INSTITUTO OSWALDO CRUZ Doutorado em Biologia Parasitária ISOLAMENTO E CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gattii DE FONTES AMBIENTAIS NA REGIÃO METROPOLITANA DE BELÉM, PARÁ. SOLANGE DO PERPÉTUO SOCORRO EVANGELISTA COSTA Rio de Janeiro/RJ 2008
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DE FONTES AMBIENTAIS NA REGIÃO METROPOLITANA DE …livros01.livrosgratis.com.br/cp112859.pdf · Cryptococcus gattii de fontes ambientais na região metropolina de Belém, ... e permissão
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INSTITUTO OSWALDO CRUZ Doutorado em Biologia Parasitária
ISOLAMENTO E CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR
DE Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gattii
DE FONTES AMBIENTAIS NA REGIÃO
METROPOLITANA DE BELÉM, PARÁ.
SOLANGE DO PERPÉTUO SOCORRO EVANGELISTA COSTA
Rio de Janeiro/RJ
2008
Livros Grátis
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ii
INSTITUTO OSWALDO CRUZ
Pós-Graduação em Biologia Parasitária
SOLANGE DO PERPÉTUO SOCORRO EVANGELISTA COSTA
ISOLAMENTO E CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE Cryptococcus
neoformans e Cryptococcus gattii DE FONTES AMBIENTAIS NA REGIÃO
METROPOLITANA DE BELÉM, PARÁ
Tese apresentada ao Instituto Oswaldo Cruz como
parte dos requisitos para obtenção do título de
Doutor em Ciências, área de concentração em
Biologia.
Orientadores: Dr. Bodo Wanke (IPEC/FIOCRUZ) Dr. José Luiz Martins do Nascimento (ICB/UFPA)
RIO DE JANEIRO 2008
Ficha catalográfica elaborada pela
Biblioteca de Ciências Biomédicas/ ICICT / FIOCRUZ - RJ
C837 Costa, Solange do Perpétuo Socorro Evangelista
Isolamento e caracterização molecular de Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gattii de fontes ambientais na região metropolina de Belém, Pará / Solange do Perpétuo Socorro Evangelista Costa. – Rio de Janeiro, 2008.
xviii, 161 f. : il. ; 30 cm.
Tese (doutorado) – Instituto Oswaldo Cruz, Pós-Graduação em Biologia Parasitária, 2008.
ISOLAMENTO E CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE Cryptococcus
neoformans e Cryptococcus gattii DE FONTES AMBIENTAIS NA REGIÃO
METROPOLITANA DE BELÉM, PARÁ
ORIENTADOR (ES): Prof. Dr. Bodo Wanke (IPEC/FIOCRUZ)
Prof Dr. José Luiz Martins do Nascimento (ICB/UFPA)
Aprovada em: 03/10/2008 EXAMINADORES Profª. Dra. Tânia Maria Pacheco Schubach – Presidente e Revisora (Laboratório de Pesquisa Clínica em Dermatozoonoses em Animais Domésticos/ IPEC/Fiocruz) Profª. Dra Cíntia de Moraes Borba - Membro (Departamento de Micologia/IOC/Fiocruz) Prof. Dr. Ricardo Pereira Igreja - Membro (Faculdade de Medicina/UFRJ) Profª. Dra. Rita Catarina Medeiros de Sousa - Suplente (Hospital Universitário João de Barros Barreto/UFPA)
Profª. Dra. Luciana Trilles - Suplente (Laboratório de Micologia/IPEC/Fiocruz)
Rio de Janeiro, 03 de outubro de 2008
iv
Aos meus pais queridos
Hilson e Raimunda
pelas oportunidades que propiciaram a todos os filhos,
priorizando a educação e pelo
carinho e apoio incondicional
Ao meu esposo Rosildo Paiva,
por sua compreensão, companheirismo, incentivo
e incansável apoio durante esta jornada.
A Rafael e Rodrigo,
filhos amados, pelo carinho e compreensão
dos momentos ausentes para realização deste trabalho.
Carinhosamente dedico.
v
AGRADECIMENTOS
Às famílias que com muita boa vontade permitiram acesso a seus
domicílios, e permissão para coleta das amostras imprescindíveis para realização do
estudo.
Ao Dr. Bodo Wanke, orientador, que com sabedoria, paciência, estímulo e
valiosas críticas e sugestões tornou possível a realização deste trabalho. A Dra.
Márcia dos Santos Lazéra, grande colaboradora deste estudo pelas valiosas críticas
e sugestões. Agradeço a ambos pelos ensinamentos, apoio e amizade que recebi
em todos os momentos.
Ao Dr. José Luiz Martins do Nascimento, orientador que me apoiou e
incentivou à realização desta pós-graduação e coordenou o Programa de
Qualificação Interinstitucional.
À Dra. Rita Catarina Medeiros Sousa, incentivadora e colaboradora na
indicação de pacientes. E ao Dr. Maurício Perez da UFRJ pela orientação estatística.
À coordenadora do Curso de Curso de Pós-graduação em Biologia
Parasitária Dra. Ana Maria Coimbra Gaspar, à secretária Luciane Vieira
Wandermurem e demais funcionários pelo apoio e preciosas orientações recebidos
no decorrer desta pós-graduação.
À direção do Instituto de Ciências Biológicas (UFPA) que me liberou das
atividades acadêmicas em vários períodos para realização desta pós-graduação e a
Pró-reitoria de Pesquisa da Universidade Federal do Pará (UFPA) pelo suporte
administrativo do programa PQI.
À Dra. Paula Beatriz de Araújo (UFRS) que gentilmente identificou o
espécime do artrópode.
Aos funcionários do Museu Paraense Emílio Goeldi, Sr. Antônio Sérgio
Lima pela gentileza na identificação do espécime botânico e ao Sr. Marcelo Thales
pela elaboração do mapa apresentado neste trabalho.
Aos professores da UFPA Dr. Cristovam Picanço Diniz, Dr. José Luiz
Martins do Nascimento, Dr. Luís Carlos Silveira e Dra. Maria da Conceição Pinheiro,
e ao Dr. Cláudio Tadeu Daniel Ribeiro e Dr. Ricardo Lourenço (Fiocruz), pelo
empenho na realização desta pós-graduação.
Aos professores do Curso de pós-graduação pelos ensinamentos e
incentivo.
vi
À Dra. Liane de Castro do Laboratório de Imunodiagnóstico (IPEC/Fiocruz),
e ao grupo do Laboratório de Virologia (IPEC/Fiocruz) pelas facilidades ao acesso e
utilização de espaço físico e equipamentos destes laboratórios.
À Dra. Marília Martins Nishikawa (INCQS/Fiocruz), sempre disposta a
ajudar; pela amizade e apoio imprescindível na identificação bioquímica dos
isolados.
À equipe do Laboratório de Micologia Ambiental (IPEC), Bernardina P.
Morales e Luciana Trilles pela valiosa colaboração no estudo molecular, Cláudia
Fauci Bezerra, Regina Célia Macedo e Gláucia G. Barbosa pelo apoio em várias
etapas do estudo ambiental. E aos demais funcionários e estagiários do IPEC
responsáveis pelo suporte técnico deste estudo.
Às estudantes de iniciação científica Gabriela Ramalho e Érica pelo apoio
a secretária Zélia Magalhães Silva pelo apoio administrativo.
Aos colegas de turma do doutorado, Aldo Valente, Ana Maria Ventura, Ana
Iecê, Eliete Araújo, Éster Miranda, Elizabeth Salbé T. da Rosa, Sâmia Demachi,
Vânia Noronha, pelo apoio e aos colegas Gionovaldo Lourenço e Wallace Santos
com os quais compartilhei várias etapas de trabalho nesta maravilhosa área de
estudo que é a Micologia.
Aos colegas do Laboratório de Micologia (UFPA) Dr. Antonio Hernández
Gutiérrez e ao biólogo José Carlos de Azevedo que me auxiliou em algumas coletas,
pelo suporte durante minha ausência ao longo das etapas deste estudo.
Aos meus irmãos, cunhados, sobrinhos e sogros pelo carinho e incentivos
constantes. E aos amigos e colegas de trabalho pelo apoio.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
(CAPES), pelo apoio financeiro concedido através de bolsa de estudo e passagens
durante as missões de estudo.
A todos que de forma direta ou indireta contribuíram com dados
fundamentais para a construção deste trabalho.
A Deus, pelo dom da vida, saúde fé e esperança em dias sempre
melhores.
Minha gratidão
vii
SUMÁRIO
RESUMO xviii
ABSTRACT xix
1. INTRODUÇÃO 1
2. REVISÃO DE LITERATURA 5
2.1 HISTÓRICO 5
2.2 O FUNGO: ASPECTOS MORFOLÓGICOS E TAXONOMIA 9
2.3 EPIDEMIOLOGIA DA CRIPTOCOCOSE E ECOLOGIA DE SEUS
AGENTES.
14
2.3.1 Em relação à distribuição geográfica 14
2.3.2 Em relação aos sorotipos 19
2.3.3 Epidemiologia Molecular 23
2.3.4 Ecologia dos agentes 28
2.4 VIRULÊNCIA EM C. neoformans E C. gattii 36
2.5 CRIPTOCOCOSE 42
2.5.1 Aspectos Clínicos 43
2.5.2 Agentes Antifúngicos 46
3. RELEVÂNCIA 52
4. OBJETIVOS 54
5. MATERIAIS E MÉTODOS 55
5.1 ESTUDO DE FONTES SAPRÓBIAS RELACIONADAS A OCO DE
ÁRVORES E EXCRETAS DE AVES NA ÁREA URBANA DE BELÉM
55
5.2 ESTUDOS DE FONTES AMBIENTAIS A PARTIR DE DOMICÍLIOS
DE PACIENTES COM CRIPTOCOCOSE
55
5.2.1 Seleção dos domicílios 55
5.2.1.1 Critérios de Inclusão 56
5.2.1.2 Critérios de exclusão 56
5.3 ÁREA DE ESTUDO 56
5.4 VISITA AO DOMICÍLIO E COLETA DAS AMOSTRAS 59
5.4.1 Entrevista 59
5.4.2 Ficha Ambiental 59
5.4.3 Coleta das Amostras 59
5.5 PROCESSAMENTO DAS AMOSTRAS 60
5.5.1 Isolamento das colônias 60
viii
5.5.2 Identificação fenotípica 61
5.5.2.1 Síntese de melanina (atividade fenoloxidase) 61
5.5.2.2 Termotolerância 61
5.5.2.3 Sensibilidade à cicloheximida 61
5.5.2.4 Sorotipagem 61
5.5.2.5 Assimilação de compostos de Carbono e Nitrogênio 62
5.5.2.6 Meio CGB 62
5.5.3 Identificação Molecular 63
5.5.3.1 Extração de DNA 63
5.5.3.2 Determinação do mating type. 64
5.5.3.3 Tipagem Molecular 65
6 RESULTADOS 66
6.1 ESTUDO DE FONTES SAPRÓBIAS RELACIONADAS A OCO DE
ÁRVORES E EXCRETAS DE AVES EM DOIS BAIRROS DE
BELÉM/PA
66
6.2 ESTUDO DE FONTES SPRÓBIAS RELACIONADAS AOS CASOS-
INDICE SELECIONADOS
68
6.3 ANÁLISE DAS AMOSTRAS COLETADAS 70
6.4 DESCRIÇÃO DOS CASOS-ÍNDICE DE CRIPTOCOCOSE, SEUS
DOMICÍLIOS E RESULTADOS DA INVESTIGAÇÃO DOMICILIAR
POR C. neoformans E OU C. gattii.
