UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS Curso de Graduação em Farmácia-Bioquímica DENGUE: ALVOS MOLECULARES POTENCIAIS E NOVAS PERSPECTIVAS TERAPÊUTICAS Mariana Montemagni Pires Trabalho de Conclusão do Curso de Farmácia-Bioquímica da Faculdade de Ciências Farmacêuticas da Universidade de São Paulo. Orientador(a): Profa. Dra Jeanine Giarolla Vargas São Paulo 2017
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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
Curso de Graduação em Farmácia-Bioquímica
DENGUE: ALVOS MOLECULARES POTENCIAIS E NOVAS
PERSPECTIVAS TERAPÊUTICAS
Mariana Montemagni Pires
Trabalho de Conclusão do Curso de
Farmácia-Bioquímica da Faculdade de
Ciências Farmacêuticas da
Universidade de São Paulo.
Orientador(a):
Profa. Dra Jeanine Giarolla Vargas
São Paulo
2017
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SUMÁRIO
p.
Lista de Abreviaturas 3
Resumo 5
1. Introdução 7
2. Objetivos 13
3. Materiais e Métodos 14
4. Resultados e Discussão 15
4.1. Inibidores de Entrada 18
4.2. Inibidores de Replicação 24
5. Conclusão 31
6. Bibliografia 33
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LISTA DE ABREVIATURAS
ADE Dengue exacerbada dependente de anticorpo (antibody-dependent
enhancement)
AIDS Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (Acquired Immunodeficiency
Syndrome)
ALT Alanina aminotransferase
ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária, Brasil
AST Aspartato aminotransferase
βOG N-octil-β-d-glicosídeo
CC50 Concentração do composto que provoca morte em 50% das células
CDC Centro de controle e prevenção da doença (Center for Disease
(FWFTLIKTQAKQPARYRRFC), com EC50 de 3 µM, mimetiza a região
responsável pela conexão dos domínios I e II (aminoácidos 41 a 60) e interage
com proteínas E monoméricas. Altera, portanto, a estrutura da superfície dos
vírions e a simetria icosaédrica do vírus, bloqueando adesão e fusão (COSTIN
et al., 2010; NICHOLSON et al., 2011; LIM et al., 2013).
4.2. Inibidores de replicação
A Tabela II apresenta as estruturas químicas dos compostos discutidos
nesta seção.
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Tabela II. Estruturas químicas dos inibidores de replicação
ARDP0006 (LIM et al., 2013)
ARDP0009 (TOMLINSON et al., 2009)
7-DMA/ MK-0608 (CARROLL et al., 2009)
Composto 1/ NITD008 (CHEN et al., 2010)
Composto 32 (STEUER et al., 2011)
Ivermectina (LIM et al., 2013)
N S
NH2
O
HN
S
NN
ST-148 (SCATURRO et al., 2014)
ST-610 (BYRD et al., 2013a)
Byrd e colaboradores (2013) demonstraram que o composto ST-148
(Tabela II) é capaz de diminuir a replicação dos quatro sorotipos da dengue em
células hospedeiras. Os achados mostraram a diminuição da viremia em 52
vezes, se administrado por via intravenosa, ou em 3 vezes, se administrado via
oral, sem apresentar citotoxicidade. Reduziram, ainda, os níveis de citocinas
inflamatórias, em testes in vivo (BYRD et al., 2013a). ST-148 reduz a
quantidade de proteína C (capsídeo), disponível para a montagem dos vírions.
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O composto compromete a redistribuição desta proteína do citosol para o
nucléolo, além da ligação às gotículas de lipídeo derivada do retículo
endoplasmático (BYRD et al., 2013a; SCATURRO et al., 2014). Além disso,
provoca estabilização da interação entre os dímeros de proteína C, formando
oligômeros, após o tratamento. O resultado final é a diminuição da replicação
viral e, portanto, da viremia. Esta estabilização afeta, também, a capacidade do
vírus em infectar uma célula após sua entrada, pois, uma vez no citosol, a
estabilização do capsídeo impede a liberação do RNA. A presença de ST-148
leva à alteração na posição das hélices α3 e α4. Por esta razão, ocorre a
abertura de uma fenda entre a hélice α1 de um dímero e as hélices α1’ e α3’ do
outro dímero, onde o composto se liga, estabilizando o tetrâmero (Figura 6). A
cadeia fenil do composto se liga à Phe 33, enquanto a fração tieno piridina
interage com a Ser 34 e Arg 68. Resíduos lipofílicos da fenda fortalecem a
ligação do ST-148, uma fez que o composto é altamente lipofílico. A ligação à
Ser 34 é fundamental. Demostraram-se que mutações neste aminoácido levam
à perda de atividade (SCATURRO et al., 2014). Ademais, ligação às hélices α1
prejudica a interação do capsídeo com membranas, afetando a montagem de
novos vírions (BYRD et al., 2013a).
