CONSEJO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA -CONCYT- SECRETARIA NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA -SENACYT- FONDO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA -FONACYT- FUNDACIÓN ROZAS-BOTRÁN- INSTITUTO DE INVESTIGACIÓN EN ENFERMEDADES GENÉTICAS Y METABÓLICAS –INVEGEM- INFORME FINAL CUANTIFICACIÓN POR PCR EN TIEMPO REAL DE LOS DISTINTOS TRANSCRITOS DE BCR-ABL Y SU UTILIZACIÓN PARA EL ESTUDIO DE ENFERMEDAD MÍNIMA RESIDUAL EN LEUCEMIA LINFÓBLASTICA AGUDA Y LEUCEMIA MIELOIDE CRÓNICA PROYECTO FODECYT No. 24-2010 Dra. Claudia Carranza Investigador Principal GUATEMALA, NOVIEMBRE DEL 2012
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CONSEJO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA -CONCYT- SECRETARIA NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA -SENACY T-
FONDO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA -FONACYT- FUNDACIÓN ROZAS-BOTRÁN- INSTITUTO DE INVESTIGACIÓN EN
ENFERMEDADES GENÉTICAS Y METABÓLICAS –INVEGEM-
INFORME FINAL
CUANTIFICACIÓN POR PCR EN TIEMPO REAL DE LOS DISTINTOS TRANSCRITOS DE BCR-ABL Y SU UTILIZACIÓN PARA EL ESTUDIO DE ENFERMEDAD MÍNIMA RESIDUAL EN LEUCEMIA LINFÓBLASTICA AGUDA Y LEUCEMIA MIELOIDE
CRÓNICA
PROYECTO FODECYT No. 24-2010
Dra. Claudia Carranza Investigador Principal
GUATEMALA, NOVIEMBRE DEL 2012
AGRADECIMIENTOS:
La realización de este trabajo, ha sido posible gracias al apoyo financiero dentro del Fondo
Nacional de Ciencia y Tecnología, -FONACYT-, otorgado por la Secretaria Nacional de
Ciencia y Tecnología –SENACYT- y al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología –
CONCYT- .
RESUMEN El objetivo general del proyecto Fodecyt No. 24-2010 es cuantificar y evaluar la
presencia de los distintos transcritos b2:a2, b3:a3, e1:a2 quiméricos del gen BCR-ABL y su
utilidad para el estudio de enfermedad mínima residual en leucemia linfoblástica aguda y
leucemia mieloide crónica.
En el presente estudio se incluyeron 30 pacientes con leucemia mieloide crónica y que
reciben tratamiento con imatinib o nilotinib; a los cuales se les realizaron 4 monitoreos
trimestralmente; haciendo un total de 120 determinaciones. Para ello se obtuvieron los
glóbulos blancos y/o blastos de médula ósea y/o sangre periférica, mediante lisis de
amonio. Se realizó extracción de ARN y retrotranscripción. Posteriormente se
cuantificaron las copias del gen quimérico BCR-ABL y del gen control ABL, mediante
PCR en Tiempo Real. Cada monitoreo se reportó en el sistema internacional.
Del total de pacientes analizados, el 39% presentó una respuesta óptima, un 25% presentó
una respuesta sub-optima al tratamiento y un 36% tiene un fallo a la terapia.
Un 64% alcanzaron una respuesta citogenética completa (<1%IS), un 43% tienen una
respuesta molecular mayor (<0.1%) y por último el 36% que presentó fallo a terapia no
alcanzó la respuesta citogenética completa (>1%).
Los resultados obtenidos en la cuantificación del gen BCR-ABL, son comparables con los
reportados en la mayoría de estudios similares.
En cuando a la edad, cabe destacar que se puede observar que los pacientes con leucemia
mieloide crónica en Guatemala, tienen una mediana de edad (<39 años) menor que la
reportada en el resto de países, en donde la mediana de esta enfermedad se encuentra entre
50-60 años.
En el recuento de plaquetas se puede observar que el grupo que no alcanzó una respuesta
citogenética completa presenta más rango de variación, que va desde 89,000 a 1,332,000
plaquetas/ml. En este grupo se encontró que un 62% presenta alteraciones hematológicas
como trombocitopenia, trombosis y leucopenia.
ABSTRACT The project goal is to quantify and evaluate the presence of different transcripts b2: a2, b3:
a3, e1: a2 from the chimeric BCR-ABL gene and its usefulness for the study of minimal
residual disease in leukemia acute lymphoblastic and chronic myeloid leukemia.
In the present study included 30 patients with chronic myeloid leukemia receiving imatinib
or nilotinib, to which were performed four quarterly monitoring, making a total of 120
determinations.
White blood cells or Blasts were obtained from bone marrow or peripheral blood by
ammonium lysis. RNA extraction and retrotranscription were performed. The BCR-ABL
and ABL gene copies were quantified by Real-Time PCR. Each monitoring was reported in
the international system.
Of the patients studied, 39% had an optimal response, 25% had a suboptimal response to
treatment and 36% has to therapy failure.
64% achieved a complete cytogenetic response (<1% IS), 43% have a major molecular
response (<0.1%) and finally the 36% that showed failure therapy did not achieve complete
cytogenetic response (> 1%).
The results obtained in the quantification of BCR-ABL, are comparable with those reported
in most similar studies.
As for the age, it is noteworthy that patients with chronic myeloid leukemia in Guatemala,
have a median age (<39 years) less than that reported in other countries, where the median
is between 50-60 years.
The platelet count shows that the group did not achieve a complete cytogenetic response
has more range of variation that goes from 89.000 to 1,332,000 platelets / ml. In this group
found that 62% have blood disorders including thrombocytopenia, thrombosis and
leukopenia.
OTROS AGRADECIMIENTOS:
La realización de este trabajo, ha sido posible gracias al:
• Apoyo financiero y académico del Instituto de Investigación en
Enfermedades Genéticas y Metabólicas –INVEGEM-.
• Apoyo financiero de la Fundación Rozas-Botrán.
• Cooperación de la Unidad de Oncología Pediátrica –UNOP-
• Cooperación del Dr. Mauricio Villegas, Dr. Cáceres y Dra. Silvana Torselli.
BIBLIOGRAFÍA BREVE ACADÉMICA DE AUTORES .
1. Dra. Claudia Carranza PhD.
En el año 2004 se gradúo de Química Bióloga en la Universidad de San Carlos,
Posteriormente en el período 2005-2007 cursó un programa de Doctorado en Biología
Molecular y Celular, especializado en el área de Genética, en el Centro de Investigación
Médica Aplicada –CIMA- , Universidad de Navarra, Pamplona España. En el año 2008, se
incorpora en el Instituto de Investigación en enfermedades Genéticas y Métabolicas –
INVEGEM-, Guatemala; y también se incorpora como catedrática titular del curso de
Bioquímica Humana en la Facultad de Medicina, Universidad Francisco Marroquín. Su
línea de investigación se ha centrado en Genética humana, Biología Molecular del Cáncer,
Genética de neoplasias hematológicas. Actualmente se encuentra cursando un Máster en
Bioética en la Universidad del Istmo, Guatemala ( 2011-2012).
2. Licda. Swuanny Villagrán
Pensum cerrado de la carrera de Química biológica, de la Facultad de Farmacia,
Universidad San Carlos de Guatemala. Actualmente se encuentra laborando como
investigadora en el Instituto de Investigación de Enfermedades Genéticas y Metabólicas –
INVEGEM- .
