7/25/2019 Culturi de Calus http://slidepdf.com/reader/full/culturi-de-calus 1/21 ASPECTEGENERALEPRIVIND OBŢINEREADECALUSŞI SUSPENSII DECELULE VEGETALE Culturile de calus Calusul este ţesutul vegetal care se formează în mod natural la nivelul suprafeţelor tăiate sau rănite cicatrizându-le, dar se poate forma şi la baza butaşilor, constituind zona de geneză a rădăcinilor adventive. Calusul tânăr este o masă de ţesut care conţine celule nediferenţiate care se divid activ. Calusul primar este cel care se dezvoltă dintr-un organ al unei plante, iar cel subdivizat şi repicat reprezintă calusul secundar. Se mai distinge un calus de tip regenerativ (embriogen care dă naştere întotdeauna la neoplantule, şi unul neregenerativ (neembriogen, din care se diferenţiază rădăcini şi uneori muguraşi, dar niciodată neoplantule. !n timp ce calusul regenerativ este dens optic, translucid sau opac, de culoare albă-lăptoasă, gălbuie sau galbenă - verde, prezentând zone compacte cu celule nediferenţiate, calusul neregenerativ este constituit dintr-o masă cristalină, transparentă, de culoare albă, brunie sau verde, cu o consistenţă mai la"ă, mai friabil, desfăcându-se uşor în pac#ete de celule. $egiunile friabile prezintă celule mari, mult vacuolizate. %ceste regiuni generează rădăcini şi mai rar muguraşi, dar niciodată plante. &otrivit lui '%)$S (Cac#iţă-Cosma,*+, cea mai ridicată capacitate regenerativă, menţinută timp îndelungat, o prezintă calusul regenerativ. ot el a observat că acest tip de calus tinde să devină neregenerativ/ după producerea acestei reversibilităţi funcţionale, procesul este definitiv, cele două tipuri de calus, diferite funcţional, nefiind interconvertibile. 0e altfel, cele două forme de calus necesită #ormoni diferiţi, în doze variate, atât pentru impulsionarea şi susţinerea creşterii cât şi pentru diferenţiere. 0e regulă, calusul regenerativ are o creştere mai lentă, spre deosebire de cel neregenerativ. S-a constatat că se generează mai mult calus din inoculii cultivaţi la întuneric decât din cei crescuţi la lumină, mediul optim pentru formarea calusului embriogen fiind particular fiecărei specii. Creşterea calusului se consideră a fi nedefinită, el putând fi înmulţit şi cultivat la infinit, în condiţiile repicării periodice. 0acă subcultivarea nu are loc în timp util, are loc îmbătrânirea culturii, ea îşi sc#imbă culoarea din gălbui, galben- verzui ori verde, la cenuşiu sau galben-brun/ uneori calusul poate căpăta o culoare *
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
ASPECTE GENERALE PRIVIND OBŢINEREA DE CALUS ŞI SUSPENSII DE CELULE
VEGETALE
Culturile de calus
Calusul este ţesutul vegetal care se formează în mod natural la nivelul suprafeţelor
tăiate sau rănite cicatrizându-le, dar se poate forma şi la baza butaşilor, constituind zona
de geneză a rădăcinilor adventive.
Calusul tânăr este o masă de ţesut care conţine celule nediferenţiate care se divid
activ. Calusul primar este cel care se dezvoltă dintr-un organ al unei plante, iar cel
subdivizat şi repicat reprezintă calusul secundar. Se mai distinge un calus de tip
regenerativ (embriogen care dă naştere întotdeauna la neoplantule, şi unul neregenerativ
(neembriogen, din care se diferenţiază rădăcini şi uneori muguraşi, dar niciodată
neoplantule. !n timp ce calusul regenerativ este dens optic, translucid sau opac, de culoare
albă-lăptoasă, gălbuie sau galbenă - verde, prezentând zone compacte cu celule
nediferenţiate, calusul neregenerativ este constituit dintr-o masă cristalină, transparentă,
de culoare albă, brunie sau verde, cu o consistenţă mai la"ă, mai friabil, desfăcându-se
uşor în pac#ete de celule. $egiunile friabile prezintă celule mari, mult vacuolizate. %ceste
regiuni generează rădăcini şi mai rar muguraşi, dar niciodată plante. &otrivit lui
'%)$S (Cac#iţă-Cosma,*+, cea mai ridicată capacitate regenerativă, menţinutătimp îndelungat, o prezintă calusul regenerativ. ot el a observat că acest tip de calus
tinde să devină neregenerativ/ după producerea acestei reversibilităţi funcţionale,
procesul este definitiv, cele două tipuri de calus, diferite funcţional, nefiind
interconvertibile. 0e altfel, cele două forme de calus necesită #ormoni diferiţi, în doze
variate, atât pentru impulsionarea şi susţinerea creşterii cât şi pentru diferenţiere. 0e
regulă, calusul regenerativ are o creştere mai lentă, spre deosebire de cel neregenerativ.
