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Cultivo de células y celulas 3t3

Trabajo Práctico n°1: Cultivo celular.

21 DE JULIO DE 2014

Laboratorio de Parasitología Molecular

Antofagasta

Universidad de Antofagasta

Fca. Ciencias del Mar y Recursos Biológicos.

Marco Teórico.

Cultivo Celular.

Se entiende por cultivo celular, el conjunto de técnicas que permiten el mantenimiento de células in vitro, preservando al máximo sus propiedades fisiológicas, bioquímicas y genéticas. Bajo unas condiciones adecuadas (medios y superficies de cultivo, presencia de antibióticos, asepsia ambiental, instrumental adecuado, etc.) se consiguen mantener clones de un solo tipo de células de origen animal y/o vegetal bien definidos a partir de cada cultivo celular. Debido a que se facilita su manipulación, se puede alcanzar una mayor viabilidad en las células lo que, hace que los cultivos celulares sean óptimos para trabajos de investigación básica, estudios de ingeniería genética y/o producción de compuestos biológicos como, por ejemplo, vacunas virales (Molecular Biology of the Cell ed. 2002).

Las técnicas de cultivo celular son indispensables en la mayoría, si no en todas las disciplinas de ciencias de la vida hasta la fecha, sin embargo se carece de modelos de cultivo celular apropiados, esto provoca que el desarrollo científico se vea obstaculizado (Genersch et al 2013).

El cultivo de tejidos se desarrolló a partir de los últimos años del siglo XIX como una continuación de las técnicas de la embriología. Wilhem Roux mantuvo en el año 1885 células de embrión de pollo en solución salina durante unos días. El zoólogo americano R.G. Harrison es considerado el iniciador de los cultivos de tejidos animales, en 1907. Harrison fue el primer autor que empleó técnicas in vitro para el estudio de fenómenos in vivo, realizando cultivos de médula espinal embrionaria de anfibios. Pudo observar el crecimiento de los axones de los neuroblastos, y estableció que el axón se formaba por expansión a partir del cuerpo neuronal y no por fusión de una cadena de células. El cultivo se realizaba en una gota de linfa del anfibio que colgaba de un cubreobjetos sobre una cámara sellada.

Células 3T3:

Corresponden a células de fibroblasto de embrión de ratón albino, fueron descubiertas en 1962 en la escuela de medicina de la universidad de New York. 3T3 significa células transferidas cada tres días en inóculos de 300.000 células. El cultivo tiene una apariencia similar a los adoquines. (Jainchill, J.1969).

Las células crecen rápidamente en monocapa en un medio, pero frenan su crecimiento cuando se encuentran confluentes, aproximadamente a la concentración de 106 células por placa, por esta razón se dice que las células 3T3 son muy proclives a la inhibición por contacto célula-célula. (Holley, R. W., & Kiernan, J. A. 1968)

Todaro, Green y Lazar realizaron un experimento en el cual la inhibición ya no era un problema (Todaro GJ, Lazar GK, Green H ,1965), utilizando suero bobino.

Estas células originalmente eran muy propensas a la inhibición de la propagación celular al contacto con temazepam (benzodiacepina), sin embargo la línea celular que se creó a partir de ellas ya no es inhibida por esto. Sigue siendo, de todos modos, sensible al virus del sarcoma y de la leucemia. (Jainchill, J.1969)

Esta línea celular es ideal para estudios que necesiten transfección usando ADN. Como ejemplo este tipo de procedimiento se utiliza con el fin de detectar oncogenes (Di Fiore P. 1987).

Figura 1: células 3T3 con crecimiento en una baja y alta densidad.Células LLC-MK2:El cultivo de células de riñón de mono en monocapa preparadas utilizando el método de la tripsina, es utilizado extensivamente en muchos laboratorios. Esta popularidad se debe al amplio espectro de agentes virales que pueden propagarse en estos cultivos, así como también la relativa facilidad con la cual pueden prepararse grandes números de cultivos. Estas células cuando han sido recientemente tripsinizadas se adhieren al recipiente y se vuelven menos sensibles a agentes tóxicos, tales como, cambios del medio, fluctuaciones de temperaturas y otros factores o condiciones adversas. Estas características la han potenciado el uso de estas células de tejidos de riñón (Hull et al 1962).

Figura 2: células LLC-MK2 con crecimiento en una baja y alta densidad.

Trichomonas vaginalis.

Son protozoos anaerobios y flagelados que miden alrededor de 10 μm de largo y 7 de ancho que presentan un gran núcleo y un aparato de Golgi, sin embargo no posee mitocondria, peroxisomas.

