INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL CENTRO INTERDISCIPLINARIO DE INVESTIGACIÓN PARA EL DESARROLLO INTEGRAL REGIONAL UNIDAD SINALOA “Cultivo hiperintensivo de camarón blanco (Litopenaeus vannamei), con cero recambio de agua, utilizando Bacillus licheniformis BCR 4-3 y melaza” TESIS QUE PARA OBTENER EL GRADO DE MAESTRIA EN RECURSOS NATURALES Y MEDIO AMBIENTE PRESENTA JOSÉ ÁVILA LEAL GUASAVE, SINALOA, MEXICO; DICIEMBRE DE 2014
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Cultivo hiperintensivo de camarón blanco Litopenaeus ...
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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
CENTRO INTERDISCIPLINARIO DE INVESTIGACIÓN PARA EL DESARROLLO INTEGRAL REGIONAL
UNIDAD SINALOA
“Cultivo hiperintensivo de camarón blanco (Litopenaeus vannamei), con cero recambio de agua, utilizando Bacillus licheniformis BCR 4-3 y
melaza”
TESIS
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE
MAESTRIA EN RECURSOS NATURALES Y MEDIO AMBIENTE
PRESENTA
JOSÉ ÁVILA LEAL
GUASAVE, SINALOA, MEXICO; DICIEMBRE DE 2014
El trabajo de tesis se desarrolló en el Departamento de Acuacultura del Centro
Interdisciplinario de Investigación para el Desarrollo Integral Regional (CIIDIR),
Unidad Sinaloa, del Instituto Politécnico Nacional (IPN). El presente trabajo fue
apoyado económicamente a través del Proyecto SIP multidisciplinario (con
número de registro 20130852). El alumno José Ávila Leal fue apoyado con una
beca CONACYT con clave CVU 482585.
El autor agradece el apoyo económico brindado por el Instituto Politécnico
Nacional como becario del programa de Beca de Estímulo Institucional de
Formación de Investigadores (BEIFI).
DEDICATORIA
A mis padres, José Ávila Hernández y Julia Leal Espinoza, por haberme dado la vida. A mi esposa Paola y mi hijo José Manuel, quienes son mi razón de vivir. A mis hermanos Verónica, Juan Carlos, José Fernando, Ana, Liliana y Dulce quienes han sido parte importante de mi vida. A todos y cada uno de los que me apoyaron en la realización de este trabajo.
AGRADECIMIENTOS
Primeramente agradecerle a Dios por darme la oportunidad de concluir esta meta. A mi esposa y mi hijo por darme su amor y apoyo incondicional en esta nueva etapa que elegimos juntos, los amo mucho. A mis padres y hermanos por todo su apoyo que me brindaron para que pudiera culminar. A los suegros Urbano y Martha que también fueron pieza importante de este logro. A mis directores de tesis el Dr. Antonio Luna González y el M. en C. Jesús Arturo Fierro Coronado, por la oportunidad que me brindaron de trabajar bajo su dirección. Por su valiosa guía, por su constante y paciente seguimiento compartiendo su tiempo y conocimiento de manera generosa durante el desarrollo del presente trabajo. A mi comité tutorial, formado por el Dr. Héctor Abelardo González Ocampo, el Dr. Ignacio Eduardo Maldonado Mendoza y el Dr. Píndaro Álvarez Ruiz, por sus sabios consejos y sus atinados comentarios, críticas y sugerencias durante la realización de esta investigación. A la Dra. Ruth Escamilla Montes y a la M. en C. Ana Claudia Sánchez Ortiz, por su valiosa colaboración y paciencia al poner a mi disposición sus conocimientos y apoyarme en el laboratorio. A la Biol. Ely Sara López Álvarez y todo el equipo de técnicos que participaron de alguna manera. A todo el personal administrativo por su gran apoyo, Dorín, Faviola, Toño, Nereyda, Ricardo y Celestino. A todos mis amigos y compañeros, Teo, Tomás, Arturo Rubio, Carmen, Viridiana, Carina, Saraí, Blanca, Socko, Pati, Gaby, Anayeli, Violeta, por su amistad y por ese gran equipo que formamos. A Arturo León, Ismael, Toñita, Vanesa, Hiroshima y toda mi generación, quienes hicieron que este proyecto de vida fuera realidad. Con absoluta sinceridad, mi agradecimiento a todos y cada uno de los que mencioné y a todos aquellos que de momento se me escapan, ya que con su aporte hicieron posible este trabajo.
¡Muchas gracias!
I
ÍNDICE GENERAL
ÍNDICE GENERAL .............................................................................................. I
ABREVIATURAS ............................................................................................... V
GLOSARIO ...................................................................................................... VII
ÍNDICE DE FIGURAS ........................................................................................ X
ÍNDICE DE TABLAS ......................................................................................... XI
RESUMEN ....................................................................................................... XII
ABSTRACT ..................................................................................................... XIV
PCR Polymerase chain reaction (Reacción en cadena de la
polimerasa)
% Porcentaje
pH Potencial de iones hidrógeno
proFO Profenoloxidasa
s Segundo
SOD Superóxido dismutasa
TCE Tasa de crecimiento específico
t Tonelada
Tgasa Transglutaminasa
UFC Unidades formadoras de colonias
WSSV White spot syndrome virus (Virus del síndrome de la
mancha blanca)
VII
GLOSARIO
Ácidos nucleicos: Son macromoléculas formadas por la repetición de un
monómero llamado nucleótido, los cuales se unen entre sí por un grupo fosfato,
formando largas cadenas: ADN y ARN (siglas de uso generalizado para expresar
a los ácidos desoxirribonucleico y ribonucleico respectivamente).