S-a constatat că se generează mai mult calus din inoculii cultivaţi la întuneric
decât din cei crescuţi la lumină, mediul optim pentru formarea calusului embriogen fiind
particular fiecărei specii. Creşterea calusului se consideră a fi nedefinită, el putând fi
înmulţit şi cultivat la infinit, în condiţiile repicării periodice. 0acă subcultivarea nu are
loc în timp util, are loc îmbătrânirea culturii, ea îşi sc#imbă culoarea din gălbui, galben-
verzui ori verde, la cenuşiu sau galben-brun/ uneori calusul poate căpăta o culoare
roşiatică sau vişinie datorită formării şi acumulării pigmenţilor antocianici în sucul
vacuolar.
&entru inducerea calusului poate fi utilizat orice organ (rădăcini, frunze, flori, etc.
sau ţesut. !n cazul în care inducerea este dificilă, ori dacă este nevoie de calus 1uvenil, se
folosesc embrioni imaturi, seminţe tinere ori părţi ale acestora (&ieri2, *++.
3tilizarea ţesutului calusal este variată. %supra acestui tip de material biologic se
pot aplica cu succes diferiţi agenţi stresanţi obţinându-se astfel linii rezistente sau
tolerante la condiţii de mediu e"treme. Calusul poate fi utilizat şi ca instrument de
cercetare în diferite e"perimente de fiziologie, în studiul problemelor de morfogeneză, în
urmărirea unor modificări ultrastructurale, (sub acţiunea unor anumiţi factori,
administraţi e"ogen sau în dependenţă de natura inoculilor din care a provenit calusul, în
analize de ordin bioc#imic, etc. %stfel, calusul poate fi utilizat ca indicator al reacţieicelulei vegetale la o serie de substanţe sau condiţii de cultură permiţând efectuarea unor
e"perienţe de fiziologie privind influenţa unor regulatori de creştere, reacţia la pesticide,
no"e ori ioni grei, respiraţia, morfogeneza, testarea viabilităţii celulare, a biogenezei unor
produşi primari sau secundari de metabolism, cercetări de enzimologie, etc.
4nconvenientul acestui tip de cultură îl constituie instabilitatea genetică a celulelor
calusale care se pot poliploidiza în anumite condiţii (natura şi concentraţia #ormonilor
prezenţi, şocuri e"treme, anaerobioza, având loc modificări sub acţiune a factorilor stresanţi şi a agenţilor mutageni. %cest nea1uns poate fi în sc#imb valorificat în sensul
selectării liniilor cu calităţi speciale. 5a dicotiledonate inducerea calusului este realizată
cu mai multă uşurinţă decât la monocotiledonate sau la gimnosperme.
Sterilizarea materialului biologic şi a incintelor de lucru
) condiţie esenţială în realizarea culturilor de e"plante pe medii aseptice este
aceea a asigurării asepsiei nu numai a recipientelor, a instrumentelor cu care se operează
şi a mediilor de cultură, ci şi a incintei (a bo"ei şi a nişei în care se inoculează, şi
respectiv a materialului vegetal care va servi la prelevarea e"plantelor. Contaminarea cu
microorganisme a recipientelor, a mediilor de cultură şi a materialului biologic se poate
realiza foarte uşor, atât în fazele incipiente, cât şi în momentul inoculării, iar în mod
secundar, în momentul transferului, respectiv al repicării culturilor. !n alte cazuri,
infecţiile se pot produce în mod pasiv, din cauza ineficienţei de înc#idere a flacoanelor de
cultură, a lipsei de atenţie în manipularea lor (manevrarea recipientelor nu se efectuează
prin prinderea lor în zona de obturare, ci prinzându-le din porţiunea baza4ă, ori a
dezvoltării întârziate a unor germeni care au stat latenţi în ţesuturile profunde ale
inoculilor.
Sterilizarea încăperilor şi a suprafeţelor
) condiţie esenţială menţinerii unui mediu aseptic este păstrarea unei curăţenii
temeinice în încăperi, dar nu mai puţin importantă este ferirea de praf a recipientelor de
cultură şi a instrumentelor. 7ste recomandabil ca personalul să poarte #alate, bonete şi
încălţăminte sterile, îmbrăcămintea de stradă şi părul constituind surse de infecţii.
o"a sterilă este de dorit a fi montată într-un loc lipsit de pulberi, fum, igrasie,vapori, din cauza faptului că aceşti agenţi obturează filtrele de aer, depreciind calităţile
acestora.
Se recomandă ca, în cursul nopţii, toate încăperile din perimetrul destinat
laboratorului de culturi de ţesuturi, să fie iradiat cu lumină 38. $adiaţiile 38 vor fi
întrerupte cu apro"imativ 9: de minute înainte de începerea operaţiunilor în zona sterilă,
din cauza faptului că ele sunt nocive sănătăţii umane. )zonul acumulat în încăperi în
cursul iradierii cu 38 va fi lăsat să difuzeze pasiv din zonele sterilizate, fără utilizareaventilatoarelor.
o"ele cu flu" laminar de aer steril vor fi puse în funcţiune cu puţin timp înaintea
începerii operaţiunilor de inoculare. !n cazul unor lucrări de mai mare importanţă, această
operaţiune se va efectua c#iar cu 6; de ore înainte de începerea lor, pulverizându-se nişa
sau bo"a sterilă cu alcool etilic ::. (Cac#iţă - Cosma şi Sand, 6:::.
