D x6ÏÅxF ²£¦ J Í ÌÊÏÈÊ64 F UJ Í ¨Î « ª w Ë y J£ {6 xÌ

ژنتيک نوين

1311 بهار ،1، شماره پانزدهم دوره

91-04صفحه

منحنی ذوب با وضوح بالا تجزیه و تحلیل

حذفیجهش

سرطان کلورکتال

HNPCC

MSH2

چکیده

کلورکتال با سرطان های در نمونه MSH2های ژن تشخیص جهش

HRMAری تکنیک کارگی هب

Diagnosis of MSH2 gene mutations in human colorectal cancer

using high resolution melting analysis

1انیریآ دی، سع2*یبهار عباس ،1ینادرخان هیسم

ی تهرانخوارزم دانشگاه ،یستیز علوم دانشکدهکارشناسی ارشد، استادیار، -1

نزنجا دانشگاه یستیز نینو یها یرفناو پژوهشکده استادیار، -2

Naderkhani S1, Bahari A

*2, Irian S

1

1. MSc Student, Assistant Professor, Faculty of Biological Sciences, Kharazmi

University of Tehran

2. Assistant Professor, Research Institute of modern biological techniques,

University of Zanjan, Iran

[email protected] :نویسنده مسئول مکاتبات، پست الکترونيکی *

(30/32/77 :تاریخ پذیرش - 22/11/79: تاریخ دریافت)

دهد ها در بيشتر موارد توسط عوامل محيطی و گاهی تصادفی رُخ می يند توموری شدن سلولآفر

دومين سرطان( CRC) سرطان کلورکتال. پذير نقش مهمی دارند برخی موارد عوامل وراثتاما در

FAP و HNPCCشاملاست و ارثی آن درصد 14بيشتر از که های توسعه يافته استدر کشور رايج

های سرطان درصد 1-14ترين نوع سرطان کلورکتال ارثی است و حدود رايج HNPCC. هستند

و MSH2 ،MLH1ويژه به MMRهای های رده زاينده در ژن جهش. شود کلورکتال را شامل می

MSH6 ژن .شوندسبب ايجاد کلورکتال می MSH2 9بر روی کروموزم (2p21) قرار دارد.

ها را از آن درصد11-24هستند که جهش حذفی رگيرها د HNPCCاز % 92در MSH2های جهش

DNAابتدا ،قرار گرفت مطالعهکلورکتال مورد نمونه سرطانی 24 تحقيقدر اين .گيرد دربر می

یتوال نييو تع HRMA روش با AAT یحذف جهشسپس وشد جسرطانی استخرا از نمونهژنومی

عنوان هب HRMAهای سرطانی با روش در اين بررسی نمونه قرار گرفت یابيمورد ارز DNA ميمستق

HRMAنتايج نشان داد که .نددشو گزارش شناسايی AATو بدون جهش حذفی wildژنوتيپ

ها خيص مولکولی و پيشگيری از بيماریو بسيار کارامدی در جهت تش جديدابزار عنوان هبتواند می

.کار گرفته شود هب

های کلیدیواژه

[ D

OR

: 20.

1001

.1.2

0084

439.

1399

.15.

1.5.

6 ]

[ D

ownl

oade

d fr

om m

g.ge

netic

s.ir

on

2022

-04-

28 ]

1 / 12

mailto:[email protected]

https://dorl.net/dor/20.1001.1.20084439.1399.15.1.5.6

https://mg.genetics.ir/article-1-111-fa.html

بهاری و همکارانعباس ...سرطانهای ونهدر نم MSH2های ژن تشخيص جهش

33 1311 بهار/ 1شماره / پانزدهمدوره / ژنتیک نوین

سرطان یکی از معضلات اصلی سلامتی انسان در جهان است،

. ها دليل این بيماری استدهد که نقص ژنمطالعات نشان می

های سوماتيک هستند ، جهشهادر سرطان رگيرهای دجهش بيشتر

یک حدود اما. شوندیافت میهای بافت سرطانی در سلول که فقط

جهش و دنشووراثتی ایجاد میصورت بهها، سرطان کلدرصد از

حاوی آن جهش هاسلول همه رگير است ود ها در آن زایندهرده

ها از دلایل اصلی گسترش جهش (Lynch et al. 2000) هستند

(.Shilpa et al. 2014) ها هستند سرطان

طور عموم در سه نوع هزایی نقش دارند بهایی که در تومورجهش

های ها، ژن های سرکوبگر تومور، پروتوانکوژنژن: دهندژن رخ می

.DNA (Teklemariam et al در ترميم و همانندسازی رگيرد

مسئول گسترش ، DNAهای درگير در ترميم جهش در ژن (2015

های ژن .(Hsieh 2001) های ارثی مختلف است ها و بيماری تومور

MSH2 ،MSH3 ،MSH6،MLH1 ،BLMشامل DNAاصلی ترميم

(.Josep et al. 2012) است PMS2 و

Worthley) بيماری هتروژنتيکی است (CRC) سرطان کلورکتال

et al. 2010) ژنتيکی های ژنتيکی و اپی که در اثر تجمع جهش

و ( Ewing et al 2014;Kheirelseid et al 2013) شودایجاد می

شرکت CRCموارد درصد 03عوامل ژنتيکی در ایجاد حدود

های ناشی از و دومين عامل مرگ (Mitchell et al. 2002) دارند

از آن را به خود اختصاص درصد 13سرطان است و تقریباً

Mitchell et al. 2002; Tarraga et al. 2014; Vasen et) دهد می

al. 2007) گير، خانوادگی الگوی تک 0طور معمول به یکی از هو ب

(Kashfi et al. 2014; Amersi et al 2005) دهدیا ارثی رخ می

CRC آید وجود می ههای ارثی رده زاینده ب ارثی از جهش

(Stintzing 2014; Kheirelseid et al 2013) درصد 13حدود که

دهد و دو سندرم معروف آن شاملرا تشکيل می CRCموارد

HNPCC و FAPهستند (Kheirelseid et al. 2013). سرطان

ترین فرم سرطان رایج (HNPCC)کلورکتال غير پوليپی ارثی

ایجاد MMRکلورکتال ارثی است و از جهش رده زاینده در ژن

(.Labianca et al. 2010) شودمی

و MLH1 ،MSH2 ،MSH6شامل MMRها در چهار ژن جهش

PMS2 ای با ابتلا به طور قابل توجه هبHNPCC مرتبط هستند .

