-
DESAIN PRIMER SPESIFIK UNTUK DETEKSI DINIPENYAKIT VIBRIOSIS PADA
UDANG PENAEID
Ince Ayu Khairana Kadriah*), Endang Susianingsih*),
Sukenda**),Munti Yuhana**), dan Enang Harris**)
*) Balai Penelitian dan Pengembangan Budidaya Air PayauJl.
Makmur Dg. Sitakka No. 129, Maros 90512, Sulawesi Selatan
E-mail: [email protected]
**) Departemen Budidaya Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu
Kelautan,Institut Pertanian Bogor
Jl. Rasamala, Kampus IPB Darmaga, Bogor 16680
(Naskah diterima: 13 Juli 2012; Disetujui publikasi: 28 Februari
2013)
ABSTRAK
Serangan Vibriosis, yang disebabkan oleh Vibrio harveyi
berpendar pada budidayaudang telah menyebabkan penurunan yang
signifikan dalam produksi, baik padapembenihan maupun di tambak
pembesaran. Pengembangan metode deteksi cepatberbasis PCR
(Polymerase Chain Reaction) sangat penting untuk mencegah
penularanvibriosis. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk
mengembangkan metode cepat deteksivibriosis pada udang penaeid
dengan menggunakan penanda molekuler yang spesifik.PCR berbasis
deteksi gen spesifik dilakukan menggunakan primer spesifik
toxR,haemolysin (vvh), dan gyrB. Dari 35 isolat, 22 isolat yang
terdeteksi memiliki genspesifik toxR, haemolysin (vvh) dan gen gyrB
dan 9 isolat terdeteksi memiliki dua gentertentu. Penanda molekuler
spesifik telah dirancang menggunakan data urutan genpenyandi
protein haemolysin dan gyrase. Desain pasangan primer yang
didasarkanpada program perangkat lunak dari Primer3 dan secara
manual menggunakan programperangkat lunak Bioedit. Tiga pasangan
primer untuk gen haemolysin dan dua primergyrase telah diperoleh
dan dipilih sebagai primer.
KATA KUNCI: vibriosis, udang penaeid, PCR, deteksi cepat,
penandamolekuler spesifik
ABSTRACT: Specific primer design for rapid detection of
Vibriosis onpenaeid shrimp. By: Ince Ayu Khairana Kadriah,
EndangSusianingsih, Sukenda, Munti Yuhana, and Enang Harris
Vibriosis occurrences, due to luminous Vibrio harveyi, on shrimp
culture maycaused substantial declines in production, either in
hatcheries or in grow out ponds.Development of Polymerase Chain
Reaction (PCR)-based rapid detection methods isvery crucial in
preventing vibriosis outbreaks. The aims of this study was to
developrapid methods of detection of the vibriosis in penaeid
shrimp by using specificmolecular markers. PCR-based detection of
specific genes were performed employingspecific primers of toxR,
haemolysin (vvh) and gyrB. Out of the 35 isolates, 22 isolateswere
detected to have toxR, haemolysin (vvh) and gyrB specific genes and
9 isolateshave two out of these specific genes. Specific markers
have been designed usingsequence data of the genes encoding the
haemolysin protein and gyrase. Primerpairs design were based on the
software program of Primer3 and manually aligned
Desain primer spesifik untuk deteksi dini penyakit ..... (Ince
Ayu Khairana Kadriah)
131
-
by using Bioedit software program. Three of primer pairs for
haemolysin gene andtwo of gyrase primers were obtained and selected
as primer.
KEYWORDS: vibriosis, penaeid shrimp, PCR, rapid detection,
specificmolecular marker
PENDAHULUAN
Kementerian Kelautan dan Perikanan masihmenempatkan udang
sebagai komoditasunggulan perikanan budidaya selama 2010-2014.
Selama periode 2010-2014 produksiudang diharapkan meningkat 74,75%
ataudari 400 ribu ton menjadi 699 ribu ton yangterdiri atas udang
vaname dan udang windu.Industri budidaya udang windu secara
inten-sif dan transportasi udang windu ke seluruhdunia melalui
perdagangan diketahui ber-hubungan erat dengan meningkatnya
kejadianinfeksi penyakit yang menyerang udangwindu selama dua
dekade ini (Saulnier et al.,2000). Bakteri vibrio berpendar adalah
salahsatu penyebab penyakit yang cukup banyakmenyerang hewan
budidaya seperti udang(Baticados et al., 1990; Karunasagar et
al.,1994; Moriarty, 1998; Zhang & Austin, 2000),beberapa
spesies ikan dan kekerangan (Aus-tin & Zhang, 2006) bahkan juga
karang (Ben-Haim et al., 2003) di seluruh dunia.