Acuicultura: Conjunto de técnicas actividades cuyo objetivo es la cría en
cautiverio de organismos acuáticos (peces, moluscos, crustáceos, reptiles o
algas) cuyo mayor o menor carácter intensivo depende del grado de intervención
del hombre en los ciclos biológicos de los organismos en cuestión.
Amplificación: Se refiere a la producción de copias adicionales de una secuencia
del DNA mediante la técnica de PCR.
Antibiótico: Sustancia producida por un ser vivo o sintetizada artificialmente que
destruye o frena el desarrollo de otras células. Generalmente actúan sobre
bacterias, aunque también actúan contra ciertos hongos y contra virus de gran
tamaño, o contra células animales o vegetales.
Bacilo: Bacteria de forma cilíndrica alargada, como la de un pequeño bastón.
Bacteria: Organismo unicelular procariota, más grande que un virus, que se
presenta en varias formas (esférica, bastón o espiral). Algunas bacterias provocan
enfermedades, pero muchas son benéficas.
Bacterias ácido lácticas: Grupo de bacterias que fermentan carbohidratos dando
ácido láctico como producto principal. Se les emplea en la fabricación de yogur,
quesos, leche fermentada y embutidos.
Ciclo umbral (Cq): Ciclo en el que la fluorescencia de la muestra supera el
umbral. Se calcula en escala logarítmica y es empleado para la cuantificación
relativa de la expresión génica.
Citoplasma basófilo: Termino que se le da a las células que producen proteínas
en forma activa, tiene un núcleo de cromatina laxa con nucleolo evidente, y su
citoplasma debe tener polirribosomas en gran cantidad o un REG y un Golgi
desarrollados.
ADN polimerasa: Enzima que sintetiza una o varias cadenas hijas de ADN a
partir de una cadena complementaria. Puede participar en la reparación o
replicación del ADN.
VIII
Electroforesis: Es un método de laboratorio en el que se utiliza una corriente
eléctrica controlada con la finalidad de separar biomoléculas según su tamaño y
carga eléctrica a través de una matriz gelatinosa.
Estrés: Es una respuesta inespecífica del organismo ante un estímulo
inespecífico (cualquier demanda específica que se le solicite). El estrés es
siempre una respuesta de carácter fisiológico, ante un agente estresor externo o
interno se produce una segregación de hormonas que producirán cambios a
distancia en diversas partes del organismo.
Gen: En biología molecular, segmento de ADN o ARN que normalmente
contiene una región promotora, una región que se transcribe y una región con
una señal de terminación de lectura.
Hemocitos: Son las células sanguíneas de los invertebrados y son producidas
por los tejidos hematopoyéticos.
Hemolinfa: Líquido interno y nutriente de los invertebrados que no contiene
oxígeno. Su composición varía mucho de una especie a otra. Puede ser de
diferentes colores o incluso incolora; los pigmentos pueden proceder de la
alimentación o de los procesos metabólicos y no tienen ninguna función biológica,
ya que el transporte de gases es independiente del aparato circulatorio.
Hospedante: Organismo capaz de contener un agente patógeno.
Patógeno: Es aquel elemento, medio u organismo capaz de producir algún tipo
de enfermedad o daño en el cuerpo de un animal, ser humano o vegetal, cuyas
condiciones estén predispuestas a las ocasiones mencionadas.
PCR: (Siglas del inglés Polymerase Chain Reaction o, en español, reacción en
cadena de la polimerasa). Es la metodología utilizada para producir múltiples
copias de fragmento de ADN molde, anillamiento con oligonucleótidos específicos
y extensión de los mismos por medio de una ADN polimerasa termotolerante.
Prevalencia: Se define como el número de casos de una enfermedad o evento en
una población y en un momento dado.
Primer: Es una cadena de ácido nucleico o de una molécula relacionada que
sirve como punto de partida para la replicación del ADN. Es una secuencia corta
de ácido nucleico que contiene un grupo 3’hidroxilo libre que forma pares de
bases complementarios a una hebra molde y actúa como punto de inicio para la
adición de nucleótidos con el fin de copiar la hebra molde.
IX
Probiótico: Suplemento microbiano formado por un cultivo simple o mixto de
microorganismos seleccionados que son adicionados con el propósito de
manipular las poblaciones bacterianas presentes en los sistemas de producción.
Pool: Agrupación de líquido de diferentes muestras.
RT-PCR: Es una variante de PCR, una técnica de laboratorio comúnmente usada
en biología molecular para generar una gran cantidad de copias de ADN, proceso
llamado “amplificación”. En la RT-PCR, sin embargo una hebra de ARN es
retrotranscripta en ADN complementario (ADNc) usando una enzima llamada
transcriptasa inversa, y el resultado, se amplifica en una PCR tradicional.
Síndrome: Cuadro clínico o conjunto sintomático que presenta alguna
enfermedad con cierto significado y que por sus características posee cierta
identidad.
Supervivencia: Término que hace referencia a vivir después de un determinado
suceso.
Virus: Agente infeccioso celular, con una organización muy simple, formada por
un complejo de proteína, la cápside y un solo tipo de ácido nucleico (ADN o ARN),
carece de metabolismo independiente y solo se puede replicar en una célula
hospedera.