Os tons em laranja representam um dímero, e os tons em azul, outro dímero; ST-148 é representado em verde; O aminoácido S34 é representado no modelo CPK.
Figura 6. Conformação do capsídeo tetrâmero antes (esquerda) e depois
(direita) da ligação de ST-148 ao aminoácido S34 (adaptado de SCATURRO et al.,
2014).
Estudaram-se ARDP0006 e ARDP0009 devido às eficácias em inibir
replicação em DENV-2, in vitro (Tabela II). Ambas as moléculas apresentaram
baixa toxicidade e boa seletividade para NS2B-NS3 protease: ARDP0006 EC50
= 4,2 ± 1,9 µM e CC50 = 69 ± 4 µM, e ARDP0009 EC50 = 35 ± 8 µM e CC50 ≥
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300 µM. ARDP0006 interage com o sítio ativo desta enzima nos resíduos Gln
35, His 51 e Ser 135 e com o bolsão S1, nos resíduos Gli 151 e Gli 153.
ARDP0009 também interage com os mesmos resíduos, mas possui uma
interação extra com o resíduo Tyr 150 no bolsão P1 (Figura 7) (TOMLINSON et
al., 2009).
Em rosa: sítio ativo da protease
Em verde: bolsão S1 da protease
Figura 7. Interação dos compostos ARDP0006 (A) e ARDP0009 (B) com a NS2B-NS3
protease (TOMLINSON et al., 2009).
Estudo realizado por Steuer e colaboradores (2011) teve como objetivo
sintetizar possíveis inibidores da NS3 protease. Sabendo-se que a enzima
apresenta uma serina (Ser 135) em seu sítio ativo, pensou-se, primeiramente,
em aldeídos para a síntese. Este grupo funcional interage com a serina
nucleofílica, de forma covalente e reversível, formando hemicetais. Os
aldeídos, no entanto, foram substituídos por α-cetoamida, por serem mais
eletrofílicas. Tentativas de planejamento como: saturação e redução da cadeia,
substituição da insaturação por um ciclopropil, substituição da função α-ceto
por α-hidroxi e por α-epoxi, ou substituição da função cetoamida por amida
resultaram em compostos com baixa atividade. Já a metilação na posição β é
tolerada. Isso mostra que a função α-cetoamidas é fundamental para a
atividade do composto. A insaturação por sua vez, confere à molécula
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conformação rígida e plana, necessária para a interação com a região 1 do sítio
ativo (S1), onde está a Ser 135. Acredita-se que a metilação tolerada na
posição β seja um indício de que a molécula pode ser substituída, nesta
posição, por cadeias que interajam com a segunda região do sítio ativo (S2).
Estabelecido como grupo farmacofórico a cadeia α-cetoamida β,γ-insaturada
(composto 1, Tabela II), prosseguiu-se com variações da cadeia aril, na
posição γ. Nesta etapa, observou-se que grupos doadores de elétrons
conferem atividade inibitória, enquanto grupos aceptores diminuíam esta
atividade. Grupo das posições 3 ou 4 do anel deve ser um doador de elétron
em S1, por ligação de hidrogênio, para Tyr150 e Asp129. Por fim, analisaram-
se as substituições no nitrogênio da α-cetoamida. Grupos alquil menores, como
o metil, e maiores, como o pentil, mantiveram a atividade. Por outro lado,
ciclohexano e o benzeno levaram à perda de atividade devido à alta
hidrofobicidade. Já os grupos com heteroátomos apresentaram bons
resultados. Estes grupos apresentam caráter hidrofílico, especialmente os
grupos contendo oxigênio. Selecionou-se o composto 32 (Tabela II) como
melhor opção de tratamento por, além de ter alta atividade inibitória, é seletivo
à protease, apresentando baixa interação com a trombina humana. Testes in
vitro comprovaram sua eficácia, ao diminuir em 1000 vezes a viremia. Não
mostrou citotoxicidade nas concentrações utilizadas (STEUER et al., 2011). A
Figura 8 mostra as interações da molécula com a protease, em comparação ao
grupo farmacofórico.
Figura 8. Representação das interações entre o sítio ativo da NS3 protease e os
compostos 1 (rosa) e 32 (verde) (adaptado de STEUER et al., 2011).