Pengembangan metode deteksi cepat,tepat, akurat dan murah sangat
bermanfaatkarena dapat digunakan dalam upaya pen-cegahan penyakit
vibriosis di lapangan baikdi panti benih maupun pada
pembesaranudang di tambak. Upaya pencegahan ini harusdilakukan
sebelum koloni bakteri mencapaiquorum. Penelitian yang dilakukan
olehDefoirdt (2007) menyimpulkan bahwa ke-mampuan bakteri vibrio
untuk melakukanquorum sensing sangat dipengaruhi olehpopulasi
bakteri tersebut di alam. Upaya untukdeteksi cepat secara molekular
salah satu-nya dengan mengisolasi gen spesifik yangdimiliki oleh
bakteri vibrio berpendar dandigunakan sebagai penanda molekular
dalamdiagnosis cepat untuk penyakit vibriosis ber-pendar
(kunang-kunang) pada budidaya udang.
Gen haemolysin diketahui merupakan genspesifik yang dimiliki
bakteri Vibrio berpendar.Gen haemolysin adalah gen yang
bertang-gung jawab pada penghancuran membran seldarah atau proses
hemolisis. Gen yang meng-kode haemolysin ini dilaporkan
ditemukanpada beberapa spesies bakteri di antaranya
adalah V. harveyi (Nishibuchi et al., 1990;Nishibuchi &
Kaper, 1995; Zhang et al., 2001)dan V. parahaemolyticus (Bej et
al., 1999).
Selain gen haemolysin gen toxR yangsecara spesifik mengkode
protein trans-membran juga memegang peranan pentingpada regulasi
gen toksin ctx dan beberapagen-gen toksin lainnya. Gen toxR akan
meng-aktifkan gen-gen lainnya untuk menghasilkantoksin (Pang et
al., 2006). Gen gyrB diketahuiberperan untuk mengkode protein
subunit Bdari DNA gyrase (topoisomerase type II). DNAgyrase
mengatur superkoiling pita ganda DNA.Gen gyrB sangat diperlukan
untuk replikasiDNA di mana gen ini berperan dalam pem-bentukan
protein yang mengkode enzimgyrase.
Pendekatan yang memanfaatkan kemajuanbioinformatika dan teknik
PCR dapat diguna-kan untuk mengembangkan penanda spesifiktersebut.
Metode PCR digunakan untuk meng-amplifikasi sekuen spesifik dari
rantai DNA.Primer rantai pendek oligonukleotida yangdidesain akan
berkomplemen dengan masing-masing ujung dari daerah target pada
rantaiDNA dan kemudian memperpanjangnya padasisi yang berlawanan
dari DNA template.Karena fungsi primer sebagai inisiator seka-ligus
pembatas daerah yang akan diamplifi-kasi, maka idealnya primer
memiliki urutanbasa nukleotida yang tepat berpasangandengan urutan
basa DNA target yang akandiamplifikasi, dan tidak menempel di
bagianlainnya. Desain primer yang bagus merupakanhal esensial bagi
keberhasilan reaksi PCR.
Untuk mendesain suatu primer memer-lukan data-data sekuen gen
yang menyandi-kan protein sejenis dengan gen yang akandiamplifikasi
melalui PCR. Data-data sekuengen dapat diperoleh pada basis data
gen darilembaga-lembaga penyedia informasi gen danprotein atau
hasil sekuen gen tertentu yangbersifat spesifik yang telah
dihasilkan. Prosesamplifikasi dari gen-gen yang mengkode
sifat-sifat tertentu utamanya sifat patogen dapatmenjadi suatu
pendekatan baru dalam metodedeteksi cepat penyakit (Cunningham,
2002).