Sterilizarea instrumentelor
!naintea începerii operaţiunilor, instrumentele vor fi introduse în alcool şi
flambate/ apoi vor fi aşezate pe suporturi, pentru a se răci. 0in cauza faptului că este
obligatorie ştergerea periodică a mâinilor cu alcool şi sterilizarea instrumentelor, e"istă
pericolul aprinderii alcoolului, iar de la eventualele picături de alcool arzânde, aprinderea
dopurilor de vată. 0in acest motiv trebuie să se acorde o atenţie deosebită tuturor
operaţiunilor. <âna proaspăt ştearsă cu alcool nu se va apropia de flacără/ instrumentele
scoase din alcool vor fi introduse în flacără în poziţie oblică, cu vârful în 1os, evitându-se
astfel scurgerea alcoolului aprins.
Se recomandă utilizarea instrumentelor în scopul dimensionării e"plantelor, abia
după răcire. !n caz contrar, temperatura ridicată a acestora poate traumatiza profund
e"plantul. 4nstrumentele tăioase, după introducere în alcool, se trec prin flacără timp de o
fracţiune de secundă, pentru a nu se deteriora tăişul lor, mai apoi fiind plon1ate într-un
recipient cu apă sterilă. &ensele, scalpele, acele vor fi menţinute în flacără, până la
înroşirea vârfului lor.
Sterilizarea recipientelor de cultură
0eoarece o serie de microorganisme au spori rezistenţi la temperaturi ridicate şi la
diferiţi agenţi dezinfectanţi, se recomandă presterilizarea sticlăriei timp de minimum treiore la *=::C, prin intermediul căldurii uscate (în etuve, prealabil introducerii în
recipiente a mediilor de cultură. 3lterior, recipientele cu medii vor fi resterilizate prin
căldură umedă (autoclavare. 0urata e"puneri sticlăriei la temperaturi ridicate depinde şi
de modul spălării ei, de sterilizarea prin autoclavare prealabil desc#iderii flacoanelor
infectate, precum şi de gradul de infectare a atmosferei din laborator. !n funcţie de
calitatea sticlei, presterilizarea la temperaturi ridicate (*::C, sau peste această valoare,
poate provoca o degradare a calităţii acesteia şi la eliberarea în mediile de cultură decompuşi to"ici.
!n scopul preîntâmpinării infecţiilor, se recomandă o corectă curăţire a sticlăriei
prin menţinerea acesteia (pe o perioadă de minim patru ore în amestec cromic. Capsulele
&etri, pipetele, lamele de microscop se împac#etează în #ârtie, iar pac#etele se aşază în
tăvi metalice sau în coşuri de sârmă, după care se sterilizează în etuvă, timp de *- 6 ore,
la *6::C. ) foarte bună curăţire a recipientelor poate fi asigurată prin intermediul
ultrasunetelor.
uburile şi dopurile din cauciuc, precum şi cele confecţionate din material plastic
termorezistent, se spală bine, se fierb şi se sterilizează prin autoclavare. 0opurile de vată
se recomandă a fi şi ele autoclavate prealabil utilizării lor (deoarece, cu ocazia primei
sterilizări produc o substanţă to"ică, iar dacă ele provin de la flacoane de cultură
infectate, se aruncă, de asemenea şi cele îmbibate accidental cu mediu. 4n general,
dopurile de vată pot fi reutilizate, dar nu de prea multe ori. Ca o măsură preventivă, se
recomandă ca dopurile să fie autoclavate şi uscate în etuvă, la temperaturi moderate.
Capacele metalice, folia de aluminiu dimensionată, buşoanele din bac#elită ori de
alt tip, se sterilizează, prealabil folosirii, în etuvă şi prin autoclavare. $ecipientele de
cultură se introduc în autoclav printr-o încăpere situată în afara perimetrului steril, fiind
scoase apoi printr-o a doua uşă, direct în perimetrul steril, ele fiind astfel transportate cu
un risc minim de contaminare cu germeni. %paratele introduse în nişă sau în bo"ă
(stereomicroscop, lampă, etc. se sterilizează prin ştergere periodică, cu alcool ::.
Sterilizarea mediilor de cultură şi a apei
!n cel mai scurt timp de la prepararea mediilor de cultură se va efectua
autoclavarea acestora. !n acest scop, după porţionarea mediilor, recipientele vor fiînc#ise, de preferinţă cu dopuri de vată dense care înc#id bine flaconul. 0acă se
întrebuinţează recipiente care se înc#id cu capace, acestea nu trebuie să asigure
etanşeitate, pentru a permite accesul aburului încălzit în recipientele cu mediu. !n cazul
nerespectării acestei recomandări, sterilizarea mediilor se va produce defectuos, căldura
umedă (aburul fiind cea care distruge germenii. !n cazul recipientelor (înc#ise cu vată
care prezintă o desc#idere mai mare, se recomandă acoperirea gurii flaconului şi cu
#ârtie, fi"ată cu aţă, sfoară sau leucoplast, deoarece acestea rezistă la autoclavare.<anipularea recipientelor sterile se face cu multă prudenţă. 7ste interzisă
prinderea lor în apropierea zonei de obturare, deoarece prin mişcarea capacului ori a
dopului se poate provoca un sc#imb de aer între mediul e"tern şi atmosfera din vas,
facilitându-se astfel accesul germenilor şi instalarea unor infecţii secundare.
