CUANTIFICACIÓN EN CITOMETRÍA DE FLUJO · 0.1% • Calibración de partículas fluorescentes utilizadas • Exactitud y reproducibilidad del pipeteo . T.A.M.O ... (Eritroblastos)

CUANTIFICACIÓN EN

CITOMETRÍA DE FLUJO Dra. Mónica Saracco

Instituto de Investigaciones

Biomédicas en Retrovirus y SIDA (ex CNRS)

CONCEPTO DE

CUANTIFICACIÓN

• Medición de células presentes en el

organismo normalmente, cuyo valor

relativo y/o absoluto tendrá suma

importancia para la toma de decisiones

diagnósticas y/o terapéuticas

¿QUÉ SE CUANTIFICA ?

• Poblaciones y sub-poblaciones

linfocitarias

• Células CD 34

• GB para depletar UGR y/o plaquetas en

transfusión

CONSIDERACIONES PARA

CUANTIFICAR

• DOBLE PLATAFORMA

• PLATAFORMA SIMPLE

• CONTROLES INTERNOS DE CALIDAD

• CONTROLES EXTERNOS DE CALIDAD

• CRITERIOS PARA INFORMAR

METODOLOGÍA

• DOBLE PLATAFORMA

• MEDICIONES SIMULTÁNEAS

• MUESTRAS SIN LAVADO

• TODOS LOS EQUIPOS CONTROLADOS

• SIMPLE PLATAFORMA

• MUESTRAS SIN LAVADO

• EVALUACIÓN DE LAS BEADS

CONTROLES DE CALIDAD INTERNOS

• Estado de la

muestra

• Calibración de

pipetas

• Control del contador

hematológico

• Reproducibilidad en

los hemogramas

• Control del citómetro

(Limpieza, canales de

fluorescencia, óptica)

EXTERNOS

• Controles de calidad

con reconocimiento

nacional e

internacional

(QASI-Program,

CAP, ProgBA)

• Evaluar y modificar

los parámetros en

base a ellos

FUENTES DE HPC

• MO

• SP movilizada

• Sangre de cordón

• Movilización con factores de crecimiento GMCSF, GCSF

• Movilización con QT

• Recolección con leucoaféresis

PBSC MO Autóloga • Menor contaminación

tumoral

• Engraftment más corto

• Recolección fácil

• Menos efectos

adversos (vol.

menores)

• Procesos ex-vivo

(manipulación

genética, purga

tumoral, selección + de

CD34)

• Mayor

contaminación

• Mayores volúmenes

• Recolección más

compleja

IDENTIFICACIÓN DE HPC

• Propiedades funcionales

• CFU-GM 10-14 días para la lectura de

resultados

• CD34 proteína glicosilada tras-membrana PM:

105-120KD, rol protector contra daño

proteolítico (mediado por ENZ.), por su gran n°

de sitios glicosilados

• Marcador confiable para reconocer células

mononucleares de MO (1%) que incluyen a las

HPC

HPC

• HPC CD34+ es una población heterogénea

que incluye a las stem cell pluripotentes así

como a los precursores diferenciados a linaje

• Monitoreo de CD34+ en SP permite

establecer el momento óptimo de recolección

por leucoaféresis, el pico depende del

protocolo utilizado

• N° de células CD34+ infundidas es predictivo

de la sobrevida del paciente post-transplante

FUNDAMENTOS

MÉTODO ISHAGE

Control Isotipo

• Puede enmascarar

CD34+ auténticos

• No se recomienda

para establecer

región de

positividad

• Se recomienda

CD45 FITC/ Isotipo

PE

AC. Anti CD34

• Selección del clon

adecuado

• Selección de

Fluorocromos PE,

PECY5, APC

• Menor

autofluorescencia,

menor unión a FC

R1 R2

R3R4

Método ISHAGE

ASPECTOS TÉCNICOS • N° de eventos

analizados = 75.000

eventos CD45+

• (mínimo 100 células

CD34+)