132
J. Ris. Akuakultur Vol. 8 No. 1 Tahun 2013: 131-143
-
BAHAN DAN METODE
Penelitian dilakukan di Laboratorium Ke-sehatan Ikan dan
Lingkungan Balai Penelitiandan Pengembangan Perikanan Budidaya
AirPayau, Maros. Analisis sekuensing dilaksana-kan di Laboratorium
Bioteknologi UNIKAAtmajaya, Jakarta dan Laboratorium 1st
BaseSingapura. Tahapan Penelitian terdiri atas:
Isolasi Bakteri Vibrio Patogen dariPanti Benih dan Tambak Udang
Windu
Sampel bakteri dan udang windu diko-leksi dari tambak percobaan
Balai Penelitiandan Pengembangan Budidaya Air Payau,Maros di
Maranak dan Takalar serta tambak-tambak udang windu di Barru,
Pangkep,Pinrang, Banyuwangi, dan Bali. Bakteri diiso-lasi dari air
tambak, sedimen tambak, danudang sakit. Sampel air diambil dengan
meng-gunakan botol steril kemudian dibawa kelaboratorium. Sedangkan
sampel sedimendiambil menggunakan sudip steril dan di-bawa ke
laboratorium menggunakan botolsteril. Isolasi bakteri dilakukan
dengan caramengambil 1 mL air sampel dan 1 g sedimentambak kemudian
diencerkan secara ber-tingkat dalam larutan fisiologis (Benson,
1985)dan dikultur pada media TCBSA (ThiosulfateCitrate Bile Sucrose
Agar). Bakteri juga diisolasidari hepatopankreas udang windu.
Deteksi Gen Spesifik pada BakteriVibrio Berpendar
Pada penelitian ini digunakan primerspesifik untuk mendeteksi
gen-gen spesifiktoxR gene, haemolysin (vvh) gene dan GyrBgene
dengan metode PCR (Tabel 1). Primer-primer ini digunakan untuk
mendeteksi gen-gen spesifik pada isolat bakteri yang diisolasidari
tambak dan panti benih di berbagai daerahdi Sulawesi Selatan dan
Jawa.
Isolasi Genom Bakteri Kandidat
Metode yang digunakan dalam isolasigenom bakteri adalah metode
phenol-chloro-form yang dikembangkan oleh Parenrengi(2000). Bakteri
dikultur di dalam nutrient brothselama empat jam kemudian dipanen
dengancara sentrifugasi. Sebanyak 1 mL biakan bakteridipindahkan ke
dalam tabung eppendorf steril1,5 mL dan disentrifugasi (6.000 rpm;
10 menit).Proses sentrifugasi diulang sebanyak dua kalidan kemudian
dilakukan pencucian denganlarutan fisiologis juga dengan
sentrifugasi.
Pelet bakteri yang dihasilkan kurang lebih50 mg kemudian
dicampur dengan 500 μLlysis buffer, 20 μL proteinase-K (stok 20
mg/mL), dan 40 μL sodium dodecyl sulfate (SDS)10%. Setelah itu,
lisat bakteri diinkubasi dalamwaterbath selama 1-3 jam pada suhu
55oC.Penambahan 12,5 μL RNAse dilakukan sebe-lum lisat disimpan
pada suhu ruang selama 15-30 menit. Selanjutnya ditambahkan
Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol (PCIA 25:24:1)sebanyak 500 μL.
Tabung eppendorf di-homogenkan dengan menggunakan minimixer secara
perlahan sampai homogen dandisimpan pada suhu ruang selama 10
menit.Selanjutnya disentrifugasi pada kecepatan13.000 rpm selama
delapan menit. Lapisanpaling atas diambil dan dipindahkan ke
tabungeppendorf baru dan dilakukan penambahanPCIA seperti
sebelumnya.
Setelah lapisan paling atas dipindahkan ketabung eppendorf baru,
kemudian dilakukanpenambahan satu bagian larutan Chloroform:Isoamyl
alcohol (CIA 24: 1) dan disentrifugasiselama empat menit dengan
kecepatan 13.000rpm. Lapisan paling atas dipindahkan ke
tabungeppendorf baru. Kemudian ditambahkan duabagian ethanol
absolut dingin dan dicampurperlahan sampai homogen selanjutnya
di-lakukan sentrifugasi dengan kecepatan 6.000rpm selama 30 menit.
Cairan dibuang kemudianpelet DNA dicuci dengan 1 mL ethanol
70%kemudian disentrifugasi dengan kecepatan6.000 rpm selama 15
menit. Pellet DNA di-keringkan selama satu malam dan setelahkering
ditambahkan 100 μL Buffer Tris-Etilendiamin Tetra Acetic Acid
(EDTA) (TE) danselanjutnya disimpan pada suhu -20oC sampaidigunakan
(Parenrengi, 2000).