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O composto ST-610 (Tabela II), por sua vez, foi identificado como
potente inibidor da helicase da proteína NS3, inibindo-a nos quatro sorotipos da
dengue. Alguns dos resultados em testes in vivo foram: (1) EC50 = 0,236 ± 0,06
µM para DENV-1, EC50 = 0,272 ± 0,05 µM para DENV-2, EC50 = 0,256 ± 0,17
µM para DENV-3, EC50 = 0,203 ± 0,09 µM para DENV-4 e (2) citotoxicidade de
CC50 ≥ 100 µM (BYRD et al., 2013b; CHAN, OOI, 2015). Acredita-se que ele
interaja com o resíduo Ala 263 da proteína, que, junto com outros aminoácidos,
como Thr 264, estabeleçam ligação de hidrogênio com a cadeia hidroxil-ribose
dos substratos do RNA. Desta forma, ST-610 pode interferir na ligação da
proteína com os substratos do ácido nucleico ou pode translocar a fita de RNA
pelo canal (BYRD et al., 2013b).
Ivermectina (Tabela II), atualmente utilizada como anti-helmintos,
demonstrou atividade anti-dengue, in vitro, para os quatro sorotipos, em dois
estudos. A molécula interage com IMPα/β1, inibindo o reconhecimento de NS5
por esta proteína (EC50 = 1,6 µM para DENV-1; EC50 = 1,4 µM para DENV-2;
EC50 = 1,2 µM para DENV-3; EC50 = 1,3 µM para DENV-4). Apesar de não
atuar sobre NS5, há indícios de que apresente atividade inibitória sobre NS3. A
proteína NS5, para desempenhar sua função como polimerase, contém, entre
os aminoácidos 320 e 405, a região NLS (do inglês, nuclear localization
sequence). Esta região é responsável pelo sinal de importação nuclear. Já a
denominada região NES (do inglês, nuclear export signal), é responsável pelo
sinal de exportação. Juntas, elas medeiam o transporte nucleocitoplasmático
de NS5. Neste sentido, NLS é reconhecida pela IMPα/β1 (importina), a qual faz
o transporte de proteínas para o núcleo celular. Portanto, uma vez bloqueada a
importina, o transporte de NS5 para o núcleo celular será interrompido. A
função nuclear desta proteína será inibida (WAGSTAFF et al., 2012; TAY et al.,
2013).
Inibidores de polimerase são classificados em duas categorias:
(1) Inibidores análogos ao nucleotídeo (NIs, do inglês nucleotide analog
inhibitors). Quando convertidos ao trifosfato correspondente, competem com os
substratos naturais (nucleotídeos) e são incorporados à cadeia de RNA. Como
resultado, levam ao término da elongação ou causam mutações nas próximas
sínteses de RNA. Esta categoria é a mais utilizada, porém apresenta maior
potencial para o desenvolvimento de resistência pela polimerase;
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(2) Inibidores não-nucleotídicos (NNIs, do inglês non-nucleotide inhibitors)
ligam-se ao sítio alostérico, inativando a enzima ou impedindo alterações
conformacionais necessárias para a iniciação e elongação na síntese de RNA
(LIM et al., 2013).
Schul e colaboradores (2007) analisaram uma série de compostos e
identificaram, entre eles, o 7-DMA (7-deaza-2’-C-metiladenosina) (Tabela II)
(SCHUL et al., 2007). Esta molécula também foi estudada por Carroll e
colaboradores devido à sua eficácia contra HCV. Estes pesquisadores a
nomearam como MK-0608 (Tabela II) (CARROLL et al., 2009). O composto foi
capaz de reduzir a viremia de dengue em testes in vivo, atuando em NS5
polimerase (RdRp). Diminuiu, também, a resposta inflamatória aguda ao vírus,
já que os níveis de TNF-α, IL-6, IL-12, IFN-γ e MCP-1 abaixaram após o
tratamento (SCHUL et al., 2007). Baseado nisso, Chen e colaboradores (2007)
demonstraram que o composto 1 (Tabela II) também foi capaz de bloquear a
síntese de RNA viral, reduzindo, em 10 vezes a viremia. Após sua conversão
para a forma 5’-trifosfatada, o composto atua como um NI, competindo com os
substratos naturais a serem inseridos no RNA pela NS5 polimerase. A porção
3’-OH da ribose é fundamental para a ligação do composto ao RNA. Já a
porção 2’-C-acetileno, após inserida na cadeia, faz impedimento estérico e
bloqueia o elongamento da fita. O planejamento iniciou com alguns
substituintes na posição 2’-C em análogos de adenosina. Compostos com as
substituições metila e acetileno apresentaram os melhores resultados (EC50 =
1,12 µM e CC50 ≥ 50 µM para metila; EC50 = 1,41 µM e CC50 ≥ 40 µM para
acetileno), enquanto as substituições etila, vinila e propino resultaram em perda
de atividade (EC50 ≥ 50 µM). Prosseguiu-se, então, com a análise da atividade
de análogos 2’-C-acetileno ribose de outras bases, citocina e guanosina, porém
ambos os compostos apresentaram resultados insatisfatórios (EC50 ≥ 100 µM).