TABLA DE CONTENIDOS :
PARTE I: I.1 INTRODUCCIÓN ………………………………………………............... 1 I.2 PLANTEAMIENTO DEL TEMA ……………………………………….. 3 I.2.1 Antecedentes en Guatemala………………………………………………. 3 I.2.2 Justificación del trabajo de investigación…………………………............. 4 I.3 OBJETIVOS ……………………………………………………….. 6 I.3.1 Objetivos I.3.1.1 General……………………………………………………. 6 I.3.1.2 Específicos………………………………………………… 6 I.3.2 Hipótesis……………………………………………………………. 8 I.4 METODOLOGÍA ………………………………………………………….. 9 I.4.1 Población…………………………………………………………………... 9 1.4.2 Indicadores………………………………………………………………… 9 I.4.3 Estrategia Metodológica…………………………………………………… 9 I.4.4 El Método………………………………………………………………….. 11 I.4.5 La técnica Estadística……………………………………………………… 19 1.4.6 Los instrumentos a utilizar………………………………………………… 19 PARTE II MARCO TEÓRICO ( CONCEPTUAL )……………………………………… 23 PARTE III III. RESULTADOS …………………………………………………………….. 44 III.1 Discusión de Resultados……………………………………………. 80 PARTE IV IV.1 CONCLUSIONES………………………………………………………... 85 IV.2 RECOMENDACIONES ………………………………………………… 87 IV.3 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS …………………………………. 88 IV.4 ANEXOS…………………………………………………………………... 96 PARTE V V.1 INFORME FINANCIERO ……………………………………………….. 166
LISTA DE FIGURAS PAG. Figura No.1: Células mieloides inmaduras de un paciente con leucemia
mieloide crónica……………………………………………………………………. 26
Figura No. 2: Linfoblastos en un frote de médula ósea de un paciente
con leucemia linfoblástica aguda…………………………………………………… 28
Figura No. 3: Alteraciones genéticas encontradas en leucemia
linfoblástica aguda infantil (a) y adultos (b)………………………………………... 33
Figura No. 4: Esquema de la t(9;22) y la localización de los genes ABL y BCR…. 34
Figura No. 5: Translocación t(9;22)(q34:q11) en LMC……………………………. 36
Figura No. 6: Localización de los puntos de rotura en los genes ABL y BCR……. 37
Figura No. 7: Probabilidad de sobrevivencia libre de eventos, según el riesgo……. 41
Figura No. 8: Gráfica de seguimiento de paciente 13-LMC……………………….. 53
Figura No. 9: Gráfica de seguimiento de paciente 15-LMC. ……………………… 54
Figura No. 10: Gráfica de seguimiento de paciente 41-LMC……………………… 55
Figura No. 11: Gráfica de seguimiento de paciente 46-LMC……………………… 56
Figura No. 12: Gráfica de seguimiento de paciente 12-LMC……………………… 57
Figura No. 13: Gráfica de seguimiento de paciente 17-LMC……………………… 58
Figura No. 14: Gráfica de seguimiento de paciente 24-LMC……………………… 59
Figura No. 15: Gráfica de seguimiento de paciente 36-LMC……………………… 60
Figura No. 16: Gráfica de seguimiento de paciente 37-LMC……………………… 61
Figura No. 17: Gráfica de seguimiento de paciente 48-LMC……………………… 62
Figura No. 18: Gráfica de seguimiento de paciente 61-LMC……………………… 63
Figura No. 19: Gráfica de seguimiento de paciente 62-LMC……………………… 64
Figura No. 20: Gráfica de seguimiento de paciente 19-LMC……………………… 65
Figura No. 21: Gráfica de seguimiento de paciente 38-LMC……………………… 66
Figura No. 22: Gráfica de seguimiento de paciente 40-LMC……………………… 67
Figura No.23: Gráfica de seguimiento de paciente 43-LMC………………………. 68
LISTA DE FIGURAS PAG.
Figura No. 24: Gráfica de seguimiento de paciente 47-LMC…………………….. 69
Figura No. 25: Gráfica de seguimiento de paciente 60-LMC…………………….. 70
Figura No. 26: Gráfica de seguimiento de paciente 39-LMC…………………….. 71
Figura No. 27: Gráfica de seguimiento de paciente 16-LMC…………………….. 72
Figura No. 28: Gráfica de seguimiento de paciente 18-LMC…………………….. 73
Figura No. 29: Gráfica de seguimiento de paciente 20-LMC…………………….. 74
Figura No. 30: Gráfica de seguimiento de paciente 42-LMC…………………….. 75
Figura No. 31: Gráfica de seguimiento de paciente 44-LMC…………………….. 76
Figura No. 32: Gráfica de seguimiento de paciente 45-LMC…………………….. 77
Figura No. 33: Gráfica de seguimiento de paciente 49-LMC…………………….. 78
Figura No. 34: Gráfica de seguimiento de paciente 50-LMC……………………. 79
Figura No. 35: Bandas comparando extracción de ARN con trizol y con kit……. 96
Figura No. 36: Almacenamiento de muestras de sangre periférica en RNAlater… 97
Figura No. 37: Trizol, reactivo que se utilizará para la extracción de ARN…….. 97
Figura No. 38: El reactivo trizol es agregado a las muestras…………………….. 98
Figura No. 39: El trizol de color rosa sobre la muestra de pacientes. …………… 98
Figura No. 40: Lisis con trizol de la muestra……………………………………… 99
Figura No. 41: Dispensación de cloroformo para la separación
de fases del ARN obtenido……………………………………………………….. 99
Figura No. 42: Tubo mezclado con cloroformo y trizol, listo para centrifugación... 100
Figura No. 43: Centrifugación de muestras para separación de fases……………... 100
Figura No. 44: Separación de fases; la fase superior lofórmica contiene el
ARNde interés……………………………………………………………………… 101
Figura No. 45: Dispensación de etanol para precipitación del ARN……………..... 101
Figura No. 46: Preparación de muestras y reactivos para QRT-PCR………………. 102
Figura No. 47: Curva de estándares de BCR-ABL y ABL, primera evaluación del kit. 103
LISTA DE FIGURAS PAG.
Figura No. 48: Amplificación de los estándares de BCR-ABL
Normalizada de la primera evaluación del kit……………………………. 103
Figura No. 49: Amplificación de los estándares de BCR-ABL, de la primera
evaluación del kit………………………………………………………………... 104
Figura No. 50: Amplificación normalizada de los estándares de ABL de la
primera evaluación del kit………………………………………………………. 104
Figura No. 51: Amplificación de los estándares de ABL, de la primera
evaluación del kit. ………………………………………………………………. 105
Figura No. 52: Amplificación del gen ABL de los controles positivos,
de la primera evaluación del kit…………………………………………………. 105
Figura No. 53: Amplificación de los controles positivos del gen BCR-ABL
normalizada, de la primera evaluación del kit…………………………………… 106
Figura No. 54: Amplificación de los controles positivos del gen BCR-ABL
de la primera evaluación del kit…………………………………………………. 106
Figura No. 55: Curva de estándares de BCR-ABL y ABL de la segunda
evaluación del kit. ……………………………………………………………….. 108
Figura No. 56: Amplificación de los estándares de ABL de la segunda
evaluación del kit……………………………………………………………….... 108
Figura No. 57: Amplificación de los estándares de ABL normalizada
de la segunda evaluación del kit. ………………………………………………… 109
Figura No. 58: Amplificación de los estándares de BCR-ABL de la segunda
evaluación del kit………………………………………………………………… 109
Figura No. 59: Amplificación de los estándares de BCR-ABL normalizada
de la segunda evaluación del kit……………………………………………….… 110
Figura No. 60: Amplificación de los controles positivos del gen BCR-ABL
normalizada de la segunda evaluación del kit…………………………………… 110
Figura No. 61: Amplificación de los controles positivos del gen ABL
normalizada de la segunda evaluación del kit…………………………………… 111
LISTA DE FIGURAS PAG.
Figura No. 62: Curva de estándares de BCR-ABL y ABL de la evaluación
del segundo kit. ………………………………………………………………. 113
Figura No. 63: Amplificación de los estándares de ABL normalizada
de la evaluación del segundo kit………………………………………………. 113
Figura No. 64: Amplificación de los estándares de ABL de la evaluación
del segundo kit………………………………………………………………… 114
Figura No. 65: Amplificación de los estándares de BCR-ABL normalizada
de la evaluación del segundo kit……………………………………………………… 114
Figura No. 66: Amplificación de los estándares de BCR-ABLde la
evaluación del segundo kit…………………………………………………….. 115
Figura No. 67: Amplificación de los controles positivos del gen BCR-ABL
normalizada de la evaluación del segundo kit…………………………………. 115
Figura No. 68: Amplificación de los controles positivos del gen BCR-ABL
de la evaluación del segundo kit……………………………………………….. 116
Figura No. 69: Amplificación del gen ABL y BCR-ABL del primer
monitoreo de pacientes ………………………………………………………… 118
Figura No. 70: Curva de estándares de BCR-ABL y ABL del primer
monitoreo de pacientes. ………………………………………………………... 119
Figura No.71: Amplificación de los estándares de BCR-ABL normalizada
del primer monitoreo de pacientes……………………………………………… 119
Figura No. 72: Amplificación de los estándares de ABL normalizada del
primer monitoreo de pacientes………………………………………………….. 120
Figura No. 73: Amplificación de los controles positivos del gen ABL
normalizada del primer monitoreo de pacientes………………………………… 120
Figura No. 74: Amplificación de los controles positivos del gen BCR-ABL
del primer monitoreo de pacientes………………………………………………. 121
Figura No. 75: Amplificación de muestras de pacientes de no. 1-11
del primer monitoreo……………………………………………………………. 121
Figura no. 76: Amplificación de muestras de pacientes de no. 1-11 normalizada
del primer monitoreo…………………………………………………………….. 122
LISTA DE FIGURAS PAG.
Figura No. 77: Curva estándar de BCR-ABL de la segunda corrida del
Primer monitoreo de pacientes …………………………………………..….. 125
Figura No. 78: Curva estándar de ABL de la segunda corrida del
primer monitoreo de pacientes……………………………………………….. 125
Figura No. 79: Amplificación de cada una de las muestras, de la segunda
corrida del primer monitoreo de pacientes…………………………………… 126
Figura No. 80: Amplificación de los estándares de ABL normalizada de la
segunda corrida del primer monitoreo de pacientes………………………….. 126
Figura No. 81: Amplificación de los estándares de BCR-ABL
normalizada de la segunda corrida del primer monitoreo…………………….. 127
Figura No. 82: Amplificación de los controles del gen ABL de la segunda
corrida del primer monitoreo de pacientes…………………………………………. 127
Figura No. 83: Amplificación de los controles del gen BCR-ABL normalizada
de la segunda corrida del primer monitoreo……………………………………. 128
Figura No. 84: Amplificación de las muestras del gen BCR-ABL normalizada
de la segunda corrida del primer monitoreo……………………………………. 128
Figura No. 85: Amplificación de las muestras del gen ABL de la segunda
corrida del primer monitoreo…………………………………………………… 129
Figura No. 86: Curva estándar del gen ABL de la tercera corrida del
primer monitoreo de pacientes………………………………………………….. 130
Figura No. 87: Curva estándar del gen BCR-ABL de la tercera
corrida del primer monitoreo de pacientes……………………………………… 131
Figura No. 88: Amplificación de todas las muestras, de la tercera
corrida del primer monitoreo……………………………………………………. 131
Figura No. 89: Amplificación de los estándares del gen control ABL
normalizada de la tercera corrida del primer monitoreo……………………….. 132
Figura No. 90: Amplificación de los estándares del gen control BCR-ABL
normalizada de la tercera corrida del primer monitoreo.……………………… 132
Figura No. 91: Amplificación de las muestras del gen ABL
normalizada de la tercera corrida del primer monitoreo……………………….. 133
LISTA DE FIGURAS PAG.