Se recomandă autoclavarea mediilor şi a apei distilate la *6* :C (ec#ivalent cu
presiunea de o atmosferă. 0urata menţinerii recipientelor cu medii în autoclav depinde
de volumul de lic#id, respectiv de mediul introdus în flacoane. !n general, autoclavarea
durează *> minute, cea mai uzuală fiind cea de 6: de minute. <ediile de cultură care
conţin ingrediente care sunt termolabile (vitamine, #ormoni, aminoacizi, se recomandă a
fi sterilizate la *6::C, timp de 6: de minute. %cest tip de substanţe se recomandă a fi
adăugate mediului (care a fost în prealabil sterilizat prin autoclavare prin filtrare.
Supraautoclavarea, mediilor de cultură determină alterarea proprietăţilor şi calităţilor
acestora, precum şi la deteriorarea raportului ionic, în timp ce subautoclavarea lor duce la
dezvoltarea de colonii de microorganisme care fac ca mediul să devină inutilizabil.
<ediile de cultură lic#ide pot fi sterilizate şi la rece, prin filtrare. !n acest scop, se
recomandă utilizarea filtrelor de sticlă care oferă avanta1ul de a fi refolosite, putându-se
curăţa prin spălare cu acid sulfuric şi lava1 îndelungat, la curent de apă, iar la final, cu apă
bidistilată. &realabil utilizării, nucile filtrante şi vasul de aspiraţie se autoclavează, fiind
înfăşurate în #ârtie sau în folie de aluminiu. Sterilizarea la rece a unor substanţe
termolabile se mai poate realiza şi prin dizolvarea lor în alcool ori în eter etilic, acetonă,
substanţe care se evaporează uşor. Substanţa solidă se va dizolva în apă bidistilată sterilă
şi, în condiţii aseptice se va adăuga mediul de cultură aseptic.
) practică mai puţin utilizată constă în introducerea în mediu a unor substanţe
dezinfectante, ca de e"emplu o"idul de propilen (împiedică dezvoltarea ciupercilor şi a bacteriilor, sulfamidele (au acţiune bacteriostatică, ori antibioticele ca penicilina,
streptomicina sau cloramfenicolul deoarece acestea pot cauza mutaţii, reducându-se şi
organogeneza la nivelul inoculilor şi capacitatea adaptivă a neoplantulelor.
%pa sterilă, de preferinţă bidistilată, se pregăteşte pentru autoclavare fie în vase
7rlenme?er, fie în baloane cu fund plat, sau în borcane înc#ise cu capac. 8asele vor fi
umplute pe trei sferturi. 0opul de vată va fi îmbrăcat, la e"terior, în #ârtie. !ndepărtarea
învelişului de #ârtie se va face în condiţii aseptice, iar anterior turnării apei, se va flambagâtu4 recipientului. 0upă turnarea cantităţii dorite, desc#iderea flaconului se va flamba
din nou, iar dopul de vată (îmbrăcat în tifon va fi trecut de asemenea prin flacără,
urmând ca recipientul să fie acoperit. %ceste operaţiuni se efectuează ori de câte ori se
desc#ide şi se înc#ide un flacon aseptic.
Prepararea mediilor de cultură
7"istă o mare diversitate de medii de cultură care servesc pentru diferite culturi
vegetale. <ediile de cultură sunt fie solide (gelificate, fie lic#ide. &entru asigurarea unui
randament sporit în prepararea mediilor de cultură se folosesc soluţii concentrate, stoc,
separat de@ microelemente, macroelemente, Ae70%, vitamine, aminoacizi şi #ormoni. !n
momentul utilizării, aceste soluţii se diluează la cantităţile recomandate de reţeta utilizată.
Bormonii se folosesc în soluţii stoc pure, nu în amestec. Soluţiile de substanţe organice
vor fi păstrate la frigider, la o temperatură de ;:C, vitaminele în congelator, iar #ormonii
!n cazul celor mai multe e"perienţe, autorii acestora combină diferite tipuri de
reţete clasice, alegând macroelementele după indicaţiile unui autor anume,
macroelementele după un alt autor, iar substanţele organice fie după indicaţiile din
literatura de specialitate, fie potrivit cerinţelor proprii speciei, soiului, e"plantului, etc. 'u
se recomandă modificarea cantităţilor din reţetele de soluţii anorganice, deoarece se produc sc#imbări în privinţa proporţiei diferiţilor compuşi, alterându-se ec#ilibrul ionic
fi"at ca optim din punct de vedere fiziologic, a stabilităţii în timp a pB -ului, etc.
!n preparare soluţiilor stoc, trebuie avute în vedere următoarele@
- 0izolvarea substanţelor se va face numai în apă bidistilată.
- Aiecare compus se va dizolva într-o anumită cantitate de apă (proporţională cu
numărul ingredientelor care urmează să fie amestecate şi cu volumul final al soluţiei
stoc, după care soluţiile obţinute (omogene optic se vor amesteca succesiv, în ordineaindicată în reţetar.