X
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Tasa de crecimiento especifico de los cuatro tratamientos del experimento1…...………………………………………..………………..…..27
Figura 2. Supervivencia de L. vannamei de los cuatro tratamientos del experimento 1…………………………………………………………………28 Figura 3. Concentración de sólidos suspendidos totales, materia orgánica e Inorgánica experimento 1…………………………………………………...31 . Figura 4. Tasa de crecimiento especifico de los dos tratamientos del experimento 2 .....................................................................................................……32
Figura 5. Concentración de sólidos suspendidos totales, materia orgánica e inorgánicaexperimento 2.. ...................................................................... 34
Figura 6. Expresión de los genes del sistema inmune de L. vannamei del bioensayo 2... ....................................................................................... 35
Figura 7. Expresiónde los genes de estrés de L. vannamei del bioensayo 2... .... 36
Figura 8. Expresiónde los genes de digestión de L. vannamei del bioensayo 2... 36
Figura 9. Tasa de crecimiento especifico de los cinco tratamientos del experimento 3 ...................................................................................... 37 Figura 10. Concentración de Biofloc en los cinco tratamientos del experimento 3.. .................................................................................... 40
Figura 11. Expresiónde los genes de digestión de L. vannamei del bioensayo 3.. ........................................................................................................ 41
Figura 12. Expresiónde los genes de estrés de L. vannamei del bioensayo 3.. ... 42
XI
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1. Genes del sistema inmune y controles internos estudiados en L. vannamei ............................................................................................ 21
Tabla 2. Genes de estrés, digestión y controles internos estudiados en L. vannamei .......................................................................................... 22
Tabla 3. Eficiencias de amplificación en el bioensayo 2 ....................................... 23
Tabla 4. Eficiencias de amplificación en el bioensayo 3 ....................................... 23
Tabla 5. Temperatura, salinidad, oxígeno disuelto y pH en el bioensayo 1 .......... 28
Tabla 6. Concentración de amonio, nitritos y nitratos (mg/L) en el bioensayo 1 ... 29
Tabla 7. Temperatura, salinidad, oxígeno disuelto y pH en el bioensayo 2. ......... 31
Tabla 8. Amonio, nitritos y nitratos (mg/L) en el bioensayo 2. .............................. 32
Tabla 9. Temperatura, salinidad, oxígeno disuelto y pH en el bioensayo 3. ......... 37
Tabla 10. Amonio, nitritos y nitratos (mg/L) en el bioensayo 3. ............................ 38
XII
RESUMEN
Se evaluó el efecto de B. licheniformis BCR 4-3 y melaza en la
concentración de desechos nitrogenados y supervivencia, crecimiento, respuesta
al estrés, digestión y sistema inmune de L. vannamei cultivado con alta densidad,
cero recambio de agua y diferentes tasas de alimentación. Se realizaron 3
bioensayos con tratamientos por triplicado. Bioensayo 1 (3.58 ± 0.77 g): I)
Control sin aditivos; II) Melaza (20-80%); III) B. licheniformis BCR 4-3 (1 x 106
UFC/L); IV) B. licheniformis BCR 4-3 (1 x 106 UFC/L) + melaza (20-80%).
Bioensayo 2 (1.77 ± 0.27 g): I) Control sin aditivos; II) B. licheniformis BCR 4-3 (1
x 106 UFC/L) + melaza 80%. Bioensayo 3 (0.72 ± 0.21 g): I) 100% de alimento +
recambio de agua cada 5 días; II) 100% de alimento sin recambio de agua; III)
100% de alimento + B. licheniformis BCR 4-3 (1 x 106 UFC/L) + melaza 80%; IV)
90% de alimento + B. licheniformis BCR 4-3 (1 x 106 UFC/L) + melaza 80%; V)
80% de alimento + B. licheniformis BCR 4-3 (1 x 106 UFC/L) + melaza 80%.
Se realizó un análisis de WSSV (PCR de punto final) al inicio de los
bioensayos y se determinó la tasa de crecimiento específico (TCE), supervivencia,
desechos nitrogenados y sólidos suspendidos totales (SST). También se
cuantificó (qPCR) la expresión relativa de genes de sistema inmune
[(profenoloxidasa, superóxido dismutasa, transglutaminasa y lisozima (bioensayo
2)], genes de estrés [(Hsp70 y Hsp90 (bioensayos 2 y 3)], genes digestivos
[(tripsina, quimotripsina y catepsina B (bioensayos 2 y 3)].
No hubo diferencias significativas entre tratamientos en el crecimiento y
supervivencia de los organismos en los tres bioensayos. Los SST y la materia
orgánica fueron altos pero no hubo un efecto negativo en la supervivencia y el
peso. En el bioensayo 1 no hubo diferencias significativas respecto a la calidad de
agua entre los tratamientos. En los bioensayos 2 (un control) y 3 (dos controles),
la concentración de amonio, nitritos y nitratos fue significativamente diferente
entre los tratamientos y los controles. En el bioensayo 2 no hubo diferencias
significativas en la expresión de proFO, TGasa, Hsp70 y Hsp90. Se observó una
sub-expresión significativa en los genes SOD, Lyz, tripsina y quimotripsina de los
organismos del tratamiento II con aditivos respecto al control sin aditivos. En el
bioensayo 3, la expresión de la catepsina B no mostró cambios significativos pero
XIII
sí los hubo en los genes de tripsina, quimotripsina y Hsp70 donde se observó una
sub-expresión en algunos tratamientos con aditivos respecto a los controles I y/o
II (con recambio y sin recambio de agua, respectivamente).