Su crecimiento es optimizado a los 37º C y un pH de 6,0 a 6,3, sin embargo puede sobrevivir hasta pH igual a 7, o un pH no menor a 5.

La vagina y sus secreciones proveen de los nutrientes necesarios para que este organismo prolifere, en conjunción con la digestión de bacterias para complementar la necesidad de nutrientes.

Su metabolismo consiste en la fermentación del piruvato a acetato, malato, H2 y CO2 en un proceso dependiente de ADP, Pi, Mg+2 y succinato. (Steinbüchel, A., & Müller, M. 1986)

Es la causa más común de vaginitis y enxocervicitis, T. vaginalis se adhiere a las células epiteliales de las mucosas utilizando adhesinas en su membrana (Heine, p., & Mcgregor, j. a. 1993)

Muchas de las infecciones son asintomáticas, casi un 88% no son diagnosticadas y un 29% son mal diagnosticadas como infecciones por T. vaginalis. (Fouts, A. C., & Kraus, S. J. 1980)

Las infecciones pueden persistir por largos periodos de tiempo o de por vida, en pacientes que no reciben un tratamiento adecuado o no reciben ningún tipo de tratamiento.

Este protozoo puede aumentar las posibilidades de contraer el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) (Public Health Agency of Canada, 2010) .se piensa que esto se debe a que T. vaginalis aumenta la cantidad de células infectadas con el virus o que son susceptibles a ser infectadas, como los linfocitos y los macrófagos. (Laga, M., Nzila, N., & Goeman, J. 1991)

La exposición de células que crecen en monocapa a T. vaginalis, tales como células vaginales y urigenitales (Hela) o riñón de mono (Vero), resultan en la disrupción de la monocapa. Las células teñidas con azul Tripán que son extraídas luego de ser expuestas al patógeno presentan una notablemente menor viabilidad. (Alderete, J. F., & Pearlman, E. 1984).

Figura 3: representación 3D de T. vaginalis

Monocitos THP-1:

THP-1 es una línea celular de monocitos humanos derivados de pacientes que padecen de leucemia monocitica aguda. Estas células son utilizadas para poner a prueba las líneas celulares de leucemia en el análisis inmunocitoquímico de la interacción proteína-proteína, y la inmunohistoquímica. La morfología de estas células es que se presentan de manera redonda, grandes y en una sola célula y son células no adherentes. Esta línea celular puede proporcionar un cultivo continuo cuando se cultivan en suspensión en un medio RPMI + 10% deFBS + 2 mM de L-glutamina, el tiempo medio de duplicación se alcanza entre las 35 a 50 horas, las condiciones óptimas para estas células es que deben cultivarse a 37°C con niveles de CO2 del 5% además no deben superar las 9x10^5 células/mL (Tsuchiya et al 1980).

Figura 4: células THP-1 con crecimiento en una baja y alta densidad.

Metodología.

Descongelamiento y cultivo de células LLCMK2.

Materiales:

Medios temperados 37°C. Tubo con 9ml de medio RPMI. Frasco T-25. Baño con agua a 37°C. Pipeteador. Pipetas estériles. Centrífuga. Células LLC-MK2.

Procedimiento.

1. Se tomó el vial con células LLC-MK2 desde su almacenamiento de -70°C desde un tanque de nitrógeno líquido.

2. Se dejó el vial en un baño a 37°C hasta su descongelamiento.3. Se transfirió el contenido del vial a un tubo falcón que contenía 9 mL de medio RPMI.4. Se re-suspendió suavemente el contenido del tubo, con el fin de disgregar las células, se

transfirió una gota a un porta objeto.5. Se centrifugo el tubo a 1800 rpm durante 10 min.6. Mientras la muestra era centrifugada se observó la viabilidad de las células, para ello, se

tomaron 10 uL de la gota trasferida al porta objeto y fue depositada en otro porta objeto agregándole 10 uL de azul de Tripán, y posteriormente se re-suspendió, luego se contaron las células vivas y muertas para realizar el porcentaje de viabilidad.

7. Al finalizar la centrifugación se eliminó el sobrenadante dejando aproximadamente 0,5ml de medio para no pasar a llevar el pellet.

8. Se agregó 5 ml de medio RPMI al pellet y se re-suspendió con el fin de disgregar las células, luego de traspaso el contenido a un frasco T-25 y se homogeneizo moviendo el frasco suavemente adelante y hacia atrás y desde lado a lado.

9. Se observó el frasco al microscopio y se incubaron las células en una estufa con las siguientes condiciones: 37°C, 5% CO2.