- 0acă substanţa se dizolvă greu, amestecul se va încălzi uşor pe baia de apă (dacă
reţeta prevede această indicaţie, agitând uşor/ flaconul poate fi aşezat şi pe un agitator
magnetic, încălzind moderat plita electrică.
- $egulatorii de creştere vor fi solubilizaţi fiecare în parte, potrivit indicaţiilor din
literatura de specialitate
- !ntrucât autorii e"primă în mod diferit concentraţia soluţiilor, se va avea în
vedere calcularea cantităţii de substanţă care trebuie cântărită pentru a asigura
ec#ivalenţa.
- !n prepararea mediului de bază fiecare compus în parte (fie soluţie stoc, fie
ingredient solid, se adaugă eşalonat, într-o anumită cantitate de apă bidistilată, cantitatea
fiind apreciată proporţional cu volumul final al soluţiei.
- !n funcţie de aparatura din dotare, timpul de autoclavare se va ma1ora cu :,* -
:,6 unităţi de pB, ştiind că are loc de regulă scăderea valorii acestuia în timpul sterilizării
- pB-ul mediului se reglează înainte de adăugarea agarului
- agarul se adaugă mediului de cultură după introducerea celorlalte ingrediente.
&entru solubilizarea acestuia, se procedează la topirea lui fie prin introducerea
recipientului cu mediu într-o baie de apă, agitând conţinutul din când în când, fie prin
autoclavarea agarului într-o anumită cantitate de apă (apreciată în funcţie de volumul
final al soluţiei sau împreună cu ingredientele anorganice, după care în bo"a sterilă este
încorporat în restul amestecului de ingrediente organice, sterilizate prin diferite procedee.
<ediul agarizat, cu agarul lic#efiat, se repartizează în recipiente de cultură (omogenizând
tot timpul amestecul şi la nevoie încălzindu-l, pentru a preîntâmpina solidificarea
acestuia. 5a pB prea acid sau la autoclavare incorectă (la temperaturi prea înalte agarulrămâne în stare lic#idă şi mediul de cultură este nefolosibil, ne mai putând fi nici
recondiţionat. (Cac#iţă - Cosma şi &etrescu, *+>
Compoziţia chimică a mediilor de cultură
7"plantele vegetale sunt menţinute în viaţă prin inocularea şi creşterea lor F in
vitroF pe medii aseptice comple"e din punct de vedere al compoziţiei lor c#imice.
Compuşii anorganici din mediile de cultură
Apa
%pa este cel mai important şi răspândit component al materiei vii, pierderea ei din
ţesuturi ducând la pierderea turgescenţei acestora. !n recipientele care conţin culturi F in
vitroF, în urma procesului de transpiraţie, o parte din apă este pierdută în atmosfera din
recipiente iar o alta se eliberează în mediul de cultură prin evaporare. !n camerele de
creştere neclimatizate se observă procesul de condensare a apei pe pereţii recipientelor.
0escreşterea treptată a gradului de umiditate în recipientele de cultură conduce la
concentrarea substanţelor din mediul de cultură, iar, în timp, substratul gelificat crapă.
)dată cu acest proces, are loc şi o dezec#ilibrare a raportului ionic iar culturile pot intra
în senescenţă şi pot muri. !n acest caz este necesară repicarea culturilor pe medii de
- reprezintă mediul pentru desfăşurarea reacţiilor bioc#imice
- participă la reacţiile de o"idoreducere care stau la baza metabolismului vegetal
(scindarea apei în cursul fotosintezei permite eliberarea #idrogenului necesar pentru
reducerea C)6
- este un agent esenţial în creşterea plantelor
- factor de reglare a temperaturii plantelor
- mecanic/ intervine în turgescenţa celulei (oldor şi colab., *+*
%pa de robinet conţine diferiţi compuşi anorganici (ioni grei şi săruri ori organici
(cloroderivate, detergenţi, microorganisme în descompunere, diferite reziduuri, diverşigermeni ori spori sau particule aflate în suspensie, ceea ce o face improprie utilizării în
prepararea mediilor de cultură. 0in aceste considerente, se recomandă prepararea
mediilor doar cu apă bidistilată, deoarece apa distilată (mai ales cea obţinută în
distilatoarele metalice mai conţine şi ioni (de regulă de cupru, care sunt to"ici pentru
celulele vegetale (Cac#iţă - Cosma şi Sand, 6:::.
Sărurile anorganice
Substanţele anorganice sunt introduse în mediile de cultură sub formă de săruri.Cele mai uzuale săruri utilizate în mediile de cultură sunt@ fosfaţii, azotaţii clorurile şi
sulfaţii de@ Ca, E, <g, <n, %l, Ae, <o, Gn, Cu, 'a, etc.