La bacteria B. licheniformis BCR 4-3 y la melaza disminuyeron el amonio,
los nitritos y los nitratos en los sistemas de cultivo del camarón blanco. Además,
se obtuvieron supervivencias altas y un crecimiento igual al de los camarones de
los grupos control. La sub-expresión de genes relacionados con el sistema
inmune como superóxido dismutasa y lisozima en los tratamientos con B.
licheniformis BCR 4-3 y melaza indica un buen estado de salud de los camarones
cultivados. También se observó una sub-expresión de las enzimas digestivas
(tripsina, quimotripsina y catepsina B en los tratamientos con B. licheniformis BCR
4-3 y la melaza. Sólo los camarones del control II (sin recambio de agua) del
bioensayo 2 estuvieron estresados ya que la expresión de la Hsp70 fue
significativamente mayor en comparación con los demás tratamientos.
XIV
ABSTRACT
The effect of B. licheniformis BCR 4-3 and molasses in the survival, growth,
concentration of nitrogenous wastes, stress response, digestion and immune
system of L. vannamei cultured with high density, zero water exchange and
different feed rates was evaluated. Bioassays with three treatments were
performed in triplicate. Bioassay 1 (3.58 ± 0.77 g): I) Control without additives; II)
Molasses (20-80%); III) B. licheniformis BCR 4-3 (1 x 106 CFU/L); IV) B.
diferencias significativas respecto al crecimiento entre los tratamientos (p>0.05).
Figura 1. Tasa de crecimiento específico de L. vannamei en el bioensayo 1. Tratamientos: I) Control sin aditivos; II) Melaza (20-80%); III) B. licheniformis BCR 4-3 (1 x 106 UFC/L); IV) B. licheniformis BCR 4-3 (1 x 106 UFC/L) + melaza (20-80%). Se indican los promedios ± EE.
0.00
0.50
1.00
1.50
2.00
2.50
3.00
3.50
I II III IV
TCE
(%/d
)
Tratamientos
28
7.1.3. Supervivencia
La supervivencia al final del bioensayo se muestran en la Figura 2, donde
el tratamiento I) (control) muestra una supervivencia del 96.66%. El tratamiento II)
mostró una supervivencia de 83.33%. El tratamiento III) tuvo una supervivencia de
93.33%. En el tratamiento IV) se obtuvo una supervivencia de 100%.
Figura 2. Supervivencia de L. vannamei en el bioensayo 1. Tratamientos: I) Control sin aditivos; II) Melaza (20-80%); III) B. licheniformis BCR 4-3 (1 x 106 UFC/L); IV) B. licheniformis BCR 4-3 (1 x 106 UFC/L) + melaza (20-80%). Se indican los promedios ± EE.
7.1.4. Parámetros fisicoquímicos
Los parámetros fisicoquímicos (Tabla 5) se mantuvieron dentro de los
intervalos óptimos para el cultivo de camarón blanco (Brock & Main, 1994). La
temperatura mostró valores promedio de 26 °C. La salinidad se mantuvo en el
intervalo de 30.1 y 31‰. El oxígeno disuelto se mantuvo entre 5.19 y 5.49 mg/L.
El pH mostró valores promedio entre 8.27 y 8.36.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
I II III IV
Sup
erv
ive
nci
a (%
)
Tratamientos
29
Tabla 5. Temperatura, salinidad, oxígeno disuelto y pH en el bioensayo 1.
Tratamientos ºC ‰ OD (mg/L) pH
I
26.66 ± 1.89 30.22 ± 0.64 5.49 ± 0.63 8.29 ± 0.11
II
26.44 ± 1.85 30.24 ± 0.66 5.29 ± 0.55 8.27 ± 0.10
III
26.26 ± 1.96 30.19 ± 0.55 5.36 ± 0.41 8.36 ± 0.09
IV
26.38 ± 1.93 30.11 ± 0.32 5.19 ± 0.56 8.30 ± 0.08
Intervalo óptimo 23-30 15-35 4.0-10.0 8.1-9.0
Tratamientos: I) Control sin aditivos; II) Melaza (20-80%); III) B. licheniformis BCR
4-3 (1 x 106 UFC/L); IV) B. licheniformis BCR 4-3 (1 x 106 UFC/L) + melaza (20-
80%). Se indican los promedios ± DE.
7.1.5 Parámetros de calidad de agua (amonio, nitritos y nitratos)
Durante el bioensayo 1, la concentración promedio de amonio mostró
valores entre 1.281 y 2.066 mg/L, por encima del límite permitido (0.1-1.0). El
tratamiento I) (control) mostró una concentración de amonio de 2.066 ± 1.07 mg/L,
el tratamiento II) de 1.679 ± 0.85 mg/L, el tratamiento III) de 1.736 ± 0.98 mg/L y el
IV) de 1.281 ± 0.86 mg/L. Los valores de nitritos estuvieron dentro del límite
permitido, por debajo de los 0.5. Por tratamiento se encontró que en el tratamiento
I) la concentración fue de 0.004 ± 0.19 mg/L, II) 0.003 ± 0.28 mg/L, III) 0.034 ± 0.22
mg/L y IV) 0.006 ± 0.19 mg/L. En cuanto a los nitratos, estuvieron dentro del
intervalo óptimo. El tratamiento I) presentó 0.058 ± 0.01 mg/L, el tratamiento II)
0.045 ± 0.01 mg/L, el III) 0.160 ± 0.06 mg/L y el IV) 0.231 ± 0.10 mg/L (Tabla 6).