74
6.4.1 Caso índice 1 74
6.4.2 Caso-índice 2 74
6.4.3 Caso índice 3 76
6.4.4 Caso índice 4 81
6.4.5 Caso índice 5 81
6.4.6 Caso índice 6 81
6.4.7 Caso índice 7 82
6.4.8 Caso índice 8 84
6.5 ANÁLISE DOS ISOLADOS QUANTO À FONTE DE ISOLAMENTO,
DISTRIBUIÇÃO
84
6.6 CARACTERIZAÇÃO FENOTÍPICA DOS ISOLADOS 87
6.7 ANÁLISE MOLECULAR 89
6.7.1 Tipo sexuado 89
6.7.2 Análise da tipagem molecular 91
ix
7 DISCUSSÃO 95
8 CONCLUSÕES 112
9 PERSPECTIVAS 115
REFERÊNCIAS 116
APÊNDICES 143
APÊNDICE 1 144
APÊNDICE 2 149
ANEXOS 156
ANEXO 1 157
ANEXO 2 159
ANEXO 3 160
ANEXO 4 161
x
LISTA DE TABELAS
Tabela 6.1 - Número e caracterização de isolados oriundos de fontes
ambientais da cidade de Belém/PA.
66
Tabela 6.2 - Dados meteorológicos de Belém/PA, referentes ao período de
coleta.
67
Tabela 6.3 - Perfil e procedência dos casos selecionados para o estudo
ambiental.
66
Tabela 6.4 - Distribuição das amostras analisadas de acordo com os
casos-índice e seus domicílios e controles
71
Quadro 6.1 - Características gerais dos domicílios de pacientes e controles
dos quais foram obtidos isolados de C. neoformans (Cn) e C.
gattii (Cg) e das amostras coletadas contaminadas.
73
Tabela 6.5 - Distribuição de Cryptococcus neoformans de acordo com o
tipo de substrato, e UFC/g relativos ao caso-índice 2.
76
Tabela 6.6 - Distribuição dos isolados de C. neoformans e C. gattii obtidos
do domicílio do caso-índice 3 e domicílios controles, de acordo
com o tipo de substrato, domicílio (paciente ou
controle)/ambiente, espécie isolada, UFC/g e número de
colônias analisadas.
80
Tabela 6.7 - Número de isolados e densidade de colônias fenoloxidase
positivas, de acordo com o tipo de substrato, relativos ao
caso-índice 7.
83
Tabela 6.8 - Distribuição de Cryptococcus spp. de acordo com o tipo de
substrato, espécie isolada e UFC/g relativos ao caso-índice 8.
84
Tabela 6.8 - Distribuição de Cryptococcus spp. de acordo com o tipo de
substrato, espécie isolada e UFC/g relativos ao caso-índice 8.
79
Tabela 6.9 - Freqüência de Isolamento de Cryptococcus neoformans e C.
gattii de acordo com o material analisado.
86
Tabela 6.10 - Freqüência de C. neoformans e C. gattii identificados pelo
teste de CGB de acordo com os casos-indice.
88
Tabela 6.11 - Distribuição dos isolados de C. neoformans e C. gattii quanto
ao tipo sexuado e caso-índice.
89
Tabela 6.12 - Distribuição do tipo sexuado de acordo com a fonte de
isolamento.
91
xi
Tabela 6.13 - Perfil dos isolados ambientais após caracterização dos tipos
moleculares analisados por PCR-RFLP.
92
Tabela 6.14 - Distribuição dos genótipos identificados por caso-índice. 92
xii
LISTA DE FIGURAS
Figura 5.1 - Mapa de localização da Região Metropolitana de Belém. 57
Figura 6.1- Figura 6.1- Eletroforese em gel de agarose ilustrando a
identificação do tipo sexuado com primers MATα1- MATα2 e
MAT a1- MAT a2 dos isolados ambientais de C. neoformans e
C. gattii de uma área da cidade de Belém/Pará, por PCR.
padrão MATa; 7: PA 134; 8: PA 102; 9: PA 158; 10: Controle
negativo
91
Figura 6.17 - Percentual dos isolados analisados conforme tipo molecular. 92
Figura 6.18 - Distribuição dos genótipos de acordo com a fonte de
isolamento.
93
Figura 6.19 - Figura 6.19 - Eletroforese em gel de agarose ilustrando a
identificação do tipo molecular (VNIV, VGII e VNI) de alguns isolados
ambientais (PA 16 a PA 214) de C. neoformans e C. gattii da região
metropolitana de Belém/Pará, obtidos por PCR/RFLP. Padrões (VNI-
VNIV e VGI-VGIV) estão representados pelos isolados LMM 794 a
LMM 801.
93
xiv
LISTA DE ABREVIATURAS, SÍMBOLOS E UNIDADES
AIDS/SIDA: Síndrome de Imunodeficiência Adquirida
AFLP: amplifield fragment lengt polymorphism
ATCC: American Type Cuture Collection
ºC: graus Celsius
CCP: criptococose cutânea primária
CGB: Ágar Canavanina-Glicina-Azul de Bromotimol
CIM:: concentração inibitória mínima
CLSI: Clinical and Laboratory Standarts Institute
CO2: dióxido de carbono
DNA: ácido desoxirribonucléico
dNTP: de desoxirribonucleosídeo(s) Trifosfato(s)
EDTA: ácido etilenodiaminotetraacético
FIOCRUZ: Fundação Oswaldo Cruz
g: grama
GalXM: Galactoxilomanana
GXM: Glucuroxilomanana
h: hora
HAART: hight active antiretroviral therapy
HIV: Vírus da Imunodeficiência Humana
HUJBB: Hospital Universitário João de Barros Barreto
IBGE: Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística
IGS: seqüência espaçadora intergênica
INCQS: Instituto Nacional de Controle de Qualidade e Saúde
IPEC: Instituto de Pesquisa Clínica Evandro Chagas
ITS: seqüência espaçadora interna
IV: intravenosa
Kb: kilobases = 1000 bases
LCR: líquor céfalo-raquidiano
LES: lúpus eritematoso sistêmico
M: Molar
MB: megabases = 106 bases
MgCl2: cloreto de Magnésio
min: minuto
xv
mL: mililitro
mm: milímetro
mM: milimolar
N: Norte
NCCLS: National Committee for Clinical Laboratory Standarts
NE: Nordeste
ng: nanograma
NaOH: Hidróxido de sódio
NaCl: cloreto de sódio
NSA: niger seed agar - ágar Níger
pb: pares de base
PCR: polymerase chain reaction – reação em cadeia da polimerase
pH: potencial hidrogeniônico
PLB: fosfolipase B
P/V: peso/volume
RAPD: Randon Amplification of Polymorphic DNA- amplificação randômica de DNA
polimórfico
RFLP: Restriction Fragment Length Polimorphism – fragmentos de DNA gerados por
enzima de restrição
RMB: região metropolitana de Belém
rpm: rotações por minuto
S: Sul
SC: Sabouraud com cloranfenicol
SDS: dodecilsulfato de sódio
SNC: Sistema nervoso central
sp: espécie
TBA: agar azul tripano
Tris: 2-amino-2hidroxidometilpropano-1,3-diol
U: unidade de atividade
UFC: unidade formadora de colônia
UFPA: Universidade Federal do Pará
UV: ultravioleta
var: variedade
VO: via oral
xvi
µm: micrômetro
µL: microlitro
µg: micrograma
µM: micromolar
xvii
RESUMO
Os agentes da criptocococose são atualmente reconhecidos como duas espécies do gênero Cryptococcus: C. neoformans e C. gattii. Enquanto C. neoformans é uma levedura haplóide de distribuição universal, ecologicamente associada à excretas de aves, notadamente pombos e guano de morcegos; apresenta-se geralmente como agente oportunista e causa meningoencefalite em hospedeiros imunocomprometidos, C. gattii é em geral restrito a regiões tropicais e subtropicais, com habitat predominantemente associado a vegetais em decomposição, comporta-se como agente primário e como tal atinge em sua maioria pacientes imunocompetentes. Ambas as espécies são capsuladas e apresentam predileção pelo Sistema Nervoso Central (SNC), constituindo-se na principal causa de meningite por fungos. No Brasil, a criptococose neoformans ocorre em todas as regiões, enquanto a criptococose gattii surge como importante endemia nas regiões Norte e Nordeste. O objetivo deste estudo foi investigar fontes sapróbias dos agentes de criptococose na região metropolitana de Belém/PA (RMB) com ênfase em ambientes domiciliares relacionados a casos de criptococose diagnosticados no Hospital Universitário João de Barros Barreto (HUJBB), no período de 2004 a 2005 para avaliar possíveis relações do ciclo de vida deste fungo com as infecções humanas. Nos domicílios e peridomicílios investigados foram coletadas 186 amostras constituídas principalmente de poeira intradomiciliar, fragmentos de madeira e raspados de ocos vegetais. Após processamento das amostras foram obtidos 220 isolados de C. neoformans e/ou C. gattii identificados com base em características fenotípicas e moleculares. Também foram analisadas amostras de oco de árvores ornamentais e excretas de gaiolas de aves de uma loja na área urbana de Belém. Maior positividade foi observada em poeira intradomicliar, seguida de madeira em decomposição e artrópodes. Isoladamente, C. neoformans foi obtido de tatuzinhos de jardins (Cubaris murina), raspado de madeira, poeira intradomiciliar e C. gattii foi isolado de poeira intradomiciliar. Em conjunto, ambas as espécies foram isoladas de poeira intradomiciliar em várias ocasiões. A amplificação do gene do feromônio revelou predominância de isolados MATα sobre isolados MATa, sendo C. neoformans MATα (45%) C. neoformans MATa (32,8%), C. gattii MATα (22,7%) e MATαa (0,5%). A PCR/RFLP do gene URA5 agrupou a maioria dos isolados no tipo molecular VNI (45%), seguido de VNIV (32%) e VGII (23%). O estudo de ocos vegetais e excretas de aves em área urbana de Belém permitiu detectar a presença de C. neoformans (VNI) em excretas de aves e C. neoformans (VNI) e C. gattii (VGII) foram isolados de rapados de oco de Senna siamea, onde compartilhavam o mesmo nicho ecológico. Aspectos clínicos e informações do ambiente domiciliar e peridomicílio do paciente foram descritos e discutidos no trabalho. Os resultados obtidos revelam achados inéditos, como a ocorrência de C. gattii em poeira intradomiciliar, e compartilhamento de ambas as espécies em oco vegetal, na cidade de Belém. Revelam a presença de isolados MATα e MATa, na Amazônia Oriental e, além disto, acrescentam novas informações às poucas disponíveis sobre a ecologia e biologia molecular de C. neoformans e C. gattii na região norte do Brasil.
xviii
ABSTRACT
The principal agents of cryptococcosis are now identified as two species of the genus Cryptococcus: C. neoformans and C. gattii. While C. neoformans is an haploid yeast, cosmopolitan, ecologically associated with avian droppings, principally pigeons and bat guano, behaves as an opportunistic agent, major cause of fungal meningoencephalitis in immunocompromised patients, C. gattii is usually restricted to tropical and subtropical regions, predominantly associated decomposing wood of trees and usually behaves as a primary agent, consequently attaining immunocompetent individuals. Both species present as capsulated yeasts and have a predilection for the central nervous system (CNS), constituting the principal etiologic agent of fungal meningitis. In Brazil, opportunistic cryptococcosis occurs in all the regions, while the primary infection prevails as a systemic endemic mycosis in the North and Northeastern regions. The aim of this study was to investigate saprobic sources of these agents in the Metropolitan Area of Belém, emphasizing the dwellings and their sourroundings related to cases of cryptococcosis diagnosed at the University Hospital João de Barros Barreto (UHJBB), during the period of 2004 to 2005 to analyzing possible correlation between environmental isolations of this fungus with human infections. One hundred and eighty six environmental samples were collected in and around eight selected dwellings, constituted mainly of indoor dust, wood debris and scrapings of hollow trees. After sample processing, 220 isolates were obtained, identified on the basis of phenotypic and molecular characteristics. Samples of hollows of ornamental trees and caged psittacine bird droppings of avian stores in the urban area of Belém were also studied. The most contaminated environmental samples were indoor dust, followed by decaying wood and arthropods. Cryptococcus neoformans was isolated alone from snow bugs, planed wood and indoor dust and C. gattii was also isolated alone from indoor dust. Both species were isolated together from indoor dust in several occasions. Amplification of the pheromone gene revealed predominance of mating type α isolates, with C. neoformans MATα (45 %), C. neoformans MATa (32,8 %) and C. gattii MATα (23,7 %) and MATαa (0,5%). PCR/RFLP of the URA5 gene grouped the majority of the isolates into the molecular type VNI (45%), followed by VNIV (32%) and VGII (23%). The study of hollow trees and psittacine bird droppings in the urban area of Belém revealed the occurrence de C. neoformans VNI in the psittacine bird droppings and both species, C. neoformans VNI and C. gattii VGII, in a hollow tree of a Senna siamea, sharing the same ecological niche. Clinical aspects of the patients and informations on their dwellings and respective surroundings were described and discussed. These results revealed unprecedented findings, as the occurrence of C. gattii in indoor dust. Also the occurrence of MATα and MATa isolates and the presence of both species in a common hollow tree in the Belém city are noteworthy. Furthermore, we add new information about the ecology and molecular biology of C. neoformans and C. gattii in the North region of Brazil.