10. Al día siguiente se observó la densidad colocando el frasco en un microscopio invertido.

Tripsinización de células LLC-MK2.

Materiales.

Tripsina. Frascos cultivo. Pipetas estériles. Pipeteador. Tubo falcón de 15ml.

Procedimiento

1. Se observó la confluencia de las células observándolas en el microscopio invertido, si la confluencia de las células eran mayores a 70%, podían ser tripsinizadas.

2. Se eliminó el medio del frasco T-25.3. Se agregó suavemente 2 mL de tripsina por el borde del frasco con el fin de lavar las

células, se homogeneizo moviendo el frasco suavemente hacia adelante y atrás y de lado a lado.

4. Se eliminó la tripsina del frasco.5. Se agregó 1 ml de tripsina directamente a la superficie donde se encontraban las células,

se homogeneizo moviendo el frasco suavemente hacia adelante y atrás y de lado a lado.6. Se observó al microscopio invertido como las células se soltaban.7. Se dio un golpe con la mano al frasco para soltar completamente las células y se observó

nuevamente al microscopio.8. El paso 7 fue repetido hasta lograr que las células se soltaran completamente.9. Se re-suspendieron las células del frasco y se traspasó todo el contenido a un tubo falcón

de 15 mL.10. Se contaron las células en una cámara de neubauer.11. Se agregó 10 ml medio RPMI.12. Se repartió el contenido en partes iguales en 2 frascos T-25 (5mL cada frasco).13. Se incubaron las células en una estufa con las siguientes condiciones: 37°C, 5% CO2.

Congelamiento de células LLC-MK2.

Materiales. Tripsina. Crio tubos. Pipetas estériles. Pipeteador. Tubo falcón de 15ml. Medio de congelamiento.

Procedimiento.1. Se observó la confluencia de las células observándolas en el microscopio invertido, si la

confluencia de las células eran mayores a 70%, podían ser tripsinizadas.2. Se eliminó el medio del frasco T-25.3. Se agregó suavemente 2 mL de tripsina por el borde del frasco con el fin de lavar las

células, se homogeneizo moviendo el frasco suavemente hacia adelante y atrás y de lado a lado.

4. Se eliminó la tripsina del frasco.5. Se agregó 1 ml de tripsina directamente a la superficie donde se encontraban las células,

se homogeneizo moviendo el frasco suavemente hacia adelante y atrás y de lado a lado.6. Se observó al microscopio invertido como las células se soltaban.7. Se dio un golpe con la mano al frasco para soltar completamente las células y se observó

nuevamente al microscopio.8. El paso 7 fue repetido hasta lograr que las células se soltaran completamente.9. Se re-suspendieron las células del frasco y se traspasó todo el contenido a un tubo falcón

de 15 mL.10. Se contaron las células en una cámara de neubauer.11. Se agregó 4 ml medio RPMI.

12. Se centrifugo a 1800 rpm durante 10 min.13. Se eliminó el medio sin tomar el sobrenadante y se agregó 1 mL de medio de

congelamiento, se traspasó el contenido a un crio-tubo.14. Se congelaron las muestras a -70°C.

Descongelamiento y cultivo de Trichomonas vaginalis.

Materiales. Medios temperados 37ºC Tubo con 9ml de medio Diamond sin suero Baño con agua a 37ºC Pipeteador Pipetas estériles Centrífuga

Procedimiento.1. Se tomó el vial con células Trichomonas vaginalis desde su almacenamiento.2. Se dejó el vial en un baño a 37°C hasta su descongelamiento.3. Se transfirió el contenido del vial a un tubo falcón que contenía 9 mL de medio Diamond

(sin suero).4. Se re-suspendió suavemente el contenido del tubo, se transfirió una gota a un porta

objeto.5. Se centrifugo el tubo a 1900 rpm durante 10 min.6. Mientras la muestra era centrifugada se observó la viabilidad de las células, para ello, se

tomaron 10 uL de la gota trasferida al porta objeto y fue depositada en otro porta objeto agregándole 10 uL de azul de Tripán, y posteriormente se re-suspendió, luego se contaron las células vivas y muertas para realizar el porcentaje de viabilidad.

7. Se contaron los 4 cuadrantes de la cámara, para luego sacar el promedio y este fue multiplicado por 10000.

8. Al finalizar la centrifugación se eliminó el sobrenadante dejando aproximadamente 0,5ml de medio para no pasar a llevar el pellet.

9. Se ajustó a 500000 células/mL10. Se agregó 5 ml de medio Diamond suplementado con 10% de suero equino al pellet y se

re-suspendió, luego de traspaso el contenido a un frasco T-25 y se homogeneizo moviendo el frasco suavemente adelante y hacia atrás y desde lado a lado.