HNPCC عنوان سندرم نقص طور رسمی به هب MMR ناخته ش

قرار دارد و از 2p22-p21بر روی کروموزوم MSH2ژن شود می

و 3145bpآن به اندازه RNAاست که اگزون تشکيل شده 12

.است kDa 104/7 تا و وزن مولکولی آن 709تعداد آمينواسيد آن

پراکنده هستند و در MSH2 زاینده در طول اگزون های رده جهش

به غير از . هستند 12و 0نقاط جهش داغ، اگزون MSH2ژن

ای در اینترون، تعداد کمی جهش نقطه-ها و مناطق اگزوناگزون

.Peltomaki et al) است شناسایی شده MSH2بخش پيشبر

2004.)

یا لينچ HNPCCها مثل در غربالگری بيماران برای بيشتر بيماری

های درون ژنی نسبتا بزرگ بسيار مهم سندرم شناسایی حذف

های های پاتوژنيک به جهشجهش درصد HNPCC 29در . است

بيشتر شوندنسبت داده می MLH1و MSH2حذفی بزرگ در

فرد بههای اطلاعاتی، منحصرهای گزارش شده در پایگاهجهش

طور مثال ویژه هر خانواده هستند با این وجود تعداد ههستند ب

هایاند که در خانوادههای تکراری شناسایی شدهکمی جهش

HNPCC دهند در سراسر جهان رخ می(Vaughn et al. 2008)

در AATرایج، حذف توالی نوکلئوتيدی هایکه از این جهش

باشد که منجر می MSH2ژن 12اگزون 1912- 1911 نوکلئوتيد

( 372کدون )آمينواسيد آسپارژین ( جهش چارچوب)به حذف

این جهش ( Vaughn et al. 2008; Mitchell et al. 2002) شودمی

.Buerstedde et al) است ها در مقالات مختلف گزارش شدهبار

1995; Desai et al. 2000; Domingo et al. 2004; Mueller et

al. 2009; Moslein et al. 1996; Stormorken et al. 2003;

Wijnen et al. 1997.)

N596del 372که باعث حذف آمينواسيد آسپارژین در کدون

آمينواسيد حذف شده در بالادست (Ripa et al. 2005) ودش می

های قرار دارد که به اليگونوکلئوتيد Cمنطقه حفظ شده انتهای

را ATPaseشود و همچنين فعاليت باز متصل می ناجور جفت

کند این منطقه اثر بسيار زیادی بر عملکرد پروتئين حفظ می

MSH2 در موجود زنده دارد (Whitehouse et al. 1997). حذف

طریق تغيير ساختار پروتئين که یک آمينواسيد که احتمال دارد از

تواند منجر به دهد میسرانجام عملکرد پروتئين را تغيير می

عنوان هب N596del .(Kunzelmann et al. 2000) شودبيماری می

جهش ایجاد کننده بيماری مطرح است که بروز بالينی دارد و بر

مقدمه

[ D

OR

: 20.

1001

.1.2

0084

439.

1399

.15.

1.5.

6 ]

[ D

ownl

oade

d fr

om m

g.ge

netic

s.ir

on

2022

-04-

28 ]

2 / 12



بهاری و همکارانعباس ...سرطانهای در نمونه MSH2های ژن تشخيص جهش

1311 ربها/ 1شماره / پانزدهمدوره / ژنتیک نوین 31

، در MSH2ژن N596delکارگيری جهش هاین اساس، ب

HNPCCهای خانواده گری قبل از بروز علائم بيماری غربال

(.Whitehouse et al. 1997) است توصيه شده

HRMA است معرفی شده 1779اولين بار در سال برای

(Teixeira Pinto. 2009) روش برای ژنوتایپينگ تنوع شناخته این

و روشی ساده ناخته کاربرد دارد گری تنوع ناش شده و غربال

گيری تغييرات دمای ذوب باشد که با اندازهمی PCR براساس

DNA ای تنوع توالی رشته دوDNA کند را شناسایی می .Tm

DNA ای در ميان توالی هموزیگوت، توالی هموزیگوت رشتهدو

هر دار و توالی هتروزیگوت متفاوت است و فلورسانسجهش

قتی که در معرض افزایش دما هستند متفاوت بوده ها و کدام از آن

ها جهش. های ذوب متفاوتی خواهند داشت و در نتيجه منحنی

( پروفایل)توسط تغيير در شکل منحنی دمایی در مقایسه با نمایه

ساده، ارزان، و با روشی HRMA .شود مرجع شناسایی می

بيل هایی از ق فاکتور .اختصاصيت، حساسيت و دقت بالا است

، رنگ و غيره دقت GC، ميزان(آمپليکون)منبع نمونه، طول قطعه

HRMA دهد را تحت تاثير قرار می (Chen et al. 2014) روش

ثری برای ؤروش م (HRMA) بالا حذوب با وضو تجزیه و تحليل

بالينی است های ای نمونهماهوارهناپایداری ریزشناسایی

(Janavicius et al. 2010) این روش برای شناسایی حساسيت و

.Teixeira Pinto) است درصد 133های رده زاینده تقریباً جهش

2009.)

نمونه بافت 33گری بين در این مطالعه سعی بر آن است که غربال

با استفاده MSH2ژن 12سرطانی از نظر جهش حذفی در اگزون

.صورت پذیرد HRMAاز روش

وميکس پژوهشکده ر آزمایشگاه ژند پژوهشاین اجرای

این .نوین زیستی دانشگاه زنجان صورت پذیرفت های فناوری

وسيله روش ه، بررسی جهش بDNAشامل استخراج طرح

HRMA و تایيد نتایجHRMA یابیبا توالی (Sequencing) است.