1
1. INTRODUÇÃO
Os fungos são organismos eucariontes, heterotróficos, com nutrição por
absorção e exibem marcada habilidade para utilizar praticamente qualquer tipo de
fonte de carbono como alimento. Estão amplamente distribuídos no ambiente,
estando presentes nos diferentes ecossistemas terrestres e aquáticos, dispersando-
se sob a forma de esporos e/ou fragmentos de hifas, por diversas vias, entre as
quais, o ar, a água e numerosos vetores como insetos, pássaros e o homem. Seu
diversificado aparato enzimático os capacita a colonizar diversos tipos de substratos
de origem animal, vegetal, e até compostos sintéticos como plástico.
A estratégia de nutrição permite classificá-los em três modos básicos de vida:
os sapróbios, que obtêm nutrientes de organismos mortos, desempenhando
importante papel ecológico como recicladores da matéria orgânica; os parasitas,
que obtêm seus nutrientes de organismos vivos, e aqueles que vivem em
associação simbiótica, como os fungos liquenizados, que mantêm associação com
algas ou cianobactérias, as micorrizas, resultantes da associação entre fungos e
raízes da maioria das plantas, e ainda os fungos endofíticos, presentes em folhas e
caules de plantas saudáveis (ALEXOPOULOS et al., 1996).
Estima-se que existam em torno de 1,5 milhões de espécies de fungos
(HAWKSWORTH, 1991), das quais aproximadamente 100 000 espécies estejam
descritas (HAWKSWORTH, 2004). A enorme discrepância entre o número de
espécies conhecidas versus o de espécies estimadas parece estar relacionada a
métodos de amostragens inadequados em várias partes do mundo, especialmente
nas regiões tropicais e subtropicais (ALEXOPOULOS et al., 1996), onde grande
parte da diversidade biológica pode ser extinta antes mesmo de ser conhecida.
Enquanto as fitopatologias micóticas são atribuídas à grande número de
espécies de fungos, as patologias micóticas em animais são causadas por
relativamente poucas espécies. Segundo Perfect (2006), das espécies descritas,
cerca de 270 são reconhecidas como causadoras de doenças em vertebrados e
humanos. Podem causar infecções que variam desde sistêmicas e potencialmente
fatais a infecções com localização superficial, cutânea e subcutânea.
Classicamente, os fungos causadores de micoses humanas são divididos em
dois grupos: 1) patógenos primários, capazes de infectar indivíduos saudáveis, e
2) patógenos oportunistas. Entre os patógenos primários se notabilizam os
agentes de micoses sistêmicas, capazes de infectar indivíduos saudáveis, incluem
2
espécies termotolerantes, dimórficas, com habitat restrito e distribuição geográfica
limitada a regiões endêmicas, e as infecções geralmente são adquiridas via
inalação. Incluem espécies causadoras da paracoccidioidomicose, histoplasmose,
coccidioidomicose e blastomicose e a infecção é referida como micose sistêmica,
pela capacidade do fungo disseminar-se no hospedeiro, infectando um ou diversos
órgãos. Segundo Lazéra et al., (2005) a criptococose por Cryptococcus gattii,
apesar de não ser um fungo dimórfico, tem comportamento de patógeno primário.
Entre os patógenos oportunistas se notabilizam fungos que causam lesões sob
certas circunstâncias, em pacientes com susceptibilidade alterada, ou após
implantação traumática do fungo. Tais fungos são ubíquos ou endógenos,
termotolerantes, em geral monomórficos, cuja via de infecção é variada, produzindo
manifestações cutâneas, subcutâneas ou sistêmicas, conforme a porta de entrada e
sua disseminação no hospedeiro. Exemplificando, podem ser citados Candida spp,
Aspegillus spp, Zygomycetes e Cryptococcus neoformans.
Duas espécies patogênicas do gênero Cryptococcus causam a criptococose:
C. neoformans e C. gattii. Esta micose é de distribuição universal, atinge humanos e
uma grande variedade de animais, tem evolução subaguda ou crônica, e pode ser
fatal quando não diagnosticada e tratada corretamente. Até a década de 1980 a sua
incidência era considerada baixa, ocorrendo principalmente em pacientes com
MATa; 7: PA 134; 8: PA 102; 9: PA 158; 10: Controle negativo.
6.7.2 Análise da tipagem molecular
Os isolados foram analisados por PCR-RFLP, para determinação do tipo
molecular. A Tabela 6.13 apresenta os dados resultantes da análise, onde se verifica
que 3 tipos moleculares foram determinados VNI, VNIV e VGII.
92
Tabela 6.13 – Perfil dos isolados ambientais após caracterização dos tipos
moleculares analisados por PCR-RFLP.
CASO-ÍNDICE E
AGENTE ETIOLÓGICO
C. neoformans C. gatti Tipagem molecular
2 (C. gattii) 46 0 VNIV
3 (C. gattii) 105 43 VNI, VNIV e VGII
7 (C.neoformans) 8 8 VNI e VGII
8 (C.neoformans) 10 0 VNI
Os genótipos determinados em 220 isolados corresponderam a 99 (45%) de
VNI, 70 (32%) de VNIV e 51 (23%) de VGII, conforme Tabela 6.14 e Figura 6.17.
Tabela 6.14 - Distribuição dos genótipos identificados por caso-índice.
GENÓTIPO CASO-
ÍNDICE VNI VNIV VGII
TOTAL
2 0 46 0 46
3 81 24 43 148
7 8 0 8 16
8 10 0 0 10
TOTAL 99 70 51 220
Figura 6.17 - Percentual dos isolados analisados conforme tipo molecular.
Em relação à fonte de isolamento o genótipo VNI foi recuperado de poeira
intradomiciliar e madeira em decomposição, VNIV foi isolado de madeira em
45%
32%
23%
VNI
VNIV
VGII
93
decomposição e tatuzinhos, e VGII de poeira intradomiciliar e madeira em
decomposição (Figura 6.18).
Figura 6.18 - Distribuição dos genótipos de acordo com a fonte de isolamento.
O perfil eletroforético obtido por PCR/RFLP de alguns isolados de C.
neoformans e C. gattii são representados na Figura 6.19.
Figura 6.19 - Eletroforese em gel de agarose ilustrando a identificação do tipo molecular
(VNIV, VGII e VNI) de alguns isolados ambientais (PA 16 a PA 214) de C. neoformans e C.
gattii da região metropolitana de Belém/Pará, obtidos por PCR/RFLP. Padrões (VNI-VNIV e
VGI-VGIV) estão representados pelos isolados LMM 794 a LMM 801.
98
0
42
0
37
0 1
33
9
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Poeira intradomiciliar Artrópodes Madeira em decomp.
VNI
VNIV
VGII
94
No apêndice 1 são apresentados dados referentes ao substrato, tipo sexuado
e tipo molecular de cada isolado, identificados por códigos utilizados nas figuras 6.16
e 6.19.
95
7. DISCUSSÃO
A criptococose e seus agentes têm sido bastante estudados no decorrer das
últimas décadas em virtude do advento da aids o que provocou um aumento drástico
das infecções oportunísticas entre as quais a criptococose, notadamente a causada
pela espécie C. neoformans. Diversas investigações têm sido reportadas
contribuindo para uma melhor compreensão do comportamento eco-epidemiológico
de ambas as espécies: C. neoformans e C. gattii, mas muitos aspectos de sua
ecologia, mecanismo de infecção, fatores de virulência, sexualidade e estrutura
populacional ainda permanecem obscuros.
Em relação às amostras ambientais coletadas aleatoriamente em lojas de
venda de pássaros e algumas árvores ornamentais de ruas da cidade de Belém,
alguns aspectos merecem destaque.
Não obstante a investigação ter sido realizada com um número pequeno de
amostras, os resultados obtidos foram relevantes devido à escassez de informações
referentes a estes importantes agentes na região Norte do Brasil. Os resultados
registraram pela primeira vez a ocorrência de C. neoformans sorotipo A, MATα,
genótipo VNI em excretas de aves, bem como C. neoformans sorotipo A, MATα,
genótipo VNI e C. gattii sorotipo B, MATα, VGII compartilhando o mesmo oco de
Senna siamea na cidade de Belém.
A ubiqüidade de C. neoformans sorotipo A é bem documentada e tem sido
isolado da maioria dos casos de aids no Brasil (ROZENBAUM et al., 1992, CASALI
et al., 2003) e no mundo (MITCHELL & PERFECT, 1995; BICANIC & HARRISON,
2005). Todos os isolados deste trabalho foram MATα e mostram concordância com
literatura mundial que relata a ocorrência de isolados MATα com marcante
predomínio sobre os isolados MATa, clínicos ou ambientais (KWON-CHUNG &
BENNETT, 1978).
Estudo global com cepas de diversos países mostrou que os tipos
moleculares VNI e VGI são os genótipos mundialmente predominantes (MEYER et
al., 1999; BOEKHOUT et al., 2001), embora a América Latina apresente perfil
diferente para C. gattii (MEYER et al., 2003; ESCANDÓN et al., 2006). No Brasil,
Lugarine et al. (2008) identificaram predominância de VNI em excretas de aves
(Passerine e Psittacine) no Paraná. No Rio Grande do Sul, Casali et al. (2003)
registraram VNI em excretas de pombos e VNIV em amostras de Eucaliptus spp.
96
O primeiro registro de C. gattii de origem ambiental na região Norte foi
documentado por Fortes et al. (2001), isolado a partir de Guetarda acreana, em uma
área de mata virgem no estado de Roraima. O isolamento de C. neoformans e C.
gattii compartilhando o mesmo oco foi registrado pela primeira vez em Teresina/PI
em Cassia grandis, sugerindo um possível elo entre seus ciclos biológicos na
natureza (LAZÉRA et al., 2000). Também Fortes (2001) relata o isolamento de
ambas as espécies a partir de oco de Adenanthera pavonina, em Boa Vista/RR. Este
evento não tem sido comumente registrado na literatura e, portanto, chama a
atenção que estes relatos tenham sido observados nas regiões Norte e Nordeste do
Brasil, as quais têm demonstrado diferenças epidemiológicas reveladas pela elevada
prevalência de C. gattii, em pacientes destas regiões (CORRÊA et al., 1999;
CAVALCANTI, 1997; MARTINS, 2003, NISHIKAWA et al. 2003), em contraste com
os relatos das regiões Sul e Sudeste, onde predomina C. neoformans.
O papel das árvores no ciclo biológico de C. neoformans ou C. gattii não está
devidamente esclarecido, mas a consistente associação de C. gattii com madeira em
decomposição tem sido demonstrada o que levou a sugestão de uma existência
endofítica em comum com outros Basidiomycetes degradadores da madeira (Sorrell,
2001). Entendemos que a presença de C. gattii e C. neoformans em oco de árvore
viva demonstra uma relação saprobiótica e conforme postula Lazéra (2000) C.
neoformans ou C. gattii e seus teleomorfos estão possivelmente associados com
madeira em decomposição e participando na sucessão ecológica dos agentes
decompositores de substratos lignificados. Esta interpretação é consistente com a
classificação do fungo na ordem Tremellales e a presença da enzima lacase
produzida por estas espécies. Segundo Sorrell, (2001) a lacase dos Basidiomycetes
degrada e mineraliza a lignina dentro da superfície interna da madeira em
decomposição que se comunica com o cerne rígido da árvore viva.