Proses PCR
Deteksi gen spesifik dilakukan denganmelakukan amplifikasi DNA
menggunakanteknik Polymerase Chain Reaction (PCR).Proses PCR
dilakukan menggunakan Kit PCRReady To Go (RTG) dengan primer
spesifikkomersil yang sudah ada dan dilakukanoptimasi pada beberapa
tingkatan suhu an-nealing.
Proses ampifikasi DNA untuk primer toxRadalah sebagai berikut:
larutan master mixdibuat dengan mencampur 20 μL aquadestmilliQ ke
dalam 1 tube RTG (GE Healthcare UKLimited Little Chalfont
Buckinghamshire, UK),kemudian ditambahkan masing-masing 1 μLPrimer
toxRR1 dan toxRF1 (Pang et al., 2006).
Desain primer spesifik untuk deteksi dini penyakit ..... (Ince
Ayu Khairana Kadriah)
133
-
Tab
el 1
.Pr
imer
spes
ifik
yan
g d
igunak
an u
ntu
k m
endet
eksi
keb
erad
aan g
en s
pes
ifik
Tab
le 1
.Sp
ecif
ic p
rim
ers
wer
e use
d t
o det
ect
the
pre
sence
of
spec
ific
gen
es
Sum
ber
(So
urc
e):
Can
o-G
om
ez e
t al. (
20
09
)
Ge
nPr
od
uk
gen
Na
ma
pri
mer
Se
ku
en
pri
me
r (5
' - 3
')Pa
nja
ng
Refe
ren
siG
enes
Gen
es p
rod
uct
Pri
mer
na
me
Pri
mer
sec
uen
ce (
5' - 3')
Len
gth
(b
p)
Ref
eren
ce
Su
b u
nit
B d
ari D
NA
gy
rase
A2
TC
TA
AC
TAT
CC
AC
CG
CG
G
Sub u
nit
B f
rom
gyra
se D
NA
B3
AG
CAA
TG
CC
ATC
TT
CA
CG
TT
C
tox
RF1
GA
AG
CA
GC
AC
TC
AC
CG
AT
tox
RR
1G
GT
GAA
GA
CT
CAT
CA
GC
A
VH
F1A
TC
AT
GA
AT
AA
AA
CT
ATT
AC
GT
TA
CT
VH
R1
GA
AA
GG
AT
GG
TT
TG
AC
AA
T
Vh
hem
oR
GC
TTG
AT
AAC
AC
TT
TG
CG
GT
308
Co
neje
ro &
He
dre
yd
a (2
004
)
gyrB
363
Th
aith
on
gn
um
et
al.
(20
06)
Re
gu
lato
r u
ntu
k tr
ansk
rip
tor
tran
smem
bra
ne (R
egul
ato
r fo
r tr
an
scri
pto
r tr
an
smem
bra
ne
)
vvh
Pro
tein
haem
oly
sin
Ha
emol
ysi
n p
rote
in1,2
57
Zh
ang
et
al.
(20
01
)
tox R
382
Pan
g e
t a
l. (2
006
)
134
J. Ris. Akuakultur Vol. 8 No. 1 Tahun 2013: 131-143
-
Setelah larutan dihomogenkan selanjutnyadimasukkan template DNA
sebanyak 3 μL. Kon-disi proses amplifikasi untuk primer
spesifiktoxR diatur sebanyak 30 siklus pada suhudenaturasi 94oC
selama satu menit, annealing57oC selama satu menit dan elongasi
72oCselama satu menit serta tahap ekstra elongasi72oC selama
sepuluh menit pada mesin PCR(Applied Biosystems 2720 Thermal
Cycler).Proses amplifikasi DNA untuk primer spesifikvvh gen
(haemolysin) diatur sebanyak 30 sikluspada suhu denaturasi 94oC
selama satu menit,annealing 53oC selama satu menit danelongasi 72oC
selama satu menit (Conejero &Hedreyda, 2004). Sedangkan untuk
amplifikasigen gyrB proses PCR juga diatur sebanyak 30siklus dengan
suhu denaturasi 94oC selamasatu menit, annealing 60oC selama satu
menitdan elongasi 72oC selama dua menit sertatahap ekstra elongasi
72oC selama tujuh menit(Thaithongnum et al., 2006).
