funcional de CD25 en este punto. Con todo, su aparición suele usarse como un marcador de la etapa de desarrollo de célula pro-B tardía a la de célula pre-B temprana.

• Si el receptor de célula pre-B no puede desplegarse sobre la superficie celular debido a reordenamientos no productivos de gen VHDJH, el desarrollo de célula B se suspende, y la célula se pierde por apoptosis. Por ende, esta etapa en el desarrollo de célula B se denomina el primer punto de control de célula pre-B

El progreso por este punto de control depende de algún tipo de eventos de emisión de señales por medio del receptor de célula pre-B, y evidencia reciente sugiere que esto está mediado por interacciones entre regiones ricas en arginina en la porción no inmunoglobulina del componente λ5 de la cadena ligera sustituto, o en las regiones CDR3 de algunas cadenas pesadas, con moléculas que tienen carga negativa sobre la superficie de las células del estroma.

La emisión de señales de receptor de célula pre-B induce la regulación

descendente transitoria de RAG1/2 y la pérdida de la actividad de TdT.

Juntos, estos eventos aseguran que, tan pronto como un gen que codifica

para cadena pesada se ha reordenado exitosamente, es

imposible la recombinación adicional de cadena pesada. Esto da lugar al fenómeno de exclusión alélica, por el cual los genes de sólo uno de los

dos alelos de cadena pesada pueden expresarse en una célula B única.

Como resultado de esta emisión de señales de receptor de célula pre-B, la cromatina en el locus de cadena pesada no usado pasa por varios

cambios físicos que la hacen incapaz de participar en eventos de reordenamiento adicionales.

• La expresión de cadena ligera sustituto también es terminada por una ronda de emisión de señales de retroacción negativa por medio del receptor de célula pre-B. Al final de la proliferación celular por emisión de señales pre-bcr, el receptor de célula pre-B se pierde de la superficie, y esto emite una señal para la entrada hacia la etapa de célula pre-B pequeña o tardía.

• En este punto se inicia el reordenamiento de cadena ligera con la reexpresión de los genes Rag1/2. En esta etapa persiste muy poca actividad de TdT y, por ende, la adición de la región N ocurre menos frecuentemente en cadenas ligeras que en cadenas pesadas.

• En el ratón, el reordenamiento de cadena ligera empieza en uno de los cromosomas que codifican para cadena κ, seguido por el otro. Si ni uno ni otro reordenamiento de cadena κ es exitoso, el reorde- namiento a continuación se intenta de manera exitosa en cada uno de los cromosomas que codifican para la cadena λ. En seres humanos, el reordenamiento es iniciado al azar en los loci de κ o de λ.

• Una vez que se ha completado exitosamente el reordenamiento del gen que codifica para cadena ligera, el receptor de IgM es expresado sobre la superficie celular, lo cual es una señal de la entrada hacia la etapa de célula B inmadura.

Si los intentos de reordenamiento del gen que codifica para cadena ligera de inmunoglobulina fracasan, la célula naciente finalmente se pierde en el segundo punto de control de célula B inmadura.

Dada la disponibilidad de cuatro cromosomas separados en los cuales intentar reordenamiento, y la oportunidad para editar cadena ligera en el caso de reordenamiento no productivo, casi todas las células pre-B que han reordenado exitosamente sus cadenas pesadas progresarán hacia la formación de una célula B inmadura.

Células B en Medula Ósea son sensibles a la inducción de tolerancia

• Las B inmaduras portan receptor (BCR) IgM funcional (único)

• B220, CD25, IL-7R y CD19

• Si receptor autorreactivo 3 destinos. Si en medula ósea Tolerancia Central

1. Proceso apoptótico.- Delación clonal en MO2. Reactivar genes que codifican para RAG= edición del

receptor de cadena ligera3. Las que escapan y siguen siendo autorreactivas se hacen

anérgicas

Muchas células B eliminadas en medula ósea mas no todas• Animales transgénicos • David Nemaze • Muchas edición de Receptor en vez de ser eliminadas

