Autoři: Kateřina Kobédová, Jiřina Marková, Revize: Eva Bártová, Ivo Papoušek Grant: IVA VFU Brno 2016FVHE/2150/34 Cíl: Seznámení se se základními metodami, využívanými k analýze DNA 1. izolace DNA 2. amplifikace DNA pomocí PCR a elektroforéza 3. vizualizace DNA a hodnocení výsledku Úkol: Určení pohlaví ptačího jedince z biologického materiálu (svalová tkáň) pomocí PCR. MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE I – PŘÍPRAVA TKÁNĚ K IZOLACI DNA Postup přípravy buněčného lyzátu: 1. vypreparujte kousek tkáně (svalovina, případně jiná tkáň ptáků) o velikosti maximálně dvou špendlíkových hlaviček a přeneste do mikrozkumavky (1,5 ml) popsané fixem 2. přidejte 200 μl roztoku GT Buffer 3. homogenizujte tkáň pomocí mikropaličky 4. novou špičkou připipetujte 20 μl proteinázy K (proteinase K) 5. uzavřete mikrozkumavku, ručně protřepejte a inkubujte při pokojové teplotě 2 minuty 6. novou špičkou připipetujte 200 μl lyzačního pufru GBT Buffer 7. uzavřete mikrozkumavku, protřepejte a vložte do třepacího termobloku předehřátého na 55 °C a inkubujte cca 3 hod při 300 rpm (rounds per minute) 8. buněčný lyzát se uchová do příštího týdne při pokojové teplotě Cvičení 9,10,11: MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE Jméno: Skupina: studenti zpracovávají vzorek ve dvojicích, mikrozkumavky je třeba označit číslem skupiny a pořadovým číslem dvojice studentů, sada automatických pipet je k dispozici pro pracovní skupinu je nutné vybrat správnou pipetu dle rozsahu objemu a zkontrolovat a nastavit na pipetě požadovaný objem - pozor na přetočení pipety mimo dané rozmezí!! k zajištění přesného objemu je třeba důkladně nasadit špičku na pipetu (bezdotykově!!) k zabránění kontaminace pipet se pro práci s DNA používá špička s filtrem k zabránění kontaminace vzorku a chemikálií se pro každou chemikálii používá vždy nová špička (jednu špičku lze použít pro stejnou chemikálii) požadovaný objem se získá stlačením pipety do první polohy a ponořením špičky pipety do nasávané tekutiny, uvolněním stlačení, přenesením požadovaného objemu do zkumavky a stlačením pipety do první polohy homogenizace vzorku se provádí ve zkumavce tzv. propipetováním tj. po přidání určité chemikálie do zkumavky třikrát opakovaně nasát směs do špičky a vytlačit odstranění špičky se provádí bezdotykově ZÁSADY PRÁCE 1/XI
7
Embed
Cvičení 9,10,11: MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE · MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE I – PŘÍPRAVA TKÁNĚ K IZOLACI DNA Postup přípravy buněčného lyzátu: 1. vypreparujte kousek tkáně (svalovina,
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
Autoři: Kateřina Kobédová, Jiřina Marková, Revize: Eva Bártová, Ivo Papoušek
Grant: IVA VFU Brno 2016FVHE/2150/34
Cíl: Seznámení se se základními metodami, využívanými k analýze DNA
1. izolace DNA
2. amplifikace DNA pomocí PCR a elektroforéza
3. vizualizace DNA a hodnocení výsledku
Úkol: Určení pohlaví ptačího jedince z biologického materiálu (svalová tkáň) pomocí PCR.
MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE I – PŘÍPRAVA TKÁNĚ K IZOLACI DNA
Postup přípravy buněčného lyzátu:
1. vypreparujte kousek tkáně (svalovina, případně jiná tkáň ptáků) o velikosti maximálně dvou špendlíkových hlaviček a přeneste do mikrozkumavky (1,5 ml) popsané fixem
2. přidejte 200 μl roztoku GT Buffer 3. homogenizujte tkáň pomocí mikropaličky 4. novou špičkou připipetujte 20 μl proteinázy K (proteinase K) 5. uzavřete mikrozkumavku, ručně protřepejte a inkubujte při pokojové teplotě 2
minuty 6. novou špičkou připipetujte 200 μl lyzačního pufru GBT Buffer 7. uzavřete mikrozkumavku, protřepejte a vložte do třepacího termobloku předehřátého
na 55 °C a inkubujte cca 3 hod při 300 rpm (rounds per minute) 8. buněčný lyzát se uchová do příštího týdne při pokojové teplotě
Cvičení 9,10,11: MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE Jméno:
Skupina:
studenti zpracovávají vzorek ve dvojicích, mikrozkumavky je třeba označit číslem skupiny a pořadovým číslem dvojice studentů, sada automatických pipet je k dispozici pro pracovní skupinu
je nutné vybrat správnou pipetu dle rozsahu objemu a zkontrolovat a nastavit na pipetě požadovaný objem - pozor na přetočení pipety mimo dané rozmezí!!