Figura No. 92: Amplificación del gen control BCR-ABL normalizada
de la tercera corrida del primer monitoreo……………………………………. 133
Figura No. 93: Amplificación de los cuatro estándares del gen control ABL
normalizada para la cuarta corrida del segunda jornada……………………… 135
Figura No. 94: Amplificación de los estándares del gen ABL de la cuarta
corrida del segunda jornada………………………………………………………….. 136
Figura No. 95: Amplificación del transcrito BCR-ABL de la cuarta corrida
del segunda jornada……………………………………………………………. 136
Figura No. 96: Amplificación del gen BCR-ABL de la cuarta corrida del
segunda jornada………………………………………………………………… 137
Figura No. 97: Curva estándar del gen control ABL de la cuarta corrida
del segunda jornada…………………………………………………………….. 137
Figura No. 98: Curva estándar del gen BCR-ABL de la cuarta corrida
del segunda jornada…………………………………………………………….. 138
Figura No. 99: Se observa la amplificación de los controles alto, mediano
y negativo del gen BCR-ABL………………………………………………… 138
Figura No. 100: Se observa la amplificación del gen control ABL en
las muestras de pacientes no. 11-25…………………………………………….. 139
Figura No. 101: Amplificación del gen ABL en muestras de pacientes de
la cuarta corrida segunda jornada………………………………………………. 139
Figura No. 102: Amplificación del gen control BCR-ABL en las muestras
de pacientes no. 11-35………………………………………………………….. 140
Figura No. 103: Se observa la amplificación del gen control BCR-ABL
en la muestras de paciente no. 11-25. …………………………………………. 140
Figura No. 104: Amplificación del gen BCR-ABL de muestras de pacientes
segundo monitoreo……………………………………………………………… 143
Figura No. 105: Amplificación del gen control ABLen muestras de pacientes
en el segundo monitoreo………………………………………………………… 144
Figura No. 106: Amplificación del gen BCR-ABL en el segundo monitoreo….. 144
Figura No. 107: Amplificación del gen BCR-ABL en el segundo monitoreo…. 145
LISTA DE FIGURAS PAG.
Figura No. 108: Amplificación del gen control ABL normalizada en el
segundo monitoreo…………………………………………………………. 145
Figura No. 109: Amplificación de curva estándar del gen ABL en el
segundo monitoreo………………………………………………………….. 146
Figura No.110 : Amplificación de estándares y 10 pacientes,
del segundo monitoreo……………………………………………………… 146
Figura No. 111: Amplificación de muestras de pacientes del gen BCR-ABL
en la segunda jornada del segundo monitoreo…………………………….. 147
Figura No. 112: Amplificación del gen control ABL de los pacientes
analizados en la segunda jornada del segundo monitoreo…………………. 147
Figura No. 113: Amplificación de muestras y estándares de la segunda
jornada del segundo monitoreo……………………………………………... 148
Figura No. 114: Curva de estándares del gen control ABL de la segunda
jornada del segundo monitoreo……………………………………………… 148
Figura No. 115: Amplificación de muestras de 15 pacientes y curva estándar
de la tercera jornada del segundo monitoreo………………………………… 149
Figura No. 116: Amplificación de muestras de pacientes de la tercera jornada
del segundo monitoreo………………………………………………………. 149
Figura No. 117: Amplificación de gen control ABL de la tercera jornada
de la segunda monitoreo……………………………………………………… 150
Figura No. 118: Amplificación de curva estándar del gen BCR-ABL de la
tercera jornada del segundo monitoreo………………………………………. 150
Figura No. 119: Amplificación del gen ABLen muestras de pacientes de la
tercera jornada del segundo monitoreo………………………………………. 151
Figura No. 120: Amplificación del gen BCR-ABL de muestras de pacientes
del tercer monitoreo…………………………………………………………... 153
Figura No. 121: Amplificación del gen control ABL en muestras de
pacientes del tercer monitoreo……………………………………………….. 153
Figura No. 122: Amplificación del gen BCR-ABL del tercer monitoreo……. 154
LISTA DE FIGURAS PAG.
Figura No. 123: Amplificación de curva estándar del gen ABL del
tercer monitoreo………………………………………………………………. 154
Figura No.124 : Amplificación de estándares y pacientes, del tercer monitoreo
Figura No. 125: Curva estándar del gen control ABL del tercer monitoreo…… 155
Figura No. 126: Curva estándar del gen BCR-ABL del tercer monitoreo……. 155
Figura No. 127: Amplificación de muestras de 15 pacientes y curva
estándar de la segunda jornada del tercer monitoreo…………………………… 158
Figura No. 128: Amplificación de gen control ABL de la segunda
jornada del tercer monitoreo…………………………………………………….. 159
Figura No. 129: Amplificación de estándares del gen ABL de la segunda
jornada del tercer monitoreo…………………………………………………….. 159
Figura No. 130: Amplificación de estándares del gen BCR-ABL de la segunda
jornada del tercer monitoreo……………………………………………………. 160
Figura No. 131: Amplificación del gen BCR-ABL de los pacientes analizados
de la segunda jornada del tercer monitoreo…………………………………….. 160
Figura No. 132: Gráfica de estándares de BCR-ABL de la segunda
jornada del tercer monitoreo……………………………………………………. 161
Figura No. 133: Curva estándar del gen ABL de la segunda jornada del
tercer monitoreo………………………………………………………………… 161
Figura No. 134: Amplificación de muestras y calibradores del cuarto monitoreo. 163
Figura No. 135: Amplificación de estándares del gen BCR-ABL del
cuarto monitoreo………………………………………………………………… 163
Figura No. 136: Amplificación de muestras del cuarto monitoreo…………….. 164
Figura No. 137: Amplificación de estándares del gen ABL del cuarto monitoreo 164
Figura No. 138: Curva estándar del gen control ABL del cuarto monitoreo….. 165
Figura No. 139: Curva estándar del gen BCR-ABL del cuarto monitoreo……. 165
LISTA DE TABLAS PAG.
Tabla No. 1: Peso molecular de transcritos…………………………. 18
Tabla No. 2 Clasificación citomorfológica de leucemias agudas
linfoblásticas (lal) de acuerdo al grupo cooperativo franco americano
- británico (fab)……………………………………………………… 30
Tabla No.3: Resultados de los cuatro monitoreos de los
pacientes analizados………………………………………………….. 45
Tabla No 4: Evaluación de la respuesta al tratamiento imatinib……. 48
Tabla No. 5 : Respuesta al imatinib del total de pacientes analizados. 49
Tabla No. 6: Pacientes y las respuestas alcanzadas………………….. 50
Tabla No 7: Respuesta al imatinib alcanzada durante el monitoreo
molecular……………………………………………………………… 50
Tabla No. 8: Datos clínicos y hematológicos…………………………. 52
Tabla No. 9: Resultado de MCGR, CCGR y MMR en distintos estudios 82
Tabla No. 10: Parámetros evaluados durante la primera corrida……… 107
Tabla No. 11: Parámetros evaluados durante la primera corrida. …….. 112
Tabla No. 12: Parámetros evaluados durante corrida………………….. 117
Tabla No. 13: Parámetros evaluados…………………………………... 123
Tabla No.14: Resultados de pacientes primera corrida………………… 124
Tabla No. 15: Resultados de pacientes de segunda corrida……………. 129
Tabla No. 16: Resultados de tercera corrida de pacientes……………… 134
Tabla No. 17: Resultados globales de los 10 pacientes ………………… 134
Tabla No. 18 : Resultados obtenidos de la corrida de pcr en tiempo real de
los pacientes 11-25……………………………………………………… 141
Tabla No. 19: Resultados e interpretación de los pacientes……………. 142
Tabla No. 20 resultados de validación de corridas del tercer monitoreo 152
Tabla No. 21: Resultados en numero de copias de BCR-ABL……….. 157
Tabla No. 22: Resultados de validación de corridas…………………... 157
RESUMEN El objetivo general del proyecto Fodecyt No. 24-2010 es cuantificar y evaluar la
presencia de los distintos transcritos b2:a2, b3:a3, e1:a2 quiméricos del gen BCR-ABL y su
utilidad para el estudio de enfermedad mínima residual en leucemia linfoblástica aguda y
leucemia mieloide crónica.