DNA های بافت پارافينه سرطان کلورکتال با روش ژنومی از نمونه

استخراج شده DNAد و سپس کميت و کيفيت سنتی استخراج ش

با استفاده از دستگاه DNAکميت. مورد بررسی قرار گرفت

یک وسيله الکتروفورز ژل آگارز هب DNAنانودراپ و کيفيت

، طراحی DNAبعد از استخراج . مورد بررسی قرار گرفت درصد

ژن 12توالی اگزون ، ابتدا مریپرا یطراح یبرا .آغازگر انجام شد

MSH2 از پایگاه علمیNCBI وEnsemble دست آمد و سپس هب

مورد تجزیه و CLC main workbenchافزار با استفاده از نرم

Beaconافزار با استفاده از نرم هم ها آغازگر. تحليل قرار گرفت

designer ver 8 و گزینهHRMA سرانجام و . آن طراحی شدند

NCBIسایت آنلاین های طراحی شده، در اختصاصيت آغازگر

BLAST های آغازگر طراحی به ویژگی 1در جدول . بررسی شد

.است شده اشاره شده

از صحت نانيشده و اطم استخراجDNA وجود از نانياطم جهت

طیانجام شد تا شرا PCRشده، ابتدا واکنش یطراح آغازگر

23در حجم PCRهای واکنش.شود یسازنهيبه HRMA شیآزما

در این مطالعه ژن .انجام شد 0و 2ق جدول ميکروليتر طب

72که شامل ( علت کوتاه بودن توالی هب)های شاهد نمونه

توالی ) AATفاقد جهش wildنمونه . نوکلئوتيد است سنتز شدند

دارای جهش حذفی mutantو نمونه ( نوکلئوتيد 72آن شامل

AAT ( نوکلئوتيد 70توالی آن شامل ) و نمونه شاهد هتروزیگوت

.است mutantو wildکيبی از هر دو توالی تر

:wildتوالی نمونه 5ʹACAGGCTATGTAGAACCAATGCAGACACTCAATGATG

TGTTAGCTCAGCTAGATGCTGTTGTCAGCTTTGCTCACG

TGTCAAATGGA3ʹ

: mutantتوالی نمونه 5ʹACAGGCTATGTAGAACCAATGCAGACACTCGATGTGT

TAGCTCAGCTAGATGCTGTTGTCAGCTTTGCTCACGTGT

CAAATGGA3ʹ PCRهای های استفاده شده در واکنش های آغازگرویژگی -1جدول

ها مواد و روش

طول آغازگر (ºC) ذوب دمای آغازگرتوالی آغازگرنام

MSH2 5 رفتʹ-ACAGGCTATGTAGAACCAAT-3ʹ 60.2 (20 mer) MSH2 5 برگشتʹ-AACAGGTGCTCCATTTGA-3ʹ 60.6 (18 mer)

[ D

OR

: 20.

1001

.1.2

0084

439.

1399

.15.

1.5.

6 ]

[ D

ownl

oade

d fr

om m

g.ge

netic

s.ir

on

2022

-04-

28 ]

3 / 12





ميکروليتر 23 با حجم نهاییPCR های مورد استفاده در واکنشگر -2جدول

.پيکومول در ميکروليتر بود 13های مورد استفاده در واکنش معادل آغازگرغلظت *

PCR ده در مورد استفا های برنامه -0 جدول

ميکروليتر 23با حجم نهایی HRMAهای مورد استفاده در واکنشگر -9 جدول

.پيکومول در ميکروليتر بود 13های مورد استفاده در واکنش معادل آغازگرغلظت *

DNA 33 با سرطانینمونهHRMA قرارگرفت ورد مطالعهم،

طور هباید بها نمونه، همه HRMAروش بودن حساس علت به

تا شدندنانودراپ ها نمونههمه باشند در ابتدا سانهم کامل

برحسب غلظت اصلی پسدست آید س هها ب غلظت اصلی آن

10وی ر ها بر نمونههمه غلظت سازی انجام گرفت و رقيق

های شاهد چون سنتز شده تنظيم شد، نمونهکروليتر ينانوگرم در م

استخراجی بود و در DNAهای شان بالاتر از نمونه وصبودند خل

های سرطانی قابل مقایسه نبود در نتيجه نتيجه با غلظت نمونه

.انجام گرفت Ctهای شاهد و سرطانی از روی سازی نمونههمسان

ریخته )ميکروتيوب(های کوچک را در لوله( DNA)ها ابتدا الگو

ها و آب گرین، پرایمرو سپس مخلوط اصلی را که شامل کيت اوا

همه .شدندها، تقسيم های کوچک دارای الگو بين لوله .است

.مراحل در اتاق تاریک و بر روی کيسه یخ و سریع انجام شد

9در جدول HRMAمورد استفاده درهای حجم و نوع واکنشگر

های آغازگرهای بهينه سازی شده برای برنامه .آورده شده است

.است آورده شده 3در جدول HRMA واکنش مورد استفاده در

(Sequencing) یابی توالی، از روش HRMAبرای تایيد نتایج

wildو mutantچندین نمونه شاهد و سرطانی .استفاده شد

سازی و برای تعيين توالی آماده، HRMAشناسایی شده با روش

.فرستاده شد

رتيکروليم 23 حجم مواد در ها واکنشگر

Red Master Mix 2x 3/12

1 *آغازگر رفت

1 *آغازگر برگشت

DNA 1

3/7 آب مقطر

تعداد چرخه مدت زمان (ºC)دما مراحل

1 3ʹ 73 سازی اوليه واسرشته

23ʹʹ 73 سازی واسرشته

93

23ʹʹ 33 ها آغازگراتصال

23ʹʹ 92 ها آغازگربسط

1 3ʹ 92 ها آغازگربسط نهایی

ميکروليتر 23 حجم مواد در ها واکنشگر

Evagreen Master 9

*رفت آغازگر 9/3

*برگشت آغازگر 9/3

DNA 1

2/10 آب مقطر

[ D

OR

: 20.

1001

.1.2

0084

439.

1399

.15.

1.5.