7lementele c#imice folosite în prepararea mediilor de cultură se împart în@
- <acroelemente@ C, ), B, ', E, Ca, &, S, <g, necesare în cantităţi de ordinul milimolilor
(m<@ (' anorganic cca. 6>- ;: m< sau mai mult, &, <g, Ca şi S în doze de *-9 m<,
respectiv 9:: - ;:: mgHl
- <icroelemente (oligoelemente@ Ae, <n, Gn, %l, , Cu, <o, 'a, Co şi 4, administrate în
concentraţii de ordinul micromolilor (mM), respectiv de cca. :,> - :,:* mg/ l. 0eoarece
anionul de clor este bine tolerat de e"plante, cationii - în numeroase reţete - se
- Auncţionarea normală a mitocondriilor şi a ribozomilor (<g
- Creştere şi dezvoltare (
- Stimularea formării membranei celulare (
- %bsorbţia microelementelor şi a macroelementelor (
- Aormarea nodozităţilor la plante (
- <etabolismul glucidelor (Ca, <g, Cu
- <itoză (Ca
- 'eutralizarea acizilor organici to"ici, de e"emplu acidul o"alic to"ic(Ca
- %ctivarea unor enzime sau comple"e enzimatice (<n (rifu şi ărbat, *++
$aportul dintre Ca şi E contribuie la ec#ilibrul #idric celular. Co măreşte
conţinutul de amidon din tuberculii de cartof, stimulează creşterea membranelor celulare
şi stimulează creşterea plantei, în timp ce4 favorizează creşterea în lungime şi greutate a plantelor (<ilică şi colab.,*+6.
) bună aprovizionarea plantelor cu &, E, <g şi Ca măreşte rezistenţa la ger
(oldor şi colab.,*+*.
Compuşii organici din mediile de cultură
Surse de carbon organic
7"plantele inoculate pe medii aseptice sunt tributare mediului în privinţa sursei decarbon organic, c#iar dacă celulele lor conţin clorofilă. %cest inconvenient se datorează
faptului că ţesuturile crescute Fin vitro" sunt #eterotrofe sau mi"otrofe, pe perioada în
care se află în condiţii artificiale de cultură, pe medii cu adaos de carbon glucidic. 4n
momentul transferării lor în mediul septic şi pe un substrat anorganic, ele redevin
autotrofe.
Glucidele
7ste necesară introducerea în mediul de cultură a carbonului organic sub forma
compuşilor glucidici, deoarece numai glucidele pot fi folosite de către plantele superioare
cu eficienţă energetică ma"imă, ca substrat respirator. &rin degradarea glucidelor, celulele
obţin energia necesară funcţionării, respectiv realizării creşterii şi multiplicării.
!n celulele ţesuturilor verzi cultivate Fin vitroF fotosinteza este slabă. 0e regulă
cloroplastele au capacitatea de a utiliza dio"idul de carbon în sinteza glucidelor, dar
- &rote1ează metaboliţii de acţiunea enzimelor #idrolizante
C Giberelinele
Aito#ormonii din această clasă se folosesc în mai mică măsură. 3n reprezentant al
clasei este D%9, care e"ercită o acţiune specifică asupra alungirii meristemelor apicale,
care în absenţa D%9 prezintă o creştere globulară. 0eoarece giberelinele in#ibă
dediferenţierea celulelor, ele se folosesc în mediile de cultură numai în cazul în care
e"plantul posedă meristeme în structura sa. 7le sunt termolabile şi se sterilizează numai
prin filtrare.
$ Acidul abscisic %A"A&
%cest fito#ormon e"ercită o influenţă in#ibitoare asupra creşterii şi dezvoltării,
fiind implicat în procesele de latenţă la muguri şi la seminţe. 0e asemenea, el in#ibăsinteza acizilor nucleici, grăbeşte îmbătrânirea ţesuturilor (pierderea turgescenţei,
degradarea clorofilelor, accentuarea sintezei carotenilor, căderea frunzelor şi a fructelor
(oldor şi colab., *+*. !n culturile de ţesuturi şi celule se foloseşte în mai mică măsură.
!n ultimul timp este utilizat în culturile de embrioni somatici pentru inducerea intrării
acestora în repaus şi în procese de conservare Fin vitroF. (Cac#iţă - Cosma şi Sand, 6:::
' 'tilena
%cest regulator de creştere se utilizează mai puţin în culturile de ţesuturi şi celule,datorită noutăţii acceptării acesteia ca fito#ormon, a faptului că efectele fiziologice ale ei
sunt multiple şi incomplet cunoscute. 7a îndeplineşte următoarele funcţii@
- 7"ercită un control asupra creşterii permeabilităţii membranelor, precum şi
asupra inducerii senescenţei ţesuturilor
- 4nduce senescenţa ţesuturilor
- 7ste implicată în transportul au"inei
0in cauza stării gazoase în care se află, ea difuzează în recipientele de cultură
fiind imposibil de sterilizat prin autoclavare.
Compuşii fenolici
%cţiunea acestor compuşi c#imici este antagonică celei e"ercitate de substanţele
de creştere, ei oprind acest proces şi provocând c#iar necroza celulelor. 5a e"plantele
cultivate Fin vitroF, compuşii fenolici sunt desorbiţi în mediul de cultură de către celulele
) cultură de e"plante este considerată ca fiind reuşită atunci când inoculul creşte,
se multiplică şi poate fi sub cultivat. Cultura trebuie să se menţină în timp şi să poată fi
direcţionate procesele de morfogeneză, de organogeneză sau de embriogeneză, potrivit
dorinţei operatorului (Cac#iţă - Cosma şi Sand, 6:::.