• Molécula para MHC H-2Kk .- Ratón sintetiza anti H-2Kk • Si selección las B inmaduras por selección =

seleccionadas en contra, en un ratón que expresa H-2Kk • En ratones H-2Kd detectaron ac transgénico en suero

B exportadas desde MO son funcionalmente inmaduras • IgM = inmadura se transporta a bazo• Vida media corta por poca expresión de Bcl-2 Bcl-xl, altas

de Fas• Si encuentran ag propio en esta etapa.- edición si no es

idóneo el receptor =apoptosis

Células B T1 y T2Marcador T1 T2 Maduras

mIgM Alta Alta Intermedia

mIgD -/baja Intermedia Alta

CD24 + + -

CD93 + + -

CD21 - + +

CD23 - + +

Receptor BAFF +/- + +

T1 T2 (25% en MO) Maduras

4 DIASBazo Folículos o zona marginal

Autorreactivas =apoptosis (55-75%)Tolerancia periférica.

Menos colesterol = no balsas lipídicas

Resistentes por expresión de mol. Antiapoptótica Bcl-

xl

BCR capaz de recibir señal si no

muere (DAG y CA+)

BAFF-R interfiere contra mol

proapoptótica Bim

B T3 autorreactivas y anérgicas • 1ra vez en sangre y en órganos linfoides • CD93+ mIgM CD23+• Células anérgicas • No se dividen ni secretan ac• Vida media mas corta • Excluidas de los folículos

Experimento de anergia • Goodnow concepto de anergia• Ratón vs lisozima de clara (egg) de gallina (hen) (HEL)

enlazado a promotor de metalotionina. =expresado en la periferia

• Otro grupo transgén para anti- HEL• Aparear los 2 ratones (transgénica doble)• Generaron células B periféricas maduras anti HEL pero

sin función

Las células B B-2 primarias maduras migran hacia los folículos linfoides

• Las células B por completo maduras expresan cifras altas de IgD y intermedia de IgM en la superficie celular.

• Recirculan en la sangre y órganos linfoides; entran a folículos de células B y muestran respuesta con antígeno en presencia de ayuda de células T, con producción de anticuerpos.

La médula de un ratón produce de 10 a 20 millones de células B cada día pero sólo alrededor de 10% llega a residir en la periferia y solo 1-3% entrará al fondo común de células B B-2 foliculares recirculantes.

Desarrollo de células B B-1 y de la zona marginal

• Las células B B-1 generan anticuerpos contra antígenos compartidos por muchas especies de bacterias .

• Es la fuente de anticuerpos naturales: Anticuerpos IgM séricos (primera línea de protección).

• Las células de la zona marginal se ubican en las zonas externas de la pulpa blanca del bazo.

• Primeras células B encontradas por antígenos transportados por la sangre que entran al bazo, igual que cel. B B-1 producen anticuerpos IgM.

Las células B B-1 se derivan de una línea de desarrollo separada

• Ocupan nichos anatómicos diferentes de los que ocupan las células B B-2, constituyen 30 a 50% de cel. B en cavidades pleura y peritoneal.

• Poseen repertorio de receptor limitado, tienden a ser dirigidos hacia el reconocimiento de antígenos carbohidrato microbianos.

Células B B-1 y B-2 se derivan de líneas de células progenitoras distintas

• Las células B-1 aparecen antes en el desarrollo ontogénico, las células B generadas en la región AGM y hígado en el feto tiene genético de células B B-1(IgM).

• Células B B-1 son regeneradas constantemente en la periferia del animal.

• Muestran diversidad de región V mucho más limitada.• Progenitoras de células B del fenotipo

CD19+CD45Rbajo/-.

Las células de la zona marginal comparten características fenotípicas y funcionales con células B

B-1 y surgen en la etapa T2

Están situadas en las regiones externas de la pulpa blanca del bazo, las células Bmz parecen estar especializadas en el reconocimiento de antígenos transportados por la sangre.

Se caracterizan por cifras altas de IgM, pero bajas de IgD de membrana y del receptor Fc CD23.

Son de vida prolongada y puede renovarse en la periferia.

Al igual que las cel. B B-2 las B mz dependen del factor de supervivencia de cel. B BAFF que se une por medio del receptor BR3