Degradation of Caffeine by Microorganism and the Use of Decaffeinated Coffee Pulp for Animal Feeding

¡Mas Café Por Favor! Jesabel I. Rivera De Jesús

Seminario LargoProf. Dimaris Acosta

Degradación de Cafeína de la Pulpa del Café por Pseudomonas sp. y su Uso Como Alimento para Animales

Objetivos del seminario

• Entender la importancia de la degradación de cafeína proveniente de la pulpa del café.

• Entender los efectos de la pulpa del café en animales.

• Entender el patrón de degradación de cafeína por Pseudomonas sp.

• Entender la naturaleza de enzimas envueltas en la degradación.

Producción del Café

• Procesos mas comunes– Húmedo• Mas simple

– Seco• Método nuevo

http://soluble-coffee.com/coffee_processing_methods.html

Cafeína

¿Cómo podemos utilizar la pulpa del café?

Potencial Biotecnológico de la Pulpa del Café

• Biotechnological potential of coffee pulp and coffee husk for bioprocesses– Ashok Pandey et. al. (2000)

• Sistema de cultivo• Optimización de bioprocesos• Composta• Producción de alimentos

Efectos de la pulpa del café en la alimentación de animales

Adrianyela Noriega Salazar, et. al.

2008

Objetivos

• Estudiar los efectos de la alimentación de animales con pulpa de café fresca y la pulpa ensilada.

http://www.ecoliblog.com/2007/12/articles/e-coli-watch/the-effects-of-a-cows-diet-on-e-coli-levels/

Hipótesis

Si la pulpa del café es rica en nutrientes entonces será una alimentación saludable

para animales.

Metodología

• Selección de – 6 vacas– 6 gallos– 6 conejos– 6 cerdos

• Se alimentaron 3 con pulpa de café fresca y 3 con pulpa de café ensilada.

Metodología (cont.)

• Cada dos semanas– Se pesaron– Se midieron

• Se observó su comportamiento

ResultadosAnimal Pulpa de café fresca Pulpa de café

ensilada

Vacas •Novillos redujeron ganancia en peso.•Intranquilas

•No afecto su producción de leche.•No efectos en crecimiento

Cabras •Redujeron su peso•Intranquilos

•Machos con mejor desempeño•No afecta crecimiento.

Gallos •Efectos dañinos en la digestión.

•Efectos dañinos en la digestión.

Conejos •Intranquilos No afecta

Cerdos •Perdida de peso No afecta

Conclusiones

• La pulpa de café ensilada tiene en mejor potencial nutritivo que la pulpa de café fresca.– Nutritiva!

• La pulpa de café fresca, tiene un efecto negativo en los animales.

¿Cómo Descafeinar La Pulpa Del Café?

¿Cómo Pseudomonas Sp. Degrada La Cafeína?

A Preliminary Study Of Caffeine Degradation By Pseudomonas Sp. Gsc 1182

Sathyanarayana N. Gummadi, et. al.

Objetivos

• Entender la habilidad que tiene Pseudomonas sp. para utilizar la cafeína como fuente de carbono y nitrógeno.

• Cual es el efecto de azucares, pH y otras fuentes de nitrógeno y carbono , en la degradación de cafeína.

Hipótesis

La degradación de cafeína será influenciada por azucares y pH.

Materiales y Métodos

• Muestras de suelo en varias profundidades– Plantaciones de Café en India.

• Encubado por 80 horas a 30°C– Cafeína– Sacarosa– Fructosa– Galactosa– Lactosa

ResultadosCantidad De Cafeína Degradada A Través Del Tiempo

ResultadosUtilización De Fuentes De Carbono

ResultadosCrecimiento De La Célula

Resultados (Pulpa como alimento)Animal Pulpa de café fresca Pulpa de café

ensilada

Vacas •Novillos redujeron ganancia en peso.•Intranquilas

•No afecto su producción de leche.•No efectos en crecimiento

Cabras •Redujeron su peso•Intranquilos

•Machos con mejor desempeño•No afecta crecimiento.

Gallos •Efectos dañinos en la digestión.