11. Se realizó el recuento en la cámara de neubauer adicionando 10 uL a esta.12. Se repitió el protocolo cada 18 horas.

Descongelamiento y cultivo de Monocitos (THP-1)

Materiales.

Medios temperados 37°C. Tubo con 9ml de medio RPMI. Frasco T-25. Baño con agua a 37°C.

Pipeteador. Pipetas estériles. Centrífuga. Células THP-1.

Procedimiento.

1. Se tomó el vial con células THP-1 desde su almacenamiento de -70°C desde un tanque de nitrógeno líquido.

2. Se dejó el vial en un baño a 37°C hasta su descongelamiento.3. Se transfirió el contenido del vial a un tubo falcón que contenía 9 mL de medio RPMI.4. Se re-suspendió suavemente el contenido del tubo, con el fin de disgregar las células, se

transfirió una gota a un porta objeto.5. Se centrifugo el tubo a 1800 rpm durante 10 min.6. Mientras la muestra era centrifugada se observó la viabilidad de las células, para ello, se

tomaron 10 uL de la gota trasferida al porta objeto y fue depositada en otro porta objeto agregándole 10 uL de azul de Tripán, y posteriormente se re-suspendió, luego se contaron las células vivas y muertas para realizar el porcentaje de viabilidad.

7. Al finalizar la centrifugación se eliminó el sobrenadante dejando aproximadamente 0,5ml de medio para no pasar a llevar el pellet.

8. Se agregó 5 ml de medio RPMI al pellet y se re-suspendió con el fin de disgregar las células, luego de traspaso el contenido a un frasco T-25 y se homogeneizo moviendo el frasco suavemente adelante y hacia atrás y desde lado a lado.

9. Se observó el frasco al microscopio y se incubaron las células en una estufa con las siguientes condiciones: 37°C, 5% CO2.

10. Al día siguiente se observó la densidad colocando el frasco en un microscopio invertido.

Resultados.

Células LLCMK2

Descongelamiento de células.

Con el fin de saber si las células eran candidatas para cultivarlas se observó la viabilidad tiñendo las células con azul Tripán, por lo tanto las células viables (vivas), no adquieren coloración azul. Obteniéndose un 100% de viabilidad.

Cultivo de las células:

El cultivo de células se observó bajo un microscopio invertido luego del cultivo para corroborar que no existiera contaminación con bacterias u otros. El cultivo permanecía transparente por lo que fue contaminado por bacterias.

Tripsinización:

Antes de soltar las células del frasco T-25 se observó la confluencia, esta debía ser superior al 70% pero sin llegar a un 100%. La confluencia observada era correspondiente a un 90%.

Se realizó un conteo en cámara de Neubauer para corroborar que las células estuviesen vivas.

Trichomonas vaginalis.

Descongelamiento y cultivo

Se observó la viabilidad de las células obteniendo solo un 30%, luego se realizó un conteo en cámara de Neubauer y se ajustó el número de células a 500000 células/ml, el volumen obtenido es 15,5 ml que se repartió en dos tubos.

Se detectó levaduras.

Monocitos THP-1

Descongelamiento y cultivo

Se realizó una nueva prueba de viabilidad que resulto en un 0% de viabilidad

Se observaron levaduras nuevamente.

Discusión.

La prueba de azul Tripán es un método de exclusión que permite distinguir células vivas de células muertas. Se basa en que las células vivas poseen su membrana intacta que impide a los colorantes entrar a la célula, por consiguiente las células vivas no se tiñen y las muertas se tiñen de color azul. (Strober, W. 2001)

Esta prueba fue utilizada para ver la viabilidad celular sin embargo, es probable que la tinción se encontraba contaminada con levaduras debido a que el cultivo de T.vaginalis y de monocitos no presentaba indicios de contaminación como la turbidez. (Johnson, G. (1942).

Una vez conclusa la experiencia con T.vaginalis, se procedió a comenzar con monocitos THP-1, sin embargo, antes de descongelar las células se observó la viabilidad y esta arrojó un 0% de viabilidad, por lo que no se pudo continuar con el procedimiento.

La viabilidad debe ser superior al 70% como mínimo para que el cultivo de las células tenga éxito. (Tennant, J. R. 1964).Esto se debe a una mala manipulación al momento de incubar las células, ya que el cultivo no se encontraba en las condiciones ambientales adecuadas, se dejaron al aire libre.

Referencias.

Genersch, E., Gisder, S., Hedtke, K., Hunter, W. B., Moeckel, N., & Mueller, U. (2013). Standard Methods for cell cultures in Apis mellifera research. J Apic Res, 52, 1-8.