Elektroforesis
Hasil PCR kemudian diaplikasikan padagel agarosa 2% untuk
diobservasi dan di-dokumentasikan. Elektroforesis minigel
hanyaoptimum untuk pemisahan DNA berukurankecil (ratusan bp hingga
sekitar 10 kb). Proseselektroforesis menggunakan minigel
yangdialiri listrik dengan voltase 150 V dan kuatampere 70 waktu
running selama 30 menit.Larutan yang digunakan adalah buffer
elek-troforesis yang diperlukan untuk menciptakankondisi stabil
selama proses berlangsung. Padaumumnya buffer yang digunakan berupa
TrisAceticacid EDTA (TAE) atau Tris Boric EDTA (TBE).Untuk pewarna
gel digunakan red gel sebagaipengganti etidhium bromide yang sudah
tidakdianjurkan lagi karena bersifat karsinogenik.
Desain Primer Spesifik
Gen-gen spesifik yang sudah berhasildiamplifikasi dengan primer
terpublikasikemudian dianalisis urutan basa DNA-nyadengan metode
sekuensing. Hasil sekuensingini menjadi rujukan untuk mendesain
primerspesifik. Setelah hasil sekuensing sudah di-peroleh
selanjutnya adalah mengumpulkansekuen gen target sebagai referensi.
Sekuenreferensi dapat diperoleh dari databaseGenBank di situs NCBI
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Sekuen referensi akan
digunakandalam uji BLAST (http://blast.ncbi.nlm. nih.gov/Blast)
untuk mengetahui kemiripansekuen gen yang dimiliki dengan sekuen
dari
gen sejenis yang sudah terdeposit pada NCBI.Urutan basa dari gen
target dalam formatnotepad dapat langsung diunduh setelahlaman
NCBI/BLAST/blastn suite terbuka.Tahapan selanjutnya adalah
menentukanperangkat lunak yang akan digunakan untukdesain primer.
Pada dasarnya sembarangdaerah tertentu pada sekuen referensi
dapatdiambil untuk dijadikan primer, tanpa perlubantuan perangkat
lunak khusus. Namun padapenelitian ini digunakan bantuan
perangkatlunak Primer3 Plus
(http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3). Setelah software
sudahberhasil diunduh, maka proses desain primersudah dapat
dimulai.
HASIL DAN BAHASAN
Hasil Deteksi Gen-Gen Spesifik padaVibrio Berpendar
Dari 35 isolat yang diisolasi dari berbagaidaerah, 22 isolat
terdeteksi memiliki genspesifik, di mana sembilan di antaranya
terde-teksi memiliki dua gen spesifik (Tabel 2). Isolatbakteri yang
memiliki gen spesifik ini kemudiandiuji virulensinya dengan uji
patogenisitassecara invivo menggunakan hewan uji udangwindu. Isolat
kode 1, 120, 170, dan 275 ter-bukti memiliki tingkat patogenisitas
lebihtinggi dibandingkan isolat bakteri vibrioberpendar lainnya
(Tabel 2). Isolat yangmemiliki tingkat patogenisitas tinggi
kemudiandipilih untuk dikarakterisasi gen spesifikhaemolysin dan
gyrase-nya dengan prosessekuensing. Untuk gen spesifik ToxR
tidakdapat disekuensing disebabkan hasil PCRyang divisualisasikan
pada gel elektroforesismenunjukkan adanya penempelan yang
tidakspesifik dari primer (unspecific annealing)sehingga tidak
terbentuk pita tunggal DNA.
Haemolysin adalah eksotoksin yang ber-tanggung jawab dalam
proses penyerapanmembran eritrosit atau proses hemolisis seldarah.
Gen yang mengkode haemolysin inidilaporkan ditemukan pada beberapa
spesiesbakteri yang termasuk genus vibrio (Conejero& Hedreyda,
2004). Bakteri vibrio patogenyang memiliki gen haemolysin diketahui
dapatmenyebabkan terjadinya lysis pada sel darahinang.
Enzim gyrase terdistribusi hampir padasemua spesies dalam genus
vibrio. Enzim iniyang mengurangi tekanan saat double-stranded DNA
sedang tidak terikat oleh ikatanhelikase hal ini menyebabkan
terjadinya
Desain primer spesifik untuk deteksi dini penyakit ..... (Ince
Ayu Khairana Kadriah)
135
-
superkoiling DNA. Banyak antibiotik bekerjadengan menyerang
gyrase. Gyrase DNAbakteri hadir di prokariota dan
beberapaeukariota, tetapi enzim ini tidak sepenuhnyamirip dalam
struktur atau urutan, dan memi-liki kedekatan yang berbeda untuk
setiapmolekul yang berbeda. Enzim ini tidak dite-mukan pada
manusia. Hal ini membuat gyrasesebagai target yang baik untuk
antibiotik.Bakteri patogen memiliki struktur gen Gyr-Byang spesifik
dibandingkan bakteri lainnya(Thaithongnum et al., 2006).