En el presente estudio se incluyeron 30 pacientes con leucemia mieloide crónica y que
reciben tratamiento con imatinib o nilotinib; a los cuales se les realizaron 4 monitoreos
trimestralmente; haciendo un total de 120 determinaciones. Para ello se obtuvieron los
glóbulos blancos y/o blastos de médula ósea y/o sangre periférica, mediante lisis de
amonio. Se realizó extracción de ARN y retrotranscripción. Posteriormente se
cuantificaron las copias del gen quimérico BCR-ABL y del gen control ABL, mediante
PCR en Tiempo Real. Cada monitoreo se reportó en el sistema internacional.
Del total de pacientes analizados, el 39% presentó una respuesta óptima, un 25% presentó
una respuesta sub-optima al tratamiento y un 36% tiene un fallo a la terapia.
Un 64% alcanzaron una respuesta citogenética completa (<1%IS), un 43% tienen una
respuesta molecular mayor (<0.1%) y por último el 36% que presentó fallo a terapia no
alcanzó la respuesta citogenética completa (>1%).
Los resultados obtenidos en la cuantificación del gen BCR-ABL, son comparables con los
reportados en la mayoría de estudios similares.
En cuando a la edad, cabe destacar que se puede observar que los pacientes con leucemia
mieloide crónica en Guatemala, tienen una mediana de edad (<39 años) menor que la
reportada en el resto de países, en donde la mediana de esta enfermedad se encuentra entre
50-60 años.
En el recuento de plaquetas se puede observar que el grupo que no alcanzó una respuesta
citogenética completa presenta más rango de variación, que va desde 89,000 a 1,332,000
plaquetas/ml. En este grupo se encontró que un 62% presenta alteraciones hematológicas
como trombocitopenia, trombosis y leucopenia.
ABSTRACT The project goal is to quantify and evaluate the presence of different transcripts b2: a2, b3:
a3, e1: a2 from the chimeric BCR-ABL gene and its usefulness for the study of minimal
residual disease in leukemia acute lymphoblastic and chronic myeloid leukemia.
In the present study included 30 patients with chronic myeloid leukemia receiving imatinib
or nilotinib, to which were performed four quarterly monitoring, making a total of 120
determinations.
White blood cells or Blasts were obtained from bone marrow or peripheral blood by
ammonium lysis. RNA extraction and retrotranscription were performed.
The BCR-ABL and ABL gene copies were quantified by Real-Time PCR. Each monitoring
was reported in the international system.
Of the patients studied, 39% had an optimal response, 25% had a suboptimal response to
treatment and 36% has to therapy failure.
64% achieved a complete cytogenetic response (<1% IS), 43% have a major molecular
response (<0.1%) and finally the 36% that showed failure therapy did not achieve complete
cytogenetic response (> 1%).
The results obtained in the quantification of BCR-ABL, are comparable with those reported
in most similar studies.
As for the age, it is noteworthy that patients with chronic myeloid leukemia in Guatemala,
have a median age (<39 years) less than that reported in other countries, where the median
is between 50-60 years.
The platelet count shows that the group did not achieve a complete cytogenetic response
has more range of variation that goes from 89.000 to 1,332,000 platelets / ml. In this group
found that 62% have blood disorders including thrombocytopenia, thrombosis and
leukopenia.
PARTE I
I.1 INTRODUCCIÓN
En general, el cáncer sigue siendo un reto para la ciencia pues hasta el momento su
porcentaje de curación es muy bajo. Sin embargo, actualmente una gran variedad de
instituciones se han dedicado a investigar este tipo de enfermedades con el fin de tener un
mayor conocimiento de cómo se produce, y de esta manera poder encontrar un tratamiento
adecuado.
Las neoplasias suelen ser de origen genético adquirido es decir que se presentan como
resultado de una gran variedad de alteraciones genéticas, que pueden ir desde mutaciones,
deleciones e inserciones en genes; hasta pérdidas o ganancias de varios cromosomas.
Se han encontrado una gran variedad de marcadores genéticos asociados a los
distintos tipos de neoplasias; y se ha visto que estos marcadores pueden dar una gran
variedad de información al médico, hasta permitirle un diagnóstico certero, darle
información sobre el pronóstico, e incluso orientar a tratamientos más específicos.
Las neoplasias hematológicas se han estudiado ampliamente mediante técnicas
citogenéticas y moleculares. Este hecho ha permitido conocer mejor los mecanismos
alterados relacionados con el desarrollo de la neoplasia. Las neoplasias hematológicas
forman un grupo de enfermedades que provienen de la expansión clonal de células
hematopoyéticas y constituyen una colección heterogénea de neoplasias originadas en el
tejido formador de la sangre.
La leucemia linfoblástica aguda es un tipo de neoplasia hematológica que se
caracteriza por la alteración del crecimiento de las células de la línea hematopoyética
linfoide. Esta enfermedad se encuentra frecuentemente en la población en general. Se han
asociado a esta leucemia una gran variedad de marcadores genéticos, que brindan
información muy importante y que además son el blanco de estudio de muchos científicos.
Uno de los marcadores encontrados frecuentemente en LLA es la alteración BCR-ABL,
que suele ser de muy mal pronóstico. Se han encontrado una gran variedad de transcritos
(b2:a2, b3:a3, e1:a2) producidos por esta alteración.
El marcador genético BCR-ABL también se encuentra presente en leucemias
mieloides crónicas en un 90%. Sin embargo, en esta enfermedad se conoce que funciona
muy bien un tratamiento conocido con el nombre de Imatinib, que fue producido
específicamente para la alteración BCR-ABL. Es importante estudiar este marcador
también en LMC, debido a que el tratamiento con Imatinib posee un costo muy elevado,
por lo que debe administrarse únicamente en pacientes que posean dicha alteración.
En Guatemala, no se ha estudiado con anterioridad la genética de las leucemias, y
además por lo mismo no se ha podido contar con esta herramienta para el mejor manejo de
la enfermedad. Actualmente el Instituto de Investigaciones en Genética –INVEGEM- de la
Fundación Rozas-Botrán ha empezado este tipo de proyectos; el primer proyecto de
investigación ya concluido fue sobre cuatro marcadores genéticos asociados a LLA ( E2A-
PBX1, MLL-AF4, ETV6-AML1 y BCR-ABL), con el fin de orientar sobre el pronóstico y
tratamiento de la misma; este proyecto también obtuvo de co-financiación de la Secretaría
nacional de Ciencia y Tecnología –SENACYT-, mediante su línea FODECYT. Y luego
también se goza de financiamiento de la Secretaría Nacional de Ciencia y Tecnología,
mediante su línea FODECYT para determinar la presencia de monosomía del cromosoma 7
en pacientes con leucemia mieloide aguda.
Para continuar con el avance en el estudio de las neoplasias hematológicas, se ha
planteó cuantificar, mediante técnicas moleculares, la presencia de los distintos transcritos
(b2:a2, b3:a3, e1:a2) del gen BCR-ABL. Una vez evaluada la presencia de estos
marcadores, se procedió a utilizarlos para monitorear la respuesta al tratamiento; así como
para detectar la presencia de enfermedad mínima residual, es decir determinar la presencia
periódica de clones celulares con alguno de estos marcadores, que puedan indicar una
posible recaída.
Con este estudio se pretendió por un lado continuar con la caracterización genética de
leucemias de la población guatemalteca; así como ayudar al hemato-oncólogo en el manejo
de la enfermedad, al realizar un monitoreo periódico de la presencia de dichos marcadores.
Se analizaron un total de 30 pacientes con diagnóstico clínico de leucemia
linfoblástica aguda, a los cuales se les realizó un total de 4 monitoreos del % BCR-
ABL/ABL espaciados por 3-4 meses.
I.2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
I.2.1 Antecedentes (Trabajo, experiencias en Guatemala)
En Guatemala, la genética humana se encuentra desarrollada pobremente.
Actualmente no existen publicaciones guatemaltecas que involucren estudios de genética en
humanos. La biología molecular es una herramienta útil para el área de genética humana.
Los estudios sobre enfermedades de origen genético como las neoplasias
hematológicas poseen un alto impacto en países en vías de desarrollo como Guatemala.
Pues gracias a estos estudios se puede apoyar en diagnóstico y pronóstico al clínico
hematólogo. Y por otro lado también es posible la caracterización genética de nuestra
población en distintas enfermedades.
El único estudio epidemiológico sobre leucemias infantiles realizado en
Centroamérica, incluyendo México, fue el realizado por Arangúre y colaboradores; en
donde se incluyeron datos de pacientes desde 1996 hasta el 2000. El promedio anual de
incidencia obtenido fue de: 44.9 por millón de niños para leucemia linfoblástica aguda –
LLA-( el principal tipo de leucemia infantil). (1)
A nivel mundial, principalmente en países desarrollados se han implementado como
técnicas de rutina, el análisis de la presencia de distintos marcadores genéticos para cada
una de las neoplasias hematológicas. Además se esta realizando una amplia investigación
para conocer mejor el desarrollo de esta afecciones, para encontrar también nuevos
biomarcadores y para establecer nuevas estrategias terapéuticas.(2)
En España, se ha tenido experiencia personal en la caracterización genética de
neoplasias hematológicas mediante la utilización de distintas técnicas moleculares
citogenéticas, principalmente en la búsqueda de nuevos mecanismos que expliquen la
sobreexpresión del gen EVI1, un gen importante en leucemias mieloides agudas. (3)
En Guatemala, El Instituto de Investigaciones en Genética –INVEGEM- de la
FUNDACIÓN ROZAS-BOTRÁN; formado por la inquietud de varios investigadores
guatemaltecos y extranjeros en desarrollar la genética humana en Guatemala, y ser una
institución a la vanguardia en los países centroamericanos; se encuentra desarrollando una
gran variedad de proyectos relacionados.