É interessante observar que as nossas amostras ambientais do oco de árvore
foram coletadas no mês de maio/2002, cujas médias de temperatura e umidade
corresponderam a 26,7ºC e 85%, respectivamente, e as amostras de habitats de
pássaros foram coletadas no mês de março/2003, com médias de 26,1ºC e 89%,
respectivamente. Estes resultados não permitem sugestões conclusivas sobre a
influência das condições climáticas, mas sugerem que ambas as espécies estão
bem adaptadas às condições de temperatura e umidade altas. Estudos realizados
em várias regiões da Colômbia sugerem que fatores climáticos, principalmente
umidade, temperatura, evaporação e radiação solar podem afetar a ocorrência dos
97
diferentes sorotipos de Cryptococcus spp. em diferentes espécies de árvores
(GRANADOS & CASTAÑEDA, 2006).
As excretas de aves são consideradas o substrato natural mais comumente
associado a C. neoformans, mas o papel das aves na disseminação do fungo no
ambiente ainda não está bem esclarecido, mesmo com um número considerável de
investigações sobre o tema. Pombos e outras aves podem transportar C.
neoformans em seus bicos, garras, pernas e penas (KOWN-CHUNG & BENNETT,
1992). Swinne-Desgain, 1994 apud Casadevall & Perfect, (1998) estudando pombos
na Bélgica isolaram C. neoformans de papos de 50% destas aves e concluíram que
os mesmos são reservatórios do fungo. Os pombos são resistentes à infecção por
inoculação via gastrintestinal e intramuscular, mas a infecção pode ser induzida por
via intracerebral ou ocular. Esta resistência pode ser em função da alta temperatura
corporal, inibidora de C. neoformans (41 a 43ºC) e a presença da microbiota
bacteriana intestinal (CASADEVALL & PERFECT, 1998). Por outro lado, Sorrell &
Ellis (1997) consideraram improvável que os pombos sejam a principal fonte de C.
neoformans na natureza, pois são encontrados em baixa concentração em vários
sítios anatômicos pesquisados. As informações disponíveis sugerem que, embora
infectados em seus papos, os pombos sejam resistentes à infecção disseminada. No
entanto, podem contribuir para a propagação do fungo por possibilitarem ao mesmo
um meio rico e propício ao seu desenvolvimento na forma de excretas e podem
transportá-los em seus bicos e pés (CASADEVALL & PERFECT, 1998).
A presença de C. neoformans e C. gattii nos habitats apresentados pode
indicar uma contaminação externa e transitória, entretanto, conforme ressaltam
Lazéra et al. (1993), estes microambientes não representam apenas uma proteção
contra a luz solar, mas também são fontes de matéria orgânica, constituindo um
habitat adequado para a sobrevivência e colonização destes fungos.
No presente estudo foram analisadas amostras ambientais de domicílios e
peridomicílios relacionadas à pacientes com criptococose e residentes na região
metropolitana de Belém. A partir da análise de 186 amostras ambientais, sendo 103
coletadas em domicílio de pacientes e 83 em domicílios vizinhos (controle), 22
apresentaram positividade para C. neoformans e/ou C. gattii, com isolamento de 220
colônias. Considerando a relação casos-índice versus positividade observou-se que
dos oito casos-índice selecionados, (em um destes só se efetivou coletas no entorno
e domicílios controles), obteve-se positividade em 4 (50%) dos casos-índices
estudados. Este percentual relativamente alto é relevante considerando-se que o
98
número de domicílios estudados foi pequeno; além disso, é superior ao encontrado
por outros autores, inclusive em número de isolados. Assim, em estudo de 824
amostras ambientais coletadas em 154 domicílios de pacientes residentes na região
metropolitana do Rio de Janeiro/RJ, Passoni et al. (1998) isolaram 37 colônias de C.
neoformans em 20 (13%) domicílios. Em outro estudo similar Cavalcanti (1997)
estudou 39 domicílios, encontrando positividade em 8 (21%), para C. neoformans e
C. gattii, sendo 4 domicílios em Teresina (PI), 1 em Açailândia (MA), 1 em Barra da
Corda (MA) e 1 em Coroatá (MA). Machado et al. (1993), após inquérito com
pacientes sobre possível contato com pombos, analisaram 59 amostras de solo
misturadas com excretas de pombos, penas e material orgânico proveniente de 16
sítios apontados pelos pacientes e detectaram positividade em 5 (8,5%). Em um dos
casos, o sorotipo A de C. neoformans isolado de LCR foi coincidente com o sorotipo
das amostras isoladas do centro de Porto Alegre, local apontado pelo paciente como
possível fonte de infecção.
A relação entre domicílio contaminado por C. neoformans e pacientes com
aids e criptococose foi mencionada por Passoni et al. (1998), que detectaram maior
positividade em domicílios de pacientes com criptococose associado a aids (15,6%),
ao passo que nos domicílios de pacientes sem criptococose e com aids detectou
8,9% e nos domicílios de pacientes sem criptococose e sem aids a positividade foi
14,3%. No presente estudo, dois domicílios de pacientes com aids não
apresentaram positividade, mas o fungo foi detectado em amostras provenientes de
domicílios vizinhos de um destes casos. Na África Central, onde a prevalência da
criptococose associada a aids é elevada (BICANIC & HARRISON, 2005; MITCHELL
& PERFECT, 1995) C. neoformans foi isolado de 7 domicílios de 20 pacientes com
criptococose associada a aids (SWINNE et al., 1989), sugerindo a importância do
acompanhamento do paciente “curado”, que facilmente pode ser re-infectado após a
alta hospitalar e seu retorno a casa.
O principal fator associado com contaminação domiciliar por C. neoformans
apontado por Passoni et al. (1998) foi a presença de criação de aves no ambiente
domiciliar. O papel das aves na ecologia de C. neoformans tem sido bastante
discutido em várias investigações, embora muitos aspectos ainda permaneçam
obscuros. Muitos estudos mostram a associação direta do fungo com as excretas de
aves, predominantemente de pombos. A elevada concentração de C. neoformans
em excretas de pombos (RUIZ et al., 1981) e a alta prevalência de pombos em
grandes centros urbanos demonstram consistentemente a possibilidade de
99
continuada exposição humana ao fungo. Entretanto, apesar de todas as evidências
disponíveis, faltam provas definitivas quanto à aquisição da infecção a partir deste
substrato.
Na tentativa de correlacionar os isolados ambientais com isolados obtidos de
pacientes têm sido utilizadas diversas técnicas de tipagem molecular. O primeiro
estudo foi desenvolvido por Currie et al. (1994) que, através da técnica de RFLP,
analisaram isolados clínicos e ambientais de Nova York e identificaram duas
linhagens de origem clínica e ambiental com relação genética. Yamamoto et al.
(1995) utilizando o método de RAPD, detectaram em duas localidades de Nagasaki
dois isolados ambientais fortemente relacionados com dois isolados clínicos,
sugerindo que a mesma linhagem pode ser encontrada em amostras clínicas e
ambientais em determinada área geográfica. Franzot et al., (1997) utilizaram RFLP
com elementos repetitivos CNRE-1 e outros métodos de tipagem molecular que
demonstraram evidências de ligação entre alguns isolados brasileiros obtidos de
excreta de pombos e de pacientes. Contrastante com estes dados, Varma et al.
(1995), através da técnica de RFLP com sonda UT-4p, não detectaram nenhuma
correlação entre cepas de pacientes com aids e sem aids e ambientais. Nos
domicílios analisados em nosso estudo não foi registrada a presença de pombos,
nem foi evidenciada a presença de excretas destas aves, ainda que na região
metropolitana de Belém e em outros centros urbanos (MONTENEGRO & PAULA,
2000; REOLON et al., 2004), principalmente nas áreas mais antigas, apresentem
grandes conglomerações destas e outras aves. Casadevall & Spitzer (1995)
sustentam que a utilização de técnicas moleculares como RFLP com elementos
repetitivos CNRE-1 e sonda UT-4p bem como cariotipagem eletroforética são
altamente discriminatória para métodos de tipagem molecular e seu uso por diversos
autores tem sugerido que a recorrência da criptococose nos casos estudados foi
devido à persistência do isolado inicial, ou seja, uma reativação.
O presente estudo mostra que, embora o substrato predominantemente
coletado tenha sido madeira em decomposição (n=97), foi da poeira intradomiciliar
(n=53) que se obteve maior positividade para Cryptococcus spp., com 10 amostras
positivas. É preciso considerar que esta positividade é subestimada, visto que mais
quatro amostras de poeira intradomiciliar apresentaram colônias fenoloxidase
positivas, entretanto, o alto grau de contaminação não permitiu o seu isolamento e
subseqüente perfeita caracterização fenotípica e genotípica. Muitas das amostras
apresentavam grande contaminação por espécies de Mucorales e Trichoderma spp.
100
O isolamento de C. neoformans de poeira domiciliar associada ou não à
presença de aves domésticas tem sido reportado por muitos autores. Além de
Passoni et al. (1998), um estudo epidemiológico registrou o isolamento de C.
neoformans a partir de poeira doméstica em 54% de domicílios de pacientes com
aids e 20% de domicílios aleatoriamente selecionados em Bumjumbura, Burundi
(SWINNE et al., 1991). Cavalcanti (1997) isolou C. neoformans de 5 amostras
constituída de poeira + solo intradomiciliar. Os dados aqui apresentados mostram
que a partir de 53 amostras de poeira intradomiciliar C. neoformans foi isolado de 4
amostras, C. gattii de uma amostra e ambas as espécies foram isoladas de outras 5
amostras. De acordo com o que foi encontrado na literatura, este parece ser o
primeiro registro de C. gattii neste tipo de substrato, bem como o primeiro relato de
compartilhamento de ambas as espécies em poeira intradomiciliar. De uma maneira
geral, as amostras de poeira consistiam de vários substratos, uma vez que foram
obtidas da varrição do domicílio no momento da visita. Em geral, estes substratos
consistiam de areia, às vezes pêlos de animais, cabelo, cupins, formigas e outros
detritos. Cabe ressaltar que todas estas amostras foram coletadas em residências
de madeira, muitas vezes com partes da edificação em decomposição. Estes
achados representam um novo aspecto no estudo da ecologia de C. gattii e
evidenciam que indivíduos podem estar em exposição contínua com o agente no
próprio ambiente domiciliar, o que impõe uma maior preocupação pela presença do
fungo em material facilmente aerossolizável e ao alcance de hospedeiros
suscetíveis.
O segundo tipo de substrato com maior positividade era constituído de restos
de madeira em decomposição, coletados em alguns casos do próprio domicílio do
paciente e/ou de domicílio controle. Diferente do esperado nas amostras de madeira
observou-se predominância de C. neoformans. Apenas uma amostra continha as
duas espécies neste substrato. Por outro lado, estes resultados reforçam a hipótese
de Lazéra et al. (2000) de que o nicho primário, tanto de C. neoformans quanto de
C. gattii, é de origem vegetal em decomposição.
A maioria dos estudos descreve C. gattii associado a vegetais e, embora
tenha habilidade para utilizar creatinina como fonte de Nitrogênio, esta levedura não
tem sido isolada de excretas de aves. Em nosso estudo C. gattii foi isolado de 6
amostras de poeira intradomiciliar, sendo 5 referentes ao caso índice 3 e uma
referente ao caso índice 7. Esperava-se a ocorrência de C. gattii em detritos de
madeira, no entanto, foi mais freqüentemente isolado de amostras de poeira
101
intradomiciliar. Por outro lado, como já foi ressaltado, as residências com poeira
positiva eram todas construídas em madeira.
Há um consenso geral de que a maioria das infecções por Cyptococcus spp.
são adquiridas por inalação de propágulos infectivos. Células da levedura
capsuladas do tipo encontrada em culturas laboratoriais são consideradas
excessivamente grandes para uma eficiente inalação (PERFECT & CASADEVALL,
2002). Porém, leveduras desidratadas e acapsuladas e/ou basidiosporos
apresentam diâmetro suficientemente pequeno para inalação e deposição alveolar.