30
Tabla 6. Concentración de amonio, nitritos y nitratos (mg/L) en el bioensayo 1.
significativas entre los tratamientos (p>0.05) (Fig. 3).
31
Figura 3. Sólidos suspendidos totales y concentración de materia orgánica e inorgánica en el bioensayo. Tratamientos: I) Control sin aditivos; II) Melaza (20-80%); III) B. licheniformis BCR 4-3 (1 x 106 UFC/L); IV) B. licheniformis BCR 4-3 (1 x 106 UFC/L) + melaza (20-80%). Se indican los promedios ± EE de cada tratamiento.
7.2. Bioensayo 2: Efecto de B. licheniformis BCR 4-3 en el crecimiento,
supervivencia, estrés, digestión y sistema inmune de L. vannamei cultivado
con alta densidad y cero recambio de agua
7.2.1. Incidencia inicial de WSSV
Los resultados obtenidos mediante la PCR anidado indicaron que un 60%
de los organismos experimentales estaban infectados con WSSV al inicio del
experimento.
7.2.2. Tasa de crecimiento específico
La TCE (%/d) en el control y en tratamiento fueron las siguientes: I) 2.97 ±
0.14; II) 2.69 ± 0.38 (Fig. 4). No hubo diferencias significativas respecto al
crecimiento entre los tratamientos (p>0.05).
0.000
0.100
0.200
0.300
0.400
0.500
0.600
0.700
I II III IV
Sólid
os
susp
en
did
os
tota
les,
Mat
eri
a
org
ánic
a e
ino
rgán
ica
(mg/
L)
Tratamientos
Sólidos suspendidos totales
Materia inorgánica
Materia orgánica
32
Figura 4. Tasa de crecimiento específico de L. vannamei en el bioensayo 2. Tratamientos: I) Control sin aditivos; II) B. licheniformis BCR 4-3 (1 x 106 UFC/L) + melaza 80%. Se indican los promedios ± EE.
7.2.3. Supervivencia
La supervivencia al final del bioensayo fue del 100% en ambos
tratamientos.
7.2.4. Parámetros fisicoquímicos
Los parámetros fisicoquímicos (Tabla 7) se mantuvieron dentro de los
intervalos óptimos para el cultivo de camarón blanco, excepto el oxígeno disuelto
según (Brock & Main, 1994).La temperatura mostró intervalos de 23 y 24 °C. La
salinidad se mantuvo en 29.81 y 29.9 ‰. El oxígeno disuelto se mantuvo entre
3.53 y 3.69 mg/L. El pH mostró valores promedio de entre 8.33 y 8.43.
Tabla 7. Temperatura, salinidad, oxígeno disuelto y pH en el bioensayo 2.
Tratamientos ºC ‰ OD (mg/L) pH
I
23.71 ± 3.67 29.81 ± 1.96 3.53 ± 0.49 8.43 ± 0.10
II
24.20 ± 3.44 29.90 ± 1.86 3.69 ± 0.65 8.33 ± 0.12
Intervalo óptimo
23-30 15-35 4.0-10.0 8.1-9.0
Tratamientos: I) Control sin aditivos; II) B. licheniformis BCR 4-3 (1 x 106 UFC/L) +
melaza 80%. Se indican los promedios ± DE.
0.00
0.50
1.00
1.50
2.00
2.50
3.00
3.50
I II
TCE
(%/d
)
Tratamientos
33
7.2.5 Parámetros de calidad de agua (amonio, nitritos y nitratos)
Durante el bioensayo 2 la concentración promedio de amonio mostró
valores entre 0.660 y 5.479 mg/L, donde el control estuvo por encima del límite
permitido (0.1-1.0). El tratamiento I (control) mostró una concentración de amonio
de 5.479 ± 5.50mg/L y el tratamiento II de 0.660 ± 0.70 mg/L. Los valores de
nitritos estuvieron dentro del límite permitido, por debajo de 0.5 en los tratamientos
I 0.061 ± 0.08 mg/L y II 0.005 ± 0.003 mg/L. En cuanto a los nitratos, estuvieron
dentro del intervalo óptimo. El tratamiento I presentó 0.170 ± 0.039 mg/L y el
tratamiento II 0.043 ± 0.02 mg/L. Hubo diferencias significativas entre tratamientos
en los tres parámetros (p<0.05) (Tabla 8).
Tabla 8. Amonio, nitritos y nitratos (mg/L) en el bioensayo 2.
Tratamientos: I) Control sin aditivos; II) B. licheniformis BCR 4-3 (1 x 106 UFC/L) +
melaza 80%. Se indican los promedios ± DE.
7.2.6 Sólidos suspendidos totales, materia orgánica e inorgánica
La concentración final de los SST fluctuó entre 0.723 y 1.211 mg/L. El
tratamiento I (control) mostró una concentración de 0.723 ± 0.04mg/L y el
tratamiento II de 1.211 ± 0.28 mg/L. El promedio de materia orgánica varió entre
0.386 y 0.668 mg/L, mientras que la materia inorgánica estuvo entre 0.337 y 0.543
mg/L (Fig. 5).
b
a
b
a a
b
34
Figura 5. Sólidos suspendidos totales y concentración de materia orgánica e inorgánica del bioensayo 2. Tratamientos: I) Control sin aditivos; II) B. licheniformis BCR 4-3 (1 x 106 UFC/L) + melaza 80%. Se indican los promedios ± EE.