En el área hemato-oncológica, nuestro equipo se encuentra desarrollando el primer
proyecto de investigación en Guatemala sobre neoplasias hematológicas. Este proyecto se
inició en el año 2009, y contó con financiamiento de la Secretaría Nacional de Ciencia y
Tecnología –SENACYT-, a través de su línea FODECYT. El objetivo global de este
estudio es detectar la presencia de los transcritos de fusión BCR-ABL, E2A-PBX1, MLL-
AF4 y ETV6-AML1 en leucemia linfoblástica aguda; estos transcritos confieren
información importante sobre el pronóstico y el tipo de terapia a escoger. Con este proyecto
se ha empezado un largo y extenso objetivo que es el de caracterizar genéticamente las
neoplasias hematológicas en la población guatemalteca. Todo esto a largo plazo nos
permitirá seleccionar algunos genes importantes, con el fin de estudiar sus funciones,
mecanismos de activación, etc. Y con todo esto describir nuevos procesos y buscar nuevos
tratamientos más eficaces (4)
Para continuar con este extenso proyecto, ahora se ha planteado cuantificar los
transcritos b2:a2, b3:a3, e1:a2 del gen BCR-ABL. Y se piensa dar un paso más que el
proyecto anterior, ya que con los marcadores encontrados se va a monitorear la respuesta al
tratamiento de la enfermedad; y también se buscará encontrar la presencia de enfermedad
mínima residual.
En los países cercanos a Guatemala, el único que ya ha realizado el estudio de los
distintos transcritos del gen BCR-ABL fue el realizado por Arana, et al. en el país de
México en el año 2002. En donde se caracterizaron 250 pacientes con leucemia mieloide
crónica. (5)
I.2.2 Justificación del trabajo de investigación
Las técnicas moleculares y citogenéticas se han convertido en países desarrollados en
herramientas clínicas importantes en neoplasias; pues sirven de soporte para el manejo
global de la enfermedad. Ya que como se ha descrito anteriormente proporcionan
información para obtener un diagnóstico más certero; así como indican el pronóstico de la
enfermedad, orientan al tratamiento y permiten el monitoreo del avance de la misma.
La utilización de estas técnicas en países en vías de desarrollo ha sido muy limitada;
debido a que suelen ser procedimientos de alto coste económico y además también por la
falta de personal calificado para realizar la misma.
Actualmente en Guatemala, no se cuenta con el apoyo de estas técnicas para el
manejo de neoplasias hematológicas; es por esta razón que INVEGEM, se ha propuesto el
desarrollo de las mismas, con el fin de detectar los marcadores genéticos principales en
nuestro país, y ponerlos a disposición de toda la población afectada por algún tipo de
leucemia. Con ello se pretende proporcionar un nuevo panorama al hemato-oncólogo en el
manejo de leucemias; y con ello lograr que una mayor cantidad de pacientes remitan y no
vuelvan a presentar recaídas.
La cuantificación de los distintos transcritos de BCR-ABL en la población
guatemalteca, permitirá monitorear la presencia de enfermedad mínima residual.
Por otro lado este proyecto permitirá continuar con la caracterización genética de las
leucemias en Guatemala, y con ello detectar los marcadores asociados a nuestra población;
para posteriormente seleccionar algunos para la realización de estudios más específicos
sobre mecanismos de acción, mutaciones, y búsqueda de nuevas opciones terapéuticas.
I.3 OBJETIVOS E HIPÓTESIS
I.3.1 OBJETIVOS
I.3.1.1 Objetivo General
• Cuantificar y evaluar la presencia de los distintos transcritos b2:a2, b3:a3, e1:a2
quiméricos del gen BCR-ABL y su utilidad para el estudio de enfermedad
mínima residual en leucemia linfoblástica aguda y leucemia mieloide crónica.
I.3.1.2 Objetivos Específicos
• Cuantificar y evaluar la presencia de los distintos transcritos b2:a2, b3:a3, e1:a2
quiméricos del gen BCR-ABL y su utilidad para el estudio de enfermedad
mínima residual en leucemia linfoblástica aguda y leucemia mieloide crónica.
• Estandarizar la técnica de PCR en tiempo real para cuantificar los distintos
transcritos de b2:a2, b3:a3, e1:a2 producidos por la translocación BCR-ABL.
• Evaluar la presencia de los transcritos b2:a2, b3:a3, e1:a2 del gen quimérico
BCR-ABL mediante RT-PCR en todos los pacientes con leucemia linfoblástica
aguda y leucemia mieloide crónica.
• Monitorear y evaluar la respuesta al tratamiento de los pacientes con leucemia
linfoblástica aguda y leucemia mieloide crónica, mediante la cuantificación
periódica (cada 3-4 meses) de los transcritos de BCR-ABL encontrados.
• Establecer la presencia de enfermedad mínima residual en los pacientes con
leucemia linfoblástica aguda y leucemia mieloide crónica que han recibido
tratamiento.
• Divulgar los resultados obtenidos, a las distintas entidades que atienden
pacientes con leucemias para ofrecerles el mismo servicio.
I.3.1 Hipótesis descriptiva
Nuestra hipótesis es que la cuantificación de la presencia de los transcritos b2:a2,
b3:a3, e1:a2 del gen quimérico BCR-ABL en leucemia linfoblástica aguda y en leucemia
mieloide crónica; permitirá monitorear el desarrollo de enfermedad mínima residual, de
manera que se evite las posibles recaídas que la leucemia pueda presentar.
.
I.4 METODOLOGÍA (INCLUYE LA LOCALIZACIÓN GEOGRÁFICA )
I.4.1 LOCALIZACIÓN
El presente estudio, analiza pacientes con leucemia mieloide crónica y/o leucemia
linfoblástica aguda provenientes de todos los departamentos de Guatemala; y que han sido
referidos al Hospital San Juan de Dios y Hospital Roosevelt.
I.4.2 INDICADORES
La determinación del porcentaje en el sistema internacional, se obtendrá de la relación
copias BCR-ABL/copias ABL *100 * factor de conversión. Dichos datos se obtendrán de
un analizador llamado Real Time PCR fast 7500 de APPLIED BIOSYTEMS
I.4.3 ESTRATEGIA METODOLÓGICA
El estudio que se pretende realizar es de tipo descriptivo longitudinal prospectivo,
esto debido a que se cuantificará la presencia de los distintos transcritos de manera
periódica; cada 3 ó 4 meses, una vez identificado la presencia de alguno de ellos en medula
ósea, y con esto se pretende monitorear el transcurso de la enfermedad. Esto se realizará
por el período de un año y medio; una vez iniciado el proyecto.
I.4.3.1 POBLACIÓN
La población objetivo de este estudio la integran todos los pacientes con
diagnóstico de leucemia linfoblástica aguda o leucemia mieloide crónica; sin
importar la edad, ni el tiempo de padecer la enfermedad que posean cualquier
transcrito de BCR-ABL positivo, para permitir el monitoreo de la enfermedad.
I.4.3.2 TÉCNICA DE MUESTREO Y CRITERIOS DE INCLUSIÓN Y
EXCLUSIÓN.
La técnica de muestreo a utilizar es por conveniencia. Y los criterios de inclusión
son:
• Paciente con leucemia linfoblástica aguda o leucemia mieloide crónica
• Edad: 0 años a 99 años.
• Casos nuevos o paciente ya en tratamiento
• Presencia de algún transcrito de BCR-ABL
Y los Criterios de exclusión son:
• Paciente que presente otras formas de leucemia
• Casos que presenten transcritos diferentes de BCR-ABL
I.4.3.3 MUESTRA
Pacientes con diagnóstico de Leucemia linfoblástica aguda y leucemia
mieloide crónica referidos por el Doctor hematólogo Julio Caceres, presidente de la
asociación para tratamiento con Imatinib de pacientes BCR-ABL positivo; o
referidos del área de hematooncología del IGGS, del Hospital de Quetzaltenango y
del Hospital Roosevelt; que presenten todos los criterios de inclusión mencionados
anteriormente. La cantidad de muestras que se analizará, serán todas las
recolectadas en el período de un año y medio de realización del proyecto ( 100
aproximadamente), cuya fecha de inicio dependerá de la fecha de inicio del
proyecto.
I.4.3.4 PLAN ESTADÍSTICO
Al ser un estudio de tipo descriptivo, no se aplicará ningún modelo
estadístico, únicamente se cuantificará la presencia del transcrito para monitoreo de
la enfermedad.