Bruce Alberts, Alexander Johnson, Julian Lewis, Mart in Raff, Keith Roberts, y Peter Walter. “Molecular Biology of the Cell”, Editorial Garland, 4ta. Edición (2002).

Hull, R. N., Cherry, W. R., & Tritch, O. J. (1962). Growth characteristics of monkey kidney cell strains LLC-MK1, LLC-MK2, and LLC-MK2 (NCTC-3196) and their utility in virus research. The Journal of experimental medicine, 115(5), 903-918.

Tsuchiya, S., Yamabe, M., Yamaguchi, Y., Kobayashi, Y., Konno, T., & Tada, K. (1980). Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP‐1). International journal of cancer, 26(2), 171-176.

Holley, R. W., & Kiernan, J. A. (1968). " Contact inhibition" of cell division in 3T3 cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 60(1), 300.

Jainchill, J. L., Aaronson, S. A., & Todaro, G. J. (1969). Murine sarcoma and leukemia viruses: assay using clonal lines of contact-inhibited mouse cells. Journal of Virology, 4(5), 549-553.

Di Fiore, P. P., Pierce, J. H., Kraus, M. H., Segatto, O., King, C. R., & Aaronson, S. A. (1987). erbB-2 is a potent oncogene when overexpressed in NIH/3T3 cells. Science, 237(4811), 178-182.

Todaro GJ, Lazar GK, Green H. The initiation of cell division in a contact-inhibited mammalian cell line. J Cell Physiol. 1965 Dec;66(3):325–333

HEINE, P., & McGREGOR, J. A. (1993). Trichomonas vaginalis: a reemerging pathogen. Clinical obstetrics and gynecology, 36(1), 137-144.

Fouts, A. C., & Kraus, S. J. (1980). Trichomonas vaginalis: reevaluation of its clinical presentation and laboratory diagnosis. Journal of Infectious Diseases, 141(2), 137-143.

Alderete, J. F., & Pearlman, E. (1984). Pathogenic Trichomonas vaginalis cytotoxicity to cell culture monolayers. The British journal of venereal diseases, 60(2), 99-105.

Steinbüchel, A., & Müller, M. (1986). Anaerobic pyruvate metabolism of< i> Tritrichomonas foetus</i> and< i> Trichomonas vaginalis</i> hydrogenosomes. Molecular and biochemical parasitology, 20(1), 57-65.

Public Health Agency of Canada, 2010 Laga, M., Nzila, N., & Goeman, J. (1991). The interrelationship of sexually transmitted

diseases and HIV infection: implications for the control of both epidemics in Africa. Aids, 5, S55-63.

Strober, W. (2001). Trypan blue exclusion test of cell viability. Current protocols in immunology, A-3B.

Tennant, J. R. (1964). Evaluation of the trypan blue technique for determination of cell viability. Transplantation, 2(6), 685-694.

Johnson, G. (1942). Physiology of a bacteria-free culture of Trichomonas vaginalis. IV. Effect of hydrogen ion concentration and oxygen tension on population. The Journal of Parasitology, 28(5), 369-379.

Anexo.

Medios.

RPMI 1640 R8005 Sigma-Aldrich

Pesar 16,4g para 1 litro y disolver en 800ml de agua Milli Q. Añadir 2g/L de bicarbonato de sodio. Una vez que se haya disuelto todo medir pH, dejar entre 7,2-7,4. Aforar a 900ml. Añadir 100ml de FBS (quedara al 10%). Filtrar el medio con filtro de 0,2m. Agregar 10ml de ATB 100X.

Tripsina

NaCl 0,14M KH2PO4 0,002M KCl 0,01M Na2HPO4 0,008M EDTA 0,00078M Tripsina 0,1%

Disolver en agua Milli Q

Dejar a pH 7,2-7,4

Filtrar

Medio de congelamiento

Al medio RPMI añadir:

10% FBS 10% DMSO

Ejemplo para 10ml de medio de congelamiento: tener 8ml de medio RPMI + 1ml FBS + 1ml DMSO.

Medio Diamond modificado (para 1litro)

Componente Cantidad Caseína peptona 24gExtracto de levadura 12gMaltosa 6gCisteína hidrocloridrica monohidratada

1,33g

Ácido ascórbico 0,24Agua destilada c.s.p. 900mlAjustar pH 6,3+/-0,2

Autoclavar por 15 minutos a 121ºC

Agregar suero equino inactivado, para esto usted debe dejar el suero durante 30 minutos en un baño a 56ºC.