*nfiinţarea unei culturi aseptice
Asepsizarea materialului +egetal destinat prele+ării de e!plante
Selectarea metodei de asepsizare şi a substanţelor care servesc acestui scop se
realizează în funcţie de calitatea materialului vegetal, estimările bazându-se pe e"ecutarea
unor e"perienţe de tatonare. &roblemele se ridică la nivelul rădăcinilor sau al organelor
subterane (purtătoare de germeni. &e de altă parte, mugurii şi tulpinile, respectiv
ramurile cu lenticele, dar şi organele cu pilozitate ridicată, prezintă inconvenientul
aderării sporilor şi a germeni lor la nivelul formaţiunilor epidermale, sau în rugozităţilede pe suprafaţa organelor iar în momentul introducerii lor în lic#idul dezinfectant, între
suprafaţa epidermei şi soluţie se interpune un strat de aer care împiedică accesibilitatea
dezinfectantului la epidermă. &entru a înlătura acest inconvenient, în soluţia asepsizantă
se pot adăuga câteva picături de Keen 6: sau :. 0ezinfectantul selectat trebuie să fie
suficient de puternic pentru a distruge microorganismele de la suprafaţa organelor, fără a
pătrunde în profunzimea acestora, putând fi în acelaşi timp uşor îndepărtat de pe
materialul biologic prin simple spă4ări repetate cu apă distilată, sterilă.&entru a îndepărta o parte din germenii aderenţi la suprafaţa materialului vegetal,
sau pentru a induce germinarea sporilor, adeseori se indică spălarea prealabilă de durată a
fragmentelor, ori păstrarea materialului vegetal (introdus în săculeţe de tifon amplasate
sub robinet, un timp, sub 1et de apă, sau clătirea acestuia în detergenţi dezinfectanţi
(0omestos materialul biologic fiind apoi trecut prin dezinfectanţii clasici. 7"istă însă şi
cazuri în care agenţii patogeni sunt localizaţi în profunzimea organelor, caz în care se
recomandă efectuarea unui e"amen fitopatologic, în prealabil e"plantării. 3n dezinfectant
frecvent utilizat, cu acţiune rapidă, este alcoolul etilic (în concentraţii de ::, +=: sau
c#iar alcoolul absolut. 0atorită acţiunii coagulante e"ercitată asupra proteinelor şi a celei
liposolubilizante, unele tipuri de organe sau de fragmente vor fi plon1ate în alcool doar 9:
- =: de secunde, fiind apoi introduse în apă sterilă.
!n mod obişnuit, pentru asepsizarea materialului biologic se utilizează soluţii
diluate de hipoclorit de calciu sau de natriu în concentraţii variabile. 0e regulă, se
introduc în dezinfectant fragmente mult mai mari decât viitorul e"plant, pentru a prote1a
celulele inoculului de necrozele provocate de agentul sterilizant. %deseori, seminţele se
sterilizează fie prin imersie în alcool etilic absolut, fie în soluţie de clorură mercurică.
%stfel, la gerbera, această substanţă a fost utilizată cu succes în concentraţie de :.* I sub
* min. (%ntofie şi %ntofie, *++.
%lte substanţe dezinfectante care se utilizează cu rezultate bune sunt@ clorura de
var (de uz sanitar, cloramina, mai rar formolul, permanganatul de potasiu, etc. (Cac#iţă-
Cosma şi Sand, 6:::.
(nocularea)peraţiunea de introducere a inoculului, respectiv a e"plantului sau a unei
porţiuni dintr-o cultură aseptică, pe medii de cultură sterile constituie procedura de
inoculare. )peraţiunea se e"ecută numai în spaţii aseptice special amena1ate, unde piesa
cea mai importantă o constituie bo"a sau #ota cu flu" laminar de aer steril. Se porneşte
ventilatorul #otei astfel încât după apro"imativ *> minute să se poată începe prelevarea şi
inocularea. Alacoanele se flambează înainte de desc#idere, iar instrumentele se
sterilizează prin introducere în alcool şi flambare. 7ste indicat să se lucreze, pe cât posibil, în profunzimea #otei şi să nu se scoată mâinile în afara mesei de lucru, pentru a
se evita contaminarea perimetrului steril cu diferiţi agenţi patogeni din zona nesterilă.
0ezinfectarea mâinilor şi a mesei de lucru se face des, prin ştergere cu un tampon îmbibat
în alcool :I. &entru a reduce factorul de risc, materialul vegetativ asepsizat se
repartizează în capsule &etri de capacitate mică şi, pe măsură ce se epuizează materialul
dintr-o capsulă, desc#idem alta.
0upă dimensionare, se ia cu fineţe e"plantul, cu vârful braţelor pensei (flambată
şi răcită în prealabil şi se inoculează astfel încât să se respecte polaritatea, înfigându-l cu
polul radicular în mediul de cultură şi orientându-l cu polul caulinar în afara mediului.