7.2.7 Análisis de genes
Los resultados muestran que la expresión de los genes
profenoloxidasa,transglutaminasa, Hsp70 y Hsp90 no fue significativamente
diferente entre los tratamientos (p>0.05). Por otro lado, la expresión de los genes
superóxido dismutasa, lisozima, tripsina y quimotripsina fue significativamente
mayor en el tratamiento II respecto al tratamiento I (Figs. 6, 7 y 8).
0.000
0.200
0.400
0.600
0.800
1.000
1.200
1.400
1.600
I II
Sólid
os
susp
en
did
os
tota
les,
Mat
eri
a
org
ánic
a e
ino
rgán
ica
(mg/
L)
Tratamientos
Sólidos suspendidostotales
Materia orgánica
Materia Inorgánica
35
Figura 6. Expresión relativa de los genes del sistema inmune de L. vannamei en el bioensayo 2. Tratamientos: I) Control sin aditivos; II) B. licheniformis BCR 4-3 (1 x 106 UFC/L) + melaza 80%. Se indican los promedios ± EE.
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
I II
Exp
resi
ón
re
lati
va d
e S
OD
Tratamientos
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
I II
Exp
resi
ón
re
lati
va d
e T
Gas
a
Tratamientos
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
I II
Exp
resi
ón
re
lati
va d
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Tratamientos
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
I II
Exp
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ón
re
lati
va d
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iso
zim
a
Tratamientos
a a
b
b
36
Figura 7. Expresión relativa de genes de estrés de L. vannamei en el bioensayo 2. Tratamientos: I) Control sin aditivos; II) B. licheniformis BCR 4-3 (1 x 106 UFC/L) + melaza 80%. Se indican los promedios ± EE.
Figura 8. Expresión relativa de genes digestivos de L. vannamei en el bioensayo 2. Tratamientos: I) Control sin aditivos; II) B. licheniformis BCR 4-3 (1 x 106 UFC/L) + melaza 80%. Se indican los promedios ± EE.
0
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1
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I II
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Tratamientos
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I II
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0
Tratamientos
0
0.2
0.4
0.6
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I II
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a
Tratamientos
0
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I II
Exp
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ón
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qu
imo
trip
sin
a
Tratamientos
a
a
b
b
37
7.3 Bioensayo 3: Efecto de B. licheniformis BCR 4-3 en el crecimiento,
supervivencia, estrés y digestión de L. vannamei cultivado con alta
densidad, cero recambio de agua y diferentes tasas de alimentación.
7.3.1. Incidencia inicial de WSSV
Los resultados obtenidos mediante la PCR anidado muestran que el 60%
de los organismos experimentales estaban infectados con WSSV al inicio del
experimento.
7.3.2. Tasa de crecimiento específico
La TCE (%/d) en los tratamientos del experimento 3 fue como sigue: I) 5.73 ±
hubo diferencias significativas respecto al crecimiento entre los tratamientos
(p>0.05).
Figura 9. Tasa de crecimiento específico de L. vannamei en el bioensayo 3. Tratamientos: I) 100% de alimento + recambio de agua cada 5 días; II) 100% de alimento sin recambio de agua; III) 100% de alimento + B. licheniformis BCR 4-3 (1 x 106 UFC/L) + melaza 80%; IV) 90% de alimento + B. licheniformis BCR 4-3 (1 x 106 UFC/L) + melaza 80%; V) 80% de alimento + B. licheniformis BCR 4-3 (1 x 106 UFC/L) + melaza 80%. Se indican los promedios ± EE.
0.00
1.00
2.00
3.00
4.00
5.00
6.00
7.00
I II III IV V
TCE
(%/d
)
Tratamientos
38
7.3.3. Supervivencia
La supervivencia al final del bioensayo 3 fue del 100% en todos los
tratamientos.
7.3.4. Parámetros fisicoquímicos
Los parámetros fisicoquímicos registrados en los tratamientos del
bioensayo 3 (Tabla 9) se mantuvieron dentro de los intervalos óptimos para el
cultivo de camarón blanco (Brock & Main, 1994).
Tabla 9. Temperatura, salinidad, oxígeno disuelto y pH en el bioensayo 3.
Tratamientos: I) 100% de alimento + recambio de agua cada 5 días; II) 100% de alimento sin recambio de agua; III) 100% de alimento + B. licheniformis BCR 4-3 (1 x 106 UFC/L) + melaza 80%; IV) 90% de alimento + B. licheniformis BCR 4-3 (1 x 106 UFC/L) + melaza 80%; V) 80% de alimento+ B. licheniformis BCR 4-3 (1 x 106 UFC/L) + melaza 80%. Se indican los promedios ± DE.
7.3.5. Parámetros de calidad de agua (amonio, nitritos y nitratos)
Durante el bioensayo la concentración promedio de amonio mostró valores
entre 0.739 y 3.249 mg/L. El tratamiento I mostró una concentración de amonio
dentro de los niveles óptimos. En contraste, el resto de los tratamientos estuvieron
por encima de lo recomendado. Los valores de nitritos y nitratos estuvieron dentro
del límite permitido (Tabla 10). Se encontraron diferencias significativa en los tres
parámetros entre los tratamientos con respecto al control I) con recambio de agua
(p<0.05)
39
Tabla 10. Amonio, nitritos y nitratos (mg/L) en el bioensayo 3.