Hasil Sekuensing Gen-Gen SpesifikVibrio Berpendar
Hasil sekuensing gen haemolysin daribakteri hasil koleksi
menunjukkan kemiripan94% dengan gen haemolysin bakteri V.
harveyiyang terdeposit pada NCBI (Gambar 1).
Sedangkan hasil sekuensing gen gyrasememiliki kemiripan 99%
dengan gen gyrasebakteri V. harveyi (Gambar 3). Kemiripan gentarget
yang diisolasi dibandingkan denganbeberapa sekuen referensi
menentukanberhasil tidaknya isolasi gen spesifik. Jumlahsekuen
referensi yang diperlukan tergantungdari sampel target. Semakin
banyak referensisekuen gen yang kita peroleh akan lebih baikagar
kita dapat mendesain primer di daerahyang benar-benar sama
(conserved region)setelah sekuen tersebut disejajarkan
(align-ment). Pada dasarnya satu data sekuen sudahdapat dijadikan
referensi dengan syarat bahwasampel target nantinya memiliki
kesamaanspesies atau dengan kata lain secara genetiksangat mirip.
Hasil sekuensing selanjutnyadigunakan untuk mendesain primer
spesifikbakteri Vibrio patogen.
136
J. Ris. Akuakultur Vol. 8 No. 1 Tahun 2013: 131-143
Tabel 2. Hasil deteksi gen-gen spesifik bakteri vibrio
berpendar
Table 2. The results of the detection of specific genes luminous
Vibrio
tox-R haemo gyr-B
1 Banyuwangi
2 Bali
3 Bali
5582 Maros
5584 Maros
5585 Maros
109 Maros
120 Maros
128 Maros
133 Maros
137 Maros
139 Maros
154 Maros
159 Maros
671 Maros
672 Maros
673 Maros
676 Maros
168 Takalar
170 Takalar
275 Pinrang
276 Pinrang
Kode isolat uji Code of isolates
Asal Origin
Gen-gen spesifik (Specific genes )
-
Sekuen gen haemolysin
>1st_BASE_399953_1hem_VhF1
GTAGTGCTATACTACATTAATCTTGCTCCGCAGCCGACTCATCAGAGCCTTCTTACCTGCTAAATGCCTCAGAAGTGAGAAGCGCACAACAAAAGCAAACATACACCTACGTACGATGCTGGTATCGAACTAGTTATTCACATGATGACCCAGAAACCGACTGGGAGTGGGCAGAAAATCCAGATGGCAGTTATTTCACTATCGAAGGCTATTGGTGGAACGCACTCTCGTTTAAAAACATGTTCTATACCAATACACCGCAAAGTGTTATCAAGCAAAANCCCATTNAG
Gambar 1. Hasil sekuensing dan alignment gen haemolysin
Figure 1. Result of sequencing and alignment of haemolysin
gene
Desain primer spesifik untuk deteksi dini penyakit ..... (Ince
Ayu Khairana Kadriah)
137
-
Gam
bar 2
.El
ektr
ofo
regra
m h
asil
seku
ensi
ng u
ntu
k gen
haem
olys
in
Figu
re 2
.El
ectr
ofor
egra
m o
f h
aem
olys
in g
ene
sequen
cing r
esult
138
J. Ris. Akuakultur Vol. 8 No. 1 Tahun 2013: 131-143
-
Gambar 3. Hasil sekuensing dan alignment gen gyrase
Figure 3. Gyrase gene sequencing and alignment result
Sekuen gen gyrase
>1st_BASE_399959_120_gyr_A2
NGGCCTTATAGCAAACTTACCATCACGGTGAGCCTCAAGCGCCACTAGCAGTAATTGGTGATACTGACCAAACGGGTACACAGATCCGCTTCTGGCCAAGCGCTGAAACCTTCACAAATATCGAATTCCATTACGATATCCTAGCAAAACGTCTACGTGAGCTTTCTTTCCTAAACTCAGGTGTTTCTATCAAGCTGGTTGATGAGCGTGAAGCAGACAAGAGTGACCACTTCATGTTTGAAGGTGGTATTCAAGCGTTCGTTGAGCACCTAAACACCAACAAAACACCGATCATTGAGAAAATCTTCCACTTCTATTTTGAACGTGAAGATGGCATTGCTATAAAATA
Desain primer spesifik untuk deteksi dini penyakit ..... (Ince
Ayu Khairana Kadriah)
139
-
Gam
bar 4
.El
ektr
ofo
regra
m h
asil
seku
ensi
ng u
ntu
k gen
gyr
ase
Figu
re 4
.El
ectr
ofor
egra
m o
f gyr
ase
gen
e se
quen
cing r
esult
140
J. Ris. Akuakultur Vol. 8 No. 1 Tahun 2013: 131-143