6 ]

[ D

ownl

oade

d fr

om m

g.ge

netic

s.ir

on

2022

-04-

28 ]

4 / 12





HRMA مورد استفاده در هایبرنامه -3 جدول

1 2 0 9 3 2 9 1 7 13 11 12 10 19 13 12 19 11

pcr های بعدی محصولات ، از چپ به راست چاهک اول لدر و چاهکRotor gene 6000های کنترلی و سرطانی در دستگاه نتایج مربوط به تکثير نمونه -1شکل

.باشد می( 11-11و 2-9)و کنترلی ( 13تا 2از شماره )های سرطانی نمونه

، جهت HRMAهای اصلی مربوط به جام واکنشقبل از ان

، Rotor gene 6000سازی و اطمينان از سالم بودن دستگاه بهينه

ها، چندین نمونه کنترل و کيت مورد استفاده و وجود الگو

قرار گرفتند که PCRمورد Rotor gene 6000سرطانی با دستگاه

شاهده قابل م 1در شکل درصد 2نتایج تکثير بر روی ژل آگارز

نوکلئوتيد می باشد و 72طول توالی ژن مورد نظر .باشد می

های تکثيری نيز در طور که در شکل مشاهده می شود نمونه همان

ها قرار داشتند که تایيد کننده تکثير صحيح نمونه bp 133محدوده

.باشد می (پلات) چند نوع گرافHRMA ، Rotor gene 6000افزاردر نرم

افتد و گراف، تکثير الگو اتفاق میدر مرحله اولد شو ترسيم می

Amplification (تکثير) در محور گرافدر این .دشو ترسيم می

x های انجام واکنش قرار دارد و محور سيکلتعداد هاy ها ميزان

را نشان (بهر تيو) هر واکنش ویژهفلورسنت ساطع شده

و آورده دست هبرا Ctکه است گرافبر مبنای همين .دهد می

تکثير نمودار 2شکل . دشو سازی میهمسان بر مبنای آن اوليه الگو

MSH2ژن AATجهش حذفی برای یو سرطان شاهد یهانمونه

، مرحله Amplificationبعد از اتمام مرحله .دهد را نشان می

HRMA شود که بر مبنای ذوب است و آناليز اصلی بر آغاز می

سه HRMA آناليز در. گيردجام میهای این مرحله انمبنای گراف

Normalised)گراف اول نمودار معمولی شودگراف ترسيم می

Graph )ه محدود صورت دستی هب گراف در اینباشد، میTm

است مهم HRMAبرای آناليز نهایی را که طعه مورد نظرق

نمونه کنترلی 2، نمودار معمولی (الف-0)شکل . شودمیمشخص

wild ،mutant وhetrozygote دهدرا نشان می .

تعداد چرخه مدت زمان (0C)دما راحلمCycling 1 13ʹ 73 واسرشته سازی اوليه

93 23ʹʹ 73 واسرشته سازی

23ʹʹ 33 هاآغازگراتصال

23ʹʹ 92 هاآغازگربسط HRMA 77-13 ʹʹ1/3 1

Melt 77-93 ʹʹ1/3 1

نتایج

[ D

OR

: 20.

1001

.1.2

0084

439.

1399

.15.

1.5.

6 ]

[ D

ownl

oade

d fr

om m

g.ge

netic

s.ir

on

2022

-04-

28 ]

5 / 12





.یو سرطان شاهد یها نمونه تکثير نمودار -2شکل

نمودار یا shiftهای کنترلی هموزیگوت با در این نمودار، نمونه

گراف کاملاً از هم شناسایی شدند و گراف نمونه کنترلی

hetrozygote در وسط دو گراف هموزیگوت wild وmutant

نسبت به hetrozygoteشکل در گراف قرار دارد و تغيير

.باشدهای کنترلی هموزیگوت کاملا مشهود می نمونه

باشد کهمی Graph (Difference)گراف دوم نمودار تفریق

صورت هب باشد و می اه مهمترین گراف برای تفکيک نمونه

( ب-0)شکل . سازد ها را از یکدیگر جدا می گرافيکی نمونه

را با hetrozygote و wild ،mutantکنترلی نمونه 2نمودار تفریق

طبق این شکل، . دهدنشان می hetrozygoteمبنا قرار دادن نمونه

صورت کاملاً مشخص از هم تفکيک و ههای کنترلی بنمونه

از منحنی سيگموئيدی ذوب در اگر: اف سومگر .اندشناسایی شده

دست هب منحنی درجه دومی (Df/dt) واحد زمان مشتق گرفته شود

Tmویژه و یک قطعه تکثير آن نشان دهنده پيک در آید که هرمی

های ژنوتيپ از این گراف برای تفکيک دمایی .باشدمیقطعه آن

ها پيک شود هر کدام از این نمونهاستفاده میکنترل هایگروه

، گراف مربوط به منحنی (الف-9)شکل . دمایی ویژه خود را دارند

hetrozygoteو wild ،mutantکنترلی نمونه HRMA 2ذوب

گراد درجه سانتی 13ها بيشتر از نمونهTm دليل اینکه هب. باشدمی

درجه 73تا 13، از HRMAبود گستره دمایی برای منحنی ذوب

درنظر گرفته شد، طبق شکل زیر raising 1/3گراد با دمای سانتی

ه شود چون هر نمون، تایيد میHRMانجام صحيح واکنش

.ویژه خود را دارد Tmپيک و ( دوپليکيت)

، wildنمونه کنترلی Melt ،2، گراف منحنی ذوب (ب-9)شکل

mutant وhetrozygote طبق این گراف هر پيک . دهدرا نشان می

تری هم باشد و پيک اضافیدهنده تکثير یک قطعه ویژه مینشان

پرایمر وجود ندارد، که این تکثير اختصاصی و بدون آلودگی و

.دهدمیدایمر را نشان

.hetrozygoteهای کنترل بر مبنای نمونه نمودار تفریق .ب hetrozygoteو wild ،mutantنمونه کنترلی 2 نمودار معمولی. الف .شاهد یهانمونه هاینمودار -0شکل

[ D

OR

: 20.

1001

.1.2

0084

439.

1399

.15.

1.5.

6 ]

[ D

ownl

oade

d fr

om m

g.ge

netic

s.ir

on

2022

-04-

28 ]

6 / 12





الف ب

نمونه شاهد Melt ،2 نمودار منحنی ذوب. ب. نمونه شاهد HRMA 2نمودار منحنی ذوب . الف. های شاهدمنحنی ذوب نمونه هاینمودار -9شکل

الف ب .های سرطانی و شاهدنمودار تفریق نمونه. ب شاهدو های سرطانینمودار معمولی نمونه. الف .ینمونه سرطان 0و شاهد یهانمونه هاینمودار -3شکل

درجه 73تا 93، از Meltگستره دمایی برای منحنی ذوب

گراف . است درنظر گرفته شده raising 1/3گراد با دمای سانتی

علت ه، بMeltدر مقایسه با منحنی ذوب HRMAمنحنی ذوب

.دهدپایين تفکيک بهتری را نشان می raising دمای

، wildهای سرطانی، از سه نمونه برای بررسی و شناسایی نمونه

mutant وhetrozygote (تایی و یا بيشتر صورت دوتایی یا سه هب )