Tratamientos: I) 100% de alimento + recambio de agua cada 5 días; II) 100% de alimento sin recambio de agua; III) 100% de alimento + B. licheniformis BCR 4-3 (1 x 106 UFC/L) + melaza 80%; IV) 90% de alimento + B. licheniformis BCR 4-3 (1 x 106 UFC/L) + melaza 80%; V) 80% de alimento + B. licheniformis BCR 4-3 (1 x 106 UFC/L) + melaza 80%. Se indican los promedios ± DE.
7.3.6. Determinación de bioflocs
La concentración final de bioflocs varió entre 1.09 y 21.50 mL/L. El
tratamiento I mostró una concentración de 1.09 ± 0.43 mL/L, tratamiento II de
21.14 ± 2.21 mL/L, tratamiento III 20.08 ± 3.77 mL/L, tratamiento IV 21.50 ± 3.23
mL/L y el tratamiento V 18.34 ± 3.12 mL/L (Fig. 10).
b
a
a
a a
a
c
c
c
b
c
d
b
c
d
40
Figura 10. Concentración de bioflocs en el bioensayo 3. Tratamientos: I) 100% de alimento + recambio de agua cada 5 días; II) 100% de alimento sin recambio de agua; III) 100% de alimento + B. licheniformis BCR 4-3 (1 x 106 UFC/L) + melaza 80%; IV) 90% de alimento + B. licheniformis BCR 4-3 (1 x 106 UFC/L) + melaza 80%; V) 80% de alimento + B. licheniformis BCR 4-3 (1 x 106 UFC/L) + melaza 80%. Se indican los promedios ± EE.
7.3.7. Análisis de genes
La expresión relativa del gen de Catepsina B no presentó diferencias
significativas (p>0.05) entre los tratamientos. Por otro lado, la expresión de los
genes de tripsina, quimotripsina y Hsp70 mostraron diferencias significativas en los
tratamientos 2, 3, 4 y 5 respecto al tratamiento I (control con recambio de agua)
(Figs. 11 y 12).
0
5
10
15
20
25
I II III IV V
Bio
flo
cs (
mL/
L)
Tratamientos
a
b b
b
b
41
Figura 11. Expresión relativa de genes digestivos de L. vannamei en el bioensayo 3. Tratamientos: I) 100% de alimento + recambio de agua cada 5 días; II) 100% de alimento sin recambio de agua; III) 100% de alimento + B. licheniformis BCR 4-3 (1 x 106 UFC/L) + melaza 80%; IV) 90% de alimento + B. licheniformis BCR 4-3 (1 x 106 UFC/L) + melaza 80%; V) 80% de alimento + B. licheniformis BCR 4-3 (1 x 106 UFC/L) + melaza 80%. Se indican los promedios ± EE.
0
0.5
1
1.5
2
2.5
I II III IV V
Exp
resi
ón
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lati
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B
Tratamientos
0
0.5
1
1.5
2
2.5
I II III IV V
Exp
resi
ón
re
lati
va d
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trip
sin
a
Tratamientos
0
0.5
1
1.5
2
I II III IV V
Exp
resi
ón
re
lati
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trip
sin
a
Tratamientos
a
c
abc abc
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a ab
ac
c bc
42
Figura 12. Expresión relativa del gen de estrés de L. vannamei en el bioensayo 3.Tratamientos: I) 100% de alimento + recambio de agua cada 5 días; II) 100% de alimento sin recambio de agua; III) 100% de alimento + B. licheniformis BCR 4-3 (1 x 106 UFC/L) + melaza 80%; IV) 90% de alimento + B. licheniformis BCR 4-3 (1 x 106 UFC/L) + melaza 80%; V) 80% de alimento + B. licheniformis BCR 4-3 (1 x 106 UFC/L) + melaza 80%. Se indican los promedios ± EE.
0
0.5
1
1.5
2
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3
I II III IV V
Exp
resi
ón
re
lati
va d
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0
Tratamientos
a
b ab ab
ab
43
8. DISCUSIÓN
Bioensayos 1 y 2 (artículo 1)
El cultivo superintensivo de camarón con cero o mínimo recambio de agua
es amigable con el medio ambiente ya que previene las enfermedades en el
mismo sistema y en las poblaciones de camarón silvestre. Además, se evita la
descarga de aguas ricas en nutrientes a los cuerpos de agua costeros
(Wasielesky et al., 2006). Por otro lado, con cero o escaso recambio de agua se
promueve la formación de bioflocs (autótrofos o heterótrofos). La producción de
bioflocs en sistemas heterótrofos se puede aumentar gracias al incremento en la
proporción C/N en los sistemas de cultivo (Avnimelech, 2006; Crab et al., 2007).
En el presente estudio, además de no recambiar agua y aplicar melaza
para permitir la formación de bioflocs, se aplicaron bacterias benéficas (B.
licheniformis BCR 4-3) en algunos de los sistemas de cultivo de camarón para
disminuir la concentración de desechos nitrogenados. Según Villamil et al. (2009),
la adición de probióticos permite el establecimiento de la microbiota intestinal e
incrementa el peso, la supervivencia, la resistencia a infecciones y la respuesta
inmune de los organismos cultivados. Además, los probióticos mejoran la calidad
de agua.