Em estudo conduzido por Ruiz & Bulmer (1981) C. neoformans foi isolado a
partir do ar em um edifício (torre) desocupado e contaminado com excretas de
pombos em Oklahoma/EUA, através da exposição de placas de Petri com meios de
cultura específicos, durante 15 min, bem como de detritos do chão e excretas de
pombo. O número e tamanho das células de C. neoformans contidas no ar foram
analisados com coletor de ar da marca Anderson. O ar continha uma média de 45
UFC em 100 l de ar e 60% das células com menos de 4,7 µm de diâmetro. Amostras
do chão foram coletadas antes e após varrição. A varrição resultou na
aerossolização de um grande número de células de 4,7 a 11 µm em diâmetro. Um
minuto após a varrição 4,4% de células viáveis de C. neoformans eram menores que
1,1 µm (0,65 – 4,7 µm), um tamanho compatível com a deposição alveolar
(NEILSON et al. 1977). Baseado nestes achados foi estimado que a exposição
humana a esta atmosfera durante uma hora poderia resultar na deposição de 41
células de C. neoformans nos pulmões. Aproximadamente 106cél/ g de C.
neoformans foi cultivado de excretas de pombos (RUIZ & BULMER, 1981). Em outra
investigação em ambiente similar ao anterior Ruiz et al., (1981), avaliaram a
distribuição e o tamanho das células de C. neoformans em amostras de excretas de
pombos acumuladas e, portanto, mais compactadas e com amostras compostas de
material particulado relativamente finos e dispersadas pelo chão, revelando que
excretas envelhecidas compactadas continham menos células viáveis de C.
neoformans que aquelas com material seco livremente espalhado pelo chão. O
material fino espalhado pelo chão continha 300 vezes mais células viáveis que as
excretas acumuladas e mais compactas.
No presente estudo, a contagem de colônias de Cryptococcus spp. em
amostras de poeira intradomiciliar variou entre 1,5 x 102 até 75 x 102 UFC/g.
Em relação ao número de colônias produzidas, chamou atenção substrato
coletado no domicílio do caso índice 2, situado na cidade de Ananindeua na RMB,
102
considerada a segunda maior cidade do estado. Artrópodes conhecidos
popularmente como “tatuzinhos de jardins” apresentaram elevadíssimos índices de
UFC, com média de 238,38 e 247,31 UFC por placa. Nas primeiras 48 horas a
maioria das placas apresentava-se como colônias marrom escuras puras, fenol
oxidase positivas. Todos os isolados foram C. neoformans e os tatuzinhos foram
identificados como Cubaris murina. Embora o paciente deste domicílio tivesse sido
acometido por C. gattii, este resultado demonstrou que tais artrópodes podem
também transportar estas leveduras e, possivelmente, dispersá-las no ambiente,
uma vez que material raspado da madeira onde os tatuzinhos andavam também
estavam contaminados com C. neoformans. Estes dados estão de acordo com Ruiz
et al. (1982), que em seus experimentos detectaram C. neoformans em tatuzinhos
de jardins identificados como Methoponorthus pruinosus. Os autores recuperaram o
fungo também de placas com meio de cultura onde os tatuzinhos foram colocados
para andarem. Através de cortes histológicos observaram a presença de leveduras
não capsuladas que foram sugeridas como sendo C. neoformans. É importante
ressaltar que em nosso estudo o procedimento utilizado para análise destes
artrópodes foi diferente dos demais substratos, o que pode ter influenciado na
enorme quantidade de colônias produzidas, pois os mesmos foram macerados em 2
ml de solução salina. As duas amostras foram coletadas no mesmo ambiente, mas
em recipientes separados, por isto foram processadas separadamente.
A associação de C. neoformans com invertebrados foi estudada em vários
aspectos por Ruiz et al. (1982), demonstrando que fatores bióticos influenciam na
sobrevivência de C. neoformans, incluindo bactérias, amebas, ácaros e tatuzinhos
de jardins. Algumas bactérias, entre quais Pseudomonas aeruginosa e Bacillus
subtilis, apresentaram propriedade anti-C. neoformans e ácaros que foram
observados em placas contendo ágar azul tripano (TBA) apresentavam células de
leveduras azuis (células de C. neoformans apresentam-se azuis sobre TBA) dentro
do trato digestivo dos ácaros. O experimento com amebas (Achantamoeba
palestinensis) isoladas de excretas de pombos demonstrou que estas, na forma de
trofozoítas, podem ingerir e matar as 99, 9% de células de C. neoformans após sete
dias de incubação. A formação de pseudohifas, observadas em outro estudo, parece
ser uma forma de resistência ao ataque (massacre) das amebas, sugerindo que esta
forma fúngica possa persistir em locais habitados por amebas (NEILSON et al.,
1978). Recentemente Kidd et al., (2003) relataram o primeiro isolamento de C. gattii
de insect frass (produto resultante de uma colônia de insetos, vivos e/ou mortos,
103
sobre substrato vegetal, igualmente vivo ou morto) coletado de uma cavidade
sombreada na casca de uma árvore viva (Eucalyptus tereticornis) na Austrália. Estes
detritos permitiram identificar o inseto como pertencente à ordem Lepidoptera.
Análise com PCR fingerprinting identificou os tipos moleculares VGI e VGII de C.
gattii.
A potencial associação entre Cryptococcus spp. e hospedeiros diversos são
consistentes com a classificação do fungo na ordem Tremellales, a qual inclui fungos
micoparasitas (KWON-CHUNG et al., 1995), sugerindo uma possível relação de
parasitismo na natureza (LIN & HEITMAN, 2006). Pelo exposto, deve-se considerar
outras relações ecológicas, como comensalismo e predação, uma vez que no
experimento com ameba, C. neoformans mostrou-se fonte de alimentação. Na
realidade, evidencia-se um complexo ciclo de interação onde várias funções
ecológicas podem ser relacionadas.
Outro aspecto que vem sendo abordado é a possibilidade do fungo adquirir
virulência no ambiente em decorrência da interação com hospedeiros não
mamíferos. Os registros de associação de Cryptococcus spp. com grande variedade
de hospedeiros sustenta a hipótese de que a virulência do fungo pode estar
relacionada e mantida por via de seleção imposta pela exposição a predadores
naturais. Amebas como Achantamoeba castelannii (STEENBERGEN et al., 2001),
nematóides (MYLONAKIS et al., 2002) e o fungo mucilaginoso Dictyostelium
discoideum, entre outros, têm sido utilizados em modelos de estudo de virulência.
Em um destes estudos, Steenbergen et al. (2001) relataram que linhagens
acapsuladas de C. neoformans não sobrevivem quando incubadas com amebas,
porém, a melaninização protege a levedura contra o ataque (killing) da ameba,
sugerindo que a virulência de C. neoformans é conseqüência de adaptações que
desenvolveram para proteção contra predadores no ambiente. Observaram ainda
que todas as leveduras testadas foram ingeridas pela ameba, no entanto, linhagens
acapsuladas e linhagens com pseudohifas foram ingeridas mais rapidamente que as
formas capsuladas, mostrando que a cápsula tem papel anti-fagocítico. Após
ingestão, as células resistem e replicam-se dentro de vacúolos fagocíticos. Vacúolos
contendo polissacarídeos são deletérios para a célula (FELDMESSER et al., 2000).
Por fim, o estudo demonstrou que muitas linhagens virulentas de C. neoformans
podem causar a lise da ameba.
No presente estudo, a determinação do tipo sexuado por PCR com primers
específicos e do tipo molecular através da técnica de PCR/RFLP do gene URA5,
104
revelou que todos os 37 isolados dos tatuzinhos e de uma amostra de raspas de
madeira onde os tatuzinhos foram encontrados pertencem ao tipo sexuado MATa,
tipo molecular VNIV. Provavelmente todos estes isolados resultaram de uma
expansão clonal, indicando possível associação comensal entre os fungos e os
tatuzinhos, provavelmente transitória. Para melhor compreensão destes achados
são necessárias novas buscas em diversos ambientes para verificar se este é um
evento ocasional ou freqüente. Estudos histológicos podem comprovar a presença
interna da levedura. E estudos controlados em laboratórios poderão melhor definir o
tipo de associação ecológica entre os fungos e tatuzinhos de jardim.
Em relação ao tipo de domicílio positivo para Cryptococcus spp. deve ser
ressaltado o fato de a maioria dos casos selecionados e mesmo os não
selecionados situarem-se em áreas de invasão, com precárias condições de
saneamento e cujas edificações são construídas de forma desordenada e
predominantemente em madeira. Muitos dos domicílios visitados encontravam-se
em aparente decomposição. Em alguns destes foi registrada a presença de
basidiomas de Basidiomycetes, denotando a participação deste grupo na
degradação da madeira.
Dos oito domicílios de casos-índice estudados destacam-se dois: i) O caso-
índice 3, de uma paciente portadora de LES e residente em área de invasão próximo
a portos e madeireiras. Cryptococcus neoformans foi isolado do domicílio da
paciente, do domicílio da mãe da paciente e de dois domicílios vizinhos.
Cryptococcus gattii foi isolado da poeira intradomiciliar após varrição no andar de
baixo da residência da mãe. As duas espécies foram encontradas em poeira
intradomiciliar de dois domicílios vizinhos, bem como do andar de cima da residência
da mãe da paciente e ainda da cozinha da paciente. Estas residências foram
construídas de forma contígua, ou seja, uma parede separa duas casas. As casas
em frente mantêm diminuta distância, podendo-se considerar como se fosse um
único ambiente. Durante a coleta não foi observada a presença de pombos, mas sim
muitas madeireiras próximas, sugerindo que material proveniente do manejo da
madeira seja disperso pelo ambiente; ii) O caso-índice 7, de um paciente do sexo
masculino, HIV negativo, de 65 anos de idade e que foi a óbito devido criptococose
por C. neoformans. O paciente era marceneiro e, portanto, em freqüente exposição a
detritos de madeira. A sua residência era em madeira, mas localizada no limite, em
área mais bem estruturada do que no caso-índice 3. Também se observou pelo lado
externo da casa uma parede em decomposição, mas as amostras coletadas não
105
foram positivas. No domicílio foram detectadas duas amostras positivas das 11
coletadas. Uma das amostras apresentou baixa densidade de colônias e rápida
contaminação, não se conseguindo seu isolamento para identificação e
caracterização precisa. Somente de uma amostra de poeira intradomiciliar coletada
no andar de cima do domicílio foram recuperados 16 isolados, identificados como C.
neoformans e C. gattii na proporção de 1:1.
O caso índice 8 refere-se a um paciente HIV positivo. Por questões familiares,
não permitiram nossa entrada no domicílio do paciente, fechado desde a sua morte.
Embora o domicílio seja em madeira, situa-se em um bairro mais estruturado, com
ruas largas e residências próximas construídas em alvenaria. Uma amostra de
poeira intradomiciliar coletada em domicílio-controle, pertencente a um parente do
paciente, foi positiva para C. neoformans. Todos os isolados foram VNI, MATα,
compatíveis com os isolados da maioria dos casos de aids.
É interessante ressaltar que na maioria das amostras ambientais, C.
neoformans sempre esteve presente em maior proporção ou pelo menos foi isolado
em maior proporção, o que pode representar maior poder de competitividade e/ou
capacidade de rápida reprodução.
Se a criptococose é causada por uma infecção aguda ou reativação de uma
infecção latente é um tema ainda em discussão. Evidências sugerem que a
reativação de infecção latente seria mais comum (LIN & HEITMAN, 2006). É
provável que as manifestações da criptococose sejam devidas à reativação mais do
que uma re-infecção (BRANDT et al., 1996). Garcia-Hermoso et al., (1999)
analisaram 9 pacientes que moraram na África durante 110 meses antes de se
mudarem para a Europa. Perfis de RAPD mostraram que os isolados clínicos dos
pacientes africanos diagnosticados na França eram significativamente diferentes dos
isolados clínicos europeus, sugerindo que a infecção por C. neoformans havia sido
adquirida na África, suportando a idéia de uma fase dormente seguida da reativação
do fungo. Através da avaliação de um grupo de viajantes que estiveram em
Vancouver foi sugerido para C. gattii um período de incubação de 2 a 11 meses,
indicando que a infecção por C. gattii é mais consistente com infecção primária
(MacDOUGALL & FYFE, 2006).