های سرطانی با عنوان شاهد استفاده شد و سپس منحنی نمونه هب

سه نمونه ابتدا شناسایی . یی شدهای شاهد مقایسه و شناسانمونه

مورد بررسی قرار ( صورت دوتایی هب)سرطانی با سه نمونه شاهد

های های سرطانی بر پایه نمونهگرفت تا شرایط شناسایی نمونه

، نمودار معمولی(الف-3)شکل . سازی شودشاهد بهينه

(Normalised Graph )های شاهد نمونهwild ،mutant و

hetrozygote طبق این . دهد ه نمونه سرطانی را نشان میو س

wildهای سرطانی بر نمودار نمونه شاهد شکل نمودار نمونه

.باشندمنطبق می

های نمونه( Difference Graph)، نمودار تفریق (ب-3)شکل

و سه نمونه سرطانی را نشان hetrozygoteو wild ،mutantشاهد

ها استفاده هتر نمونهاز نمودار تفریق برای تفکيک ب. دهد می

mutantکه در این شکل نمودار تفریق بر پایه ژنوتيپ . شود می

های سرطانی در محدوده در نمودار تفریق هم منحنی نمونه. است

شکل است و همچنين کاملاً هم wildهای کنترلی منحنی نمونه

، هر سه (معمولی و تفریق)در نتيجه طبق هر دو نمودار هستند

.شوندشناسایی می wildنی بعنوان ژنوتيپ نمونه سرطا

و wild ،mutantنمودار تفریق سه نمونه شاهد 2شکل

heterozygote در این . دهدسرطانی را نشان می نمونه 23با

عنوان ژنوتيپ پایه قرار داده شده هب mutantنمودار تفریق، نمونه

[ D

OR

: 20.

1001

.1.2

0084

439.

1399

.15.

1.5.

6 ]

[ D

ownl

oade

d fr

om m

g.ge

netic

s.ir

on

2022

-04-

28 ]

7 / 12





ایه آن های سرطانی بر پاست وسپس دو نمونه شاهد دیگر و نمونه

های سرطانی شبيه طبق شکل، منحنی همه نمونه. اند شناسایی شده

های باشد پس همه این نمونهمی wildمنحنی نمونه شاهد

. شوندشناسایی می wildسرطانی،

نمونه سرطانی بر پایه ژنوتيپ 23های شاهد و نمودار تفریق نمونه -2شکل

mutant

، wild ،mutantهای شاهد هنمودار معمولی نمون( الف-9)شکل

heterozygote در این . دهدنمونه سرطانی را نشان می 29و

کاملاً همشکل و mutantهای هر پنج نمونه شاهد نمودار منحنی

، heterozygoteهای شاهد و در مورد نمونه. بر هم منطبق هستند

یکسان هستند و یک تغيير heterozygoteهم منحنی چهار نمونه

mutantو wildهای شاهد ها نسبت به نمونه ر منحنی آنشکلی د

روی هم wildو منحنی هر سه نمونه شاهد . شودمشاهده می

افتاده و شکل یکسانی دارند که این نتایج تایيد کننده شناسایی

های سرطانی در این نمودار منحنی نمونه. ها استصحيح نمونه

منطبق هستند و در نتيجه wildبر منحنی نمونه کنترلی ( نمونه 29)

wildعنوان ژنوتيپ هب( نمونه 29)های سرطانی همه نمونه

.شوندبندی می شناسایی و دسته

های شاهد نمودار تفریق نمونه( د-ج-ب-الف-9)های شکل

wild ،mutant ،hetrozygote های سرطانی را نشان و نمونه

شاهد در سه شکل زیر که در هر شکل یک نوع نمونه . دهد می

های هر سه نوع عنوان ژنوتيپ پایه قرار گرفته است، گراف هب

شاهد کاملاً از هم تفکيک شده و قابل شناسایی هستند و شکل

طبق هر سه شکل کاملاً مشهود است که . خاص خودشان را دارند

های شاهد به منحنی نمونه( نمونه 29)های سرطانی منحنی نمونه

wildنمونه سرطانی، چند نمونه 29این از . ، شبيه و نزدیک است

بررسی شده بودند و در 0 در آزمایش قبلی در نمودار تفریق شکل

.شناسایی شدند wildهر دو آزمایش هم

ب الف

[ D

OR

: 20.

1001

.1.2

0084

439.

1399

.15.

1.5.

6 ]

[ D

ownl

oade

d fr

om m

g.ge

netic

s.ir

on

2022

-04-

28 ]

8 / 12





د ج

ه نمون 29و شاهد یهانمونه نمودار تفریق. ی بنمونه سرطان 29و شاهد یهانمونه نمودار معمولی. الف .ینمونه سرطان 29و شاهد یهانمونه هاینمودار -9شکل

.hetrozygote پایهبر ینمونه سرطان 29و شاهد یهانمونه نمودار تفریق. د. mutant پایهبر ینمونه سرطان 29و شاهد یها نمونه نمودار تفریق. ج. wild پایهبر یسرطان

، wildسه نمونه ( Alignment)سازی ترازنتایج هم 1 شکل

mutant طور که در دهد، همانو یک نمونه سرطانی را نشان می

و باشدمیAAT دارای توالی wildشکل مشخص است نمونه

سازی تراز فاقد این توالی است و طبق این هم mutantنمونه

.شناخته شد wildهمچنين نمونه سرطانی ژنوتيپ

برای پویش «استاندارد طلایی»ن روش عنوا ه، بDNAیابی توالی

(Scanning) جهش شناخته شده و ناشناخته در نظر گرفته

بيشتر . باشدشود، ولی روشی نسبتاً گران، دشوار و زمانبر می می

ها ، برای غربال تفاوت(Scanning) های دیگر پویش جهشروش

ها این روش. در یک فرد توسعه یافته است DNAبين دو کپی

شامل SSCP،2

DGGE ،DHPLC0 ،TGCE

و اسپکتروسکوپی 9

به جداسازی نمونه بر روی نياز هاهمه این روش. جرمی هستند

نمایش فلورسانس نمایه دمایی . های دیگر دارند ژل یا ماتریکس

است که DNAیابی ، جایگزین دیگری برای توالیPCRمحصول

يازی دهد که ندر محلول را می DNAهای امکان شناسایی جهش

های فلورسانتی و روش. به جداسازی بر روی ژل را ندارد

1 Single-Strand Conformational Polymorphism Analysis

2 Denaturing Gradient Gel Electrophoresis

3 Denaturing High Performance Liquid Chromatography

4 Temperature Gradient Capillary Electrophoresis

و نمونه سرطانی wild ،mutantسازی دو نمونه شاهد ترازهم -1شکل

بحث

[ D

OR

: 20.