-
Desain Primer Spesifik
Desain primer spesifik dilakukan denganbantuan perangkat lunak
Primer3Plus denganmenggunakan hasil sekuen gen spesifikhaemolysin
dan gyrase (Gambar 5). Penseja-jaran secara manual dilakukan untuk
mem-bandingkan sekuen gen dari bakteri hasilkoleksi dengan sekuen
gen sejenis yangterdeposit pada NCBI (Gambar 6). Pada dasar-nya
sembarang daerah tertentu pada sekuenreferensi dapat diambil untuk
dijadikan primer,tanpa perlu bantuan software khusus. Namuncara ini
amat berisiko karena kita tidakmengetahui bagaimana kualitas primer
yangdihasilkan nantinya.
Hasil desain diperoleh tiga pasang primeruntuk deteksi gen
haemolysin dan dua pasangprimer untuk gen gyrase (Tabel 3). Pada
setiaphasil desain primer yang dikeluarkan olehperangkat lunak
Primer3 selalu terdapatpasangan primer forward dan reverse
yangdirekomendasikan serta pilihan pasanganprimer lain sebagai
cadangan.
UCAPAN TERIMA KASIH
Penelitian ini bagian dari riset ManajemenKesehatan Ikan dan
Lingkungan Balai Pene-litian dan Pengembangan Budidaya Air Payaudan
dibiayai oleh APBN Kementerian Kelautandan Perikanan tahun anggaran
2010-2011.
Gambar 5. Proses desain primer menggunakan perangkat lunak
Primer3Plus
Figure 5. Primer design process using software Primer3Plus
Desain primer spesifik untuk deteksi dini penyakit ..... (Ince
Ayu Khairana Kadriah)
141
-
DAFTAR ACUAN
Austin, B. & Zhang, X.-H. 2006. Vibrio harveyi: asignificant
pathogen of marine vertebratesand invertebrates. Lett. Appl.
Microbiol., 43:119-124.
Baticados, M.C.L., Lavilla-Pitogo, C.R., Cruz-Lacierda, E.R., de
la Pena, L.D., & Sunaz,N.A. 1990. Studies on the chemical
con-trol of luminous bacteria Vibrio harveyi
and V. splendidus isolated from diseasedPenaeus monodon larvae
and rearing wa-ter. Diseases of Aquatic Organism., 9: 133-139.
Bej, A.K., Patterson, D.P., Brasher, C.W., Vickery,M.C., Jones,
D.D., & Kaysner, C.A. 1999.Detection of total and
haemolysin-produc-ing Vibrio parahaemolyticus in shellfishusing
multiplex PCR amplification of tl, tdhand trh. J. Microbiol.
Methods, 36: 215-225.
Tabel 3. Hasil desain primer spesifik
Table 3. The result of specific primer design
Nama oligo Sekuen (5’ - 3’ ) PanjangOligo name Secuence (5’ - 3’
) Length (bp)
IAVhF1 CAAAAGTGAAAAGCGCACAA 20
IAVhF2 TGAAAAGCGCACAACAAAAG 20
IAVhF3 GAAGTGAGAAGCGCACAACA 20
IAVhR1 TTCCACCAATAGCCTTCGAT 20
IAVhR2 TTAAACGAGAGTGCGTTCCA 20
IAVhR3 AACACTTTGCGGTGTATTGG 20
IAGyrF1 TGACCAAACGGGTACACAGA 20
IAGyrF2 CCAAACGGGTACACAGATCC 20
IAGyrR1 CAACGAACGCTTGAATACCA 20
IAGyrR2 CGAACGCTTGAATACCACCT 20
Gambar 6. Proses pensejajaran hasil sekuen secara manual
menggunakan perangkat lunak Bioedit
Figure 6. The process sequence alignment results manually using
software Bioedit
142
J. Ris. Akuakultur Vol. 8 No. 1 Tahun 2013: 131-143
-
Ben_Haim, Y., Thompson, F. L., Thompson, C.C., Cnockaert, M.C.,
Hoste, B., Swings, J., &Rosenberg, E. 2003. Vibrio
coralliilyticus sp.nov., a temperature-dependent pathogenof the
coral Pocillopora damicornis. Int. J.Syst. Evol. Microbiol., 53:
309-315.