No Brasil, estudos clínico-epidemiológicos mostram a importância da
criptococose gattii de SNC em adultos jovens de ambos os sexos e crianças nas
regiões N e NE, com letalidade de 35% a 40% (CAVALCANTI 1997, CORRÊA et al.
1999, SANTOS 2000, DARZÉ et al. 2000, NISHIKAWA et al. 2003, MARTINS 2003,
106
LAZÉRA et al. 2005). É notório que a maioria é diagnosticada quando há
manifestações do SNC, não se diagnosticando formas pulmonares mais leves, o que
parece indicar um importante fator de sub-diagnóstico da doença nestas regiões.
No estado do Pará os registros hospitalares mostram alta incidência de
criptococose, embora pouco documentada na literatura. Há registro de um caso de
criptococose cutânea de paciente masculino de 29 meses, residente em casa tipo
palafita, ocorrido em 1981, cujo diagnóstico foi obtido por exame histopatológico e
seu tratamento realizado pela remoção da lesão, não ocorrendo recidiva (AUAD,
1993). Em estudo mais recente, Corrêa et al., (1999) registram criptococose gattii em
crianças e jovens no Pará e Santos et al. (2005) apresentaram em congresso um
estudo que mostra o predomínio da criptococose gattii sobre a criptococose
neoformans em centro de referência em Belém do Pará onde a maioria absoluta
apresenta lesão de SNC.
A percepção da importância da criptococose gattii é crescente; se antes era
vista como problema restrito a grupos populacionais rurais ou nativos, atualmente
identifica-se sua ocorrência em diversas regiões onde surjam condições laboratoriais
para o diagnóstico e discriminação das espécies de Cryptococcus (LAZÉRA et al.,
2007).
Tais achados sugerem a possibilidade de infecção humana indoor, isto é, a
infecção seria adquirida dentro das residências. É, portanto, de fundamental
importância ampliar este estudo para verificar se o próprio ambiente domiciliar em
Belém do Pará e outros domicílios em condições similares podem representar fontes
cotidianas para a infecção humana, o que traz um novo conceito de risco na
criptococose, particularmente aquela causada por C. gattii que atinge crianças e
jovens aparentemente normais em Belém do Pará, bem como nas regiões Norte e
Nordeste do Brasil em geral.
É reconhecida a predominância do tipo sexuado MATα sobre MATa em
isolados de C. neoformans e C. gattii independente da origem clínica ou ambiental.
Kwon-Chung & Bennett (1978) encontraram uma proporção de 30:1 entre os
isolados clínicos e 40:1 entre os isolados ambientais de C. neoformans. Todos os
isolados C. gattii sorotipo B de Vancouver foram MATα e a grande maioria fértil
(FRASER et al., 2003). Não está claro o porquê deste predomínio, embora o tipo
sexuado MATα seja referido como mais virulento (KWON-CHUNG et al., 1992b), o
que lhe conferiria maior competitividade. Wickes et al. (1996), ao demonstrar in vitro
que isolados do tipo sexuado MATα são capazes de produzir hifas e basidiosporos
107
na ausência de mating, sob determinadas condições (limitação de nitrogênio e
água), sugere que esta associação possa explicar a preponderância deste mating
type na natureza. O dimorfismo refere-se à capacidade de algumas espécies se
apresentarem ora na fase micelial ora na fase leveduriforme, dependente de
determinados fatores como temperatura, nutrientes e tensão de CO2, observados em
várias espécies de fungos patogênicos, notadamente os causadores de infecções
sistêmicas. Embora a presença de hifas seja descrita em C. neoformans e C. gattii,
estes não têm sido referidos como dimórficos, porque a fase micelial é transitória e
observada durante a fase sexual (WICKES et al. 1996)
A determinação do mating type em 220 isolados analisados neste estudo
mostrou concordância com a literatura em relação a maior freqüência de isolados
MATα. Entretanto diferentemente do estudo de Kwon-Chung & Bennett (1978) os
isolados obtidos neste trabalho revelaram predomínio de MATα, na proporção ~2:1.
Halliday et al., (1999) analisando isolados clínicos e ambientais da Austrália também
detectaram a maioria de isolados MATα, porém em isolados de uma determinada
área geográfica a proporção de MATα foi de 27:2 enquanto que numa segunda área
esta proporção foi de 50:50, o esperado para uma recombinação sexual. Nosso
estudo revelou que o tipo sexuado MATa só foi detectado em isolados de C.
neoformans. Mas, o que chamou mais atenção foi a ocorrência de ambos os tipos
sexuados em um mesmo ambiente em domicílios diferentes. C. neoformans MATa
foi recuperado de duas amostras de restos de madeira em decomposição retirada da
própria parede do domicílio de uma paciente (caso índice 3) enquanto de amostras
de poeira doméstica isolou-se C. neoformans MATα e C. gattii MATα de um
domicílio situado em frente. Um segunda coleta, realizada 4 meses depois, revelou a
presença de C. neoformans e C. gattii MATα do domicílio desta paciente. A
presença de isolados de MATα e MATa no mesmo espaço geográfico reforça
evidências de ocorrência do ciclo sexuado na natureza, possivelmente ligado a
ambientes com a presença de substratos de origem vegetal em decomposição,
como já foi sugerido por Lazéra et al. (2000). Cruzamento entre isolados ambientais
coletados em Roraima demonstraram fertilidade in vitro, entretanto mostraram
ausência de autofertilidade (FORTES, 2001).
Considerando que os primers utilizados para este estudo foram originalmente
construídos com base no feromônio de isolados C. neoformans sorotipo D, chamou
atenção uma amostra de C. gattii em que o marcador molecular revelou bandas
compatíveis com MATαa. A PCR foi repetida mais de uma vez com o mesmo
108
resultado. Sendo assim este isolado merece ser mais bem estudado quanto à sua
ploidia e seqüenciamento genético para confirmação do tipo sexuado e verificação
se trata de isolado recombinante ou híbrido, uma vez que há possibilidade de
híbridos inter-espécies e estes são extremamente raros na natureza. Isolados αa
são característicos do ciclo sexual clássico destas leveduras. Embora apenas um
isolado αa, tenha sido detectado é possível especular que há uma grande
possibilidade da existência do ciclo sexuado nestes habitats, visto que isolados
MATα e MATa foram recuperados de um mesmo ambiente. Além disto, cepas
haplóides foram demonstradas, capazes de desenvolver um ciclo monocariótico
(WICKES et al., 1996) indicando a necessidade de continuar esta linha de pesquisa
que poderá resultar no encontro de híbridos ou recombinantes.
O estudo do ciclo sexuado não foi objeto deste estudo, porém resultou no
isolamento de colônias que devem ser testadas para verificar sua fertilidade e
possível recombinação ou hibridização gênica entre C. neoformans e C.gattii.
Em estudo de plantas e animais os termos hibridização e híbrido são
utilizados para descrever o processo ou produto do processo no qual uma progênie
é gerada a partir do cruzamento de duas linhagens parentais geneticamente
divergentes, como por exemplo, linhagens de diferentes raças, variedades,
subespécies espécies ou gêneros (Xu et al., 2002). Linhagens de sorotipo A e D são
referidas como variedades por alguns autores, devido às diferenças sorotípicas entre
estas. Por isto, mating type entre linhagens sorotipo A e D tem sido referidos como
híbridos (XU et al., 2002). A recombinação refere-se à formação de uma nova
combinação de genes observada na progênie e não nos parentais resultante de
crossing over e segregação, independente ou durante a meiose. Não foi possível
obter a sorotipagem de todos os isolados devido a indisponibilidade comercial do kit
Crypto Iatron. Entretanto estes isolados MATa foram caracterizados como VNIV, e
este genótipo mostra correspondência com sorotipo D. A maioria dos isolados
híbridos relatados na literatura são AD, compatíveis com a distribuição cosmopolita
destes sorotipos. Híbridos BD, oriundos do cruzamento entre as espécies são raros.
A sua ocorrência natural foi registrada por Bovers et al. (2006).
Outros isolados MATa foram obtidos das amostras de tatuzinhos coletados
em quintal do domicílio do paciente caso índice-2. Estes achados foram discutidos
acima.
109
No Brasil, o tipo sexuado MATa foi registrado por Trilles et al. (2003) em
alguns isolados do Piauí, do Rio de Janeiro e do Amazonas. Raros isolados αa
foram registrados por Casali et al. (2003) e Barreto de Oliveira et al. (2004).
A distribuição dos tipos moleculares pelo método de PCR/RFLP do gene
URA5, evidenciou a ocorrência de três tipos moleculares em isolados ambientais na
RMB. O genótipo mais freqüente foi VNI (45 %), seguido pelo genótipo VNIV (32 %)
e VGII (23 %). Estes resultados estão em concordância com estudos prévios que
estabeleceram o genótipo VNI como o mais freqüente entre os isolados de C.
neoformans (MEYER et al., 1999; MEYER et al., 2003). Os genótipos VNI e VGI
foram considerados os tipos moleculares mundialmente predominantes (MEYER et
al., 1999, BOEKHOUT, et al., 2001), sendo que a maioria dos isolados clínicos de
pacientes com aids são VNI (ELLIS et al., 2000). Por outro lado, estudos posteriores
mostraram perfil diferente para isolados da América Latina. Isolados de origem
clínica, veterinária e ambiental provenientes de 9 países iberoamericanos foram
estudados por Meyer et al. (2003) e revelaram o predomínio do genótipo VNI
(68,2%) e, em menor proporção, VNII (5,6%), VNIII (4,1%), VNIV (1,8%), VGI (3,5%),
VGII (6,2%), VGIII (9,1%) e VGIV (1,5%). Notou-se a ocorrência de todos os
genótipos e, entre os isolados de C. gattii, prevaleceu o genótipo VGIII; porém, entre
os isolados brasileiros somente o genótipo VGII foi registrado. Estudo de 247
isolados ambientais de várias regiões da Colômbia agrupou a maioria no genótipo
VNI (98,1%) e VGII (100%) (ESCANDÓN et al., 2006).
Em nossa investigação ambiental não foi detectado o genótipo VGIII,
prevalente nas cepas ibero-americanas; porém, quando se avaliam somente as
cepas brasileiras, estes resultados coincidem com o estudo de Meyer et al. (2003).
No Rio Grande do Sul o estudo de cepas clínicas e ambientais (CASALI et al., 2003)
mostrou VNI (83,9%) de C. neoformans como o mais freqüente tipo molecular, de
origem clínica e ambiental. Entre os isolados C. gattii (8,9 %) todos foram VGIII
embora de origem clínica, mostram divergência em relação aos observados neste
estudo onde todos os isolados foram VGII. Estes achados estão de acordo com o
observado em outra análise de sorotipos, que também revelou marcante diferença
em relação a C. gattii quando se comparam a sua ocorrência nas regiões
Norte/Nordeste e Sul/Sudeste (NISHIKAWA et al., 2003).
Neste trabalho o genótipo VNIV foi isolado de tatuzinhos de jardins e raspado
de madeira relacionado, bem como de raspados de madeira em decomposição de
110
um domicílio, revelando-se todos do tipo sexuado MATa . Todos os isolados
oriundos de Eucaliptus spp. analisados por Casali et al., (2003) apresentaram este
genótipo, mas diferentemente, todos foram MATα . É interessante este achado uma
vez que também foram isolados em madeira em decomposição e pode-se afirmar
que não era de Eucaliptus spp. Embora não possamos afirmar, nosso achado
sugere que o fungo estivesse presente na madeira e que, ao serem ingeridos pelos
tatuzinhos, de alguma forma conseguem sobreviver por algum mecanismo de
escape e multiplicar-se em seu interior. Estes achados necessitam de novas buscas
e novas abordagens para um melhor entendimento desta relação.