1001

.1.2

0084

439.

1399

.15.

1.5.

6 ]

[ D

ownl

oade

d fr

om m

g.ge

netic

s.ir

on

2022

-04-

28 ]

9 / 12





های براساس پروب مثل هيبریداسيون دوگانه، کاوشگر

بيکون )سری های سنجاق یا کاوشگر( TaqMan)اگزونوکلئازی

هایی که برای شناسایی جهش کاربرد دارند اما فقط باز( مولکولی

کنند و بنابراین این یاند را شناسایی مبا کاوشگر پوشش داده شده

جهش کارایی ندارند، چرا که ( Scanning)ها برای پویش روش

ها را در هایی است که بتواند جهش پویش جهش مستلزم روش

بنابراین بعضی از . تر شناسایی کند سرتاسر نواحی بزرگ

و زحمت کنند صورت اتوماتيک عمل نمی ههای فوق ب روش

ها پيچيده، گران و ه سایر روشک طلبند در حالی بالایی را می

(.Li et al. 2015) مستلزم تجهيزات اختصاصی هستند

یبرا یديمف روشHRMA بالا، در شده ذکر یها روش برخلاف

،تيحساس بودن، ارزان و ساده. است یتوال تنوع یابیارز

هستند که یخوب اريبس یهایژگیو بالا دقت و تياختصاص

HRMA کاربرد در یبرا یو جالب دیعنوان ابزار جد هرا ب

نیا. کرده است لیتبد و تعيين ژنوتيپ یصيتشخ یهاشگاهیآزما

جهش شیو پو شدهجهش شناخته نگيپیقدرت ژنوتا روش

در که باشدیم PCRبر یو روش مبتن. ناشناخته را دارد

;Henry et al. 2015) دارد کاربرد یسرطان جهش یگر غربال

Vossen et al. 2009 )تياختصاص و تيحساسHRMA ،به رنگ

(. Erali et al. 2010) دارد یبستگمورد استفاده افزاردستگاه و نرم

ای غربالگری جهش در سرطان معده و کلورکتال با در مطالعه

استخراجی از بافت پارافينه DNAبر روی HRMAروش

های سلولی سرطان کلورکتال و بافت سالم با سرطانی و رده

و ABI 7500 real-time PCRستگاهاستفاده از دو د

LightScanner های انجام گرفت و تجزیه و تحليل دادهHRMA

Call-IT 2.5و ABI HRM software v2.0.1های افزار هم با نرم

LightScanner در این مطالعه دقت و صحت، . انجام شد

نسبت به ABI 7500 HRMحساسيت و اختصاصيت

LightScanner جهش مورد بررسی قرار گرفتگری در غربال .

در مقایسه با ABI 7500 HRMدقت، حساسيت و اختصاصيت

LightScanner بسيار مناسب بود و همچنين برایLightScanner

Call-IT 2.5افزار آل بود؛ برعکس قدرت تفکيک در نرمهم ایده

LightScanner بالاتر ازABI HRM Software v2.0.1 بود در این

، روشی با دقت، حساسيت و HRMAن داده شد که مطالعه نشا

باشد اختصاصيت بالا و بسيار مناسب برای غربالگری جهش می

(Henry et al. 2015.)

گری نشانگر مهمی برای غربال (MSI) ایماهوارهناپایداری ریز

HNPCC (سندرملينچ ) و همچنين نشانگر تشخيصی برای سرطان

، MSIهای شناسایی ترین روشرایج. باشدگير میکلورکتال تک

باشد که هر دو روش می DHPLCو الکتروفورزموئين فلورسنتی

است که جدیدی ، روشHRMA. هایی دارندها و عيبمزیت

DHPLCو الکتروفورز موئين فلورسنتی روش های اصلی دوعيب

93در MSIبرای شناسایی HRMAکاربرد ایمطالعه در. ندارد را

دو دستگاه HRMAانجام گرفت و توانایی CRCنمونه پارافينه

LightCycler- 480 وScanner Light و همچنين .مقایسه شد

اختصاصيت و حساسيت این روش در دو دستگاه ذکر شده با

پایدار CRCهای مثبت و نمونه MSIهای شناخته شده با نمونه

همه . بررسی شد( Microsatellite-Stable CRC)ای ماهواره

درصد 133مثبت در هر دو دستگاه با حساسيت MSIهای نهنمو

-LightCyclerها در دو دستگاه شناسایی شده و اختصاصيت آن

بنابراین . بود% 0/72و % 1/77ترتيب به Scanner Lightو 480

MSIثر شناسایی ؤعنوان روش م هب HRMروش تجزیه و تحليل

.Janavicius et al) کاربرد دارد( بالينی)های کلينيکی در نمونه

شناسایی تغييرات ژنتيکی جدید در دیگر ایدر مطالعه (.2010

در بيماران مشکوک به لينچ MSH6و MSH2 ،MLH1هایژن

IHCو HRMAبا روش ( HNPCC)سندرم مورد بررسی قرار 1

توالی مسقيم از روش تعيين HRMAگرفته و برای تایيد نتایج

مورد مطالعه بوده است که در بررسی بيمار 92. استفاده شده است

و MSH2، در سه بيمار جهش حذفی جدید در HRMAبا روش

است و گزارش شده MLH1معنی در در یک بيمار جهش بی

صورت بيان هترتيب ب به IHCها در روش گزارش این جهش

PMS2و MLH1و بيان ضعيف پروتئين MSH2 نشدن پروتئين

روشی HRMAشود که زارش میدر این مطالعه گ. بوده است

ای و حذفی های نقطه سریع، ارزان وتوانمند برای شناسایی جهش

کند که برای هست اما تاکيد می MMRهای کوچک در ژن

های کروموزومی نظمیهای حذفی بزرگتر و بیشناسایی جهش

های به تنهایی کافی نيست و بلکه باید از روش HRMAروش

1 Immunohistochemistry

[ D

OR

: 20.

1001

.1.2

0084

439.

1399

.15.

1.5.