I.4.3.4 EVALUACIÓN BIOETICA
Se solicitará mediante un consentimiento escrito informado la aceptación expresa de
los pacientes de participar en el estudio y proporcionar los datos necesarios para su
ejecución, en el caso de tratarse de menores de edad, el encargado responsable del
paciente debe aceptar el consentimiento; los niños que estén en uso de razón
firmarán la hoja de asentimiento.
I.4.3.4 IMPACTO AMBIENTAL
El único compuesto que es tóxico que se utilizará en el presente proyecto es el
bromuro de etidio, el cual se eliminará mediante el uso de carbón activado. Los
líquidos contaminados con bromuro de etidio se filtrarán con carbón activado para
su posterior eliminación. Los residuos solidos se colocarán en contacto con carbón
activado y posteriormente se enviarán para su incineración.
I.4.4 MATERIALES Y MÉTODOS
I.4.4.1 MATERIALES Y REACTIVOS.
A. Médula ósea de pacientes diagnosticados con leucemia linfoblástica aguda o
leucemia mieloide crónica.
B. Kit para extracción de linfocitos de médula ósea (FICOLL, GENERAL
ELECTRIC)
C. Kit de extracción de RNA (APPLIED BIOSYSTEMS, USA)
D. Reactivos para retrotranscripción (APPLIED BIOSYSTEMS, USA)
• H2O DEPC
• Hexámeros
• dNTPs
• Buffer 5X
• DTT
• RNASE outTM
• enzima Transcriptasa
• Tubos eppendorf 1.5 ml RNAsa free
• Tubos eppendorf 0.5 ml y 0.2ml RNAsa free
• Hielo seco
E. PCR calidad cDNA
• Tris (10mM) pH 8,3
• MgCl2 (1.5 mM)
• KCl (50mM)
• dNTPs (0.25mM de dATP, dCTP, dTTP y dGPT)
• Oligonucleótidos (0.5 µM de A2 y C3)
• Taq Gold (1.5 U/µl)
• EDTA
• H2O DEPC
F. Reactivos de reacción de cadena de polimerasa
• Cebadores de los transcritos de fusión del gen BCR-ABL (p190,p210 y p230)
• Buffer PCR (10x)
• MgCl2 (50 mM)
• dNTPs (10mM)
• Taq Gold (5unids/µl)
• H2O DEPC
• Agarosa
• Buffer TAE
G. Curva de estandarización para cuantificación absoluta
• Estándar para transcritos de BCR-ABL
• Kit de clonación
• Primers
• Kit de purificación de plásmidos
• Kit de transcripción
• DNAsa I
• Caldo de cultivo LB
• Medio LB sólido
• IPTG
• X-gal
• Antibióticos
• Glicerol
• Fragmentos de DNA sintético
• Secuenciación de fragmentos de DNA amplificados anteriormente
• Cajás de petri
• Tubos falcon de 50 ml
• Tubos falcon de 15 ml
• crioviales
H. Controles positivos y su cultivo
• Se escogerán tres de las siguientes líneas celulares humanas: CML-T1,
y copias adicionales distintos cromosomas (21,22).
En los análisis citogenéticos de pacientes con LMC también se han identificado
otras translocaciones después del cromosoma filadelfia que son: t(5;12)(q33;p13) y
t(8;13)(p11;q12), ambas translocaciones generan la fusión de genes, y tienen en común la
alteración de genes que codifican receptores tirosin cinasa, en el caso de la t(5;12) la
alteración ocurre en el receptor del factor de crecimiento B, mientras en el caso de la
translocación t(8;13) la alteración se da en el receptor del factor de crecimiento de
fibroblastos, esto sugiere que ambas alteraciones activan las mismas vías que activa la
presencia del cromosoma filadelfia, razón por la cual se considera que ambas
translocaciones son capaces de desarrollar LMC (21-22).
D. REORDENACION BCR-ABL
La fusión génica BCR-ABL resulta de la formación del cromosoma Filadelfia, en la
que ocurre la translocación de la región q11 del cromosoma 22 (BCR) a la región q34 del
cromosoma 9 (ABL) (Ver figura No. 4) (23).
FIGURA No. 4: ESQUEMA DE LA T(9;22) Y LA LOCALIZAC IÓN DE LOS
GENES ABL Y BCR.
33´ BCR
22q11
ABL9q34
5´BCR
3´BCR
5´BCR
ABL
9 22 der(9) der(22)
Fuente: Melo J. Rev. Blood. 1996; 88:2375-2384.)
El gen ABL localizado en el cromosoma 9q, es el homólogo humano del oncogen v-
abl del virus de la leucemia murina y codifica para un receptor de tirosina cinasa. ABL es
un gen constituido por 8 exones que como resultado del corte y empalme (splicing)
alternativo del primer exón 1a y 1b, codifica para dos isoformas de una proteína de 145
KDa. La proteína está constituida por tres dominios homólogos a secuencias SRC (SH1,
SH2 y SH3), que se localizan en la región NH2-terminal. El dominio SH1 tiene la función
de tirosina cinasa, mientras que los dominios SH2 y SH3 permiten la interacción con otras
proteínas. Hacía la región 3’ se localiza la secuencia señal de localización nuclear y los
dominios de unión a DNA y actina. La proteína normal ABL está involucrada en la
regulación del ciclo celular, en la respuesta al estrés genotóxico y en la transmisión de
información acerca del ambiente celular a través de la señalización mediada por las
integrinas. Al parecer la proteína ABL tiene un complejo papel como modulador celular que
integra las señales del ambiente extracelular e intracelular e influye en las decisiones para
mantener el ciclo celular y la apoptosis (23-44).
El gen BCR, se localiza en la región q34 del cromosoma 22 y está constituido por 23
exones que codifican para una proteína de 160 KDa. La proteína BCR posee un dominio de
dimerización y un dominio de cinasa, en la región NH2-terminal, además de un dominio
con actividad de GTPasa hacia la región COOH. La proteína BCR está presente en varios
tejidos y aunque existen datos que apoyan la hipótesis de que BCR participa en la
transducción de señales, su verdadero papel permanece sin ser determinado (25,44).
A nivel molecular, la t(9;22) resulta en una fusión cabeza-cola de los genes BCR y
ABL cuando parte del gen ABL localizado en el cromosoma 9 es transferida e insertada
dentro del gen BCR del cromosoma 22, originando el transcrito de fusión del gen quimérico
BCR-ABL, mismo que codifica para una proteína que aumenta la actividad tirosina quinasa
con potencial neoplásico asociado a un pronóstico adverso (Ver figura No. 5) (23-44).
FIGURA No. 5 : TRANSLOCACIÓN t(9;22)(q34:q11) EN LM C.
Fuente: Melo J. Rev. Blood. 1996; 88:2375-2384.
La localización precisa del punto de ruptura en el gen BCR y ABL, así como la
composición de la proteína producto de la fusión BCR-ABL puede servir para determinar el
fenotipo de la enfermedad y por tanto, para orientarse en la estrategia terapéutica a seguir
(40).
El oncogén quimérico BCR-ABL lleva a la síntesis de proteínas de diferente peso
molecular dependiendo de la localización del punto de rotura. Así es posible distinguir tres
9 22 t(9;22)(q34;q11)
9 22
nuevas proteínas de fusión (p190BCR-ABL, p210BCR-ABL y p230BCR-ABL). Los puntos de
rupturas más frecuentes en el gen BCR ocurren en los exones 1(e1), 12(b2), 13(b3) y
19(e19) y el punto de ruptura en el gen ABL habitualmente se produce en el exón 2(a2) (23-
44).
Cuando se da la unión de los exones b3a2 y/o b2a2 (Región M-bcr) se codifica para
una proteína de 210kD (p210BCR-ABL) la cual se presenta en el 20% a 40% de los pacientes
con Leucemia Linfoblástica aguda (LLA) y es característica en más del 95% de pacientes
con leucemia mieloide crónica (LMC); si los exones e1 y e2 son removidos por el corte y
empalme (Región m-bcr) la unión de e1a2 se transcribe en una proteína de 190kD
(p190BCR-ABL) la cual se detecta en el 60% a 80% de los pacientes con LLA y en menos del
10% para aquellos con LMC. Es posible observar una tercer proteína de fusión próxima a
3’ del extremo distal del gen BCR denominada p230BCR-ABL, la cual resulta de la fusión de
los exones e19a2 (Región µ-bcr), cuya expresión se asocia a leucemias crónicas neutrofilas
y trombocitosis (Ver figura No. 6) (23,44).
FIGURA No. 6: LOCALIZACIÓN DE LOS PUNTOS DE ROTURA EN LOS
GENES ABL Y BCR.
Fuente: Melo J. Rev. Blood. 1996; 88:2375-2384.
Tanto la p210 como la p190 presentan una mayor actividad de tirosina cinasa
comparada con la proteína ABL normal. La proteína BCR-ABL fosforila residuos de
tirosina de muchas proteínas celulares y activa diferentes rutas de señalización, lo cual
conlleva a la transformación celular. En modelos experimentales, se ha observado que estas
proteínas son capaces de transformar precursores hematopoyéticos por la activación de
señales mitógenas, inhibición de apoptosis y alteraciones en la adhesión de las células al
estroma (25, 30-37).