Trilles et al. (2003) pelo método de AFLP identificaram 3 isolados do Piauí
como AFLP2, correspondente ao genótipo VNIV. Destes, dois foram isolados de solo
de toca de tatu e um de oco de árvore, e todos eram MATa. Analisando estes dados
em conjunto, observa-se que todos os genótipos VNIV das regiões N e NE eram
MATa, o tipo sexuado menos freqüente no mundo, enquanto que na região Sul
prevaleceram isolados MATα. Todos estes achados parecem mostrar uma relação
entre C. neoformans VNIV com vegetais e animais, uma vez que tatus têm sido
considerados possíveis reservatórios de vários patógenos (WANKE et al., 2007).
A ocorrência do genótipo VNIV no norte do Brasil adiciona um novo dado à
literatura, uma vez que até recentemente era considerado restrito a Índia e África do
Sul (ELLIS et al., 2000).
A ocorrência de isolados VGII neste estudo representa um achado importante,
uma vez que este genótipo foi o responsável pelo surto iniciado em 1999 na ilha de
Vancouver, Canadá, onde foi demonstrado que a concentração de propágulos foi
significantemente maior nos meses mais quentes e secos do ano (KIDD et al., 2007)
e alta fertilidade (FRASER et al., 2003). Dois subtipos foram identificados por Kidd et
al., (2004) nomeados VGIIa e VGIIb. A maioria destes isolados é considerada hiper-
virulenta e tem um idêntico genótipo, compatível com o único genótipo do Pacífico
Nordeste. A minoria é significantemente menos virulenta e compartilha genótipo
idêntico aos isolados férteis da população recombinante da Austrália (FRASER et
al., 2005). Considerando que C. gattii acomete principalmente hospedeiros
imunocompetentes, com elevada prevalência em crianças e jovens, tanto no estado
Pará (CORRÊA et al., 1999) quanto no Piauí (CAVALCANTI, 1997; MARTINS, 2003)
e Amazonas (SANTOS, 2000), este estudo confirma a presença de C. gattii VGII em
111
fontes ambientais da RMB e se revela preocupante, dado a elevada presença de
construções em madeira. As sobras das madeireiras constituem um material
abundante, barato e acessível para construção de habitações rústicas em áreas
alagadas na maior parte do ano e sem saneamento.
Estes achados mostram um ciclo biológico complexo dos agentes da
criptococose, adaptados a ambiente domiciliar localizado em área onde a pobreza
impera, cuja população usa madeira de refugo para a maioria de suas construções,
sob regime de alta pluviosidade e elevada umidade relativa do ar, em alguns casos
situadas próximas a rios ou igarapés muitas vezes sofrendo inundações provocadas
pelo regime de marés muito fortes nesta região do Brasil. Nestas condições,
observa-se acelerado processo de decomposição de substratos de madeira não
tratada, propiciando íntimo contato homem-fungo e atingindo todas as faixas etárias,
incluindo as crianças. Portanto, é bem provável que propágulos de leveduras
dessecadas e até mesmos basidiosporos possam ser produzidos por C. neoformans
e/ou C. gattii e sejam inalados no cotidiano destes domicílios, causando infecção
pulmonar assintomática, pneumonia ou disseminando para o sistema nervoso
central e outros órgãos. É importante ampliar os estudos sobre a criptococose e
seus agentes no Norte e Nordeste do Brasil, bem como identificar tipos moleculares
predominantes em infecções humanas, em animais e no meio ambiente, para um
melhor entendimento da estrutura populacional e diferenças geográficas destes
importantes agentes e identificar possíveis mecanismos de infecção nesta região.
A falta de condições de planejamento das construções e saneamento
contribui para um ambiente de pouca luminosidade e ventilação, menos limpo,
propiciando o desenvolvimento e multiplicação destes patógenos.
O presente estudo contribui pioneiramente para o conhecimento de fontes
ambientais e caracterização molecular de C. neoformans e C. gattii, oriundas da
região Norte do Brasil, adicionando novos genótipos e aspectos ecológicos
concernentes a estes dois agentes de relevante importância médica para a região,
bem como poderá servir de subsídio para novas pesquisas que visem identificar
possível elo genético entre isolados clínicos e ambientais.
112
8 – CONCLUSÕES Os resultados aqui apresentados permitem as seguintes conclusões:
1. Em relação às amostras coletadas em ocos de árvores ornamentais em área
urbana de Belém, registrou-se pela primeira vez a ocorrência de C. neoformans
sorotipo A, MATα, genótipo VNI e C. gattii sorotipo B, MAT α, genótipo VGII
compartilhando o mesmo oco de Senna siamea na cidade de Belém/PA, sugerindo
provável interação entre estas.
2. Metade dos domicílios dos casos-índice pesquisados (3/8 mais 1 domicílio
controle) apresentou contaminação por Cryptococcus neoformans e/ou
Cryptococcus gattii, demonstrando a ocorrência dos agentes da criptococose dentro
de e/ou no entorno de domicílios de pacientes da região.
3. A identificação dos isolados ambientais revelou o predomínio de C. neoformans
sobre C. gattii.
4. Em relação ao substrato investigado, detectou-se maior contaminação em poeira
intradomiciliar, demonstrando a ocorrência do fungo em material facilmente
aerossolizável.
5. Pela primeira vez foi demonstrada a ocorrência de C. gattii em ambiente
intradomiciliar, bem como a ocorrência de ambas as espécies compartilhando o
mesmo ambiente domiciliar, acrescentando mais um dado ecológico sobre
comportamento destes agentes.
6. Nos substratos constituídos de madeira em decomposição, Cryptococcus
neoformans foi isolado de 3 amostras e C. gattii, em conjunto com C. neoformans, foi
isolado de uma, sustentando a hipótese de que substrato de origem vegetal em
decomposição é habitat primário de ambas as espécies.
7. Cryptococcus neoformans foi isolado de tatuzinhos de jardins (Cubaris murina),
achado inédito.
113
8. A ocorrência de C. neoformans em amostra de raspado de madeira onde os
artrópodes C. murina foram coletados sugere que os mesmos possam ser
dispersores do fungo no ambiente.
9. Em função do elevado índice de UFC de C. neoformans detectado nos
artrópodes, bem como o baixo índice de contaminação por outros fungos, sugere
que o fungo estava colonizando internamente estes artrópodes e que,
possivelmente, conseguem sobreviver e se multiplicar em seu interior.
10. A caracterização molecular mostrou que todos os isolados dos tatuzinhos de
jardins eram do tipo sexuado MATa, tipo molecular VNIV, indicando possível
estrutura populacional clonal.
11. Globalmente, a determinação do mating type mostrou predominância de isolados
MATα, sendo 45% C. neoformans MATα, 32% C. neoformans MATa e 23% C. gattii
MATα. Um isolado C. gattii MATαa foi demonstrado. A ocorrência de isolados MATα
e isolados MATa em um mesmo ambiente sugere a possibilidade de cruzamento
entre isolados ambientais, o que poderia resultar em progênie de recombinantes ou
híbridos.
12. A ocorrência de C. gattii MATαa, indica possibilidade de híbridos inter-espécies.
Todavia merece estudos mais aprofundados para comprovação do achado que é
raro na natureza.
13. A utilização de PCR/RFLP do gene URA5 revelou o predomínio do tipo molecular
VNI, seguido de VNIV e VGII. Os genótipos VNIV e VGII constituem-se em novos
registros de isolados ambientais para a região norte do Brasil. Embora registrado em
menor número, a ocorrência de VGII é marcante quando comparada com as das
regiões Sul e Sudeste do Brasil.
14. A ocorrência isolada ou combinada de C. neoformans e C. gattii em habitações
precárias, construídas predominantemente em madeira, em uma região quente e
úmida, com alta pluviosidade, favorece a possibilidade de infecção indoor.
114
15. A elevada ocorrência dos agentes da criptococose na RMB indica que este
modelo de estudo deve ser aumentado para avaliação mais abrangente da relação
entre fontes de infecção e pacientes.
115
9 - PERSPECTIVAS
O Hospital Universitário João de Barros Barreto tem registrado um índice
relativamente alto de meningite por Cryptococcus spp., inclusive recente caso
(junho/2008) de óbito de um menino em local similar em bairro próximo ao registrado
neste estudo, o que deixou a população em pânico. A ocorrência de meningite
criptoccócica por C. gattii tem sido registrada nas regiões Norte e Nordeste
notadamente em crianças e jovens aparentemente hígidos têm evidenciado elevada
morbidade e mortalidade sugerindo áreas endêmicas na região. Os resultados
obtidos no presente estudo permitem sugerir algumas linhas de pesquisa e
divulgação, a saber:
• Realizar estudos moleculares buscando caracterizar os genótipos da região e
subsidiar as equipes de saúde locais no conhecimento das possíveis fontes
ambientais da região.
• Identificar a freqüência de ocorrência de ambas as espécies (C. neoformans e
C. gattii) num mesmo biótopo na região urbana de Belém
• Estudo comparativo da presença destes agentes em áreas de florestas com
mínima ação antrópica e em áreas degradadas pela atividade humana.
• Investigar a relação entre C. neoformans e C. gattii com a biota local, como
insetos, isópodas, e amebas e outros animais.
• Utilizar estas linhas de pesquisa para treinamento de alunos de graduação e
pós-graduação visando a formação de grupo de pesquisa que possa gerar
informações da região.
• Elaborar material informativo para divulgar junto à população de áreas com
registro da infecção e outros, visando auxiliar na prevenção desta micose.
• Realizar palestras comunitárias e para a comunidade acadêmica e
profissionais da saúde visando a divulgação de informações que possam ajudar para
uma melhor diagnóstico e prevenção.
• Estes resultados iniciais indicam a importância de se ampliar os estudos para
outras regiões da Amazônia, onde a criptococose gattii é endêmica, atingindo um
grande contingente de crianças e adolescentes imunocompetentes.
Pelo exposto pretende-se dar continuidade a esta linha de pesquisa e
expandir para cidades do interior do estado onde haja registro da infecção.
116
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APÊNDICE
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APÊNDICE 1 - Dados Complementares
TABELA 1. Caracterização dos isolados ambientais da Região Metropolitana de Belém.