6 ]

[ D

ownl

oade

d fr

om m

g.ge

netic

s.ir

on

2022

-04-

28 ]

10 / 12





MLPA و array-CGH ده شوداستفا (Mazurek et al. 2012) .

روش حساسی است و HRMAهای یاد شده در بالا، طبق مقاله

ی تجزیه و تحليل نتایج، عوامل مختلفی مثل نوع دستگاه، نحوه

تواند بر نتيجه تاثير افزار مورد استفاده و غيره می نوع رنگ، نرم

از HRMAبگذارد بنابراین در بيشتر موارد در کنار روش

شود یا استفاده می HRMAهای دیگری برای تایيد نتایج روش

هایی انجام شده و نتایج مشخص های دیگر آزمایش اینکه با روش

،HRMA شده است و فقط برای بررسی حساسيت و اختصاصيت

.است از این روش برای بررسی دوباره آزمایش استفاده شده

ژن 12 در اگزون AATبررسی ميزان جهش حذفی در این تحقيق

MSH2 (های درگير در ایجاد سرطان یکی از ژن) که بر روی

در بيماران مبتلا به سرطان کلورکتال انسانی قرار دارد، 2کروموزم

های سرانجام با مقایسه منحنی هر نمونه در آزمایش. شدبررسی

فاقد جهش ) wildنمونه سرطانی با ژنوتيپ 33مختلف همه

در برخی موارد برای . شدندشناسایی و گزارش ( AATحذفی

در این . ، استفاده شدDNAیابی مستقيم تایيد نتایج از روش توالی

عنوان روش اصلی استفاده شده و از هب HRMAاز روش تحقيق

ها برای تایيد آزمایش استفاده شده تکرار آزمایش و تکرار نمونه

.است

توان را می HRMAبا توجه به نتایج حاصل از این مطالعه، روش

های شناخته گری مناسب برای جهش عنوان یک روش غربال به

روشکارگيری این ه، با ببنابراین ها معرفی کرد شده در بيماری

HNPCCتوان از ابتلای افراد مستعد به سرطان کلورکتال ارثی می

:های زیادی دارد از قبيل مزیت HRMA روش. پيشگيری کرد

با هزینه کمتری قدرت های تشخيصی دیگر نسبت به روش -

.تکرار پذیری بالایی دارد

های سازی نمونه سازی صحيح شرایط آماده در صورت بهينه -

و تکرار آزمایش برای هر نمونه، روش ( مجهول)شاهد و سرطانی

HRMA از دقت بالایی برخوردار بوده و قابل اعتماد است.

، و DNAگيری، استخراج برای نمونه)روش بسيار سریعی است -

(.زمان بسيار کمی نياز است HRMAانجام

آلودگی در این روش بسيار کم است چون همه مراحل در -

.گيردداخل یک لوله کوچک انجام می

شاهد و )ها روش بسيار حساسی است در این روش همه نمونه -

باید در شرایط یکسان آماده شوند چون این مورد در ( سرطانی

ثر است و احتمال دارد ؤو سرطانی م های شاهد شناسایی نمونه

. ها اشتباه شناسایی شوند نمونه

گذار ، تجزیه و تحليل نتایج بسيار مهم و تاثيرHRMAدر روش -

.است

Amersi F, Agustin M and Y Ko (2005) Cancer:

Epidemiology,Risk Factors, and Health Service. Clinics in

Colon and Rectal Surgery 18:3 Buerstedde J-M, Alday P, Torhorst J, Weber W, Muller H,

Scott R (1995) Detection of new mutations in six out of 10

Swiss HNPCC families by genomic sequencing of the

hMSH2 and hMLH1 genes. Journal of Medical Genetics

32: 909-912.

Chen D, Wang YY, Chuai ZR, Huang JF, Wang YX, Liu

K, Zhang LQ, Yang Z, Shi D.Ch, Liu Q, Hung Q, Fu WL

(2014) High-Resolution Melting Analysis for accurate

detection of BRAF mutations :a systematic review and

metaanalysis. Scientificreports 4: 4168.

Desai DC, Lockman JC, et al (2000) Recurrent germline

mutation in MSH2 arise frequently de novo. Journal of

Medical Genetics 37: 646-652.

Domingo E, Laiho P, Ollikainen M, Pinto M, Wang L,

French AJ, Westra J, Frebourg T, Espı´n E, Armengol M,

Hamelin R, Yamamoto H, Hofstra RM W, Seruca R,

Lindblom A, Peltoma kiP, Thibodeau SN, Aaltonen LA,

Schwartz SJr (2004) BRAF screening as a low-cost

effective strategy for simplifying HNPCC genetic. Journal

of Medical Genetics 41:664-668.

Erali M, Wittwer CT (2010) High resolution melting

analysis for gene scanning. Methods 50:250-61.

Ewing I, Hurley JJ, Josephides E, Millar A (2014) The

molecular genetics of colorectal cancer. Frontline

Gastroenterology 5: 26-30.

Janavicius R. Dovile Matiukaite Arturas Jakubauskas,

Laimonas Griskevicius (2010) Microsatellite Instability

Detection by High-Resolution Melting Analysis. Clinical

Chemistry 56(11).

Janavicius R, Matiukaite D, Jakubauskas A and

Griskevicius L (2010) Microsatellite Instability Detection

by High-Resolution Melting Analysis. Clinical Chemistry

56:1750-1757.

Josep J. Centelles (2012) General Aspects of Colorectal

Cancer. International Scholarly Research Network ISRN

Oncology Henry OE and M Ilyas (2015) Cancer mutation

screening: Comparison of high-resolution melt analysis

between two platforms. Ecancer 9:522.

منابع

[ D

OR

: 20.

1001

.1.2

0084

439.

1399

.15.

1.5.

6 ]

[ D

ownl

oade

d fr

om m

g.ge

netic

s.ir

on

2022

-04-

28 ]

11 / 12





Hsieh P (2001) Molecular mechanisms of DNA mismatch

repair. Mutation Research 486: 71-87.

Kashfi SMH, Golmohammadi M, Behboudi F,

Nazemalhosseini-Mojarad E, Zali M R (2014) MUTYH

the base excision repair gene family member associated

with colorectal cancer polyposis. Gastroenterol Hepatol

Bed Bench 6:1-10

Kheirelseid EAH, Miller N, Kerin MJ (2013) Molecular

biology of colorectal cancer: Review of the literature.