En el primer bioensayo no hubo diferencias significativas en el peso de los
organismos y la supervivencia fue alta. Sin embargo, el mejor tratamiento (100%
de supervivencia y la mayor TCE) fue donde se aplicó B. licheniformis BCR 4-3 y
melaza. Es importante señalar que la calidad del agua de los cultivos intensivos
no sólo está determinada por la composición de la comunidad microbiana sino
también por parámetros fisicoquímicos de la misma tales como salinidad,
temperatura, concentración de oxígeno y pH, así como otros factores estocásticos
que pueden favorecer la entrada y proliferación de algunos microorganismos
(Verschuere et al., 1997; 2000a; Villamil et al., 2003). En el bioensayo 1 los
parámetros mencionados estuvieron dentro de los límites permitidos para el
cultivo de camarón (Brock & Main, 1994). El objetivo principal de la utilización de
probióticos fue disminuir el amonio y los nitritos. Al respecto, no se presentaron
diferencias significativas entre los tratamientos en la concentración de nitritos y
nitratos, los cuales estuvieron dentro de los límites óptimos para el cultivo de
camarón. Por otro lado, en la concentración de amonio tampoco se observaron
diferencias significativas. Sin embargo, el amonio estuvo por encima del intervalo
44
permitido en todos los tratamientos, sin embargo se observó una reducción de
aproximadamente 40% en el tratamiento IV (bacilos más melaza) respecto al
control, lo que concuerda con lo reportado por Weber et al. (2013), quien utilizó
tres cepas de Bacillus sp. en un cultivo de camarón para reducir el amonio entre
un 50 y 87%.
Los sistemas de cultivo hiperintensivos se caracterizan por generar
grandes cantidades de sólidos suspendidos totales (SST) y lodos en el fondo de
los sistemas de cultivo (Torres-Beristain, 2005; Vinatea et al., 2010; Coyle et al.,
2011). Ray et al. (2010) mencionan que las concentraciones altas de SST pueden
ocluir las branquias de los camarones y afectar su crecimiento. En el presente
estudio la mayor concentración SST (523 mg/L) se dio en el tratamiento con
melaza y bacilos pero estuvo dentro del intervalo permitido ya que según
Schveitzer et al. (2013) la concentración de TSS en los sistemas de cultivo debe
estar entre 400 y 600 mg/L. Por otro lado, el control de los SST es importante ya
que el aumento de los SST conlleva un aumento de la materia orgánica, la cual,
según Ferreira et al. (2011) promueve el desarrollo de especies del género Vibrio,
muchas de las cuales son potencialmente patógenas.
En el segundo bioensayo se tomó el mejor tratamiento (B. licheniformis
BCR 4-3 (1 x 106 UFC/L) + 80% melaza) del primer bioensayo. No hubo
diferencias significativas entre tratamientos respecto al crecimiento y la
supervivencia (100 %). La salinidad y el pH estuvieron dentro de los valores
óptimos en los dos tratamientos (Brock & Main, 1994); sin embargo, el oxígeno
disuelto y la temperatura estuvieron por debajo del intervalo óptimo, lo que implica
cierto grado de estrés. Respecto a los desechos nitrogenados (amonio, nitritos y
nitratos), éstos disminuyeron significativamente en el tratamiento II (bacilos más
melaza) respecto al control, lo que concuerda con lo reportado por Weber et al.
(2013), quien utilizó tres cepas de Bacillus sp. en un cultivo de camarón para
reducir el amonio. Silva et al. (2013) mencionan que el aumento considerable del
nitrógeno y el fósforo no son asimilables por el camarón (L. vannamei) y son
tóxicos. Confirmando lo anterior, Chen et al. (2012) mencionan que una alta
concentración de desechos nitrogenados interfiere con la respuesta inmune del
camarón (L. vannamei).
En los sólidos suspendidos totales, materia orgánica e inorgánica no hubo
diferencias significativas, pero la concentración final de los SST fue 0.723 (control)
45
y 1211 mg/L (tratamiento II), muy por arriba de las concentraciones permitidas
(400-600 mg/L) según Schveitzer et al. (2013), quienes mencionan que en
concentraciones por encima de 800 mg/L, observaron una mortalidad alta en L.
vannamei cultivado en un sistema hiperintensivo. De manera similar, Hopkins et
al. (1993) mencionan que en cultivos intensivos sin intercambio de agua, la alta
concentración de sólidos se relaciona con la mortalidad de los camarones por el
aumento en la oclusión de las branquias.
En el segundo bioensayo no hubo diferencias significativas entre los
tratamientos en la expresión de los genes profenoloxidasa y transglutaminasa.
Por otro lado, se observó una sub-expresión significativa en los genes SOD y
lisozima en el tratamiento II respecto al control. Los resultados contrastan con los
reportados por Kim et al. (2014), quienes estudiaron, en un sistema
hiperintensivo, la expresión de seis genes del sistema inmune en postlarvas de
camarón blanco, incluido el de la profenoloxidasa. Los autores mencionan que los
parámetros fisicoquímicos y la concentración de SST estuvieron dentro de los
intervalos óptimos para el cultivo de camarón blanco. En el trabajo mencionado,
se encontró un aumento significativo en los niveles de expresión del ARNm y
atribuyen el aumento a los bioflocs, particularmente a la gran cantidad de
bacterias presentes en los mismos y que sirven de alimento para el camarón. La
pared celular de microorganismos como bacterias y levaduras contiene moléculas
(lipopolisacáridos, peptidoglucanos y betaglucanos) que pueden activar el sistema