ISOLADOS SUBSTRATO ESPÉCIE SOROTIPO MAT URA-5 PA1 Tatuzinho de jardim C. neoformans Mat a VNIV PA2 Tatuzinho de jardim C. neoformans Mat a VNIV PA3 Tatuzinho de jardim C. neoformans Mat a VNIV PA4 Tatuzinho de jardim C. neoformans Mat a VNIV PA5 Tatuzinho de jardim C. neoformans Mat a VNIV PA6 Tatuzinho de jardim C. neoformans D Mat a VNIV PA7 Raspado de madeira C. neoformans Mat a VNIV PA8 Raspado de madeira C. neoformans Mat a VNIV PA9 Raspado de madeira C. neoformans Mat a VNIV PA10 Raspado de madeira C. neoformans Mat a VNIV PA11 Raspado de madeira C. neoformans D Mat a VNIV PA12 Raspado de madeira C. neoformans Mat a VNIV PA13 Raspado de madeira C. neoformans Mat a VNIV PA14 Raspado de madeira C. neoformans Mat a VNIV PA15 Raspado de madeira C. neoformans Mat a VNIV PA16 Tatuzinho de jardim C. neoformans Mat a VNIV PA17 Tatuzinho de jardim C. neoformans Mat a VNIV PA18 Tatuzinho de jardim C. neoformans Mat a VNIV PA19 Tatuzinho de jardim C. neoformans Mat a VNIV PA20 Tatuzinho de jardim C. neoformans Mat a VNIV PA21 Tatuzinho de jardim C. neoformans Mat a VNIV PA22 Tatuzinho de jardim C. neoformans Mat a VNIV PA23 Tatuzinho de jardim C. neoformans Mat a VNIV PA24 Tatuzinho de jardim C. neoformans Mat a VNIV PA25 Tatuzinho de jardim C. neoformans Mat a VNIV PA26 Tatuzinho de jardim C. neoformans Mat a VNIV PA27 Tatuzinho de jardim C. neoformans Mat a VNIV PA28 Tatuzinho de jardim C. neoformans Mat a VNIV PA29 Tatuzinho de jardim C. neoformans Mat a VNIV PA30 Tatuzinho de jardim C. neoformans Mat a VNIV PA31 Tatuzinho de jardim C. neoformans Mat a VNIV PA32 Tatuzinho de jardim C. neoformans Mat a VNIV PA33 Tatuzinho de jardim C. neoformans Mat a VNIV PA34 Tatuzinho de jardim C. neoformans Mat a VNIV PA35 Tatuzinho de jardim C. neoformans Mat a VNIV PA36 Tatuzinho de jardim C. neoformans D Mat a VNIV PA37 Tatuzinho de jardim C . neoformans Mat a VNIV PA38 Tatuzinho de jardim C. neoformans Mat a VNIV PA39 Tatuzinho de jardim C. neoformans Mat a VNIV PA40 Tatuzinho de jardim C. neoformans Mat a VNIV PA41 Tatuzinho de jardim C. neoformans Mat a VNIV PA42 Tatuzinho de jardim C. neoformans Mat a VNIV PA43 Tatuzinho de jardim C. neoformans Mat a VNIV PA44 Tatuzinho de jardim C. neoformans Mat a VNIV PA45 Tatuzinho de jardim C. neoformans Mat a VNIV PA46 Tatuzinho de jardim C. neoformans Mat a VNIV PA47 Madeira em decomposição C. neoformans Mat a VNIV PA48 Madeira em decomposição C. neoformans Mat a VNIV PA49 Madeira em decomposição C. neoformans Mat a VNIV
145
PA50 Madeira em decomposição C. neoformans Mat a VNIV PA51 Madeira em decomposição C. neoformans Mat a VNIV PA52 Madeira em decomposição C. neoformans Mat a VNIV PA53 Madeira em decomposição C. neoformans Mat a VNIV PA54 Madeira em decomposição C. neoformans Mat a VNIV PA55 Madeira em decomposição C. neoformans Mat a VNIV PA56 Madeira em decomposição C. neoformans Mat a VNIV PA57 Madeira em decomposição C. neoformans Mat a VNIV PA58 Madeira em decomposição C. neoformans Mat a VNIV PA59 Madeira em decomposição C. neoformans Mat a VNIV PA60 Madeira em decomposição C. neoformans Mat a VNIV PA61 Madeira em decomposição C. neoformans Mat a VNIV PA62 Madeira em decomposição C. neoformans Mat a VNIV PA63 Madeira em decomposição C. neoformans Mat a VNIV PA64 Madeira em decomposição C. neoformans Mat a VNIV PA65 Madeira em decomposição C. neoformans Mat a VNIV PA66 Madeira em decomposição C. neoformans Mat a VNIV PA67 Madeira em decomposição C. neoformans Mat a VNIV PA68 Madeira em decomposição C. neoformans Mat a VNIV PA69 Madeira em decomposição C. neoformans Mat a VNIV PA70 Madeira em decomposição C. neoformans Mat a VNIV PA71 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA72 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA73 Poeira intradomiciliar C. gattii Mat alfa VGII PA74 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA75 Poeira intradomiciliar C. gattii B Mat alfa VGII PA76 Poeira intradomiciliar C. gattii B Mat alfa VGII PA77 Poeira intradomiciliar C. gattii Mat alfa VGII PA78 Poeira intradomiciliar C. gattii Mat alfa VGII PA79 Poeira intradomiciliar C. gattii Mat alfa VGII PA80 Poeira intradomiciliar C. gattii Mat alfa VGII PA81 Poeira intradomiciliar C. gattii Mat alfa VGII PA82 Poeira intradomiciliar C. gattii Mat alfa VGII PA83 Poeira intradomiciliar C. gattii Mat alfa VGII PA84 Poeira intradomiciliar C. gattii Mat alfa VGII PA85 Poeira intradomiciliar C. gattii Mat alfa VGII PA86 Poeira intradomiciliar C. gattii Mat alfa VGII PA87 Poeira intradomiciliar C. gattii Mat alfa VGII PA88 Poeira intradomiciliar C. gattii Mat alfa VGII PA89 Poeira intradomiciliar C. gattii Mat alfa VGII PA90 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA91 Poeira intradomiciliar C. gattii B Mat alfa VGII PA92 Poeira intradomiciliar C. gattii Mat alfa VGII PA93 Poeira intradomiciliar C. gattii Mat alfa VGII PA94 Poeira intradomiciliar C. gattii Mat alfa VGII PA95 Poeira intradomiciliar C. gattii Mat αa VGII PA96 Poeira intradomiciliar C. gattii Mat alfa VGII PA97 Poeira intradomiciliar C. gattii Mat alfa VGII PA98 Poeira intradomicliar – parede C. neoformans Mat alfa VNI PA99 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA100 Poeira intradomiciliar C. gattii B Mat alfa VGII PA101 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA102 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA103 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI
146
PA104 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA105 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA106 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA107 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA108 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA109 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA110 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA111 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA112 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA113 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA114 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA115 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA116 Poeira intradomiciliar C. gattii B Mat alfa VGII PA117 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA118 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA119 Poeira intradomiciliar C. neoformans B Mat alfa VNI PA120 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA121 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA122 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA123 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA124 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA125 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA126 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA127 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA128 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA129 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA130 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA131 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA132 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA133 Poeira intradomiciliar C gattii B Mat alfa VGII PA134 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA135 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA136 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA137 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA138 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA139 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA140 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA141 Poeira intradomiciliar C. neoformans A Mat alfa VNI PA142 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA143 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA144 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA145 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA146 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA147 Poeira intradomiciliar C gattii Mat alfa VGII PA148 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA149 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA150 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA151 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA152 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA153 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA154 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA155 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA156 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA157 Poeira intradomiciliar C gattii Mat alfa VGII
147
PA158 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA159 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA160 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA161 Poeira intradomiciliar C. gattii B Mat alfa VGII PA162 Poeira intradomiciliar C. gattii B Mat alfa VGII PA163 Poeira intradomiciliar C.gattii Mat alfa VGII PA164 Madeira em decomposição C. gattii B Mat alfa VGII PA165 Madeira em decomposição C. gattii Mat alfa VGII PA166 Madeira em decomposição C. gattii B Mat alfa VGII PA167 Madeira em decomposição C. gattii Mat alfa VGII PA168 Madeira em decomposição C. gattii B Mat alfa VGII PA169 Madeira em decomposição C. gattii B Mat alfa VGII PA170 Madeira em decomposição C. gattii Mat alfa VGII PA171 Madeira em decomposição C. gattii B Mat alfa VGII PA172 Madeira em decomposição C. gattii B Mat alfa VGII PA173 Madeira em decomposição C. neoformans Mat alfa VNI PA174 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA175 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA176 Poeira intradomiciliar C. gattii B Mat alfa VGII PA177 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA178 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA179 Poeira intradomiciliar C. gattii B Mat alfa VGII PA180 Poeira intradomiciliar C. gattii B Mat alfa VGII PA181 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA182 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA183 Poeira intradomiciliar C. gattii B Mat alfa VGII PA184 Poeira intradomiciliar C. gattii B Mat alfa VGII PA185 Poeira intradomiciliar C. gattii B Mat alfa VGII PA186 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA187 Poeira intradomiciliar C. gattii B Mat alfa VGII PA188 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA189 Poeira intradomiciliar C. gattii B Mat alfa VGII PA190 Poeira intradomiciliar C. gattii Mat alfa VGII PA191 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA192 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA193 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA194 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA195 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA196 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA197 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA198 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA199 Poeira intradomiciliar C. gattii Mat alfa VGII PA200 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA201 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA202 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA203 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA204 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA205 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA206 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA207 Poeira intradomiciliar C. gattii Mat alfa VGII PA208 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA209 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA210 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA211 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI
148
PA212 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA213 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA214 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA215 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA216 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA217 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA218 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA219 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA220 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI
149
APÊNDICE 2
First isolation of Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii
from environmental sources in the city of Belém, Pará, Brasil.
Solange do PSE Costa11, Márcia dos S Lazéra2, Wallace RA Santos3; Bernardina
P Morales2, Cláudia CF Bezerra2, Marília M Nishikawa4, Gláucia G Barbosa2,
Luciana Trilles2, José L do Nascimento1, Bodo Wanke2.
Instituto de Ciências Biológicas/UFPA, Rua Augusto Corrêa, 01, Guamá, 66075-110, Belém, PA,
Brasil1; Laboratório de Micologia/IPEC/FIOCRUZ, Rio de Janeiro, RJ, Brasil2, Instituto de
Ciências da Saúde/UFPA, Belém, PA, Brasil3, INCQS/FIOCRUZ, Rio de Janeiro, RJ, Brasil4. E-
com ........... anos de idade fui procurado(a) pela Profª. Solange do Perpétuo Socorro
Evangelista Costa (CRBM Nº 232), biomédica, professora e pesquisadora do
Laboratório de Micologia da Universidade Federal do Pará, oportunidade em que fui
informado sobre os objetivos da pesquisa, dentro do projeto acima citado, sob sua
coordenação. Compreendi que o objetivo principal desta pesquisa é investigar a
presença do fungo Cryptococcus neoformans, causador de micose denominada
criptococose, no ambiente domiciliar.
A Profª. Solange do Perpétuo Socorro Evangelista Costa ou outro membro de
sua equipe justificou o objetivo da pesquisa porque deseja saber se paciente com
criptococose esteve exposto ao fungo causador da micose em ambiente domiciliar
e/ou áreas vizinhas. Ela explicou a mim e a meus familiares, que este estudo irá
contribuir para a entender se a presença deste fungo nos domicílios e/ou áreas
vizinhas está relacionada aos casos de criptococose ocorridos em Belém.
Também me esclareceram que, serei informado sobre o resultado da
pesquisa efetuada em minha residência. Segundo as informações prestadas, a
pesquisa consta de levantamento de dados pessoais, relacionados ao hábito do
paciente, bem como de informações acerca do domicílio e área vizinha, que serão
anotados em uma ficha própria.
Está claro que eu posso não querer participar desta pesquisa, e isso não
causará mal, nem a mim nem a minha família. Mas também foi dito e repetido que
não receberei nenhum pagamento por participar. Compreendido tudo isso, eu
autorizo que minha residência seja visitada e estudada, através da coleta de
materiais no interior e área externa de meu domicílio, inclusive permito fotografar
locais da residência, relacionados à pesquisa.
158
Foi garantido também que as informações dadas ao projeto são
secretas, e que a ninguém será informado sobre meu nome, ou de meus familiares,
como participantes da pesquisa.
Também fiquei ciente que caso tenha alguma reclamação a fazer deverei
procurar a Profª. Solange do Perpétuo Socorro Evangelista Costa ou outro membro
de sua equipe (telefones: (091) 211-1549, e fax (091) 221-1602 ou a direção do
Centro de Ciências Biológicas da UFPA, cito a Rua Augusto Corrêa, 01, Bairro do
Guamá em Belém.
Por fim declaro que além de ler esse documento, recebi as explicações que
desejei da equipe do projeto, e por não ter mais dúvidas, concordo em participar
como voluntário do projeto e estudo agora proposto, o que fica confirmado pela
minha assinatura abaixo. Como Tenho Dificuldade (SIM � NÃO �), de entender o
escrito acima, atesto também que a profª Solange Do Perpétuo Socorro E. Costa (ou
um membro da sua equipe) leu pausadamente este documento e esclareceu as
minhas dúvidas, e como tem a minha concordância para participar do estudo,
coloquei abaixo a minha assinatura (ou impressão digital).
(Local) ..........................., ......... de ........................ de 2003
PESQUISADO NOME: ................................................................................................ Assinatura:___________________________________ IMPRESSÃO DATILOSCÓPICA (quando se aplicar)
ESTUDO DE VARIEDADE [sim] [não] ESTUDO DE SOROTIPO [sim] [não] [ ] neoformans [ ] gattii [ A ] [ B ] [ C ] [ D ]
160
ANEXO 3. Documento de comprovação do Comitê de Ética e Pesquisa do HUJBB
161
ANEXO 4
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