Sabendo-se que análogos de adenosina com substituição 2’-C-alquil na ribose
sofrem desaminação, pela adenosina desaminase intracelular, para derivados
de inosina, substituiu-se o nitrogênio da posição 7 por um carbono (composto
1) (tabela III). Esta alteração, por impedir a modificação intracelular do
composto, melhorou sua atividade (EC50 = 0,7 µM) e citotoxicidade (CC50 ≥ 100
µM). Algumas substituições no carbono 7 foram testadas, no entanto, todas
falharam (CHEN et al., 2010). Importante mencionar que este composto é um
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pró-fármaco que depende de enzimas conversoras para que sua forma
trifosfatada seja obtida.
Tabela III. Análogo de adenosina vs Composto 1/ NITD008
Análogo de adenosina com substituição 2’-C-acetileno
(adaptado de CHEN et al., 2010)
Composto 1/ NITD008 (adaptado de CHEN et al., 2010)
5. CONCLUSÃO
Embora a dengue atinja milhões de pessoas anualmente (WHO, 2017;
BHATT et al., 2013), ainda não existe um tratamento capaz de curar a doença
(CDC, 2016; NHS, 2016). Seu controle, atualmente, é realizado apenas com
terapia de suporte (MS, 2016; WHO, 2009), prevenção por controle do vetor
(MURRAY, QUAM, WILDER-SMITH, 2013) e, mais recentemente, por vacina
(ANVISA, 2017b; G1, 2016; Sanofi Pasteur, 2017). Inúmeros são os compostos
estudados para o tratamento da dengue, obtidos por Structure Based Drug
Design no caso de novas moléculas, ou estudados contra alvos diferentes, no
caso de medicamentos já existentes para outras doenças. No entanto, poucos
são os compostos que seguem para estudos clínicos. Para isso, é necessário
entender-se as limitações e aplicar-lhes melhorias moleculares.
Neste trabalho foram apresentadas 13 moléculas promissoras. Entre
elas, três já haviam sido estudadas para outras doenças (CRDS, ivermectina,
7-DMA/MK-0608) e dez eram novos compostos (SA-17, NITD448, DN59,
1OAN1, ST-148, ARDP0006, ARDP0009, composto 32, ST-610 e composto
1/NITD008). Ainda, quatro apresentaram eficácia e segurança in vivo (7-
DMA/MK-0608, ST-148, ST-610 e composto 1/NITD008) e nove foram
estudadas apenas em testes in vitro (CRDS, SA-17, NITD448, DN59, 1OAN1,
ARDP0006, ARDP0009, composto 32 e ivermectina). Entretanto, nenhuma
delas foi avaliada em ensaios clínicos, até então. Para se prosseguir com
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estudos clínicos é necessário que a molécula tenha demonstrado eficácia e
segurança em estudos in vivo (ANVISA, 2017a).
Entre os compostos, 7-DMA/MK-0608 e 1/NITD008, já avaliados em
animais, apresentaram bom perfil farmacocinético para administração oral, com
boa disponibilidade na administração de duas doses orais ao dia, por três dias
(SCHUL et al., 2007; YIN et al., 2009). Já o composto ST-148 apresentou
queda na viremia de três vezes no tratamento oral e de 52 vezes no tratamento
intravenoso (BYRD et al., 2013a). O ST-610 mostrou biodisponibilidade oral de
apenas 7% enquanto a biodisponibilidade intraperitoneal foi de 56% (BYRD et
al., 2013b). Ambos precisam, portanto, de modificações moleculares, as quais
possam melhorar seu perfil farmacocinético. O 1/NITD008 apresentou, no
entanto, efeitos adversos em tratamentos de duas semanas em ratos e
cachorros (YIN et al., 2009). Avaliações futuras devem ser feitas a fim de se
identificar as causas e contorná-las, para que o composto possa ser,
finalmente, testado em humanos. Já durante o estudo in vivo de 7-DMA/MK-
0608, nenhum obstáculo foi encontrado (SCHUL et al., 2007). Ensaios clínicos
podem ser realizados para a molécula.
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6. BIBLIOGRAFIA
ANVISA. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Considerações e
definições para pesquisa clínica. Disponível em: http://www.anvisa.gov.br/
medicamentos/pesquisa/def.htm. Acesso em: 13 Abril 2017 (a).
ANVISA. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Consulta a