k zajištění přesného objemu je třeba důkladně nasadit špičku na pipetu (bezdotykově!!) k zabránění kontaminace pipet se pro práci s DNA používá špička s filtrem k zabránění kontaminace vzorku a chemikálií se pro každou chemikálii používá vždy nová
špička (jednu špičku lze použít pro stejnou chemikálii) požadovaný objem se získá stlačením pipety do první polohy a ponořením špičky pipety do
nasávané tekutiny, uvolněním stlačení, přenesením požadovaného objemu do zkumavky a stlačením pipety do první polohy
homogenizace vzorku se provádí ve zkumavce tzv. propipetováním tj. po přidání určité chemikálie do zkumavky třikrát opakovaně nasát směs do špičky a vytlačit
odstranění špičky se provádí bezdotykově
ZÁSADY PRÁCE
1/XI
Autoři: Kateřina Kobédová, Jiřina Marková, Revize: Eva Bártová, Ivo Papoušek
Grant: IVA VFU Brno 2016FVHE/2150/34
MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE II – IZOLACE DNA A PCR
IZOLACE DNA
1. přidejte k buněčnému lyzátu v mikrozkumavce 200 μl 96% ethanolu 2. promíchejte obsah mikrozkumavky opakovaným převrácením 3. vezměte kolonku se sběrnou zkumavkou a víčko kolonky popište fixem (vaše
indentifikační číslo) a přelijte celý obsah z mikrozkumavky do kolonky 4. centrifugujte 1 min při 13000 rpm 5. obsah sběrné zkumavky vylijte (do odpadní nádoby) a sběrnou zkumavku vraťte pod
kolonku 6. do kolonky napipetujte (novou špičkou) 400 μl promývacího roztoku 1 (W1 Buffer) 7. centrifugujte 1 min při 13000 rpm 8. obsah sběrné zkumavky vylijte (do odpadní nádoby) a sběrnou zkumavku vraťte pod
55 °C 15. inkubujte 2 min při pokojové teplotě 16. centrifugujte 2 min při 13000 rpm 17. odstraňte kolonku (vyhoďte ji do odpadní nádoby) a uzavřete mikrozkumavku, která
obsahuje izolovanou DNA
eluční roztok promývací roztoky
centrifugace
centrifugace
DNA
navázání
DNA na
kolonku centrifugace
sběrná zkumavka
2/XI
Autoři: Kateřina Kobédová, Jiřina Marková, Revize: Eva Bártová, Ivo Papoušek
Grant: IVA VFU Brno 2016FVHE/2150/34
PCR
Vždy dvojice studentů zpracovává jeden vzorek:
1. připravte PCR směs do malé PCR mikrozkumavky (směs pro jeden vzorek 18 μl): 10 μl - PCR master mix (směs nukleotidů dNTP, DNA polymerázy a Mg2+ iontů) 2 μl - primer 2550F (GTTACTGATTCGTCTACGAGA) 2 μl - primer 2718R (ATTGAAATGATCCAGTGCTTG) 4 μl - voda pro PCR
2. připipetujte k PCR směsi (18 μl) novou špičkou 2 μl izolované DNA 3. pořádně uzavřete PCR mikrozkumavku, vložte ji do termocykleru, vyučující následně
spustí PCR program 4. po dokončení programu bude PCR produkt uchován v lednici Program PCR amplifikace:
Počáteční denaturace DNA 94 °C 3 min Denaturace DNA 94 °C 30 sec Nasedání primerů (annealing) 55 °C 45 sec 35 cyklů Syntéza komplementárního řetězce DNA (extenze) 72 °C 45 sec Dosyntetizování řetězců DNA (finální extenze) 72 °C 5 min
MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE III – ELEKTROFORÉZA GELOVÁ ELEKTROFORÉZA
Příprava 1,2% agarózového gelu (jeden gel pro celou skupinu)
1. do baňky typu Erlen odvažte 1,2 g agarózy 2. skleněným válcem odměřte 100 ml TBE pufru, přidejte do baňky a
kroužením promíchejte 3. dejte baňku do mikrovlnné trouby a vařte při teplotě nastavené
na maximální ohřev po dobu 2 minut (jakmile začne obsah kádinky bublat, přerušte ohřev a promíchejte obsah kádinky v ruce s nasazenou rukavicí)
4. po 2 minutách ohřevu vyjměte baňku z mikrovlnné trouby a opatrně ji ochlaďte pod tekoucí vodou na teplotu přibližně 60 °C (teplota, kdy několik sekund udržíme kádinku přiloženou ke hřbetu ruky)
5. napipetujte (novou špičkou) 3 μl MIDORI Green (10 tis. krát koncentrovaný roztok) a v ruce promíchejte
6. připravte si nalévací vanu a přelijte do ní rozehřátý agar z baňky 7. do vany vložte hřebínek a špičkou od pipety odstraňte případné bubliny v gelu (gel ztuhne
asi po 30 minutách)
3/XI
degenerované nukleotidy: R=A,G; Y=C,T
Autoři: Kateřina Kobédová, Jiřina Marková, Revize: Eva Bártová, Ivo Papoušek
Grant: IVA VFU Brno 2016FVHE/2150/34
Nanášení vzorků
1. po ztuhnutí gelu vyjměte hřebínek, přeneste gel do elektroforetické vany a zalijte TBE pufrem tak, aby byl celý gel ponořený
2. do jedné z jamek v gelu (nejlépe do prostřední) naneste 3 μl velikostního markeru
3. do dalších jamek v gelu nanáší (novou špičkou) vždy jeden z dvojice studentů svůj vzorek, tj. 10 μl PCR produktu (s pipetou je třeba manipulovat opatrně, ať neprotrhnete gel)
4. zapojte elektroforetickou vanu do zdroje a pusťte elektrický proud při konstantním napětí 120 V po dobu 30 minut
5. po ukončení elektroforézy přemístěte gel na UV-transluminátor a pod UV zářením odečtěte výsledek (v rámci bezpečnosti je třeba pozorovat gel přes plastový kryt)
Vyhodnocení:
U samičího pohlaví: (ZW) se na gelu objeví 2 pruhy (bandy). Jeden větší, který odpovídá CHD-Z, a druhý menší asi o 200 bp (párů bazí), který odpovídá CHD-W.
U samčího pohlaví: (ZZ) se na gelu objeví jen jeden pruh, který odpovídá CHD-Z.