American Journal of Molecular Biology 3: 72-80.

Kunzelmann K, Nitschke R (2000) Defects in processing

and trafficking of cystic fibrosis transmembrane

conductance regulator. Exp. Nephrol 8: 332-342.

Labianca R, Nordlinger B, G D Beretta, Brouquet A and

Cervantes A (2010) Primary colon cancer: ESMO Clinical

Practice Guidelines for diagnosis, adjuvant treatment and

follow-up. Annals of Oncology 21:70-77.

Li BS, Wang XY, Ma FL, Jiang B, Song XX, et al (2011)

Is High Resolution Melting Analysis (HRMA) Accurate

for Detection of Human DiseaseAssociated Mutations? A

Meta Analysis. PLoS ONE 6: e28078.

Lynch H T, Lynch J (2000) Lynch syndrome: genetics,

natural history, genetic counseling, and prevention. Journal

of Clinical Oncology:18(21 Suppl): 19-31.

Mazurek A, Fiszer-Kierzkowska A, Budryk M (2012)

Identification of new genetic alterations in MLH1,MSH2

and MSH6 using IHC and HRM analysis in Lynch

syndrome-suspected patients. Hereditary Cancer in

Clinical Practice 10 (Suppl 3):A11

Mitchell RJ, Farrington SM, Dunlop MG, Campbell H

(2002) Mismatch Repair Genes hMLH1 and hMSH2 and

Colorectal Cancer: A HuGE Review. American Journal

of Epidemiology 156: 885-902.

Moslein G, Tester DJ, Lindor NM, Honchel R,

Cunningham J M, French A J, Halling K C, Schwab M,

Goretzki P and Thibodeau SN (1996) Microsatellite

instability and mutation analysis of hMSH2 and hMLH1 in

patients with sporadic, familial and hereditary colorectal

cancer. Human Molecular Genetics 5:1245-1252.

Mueller J, Gazzoli I, Bandipalliam P. Garber JE, Syngal S,

and. Kolodner RD (2009) Comprehensive Molecular

Analysis of Mismatch Repair Gene Defects in Suspected

Lynch Syndrome (Hereditary Nonpolyposis Colorectal

Cancer) Cases. Cancer Research 69: 17

Peltomaki P and Vasen H (2004) Mutations associated

with HNPCC predisposition – Update of ICG-

HNPCC/INSiGHT mutation database. Disease Markers

20: 269-276.

Ripa RS, Katballe N, Wikman FP, Jager AC, Bernstein I,

Qrntoft T, Schwartz M, Nielsen FC, Bisgaard ML (2005)

Presymptomatic diagnosis using a deletion of a single

codon in families with hereditary non-polyposis colorectal

cancer. Mutation Research 570:89-96.

Roper J and Hung KE (2013) Molecular Pathogenesis of

Colorectal Cancer. Chapter 2 :Molecular Mechanisms of

Colorectal C arcinogenesis. Springer Science.

Shilpa V, Lakshmi K (2014) Molecular Mechanisms of

Mismatch Repair Genes in Cancer – A Brief Review.

Journal Proteomics Genomics 1:101

Stintzing S (2014) Management of colorectal cancer.

F1000Prime Reports 6(108).

Stormorken AT, Müller W, Lindblom A, Heimdal K, Aase

S, Lothe, IM Norèn T, Wijnen JT, Moslein G and Moller P

(2003) The inframe MSH2 codon 596 deletion is linked

with HNPCC and associated with lack of MSH2 protein in

tumours. Familial Cancer 2: 9-13.

Tarraga LPJ, Albero JS, Rodroguez-Montes JA (2014)

Primary and secondary Prevention of Colorectal Cancer.

Clinical Medicine Insights: Gastroenterology 7:33-46.

Teixeira Pinto PM (2009) Comparison of methodologies

for KRAS mutation detection in metastatic colorectal

cancer. Porto. Dissertação de Mestrado em Oncologia

Teklemariam AD, Geleta G and Tassew A (2015) A

Review on Gene Involved in Cancer Development and

Oncogenic Viruses. African Journal of Basic & Applied

Sciences 7: 223-232

Vasen HFA, Moslein G, Alonso A, Bernstein I, Bertario L,

Blanco I, Burn J, Capella G, Engel C, Frayling I, Friedl W,

Hes FJ, Hodgson S, Mecklin JP, Moller P, Nagengast F,

Parc Y, Sinisalo R, J Sampson R, Stormorken A, Wijnen J

(2007) Guidelines for the clinical management of Lynch

syndrome (hereditary non-polyposis cancer). Journal of

Medical Genetics 44:353-362.

Vaughn CP, Lyon E,and Samowitz WS (2008)

Confirmation of Single Exon Deletions in MLH1and

MSH2 Using Quantitative Polymerase Chain Reaction.

Journal of Molecular Diagnostics 10 (4).

Vossen RH, Aten E, Roos A, den Dunnen JT (2009) High-

resolution melting analysis (HRMA): more than just

sequence variant screening. Human Mutatation 30:860 –6.

Whitehouse A, Deeble J, Taylor GR, Guillou PJ, Phillips

SE, Meredith DM, Markham AF (1997) Mapping the

minimal domain of hMSH-2 sufficient for binding

mismatched oligonucleotides. Biochemical Biophysical

Research Communication 232:10-13.

Wijnen J, Khan PM, Vasen H, van der Klift H, Mulder A,

van Leeuwen-Cornelisse I, Bakker B, Losekoot M, MoIler

P,and Fodde R (1997) Hereditary Nonpolyposis Colorectal

Cancer Families Not Complying with the Amsterdam

Criteria Show Extremely Low Frequency of Mismatch-

Repair-Gene Mutations. American Journal Human

Genetics 61:329-335

Worthley DL, Leggett BA (2010) Colorectal Cancer:

Molecular Features and Clinical Opportunities. The

Clinical Biochemist Reviews 31.

[ D

OR

: 20.

1001

.1.2

0084

439.

1399

.15.

1.5.

6 ]

[ D

ownl

oade

d fr

om m

g.ge

netic

s.ir

on

2022

-04-

28 ]

Powered by TCPDF (www.tcpdf.org)

12 / 12



http://www.tcpdf.org

D x6ÏÅxF ²£¦ J Í ÌÊÏÈÊ64 F UJ Í ¨Î « ª w Ë y J£ {6 xÌ

Documents