•Efectos dañinos en la digestión.

Conejos •Intranquilos No afecta

Cerdos •Perdida de peso No afecta

Conclusión

• La presencia de fuentes de carbono en el medio, aumenta la degradación de cafeína.

• Sacarosa fue la mejor fuente de carbono para promover el crecimiento de la célula.

¿Como degrada Pseudomonas sp. la cafeína?

Inducible Nature of Enzymes Involved in catabolism of caffeine and related

methylxanthines

Sathyanarayana N. Gummadi, et. al.

Objetivos

• Estudiar el sistema de enzimas envueltas en el catabolismo de cafeína.

Introducción

• Pseudomonas sp.– Extremofilica – Carbono y nitrógeno a partir de cafeína.

http://www.biw.kuleuven.be

http://www.scienceclarified.com/images/uesc_02_img0068.jpg

Degradación de Cafeína

Materiales y Métodos

• Condiciones de cultivo– Medio CAS– 36hrs– Nutrient Broth• 2.5hrs (fase log media)

http://www.ucc.ie/en/eri/dirresproj/recdnaapprtoxic/imgcol,51319,en.jpg

Materiales y Métodos (cont.)

• Estudios de inducción– Sustitución xantinas por cafeína.– Células removidas por centrifugación por

10min a 4°C– 3 lavadas con buffer

Materiales y Métodos (cont.)

• Preparación extracto para estudio de enzimas– Células en buffer de lisis– Células rotas por sonicación en hielo– Debris centrifugado por 30min.– Sobrenadante = extracto de enzimas.

Materiales y Métodos (cont.)

• Análisis de actividad enzimática en la degradación de metilxantinas. – Actividad enzimática medida en RP-HPLC– Medida a 30°C en una reacción mixta– Reacción iniciada añadiendo extracto– En 10 min, parar reacción con TCA 10%

Resultados y discusión

• Localización de actividad enzimática de degradación de cafeína.– No actividad en sobrenadante• Una vez formado el lisado, actividad duraba

algunas horas• Estabilización con buffer de lisis.

– No actividad en membrana• Actividad solo en citoplasma

Resultados y discusión (cont. )

Resultados y discusión (cont. )

• Efectos en la concentración de cafeína y de proteína en la actividad enzimática.– Actividad enzimática aumenta hasta 10mM.– Luego disminuye hasta 40mn.

Resultados y discusión (cont. )

Resultados y discusión (cont. )

• Naturaleza de la actividad degradadora en Pseudomonas sp.– Metabolitos del rompimiento de cafeína como

nutrientes?• Crecimiento en todas las metilxantinas• HPLC – medida de degradación

Resultados y discusión (cont. )

• Naturaleza de la actividad degradadora en Pseudomonas sp. (cont.)– Catabolismo: ¿una o mas enzimas?• Experimentos de inducción• Actividad en todos los metabolitos de N-

demetilación• Control – Nutrient Broth

Conclusión

• ¿Como degrada la cafeína?– Pseudomona también utiliza metabolitos de la

degradación de cafeína.– Mas de una enzima envueltas en las etapas iníciales

del catabolismo de cafeína.

Futuras Investigaciones

• Efecto de la presencia de otros organismos en la degradación de cafeína.

• Plantas transgénicas que degraden cafeína?• Desarrollar procedimiento fácil para degradar

cafeína por microorganismo.

Conclusión y Resumen del Seminario

• Pulpa de café como alimento– Descafeinada

• Pseudomona sp. es el microorganismo estelar por su habilidad de utilizar cafeína como recurso de carbono.

• Hay varias enzimas que participan en la degradación de cafeína.

Referencias

• Gummadi, S. e. (2006). A preliminary study of caffeine degradatoin by Prseudomonas sp. GSC1182. Journal of Food Microbiology , 346-350.

• Gummadi, S. e. (2008). Inducible nature of the enzymes involved in catabolism of caffeine and related methylxanthines. Journal of Basic Microbiology , 227-233.

• Noriega, A. e. (2008). Utilizacion dd la planta del cafe en la alimentacion animal. Zootecnia Tropical , 411-419.

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