0acă acest lucru nu este posibil, e"plantul va fi orientat orizontal sau uşor oblic, în
poziţie plagiotropă pe suprafaţa mediului, adâncindu-l uşor în acesta. lnoculii
meristematici este de dorit să fie amplasaţi cu suprafaţa secţionată în contact cu mediul de
cultură. !n cazul culturilor de celule, ori al utilizării mediilor lic#ide, inoculul se depune
printr-o uşoară lovire a vârfului instrumentului de inoculare în porţiunea de desc#idere a
vasului de cultură, e"plantul căzând în mediu. !n cazul culturilor solide sau semisolide,
inoculii trebuie afundaţi uşor în substrat.
!n timpul inoculării eprubeta sau sticla cu mediu solid se recomandă a fi ţinută
orizontal în scopul reducerii semnificative a numărului de infecţii. Seminţele, ca şi
meristemele, se inoculează de preferinţă pe suprafaţa mediului şi nu în profunzimea
acestuia, pentru a preveni apariţia deficitului de o"igen. (&ieri2, *++.
(ncubarea şi creşterea diri,ată a inoculilor
0upă inoculare, flacoanele sunt trecute în camera de creştere (de vegetaţie şi sunt
menţinute într-un regim climatizat. Camera de creştere este destinată păstrării în condiţii
optime a cormofitoinoculilor, în vederea asigurării dezvoltării acestora. Alacoanele cucormofitoinoculi trebuie e"puse la lumină, pe eta1ere metalice iluminate în regim
prestabilit, reglabil, preferabil automatizat. !ncepe acum perioada de incubare şi de
creştere a culturilor, perioadă variabilă ca durată, în funcţie de@
- tipul culturilor
- specie
- natura e"plantelor
- condiţiile din camera de creştere!n această perioadă se urmăreşte - în primul rând - apariţia infecţiilor. )dată
constatat acest fapt, recipientele de cultură infectate trebuie eliminate.
0e regulă, în apro"imativ una sau două săptămâni de la inoculare, la inoculii
proveniţi de la plante ierboase se observă de1a manifestarea proceselor regenerative. 5a
inoculii proveniţi de la plantele lemnoase, procesele de proliferare sunt mult mai lente.
3neori, la scurt timp de la inoculare, mediul de cultură se brunifică, fapt vizibil,
evident, dacă în substratul de cultură nu s-a introdus cărbune activ. !n acest caz se
recomandă transferarea plantulelor pe medii proaspete, caz în care vor demara procesele
regenerative. $ecipientele infectate nu vor fi desc#ise decât după sterilizarea lor prin
autoclavare. &e mediile solide infecţiile pot să apară la suprafaţa mediului, mai aproape
sau mai departe de e"plante, sub forma unor mucegaiuri ori sub forma unor colonii
bacteriene (colorate galben - verzui, roşu ori negru care -în unele cazuri - pot lic#efia pe
alocuri mediile agarizate. 4nfecţiile bacteriene pot învălui inoculul, iar mediul aflat în
imediata vecinătate a acestuia, privit prin transparenţă, prezintă (în 1urul ţesutului
infectat un aspect opalescent. %lteori, în mediile solide, infecţiile apar în profunzimea
acestora, având o formă lenticulară, ovală sau sferică, dovadă a faptului că mediul a fost
sterilizat necorespunzător, sub temperatura de *6::C. !n cazul mediilor lic#ide,
sterilizarea incorectă a acestora cauzează o mărire e"agerată a turbidităţii lor, aspect care
apare la câteva zile după autoclavarea acestora. <ediile infectate în etapa de
preinoculare, nu sunt indicate a fi folosite printr-o reautoclavare, deoarece în ele se
produc sc#imbări de pB şi modificări în ceea ce priveşte calitatea substanţelor organice.
!n mediile lic#ide, infecţiile se propagă mult mai repede decât în culturile efectuate pe
medii solide. 5a culturile lic#ide se va avea în vedere posibilitatea ca turbiditatea să fie o
consecinţă a precipitării unor săruri din cauza preparării incorecte a mediilor. (Cac#iţă -Cosma şi Sand, 6:::.
Subculti+area inoculilor
&entru păstrarea vitalităţii unei culturi, se impune operarea de subculturi şi în
cazul culturilor de celule, precum şi ori de câte ori se semnalează apariţia în culturi a unor
perturbaţii alarmante, de natură variată@ spumare, turbiditate e"agerată - cauzată de o
rapidă multiplicare a celulelor aflate în cultură - o sc#imbare a culorii suspensiilor
celulare (ca un semn de necrozare a celulelor, ele devenind cenuşii sau brune, etc. )cultură de celule este îmbătrânită după cca. trei săptămâni de la iniţierea ei, în funcţie de
specie, de provenienţă şi de condiţiile de cultură. &entru subcultivare sunt necesari doar
câţiva cm9 de mediu din cultura vec#e ce vor fi inoculaţi în cca. *:: - 6>: cm 9 de mediu
proaspăt.
0acă, însă, se doreşte formarea de calus din culturi de celule, la subcultură, câţiva
cm9 de mediu sunt dispersaţi şi etalaţi pe o placă subţire de mediu agarizat, te#nică ce
permite izolarea de linii celulare.
Subcultivarea poate fi necesară din mai multe motive@
- <ediul nutritiv s-a epuizat (fenomene de deficienţă
- <ediul nutritiv s-a uscat (rezultând concentraţii mari de săruri şi de glucide
- 0atorită creşterii, s-a umplut flaconul sau eprubeta