Vías de señalización activadas por Bcr-Abl
Una consecuencia del incremento de la actividad de la tirosina quinasaradica en que
el BCR-ABL puede fosforilar diferentes sustratos, activando múltiples señales de
transducción en las células. Las vías activadas son RAS, vía Fosfatidilinositol-3-cinasa, Jak-
Stat, MAPK y ROS.
- Vía RAS: la activación de Ras se poduce por transducción de señales mediadas por
receptores con actividad tirosin cinasas. Una vez realizada la unión al ligando y
dimerización, los receptores tirosincinasas activados, se unen a moléculas adpatadoras
que contiene los dominios SH2 y SH3 como son Grb-2 y SHC formando complejos de
señalización con factores intercambiadores Ras en la membrana celular. Estos complejos
desencadenan una acumulación de la forma Ras e inducen un efecto antiapoptótico que,
aunque sea insuficiente, es necesario para la transformación derivada de BCR-ABL. La
activación inapropiada del gen Ras por una mutación del gen, ha demostrado ser una
importante vía de la señal de transducción celular para la proliferación y transformación
maligna de los tumores.
- Vía Fosfatidilinositol-3-cinasa: esta vía funciona en la regulación del metabolismo
lipídico fosfoinositídico y en la generación de segundos mensajeros lipídicos
relacionados con la transducción de señales. Se ha visto que una subunidad de esta
proteína se fosforila en residuos tirosina en células que expresan BCR-ABL y forma
complejos con cbl y moléculas adaptadas crk y crkl. PI3 está activado de forma
constitutiva por la translocación BCR-ABL jugando un papel importante en su
transformación (84,85).
- Vía Jak-Stat: El crecimiento de las células hematopoyéticas normales se controla por
citocinas. Los receptores para estas citocinas traducen señales mediante activación de
proteínas denominadas genéricamente Jak (Janus tirosine kinases), que es una familia de
cinasas citoplasmáticas que fosforilan y activan los factores de transcripción STAT
(Signal Transducer and Activators of transcription), BCR-ABL activa constitutivamente
las vías de señalización de JAK y STAT en células hematopoyéticas, siendo STAT 1 y
STAT 5 las tirosin-fosforiladas más importantes. La fosforilación constitutiva de factores
de transcripción STAT han sido reportados en líneas celulares positivas BCR-ABL y en
células primarias con LMC, la activación STAT 5 contribuye a la transformación
maligna a pesar de sus funciones pleiotropicas; su efecto en la transformación de células
BCR-ABL parece ser anti-apoptotico e implica la activación trasncripcional de Bcl-xl. En
contraste con la activación de la vía Jak-Stat por medio de estímulos fisiológicos, BCR-
ABL activa directamente STAT 1 y STAT 5 sin previa fosforilación de proteínas Jak (35-
44).
- Vía MAPK: un primer acontecimiento de señalización que sigue a la activación de RAS
es la activación de la vía de señalización de proteínas activadoras de mitogénesis con
actividad cinasa (MAPK). Se conocen claramente tres cascadas de MAPK: la cinasa
regulada extracelularmente (ERK), la vía de las Jun cinasas o cinasas activadas por
estrés (SAPK) y la vía de la p28 cinasa. El punto final para cada una de estas vías es la
fosforilación y activación de transcripción. BCR-ABL y v-ABL activan la vía SAPK en
fibroblastos y células hematopoyéticas. Así mismo activan promotores dependientes de
Jun de manera dependiente de RAS, MEPK y SAPK. Mientras que los efectos de BCR-
ABL en la vía JNK parecen ser claros, estudios de la vía ERK muestran que la BCR-ABL
funciona de manera distinta a la mayoría de los receptores con actividad tirosincinasa
(35-44).
- Vía ROS: la transformación de las líneas celulares con BCR-ABL presenta un incremento
de ROS, comparado con las líneas celulares no BCR-ABL. Este incremento es suficiente
para la transformación fenotípica en sí misma. Se ha sugerido que ROS podría actuar
como segundo mensajero en la regulación de la actividad de las enzimas sensibles a la
acción de oxidorreducción (redox), como son las cinasas y fosfatasas. La inhibición de la
proteína tirosin fosfatasa (PTPasa) mediante la modulación redox explicaría el amplio
espectro de las actividades biológicas de ROS. Un incremento de ROS amplifica las
señales de BCR-ABL, posiblemente regulando las proteínas redox-sensibles, como es la
PTPasa celular, la cual también está incrementada. También es de particual interés en la
LMC humana, el hecho de que un incremento de ROS pueda tener consecuencias a largo
plazo en la estabilidad genética. Los niveles de ROS no sólo son modulados por
enzimas, antioxidantes y grupos sulfhidrilos, sino también reaccionados con las bases
del ADN. Aunque las modificaciones pueden ser corregidas eficientemente por los
mecanismos de reparación de ADN, un incremnto persistente de ROS podría inducir la
acumulación de mutaciones en las células de la LMC, que podría contribuir a la
progresión de la enfermedad (35-44).
E. EVALUACION DEL RIESGO EN PACIENTES CON LEUCEMIA
La evaluación rigurosa del riesgo o posibilidad de recaida en un paciente con leucemia
es necesaria en el momento del diagnóstico para evitar un tratamiento inefectivo. Existe un
notable desacuerdo para definir los subgrupos de riesgo, sin embargo de forma común se
dividen en tres categorías: riesgo bajo, riesgo moderado y alto riesgo (44-50).
Deacuerdo con los criterios de definición de un riesgo bajo, se presenta en pacientes
con edad entre los 1 y 9 años y un recuento de leucocitos menor a 50,000/mm3, pacientes
con conteos por arriba de 50,000 leucocitos/mm3 se encuentran en un riesgo alto. Una
mejor clasificación para el riesgo se basa en marcadores genéticos, como por ejemplo: se
ha observado que niños menores a un año, los cuales son evaluados como pacientes de alto
riesgo, en el 70 al 80% presentan reordemamientos en el gen MLL el cual es un marcador
de mal pronóstico, previamente explicado, este reareglo genético junto con el gen
quimérico BCR-ABL, son dos alteraciones que se presentan con frecuencia en adultos,
colocandolos en un riesgo alto, pero marcadores como la hiperdiploidía masiva y la
reordenación TEL-AML1 se presentan con una frecuencia mayor en niños (fig 1), ambos
marcadores son de muy buen pronóstico lo cual coloca a pacientes con dichos rearreglos
como pacientes de bajo rieso, además se han observado ciertas carácteristicas en conjunto
de tal forma que pacientes que presentan hiperdiploidía masiva tambien presentan bajos
conteos de leucocitos. En el caso de pacientes con riesgo moderado son considerados
aquellos con edad inferior a un año o mayores a 10 años y un recuento superior a 50,000
leucocitos/mm3 que no presenten marcadores genéticos favorables o desfavorales (44-50).
Es por ello que la clasificación e identificación de perfiles de riesgo se realiza en
base a lo que la institución determine como parámetros claves, y ello depende en gran
medida de los recursos institucionales.
La determinación del riesgo, permite identificar la probabilidad de sobrevivencia libre
de eventos años depues del diagnóstico, es decir como por ejemplo: para pacientes con un
riesgo alto se espera que el 40% sobrevivan 10 años post-diagnóstico, por el contrario
pacientes identificados como de bajo riesgo hasta el 80% puede sobrevivir 10 años sin
eventos (recaídas) (Ver figura No. 7) (44-50).
FIGURA NO. 7: PROBABILIDAD DE SOBREVIVENCIA LIBRE D E
EVENTOS, SEGÚN EL RIESGO
Fuente: Ching-Hon P. NEJ 1995;332(24).
F. TRATAMIENTO DE PACIENTES CON LEUCEMIA
En la actualidad debido al desarrollo de terapias más efectivas, se ha incrementado
la tasa de cura de pacientes con LLA. El tratamiento se divide en tres fases:
- Induccíon a la remisión: el primer objetivo de la terapia en pacientes con leucemia es
inducir la remisión completa con el reestablecimiento de una hematopoyesis normal, la
inducción incluye el uso de glucocorticoides (prednisona o dexametasona, esta última
ofrece una vida media mayor y penetracion en LCR, por lo que es más segura). Por otro
lado la vincristina y la asparginasa (para evitar recaidas en el sistema nervioso central)
para niños o antraciclina para adultos, ha llevado a tasas de remisión completa de 97 a
99% en niños y de 75 a 90% en adultos. (50-62).
- Intensificacion de la terapia o consolidación: Los pacientes que logren el
reestablecimiento de la hematopoyesis, pueden seguir a la fase de consolidación. El
tratamiento es aplicado en poco tiempo después de la inducción, entre las drogas se
encuentran altas dosis de metrotrexato con o sin 6-mercaptopurina (50-62).
- Continuación de tratamiento: es una prolongación en el tratamiento para eliminar
cualquier posibilidad de que existan células malignas en el post tratamiento (55).
Otras posibilidades de tratamiento son:
- Profilaxis del sistema nervioso central (SNC): esto se debe como consecuencia de que el
SNC puede ser un reservorio de células malignas, sin embargo niveles altos de
quimioterapia sistémica eliminan la necesidad de irradiación craneal, en ciertos casos
(50-62).