Benson, H.J. 1985. Microbiological Applica-tions: A. Laboratory
Manual in GeneralMicrobiology. Fourth Edition. Wm. C.
BrownPublishers. Dubuque, Iowa, 450 pp.
Cano-Gomez, A., Bourne, D.G., Hall, M.R., Owens,L. & Hoj, L.
2009. Molecular identification,typing and tracking of Vibrio
harveyi inaquaculture systems: Current methods andfuture prospects.
Aquaculture, 287: 1-10.
Conejero, M.J.U. & Hedreyda, C.T. 2004. PCRdetection of
haemolysin (vhh) gene inVibrio harveyi. J. Gen. Appl. Microbiol.,
50:137-142.
Cunningham, C.O. 2002. Molecular diagnosisof fish and shellfish
diseases: present sta-tus and potential use in disease
control.Aquaculture, 206: 19-55.
Defoirdt, T. 2007. Quorum sensing disruptionand the use of
short-chain fatty acids andpolyhydroxyalkanoates to control
lumines-cent Vibriosis. PhD thesis, Ghent Univer-sity, Belgium, 228
pp.
Karunasagar, I., Pai, R., Malathi, G.R., &Karunasagar, I.
1994. Mass mortality ofPenaeus monodon larvae due to
antibiotic-resistant Vibrio harveyi infection. Aquacul-ture, 128:
203-209.
Moriarty, D.J.W. 1998. Control of luminousVibrio species in
penaeid aquacultureponds. Aquaculture, 168: 351-358.
Nishibuchi, M., Khaeomanee-iam, V., Honda, T.,Kaper, J.B., &
Miwatani, T. 1990. Compara-
tive analysis of the haemolysin genes ofVibrio cholerae non-O1,
Vibrio mimicus, andVibrio hollisae that are similar to the tdhgene
of Vibrio parahaemolyticus. FEMSMicrobiol. Lett., 67: 251-256.
Nishibuchi, M. & Kaper, J. 1995. Thermostabledirect
haemolysin gene of Vibrio para-haemolyticus: A virulence gene
acquiredby a marine bacterium. Infect. Immun., 63:2,093-2,099.
Pang, L., Zhang, X.H., Zhong, Y., Chen, J., Li, Y.,& Austin,
B. 2006. Identification of Vibrioharveyi using PCR amplification of
the toxRgene. Lett. Appl. Microbiol., 43: 249-255.
Parenrengi, A. 2000. Studies on genetic vari-ability of groupers
(Genus: Epinephelus)from Indo-Malaysian waters using PCR-RAPD
Analysis. Thesis master of Science,Kolej University Terengganu,
UniversitiPutra Malaysia, 174 pp.
Saulnier, D., Haffner, P., Goarant, C., Levy, P., &Ansquer,
D. 2000. Experimental infectionmodels for shrimp Vibriosis studies:
a re-view. Aquaculture, 191: 133-144.
Thaithongnum, S., Ratanama, R., Weeradechapol,K., Sukhoom, A.,
& Vuddhakul, V. 2006. De-tection of Vibrio harveyi in shrimp
post-lavae and hatchery tank water by the mostprobable number
technique with PCR.Aquaculture, 261: 1-9.
Zhang, X.H. & Austin, B. 2000. Pathogenicity ofVibrio
harveyi to salmonids. J. Fish Dis., 23:93-102.
Zhang, X.H., Meaden, P.G., & Austin, B. 2001.Duplication of
haemolysin genes in a viru-lent isolate of Vibrio harveyi. Appl.
Environ.Microbiol., 67: 3,161-3,167.
Desain primer spesifik untuk deteksi dini penyakit ..... (Ince
Ayu Khairana Kadriah)
143