- Trasplante de progenitores hematopoyéticos: este se recomienda en el caso de pacientes
que no logran un remisión inicial, pacientes que presentan una segunda recaída después
de la remisión hematológica, y en niños con LLA en los cuales se lleva una terapia de
más de 36 meses con antimetabolitos, sin remisión. Debido al pronóstico desfavorable
de los pacientes con reordenamiento BCR-ABL, se indica un trasplante cuando se logra
la primera remisión (50-62).
Los pacientes con reordenamiento BCR-ABL requieren de regímenes más
agresivos, en la actualidad en el caso de pacientes con LLA se recomienda el trasplante de
médula ósea que provee de un 30% de remisión, el mesilato de imatinib (Gleevec), el cual
es un inhibidor de la actividad tirosin cinasa (que genera la fusión BCR-ABL), se ha
incorporado en los regímenes de mantenimiento de pacientes con LLA positiva al Ph (55-
62).
En el caso de la LMC, el objetivo del tratamiento es la prevención de una crisis
blástica (ver LMC), ya que cuando ocurre el pronóstico es muy pobre, aunque se puede
lograr una rápida reducción de conteo de células blancas con quimioterapia (bilsulfán o
hidroxiurea en la crisis blástica), sin embargo estas drogas fallan en prevenir la progresión
de la enfermedad. El interferón alfa (IFN) fue el primer agente en modificar la historia
natural de la LMC prolongando la sobrevida en pacientes con una remisión hematológica
completa (<35% de células Ph positivas). Un segundo avance en la tratamiento de la LMC
ocurre cuando el 60-80% de pacientes trasplantados presenta una sobrevida libre de eventos
de 5 años, pero tanto el INF como el trasplante son considerados como posibles inductores
de toxicidad para la LMC. En el año 2001, se reporta que estudios que utilizan como
tratamiento el mesilato de imatinib (Gleevec), presentan altas tasas de remisión
hematológica completa. (50,52,55).
G. ENFERMEDAD MINIMA RESIDUAL (EMR)
La EMR consiste en la persistencia de un clon anormal, aún en niveles bajos,
durante o tras finalizar el tratamiento. La EMR tiene significado pronóstico ya que predice
la recaída de la enfermedad y por este motivo, conocer su presencia ayuda a plantear
estrategias terapéuticas que permitan prevenirla (14,131-135).
Las técnicas para determinar la EMR, se basan en monitorear la presencia de un
marcador asociado a la enfermedad por determinados períodos, hasta determinar su
ausencia total. Esta evaluación del marcador citogenética se puede realizar por distintas
técnicas como cariotipo, Hibridación in situ con Fluorescencia –FISH-, reacción en cadena
de la polimerasa – PCR- y Reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real –RQ PCR-
(50-62).
PARTE III
RESULTADOS
TABLA No. 3: RESULTADOS DE LOS CUATRO MONITOREOS DE LOS PACIENTES ANALIZADOS
CODIGO GENERA
L
RESULTADO PRIMER
MONITOREO (%IS)
RESULTADO SEGUNDO
MONITOREO (%IS)
RESULTADO TERCER
MONITOREO (%IS)
RESULTADO CUARTO
MONITOREO (%IS)
OBSERVACIONES
12-LMC 1.21 2.95 0.20 0.19
Fecha de diagnóstico 04/11/2010
13-LMC 0.35 0.0496 0.003
No se presentó Fecha de diagnóstico
19/01/2010
14-LMC Indetectable 0.02 0.003 0.003 Fecha de diagnóstico
06/12/2010
15-LMC 0.40 0.022 0.012 0.004
Fecha de diagnóstico: 04/11/2010
16-LMC 2.83 48.33
50.25
No se presentó
Fecha de diagnóstico: 01/10/2010 Resistencia a Glivec, es necesario cambiar a Nilotinib pero no se cuenta con los recursos necesarios. Medico tratante sugiere ingreso al IGSS para recibir el medicamente de la institución, sin embargo no ha sido posible.
17-LMC 3.51 No se presento 0.029 No se presentó
Fecha de diagnóstico: octubre del 2010
18-LMC 8.11 41.22
31.38
32.92
Fecha de diagnóstico: Enero del 2010 Posible Resistencia, no fue posible hablar con el médico tratante sobre la evolución del paciente.
19-LMC 16.72 0.56 0.61
0.73
Fecha de diagnóstico: 30/09/2010
20-LMC No se presentó No se presentó 35.28 48.79
23-LMC 10.51 No se presentó
No se presentó
No se presentó
Fecha de diagnóstico: 05/04/2004 Falleció, no se tienen datos exactos de la fecha de fallecimiento o las causas del mismo.
24-LMC
15.44 0.53
0.31
0.093
Fecha de diagnóstico: 09/02/2011
36-LMC
0.13 0.17
No se presentó
0.030
Fecha de diagnóstico: 03/11/2009 No se presento el día de la jornada, sin embargo se logro tomar muestra de sangre del paciente el día de la consulta en el Hospital San Juan de Dios. No se ha procesado y sigue en espera de que entren mas muestras.
37-LMC 0.12 0.16 0.12
0.052
Fecha de diagnóstico 09/07/2010
38-LMC 1.16 1.22 0.67 0.56
Fecha de diagnóstico 10/01/2011
39-LMC 2.68 40.19
13.37
7.93
Fecha de diagnóstico 28/12/2007 Paciente con buena adherencia al tratamiento, sin embargo presenta resistencia a Glivec. Presento toxicidad al inicio del tratamiento, a la fecha tolera la dosis de 400 mg/dia. La resistencia se debe posiblemente a las dosis bajas y medicación con suspensión parcial e intermitente.
40-LMC 0.81 0.81 0.18
0.28
Fecha de diagnóstico: 11/01/2008
41-LMC 0.46 No se presento 0.13
indetectable
Fecha de diagnóstico: 12/07/2010
42-LMC 0.26 0.10 0.64
15.29
Fecha de diagnóstico: 15/10/2010
43-LMC 1.45 No se presento
No se presentó 0.64 Fecha de diagnóstico. 08/09/2010
Fecha de diagnóstico 06/07/2005 Resistencia a Glivec. Toma actualmente 800 mg/ día de Glivec sin embargo no responde al tratamiento.
45-LMC 0.09
BCR-ABL: 1,444,219.5
ABL:47,373.125
RATIO: 30.4860
falleció
falleció
Fecha de diagnóstico: 03/06/2010 Falleció el 24 de Octubre de 2011, sexto día de quimioterapia para la inducción a la remisión, como consecuencia de hemorragias múltiples. Fenotipo compatible con LMA.
46-LMC 2.86 0.0097
0.003
No se presentó
Fecha de diagnóstico: 19/12/2006 Paciente con tratamiento con Glivec desde 2007 y sin alcanzar respuesta molecular mayor. Presento toxicidad al Glivec, por lo que medico tratante decide cambiar a 400 mg/día de Tasigna en agosto de 2011. Obteniendo buenos resultados.
47-LMC 1.24 0.22
0.24
0.23 Fecha de diagnóstico: 23/01/2003
48-LMC 0.10 0.098
0.022 No se presentó Fecha de diagnóstico: 13/10/2010
49-LMC 13.59
BCR-ABL: 17,167.045
ABL:12,581.998
RATIO: 136.44
333.73
108.459
Fecha de diagnóstico: 25/04/2005 Paciente resistente a Nilotib, actualmente no existe otra opción de tratamiento.
50-LMC 36.47 No se presento 1.25
14.66
Fecha de diagnóstico: 04/05/2011
59-LMC 0.26 No se presentó
indetectable
indetectable
Fecha de diagnóstico: Abril del 2011 Paciente con ingreso reciente al estudio.
60-LMC 2.50 0.30
0.42
No se presentó
Fecha de diagnóstico: Marzo del 2011 Paciente con ingreso reciente al estudio
61-LMC 98.49 No se presentó
3.71 0.19
Paciente con ingreso reciente al estudio. Paciente diagnosticada en 6 de Septiembre de 2011, inicio tratamiento el 11 de octubre Glivec 300 mg/día. Se sugiere esperar respuesta.
62-LMC 19.84 No se presentó
0.11
0.023
Fecha de diagnóstico: noviembre del 2008. Paciente con ingreso reciente al estudio. Tiene 3 años de tratamiento con Glivec y no muestra mejora completa, posible resistencia al tratamiento por no alcanzar respuesta molecular mayor ante el tiempo de tratamiento.
En la tabla No. 3, presentada anteriormente se observa un resumen de los valores en %IS
obtenidos en cada uno de los monitoreos por paciente; así como la fecha de diagnóstico y
algunos datos clínicos de interés. En los anexos 2 al 7, se observan los datos y gráficas
obtenidos por las corridas de muestras en PCR en Tiempo Real.
Según Baccarani, et al. Se indica en la tabla No. 4 a continuación los parámetros que se
utilizan para clasificar la respuesta al imatinib como óptima, subóptima y fallo a terapia; y
que fueron los parámetros utilizados para la clasificación de respuesta a tratamiento que se
muestra en la tabla No. 4. (63-70)
TABLA 4: EVALUACIÓN DE LA RESPUESTA AL TRATAMIENTO IMATINIB