• Asegura precisión

• WCB <10X109 l,

100 ul de SP/

Aféresis. Incubar

20 30 min. 4°C

• Incluir todas las

células nucleadas

y se pueden

eliminar las

muertas con

tinciones nucleares

• 24hs 98%

viabilidad

CD45

• Antígeno CD45

Pan Leucocitario

• Negativo en GR y

plaquetas

• Denominador de

leucocitos para el

recuento absoluto

de CD34

• Lisis de GR

• Mejor recuperación

celular

• Menor tiempo

• Lavados pérdida

de CD34+

RECUENTO ABSOLUTO

SIMPLE PLATAFORMA • Más sencillo

• Mayor

estandarización

inter-laboratorio

• Se evitan errores

inherentes al uso

de un 2° equipo

• Errores de 0.06% a

0.1%

• Calibración de

partículas

fluorescentes

utilizadas

• Exactitud y

reproducibilidad

del pipeteo

T.A.M.O

Reconstitución Hematopoyética

• Neutrófilos > 0.5 X 109 l

• Plaquetas > 20 X 109 l

• 2X106 a 8 X106 células CD34+/Kg de peso

• Rango varía según patología y QT realizada

• Reconstitución tardía

0.5 X 106 a 2.0 x 106 células CD34+/Kg de peso

• Células precursoras primitivas CD34+/ CD38 neg o débil, HLA-DR neg/ débil

• CD90, CD133, CD13

(precursoras primitivas)

• Progenitores con diferenciación a linaje

CD71, CD13 (H), TdT,

CD19, CD10, MOP

RECUENTO ABSOLUTO

LTCD3/CD4+

• DOBLE

PLATAFORMA

• Hemograma

• S/lavado

• CMF 3 colores/ 4

colores

• Más económica

• Requiere mayor

control (2 equipos)

• PLATAFORMA

ÚNICA

• Tubos Tru-Count

• 4 Colores

• S/Lavado

• Encarece el método

• Utiliza solo 1 equipo

• Evaluar

reproducibilidad

CONTROLES DE CALIDAD

Control de calidad interno

• Trazabilidad y reproducibilidad de equipos utilizados

• Controles comerciales o Sangre periférica normal

Control de calidad

externo

• Sangre

estabilizada

CDC RECOMENDACIONES

• Repetición de 1 MoAb en la determinación de CD3/CD4 y CD3/CD8

• La suma de CD3/CD4 y CD3/CD8 deberá ser igual al valor del CD3 +/- 5 a 10%

• La suma de LT CD3+, LB CD19+, células NK deberá ser igual al 100% +/- 5-10% en poblaciones linfocitarias periféricas

• No realizar lavados

MATERIALES Y MÉTODOS

• 5ml de SP con EDTA en tubos Vacutainer

• Marcación con 50 ul de sangre entera

bien homogeneizada / 5 ul de MoAb

• Incubar 15 a 20 minutos, T° ambiente

• Lisado con distintos métodos

• Hacer la CMF

EVALUACIÓN PREVIA CMF

• 1) SP sin presencia de coágulos

• 2) Dentro de las 24 hs de extracción

• 3) Hemograma con reproducibilidad

• 4) Evaluar todos los parámetros del

mismo, GR, GB, Plaquetas

• 5) Repetir en caso de leucopenia o

leucocitosis

EVALUAR DURANTE LA CMF

• Método de lisis

• Presencia de GR nucleados

(Eritroblastos)

• Pureza de la región seleccionada (baja en

monocitos)

• Evaluar la presencia de células dobles

positivas

¿CUÁNDO SE DEBERÁ

REPETIR UNA MUESTRA?

• Mala lisis de GR (no se puede establecer

una clara diferencia entre linfocitos,

monocitos y granulocitos)

• La suma de valores CD3/CD4 y

CD3/CD8 supera ampliamente al CD3

(sin observar células dobles positivas)

• Valores de CD3 inferiores al 50% (sin

alteraciones de lisis presentes)

¿CUÁNDO DEBO MEDIR

TODAS LAS POBLACIONES Y

SUB-POBLACIONES

PERIFÉRICAS?

• Siempre sería lo correcto

• Indispensable, con valores bajos menores

al 50% de CD3 total

• Evaluar células B (CD19 positivas)

• Evaluar células NK (CD56-16 positivas)

PROTOCOLOS DE ANÁLISIS

• Región morfológica

FSC vs. SSC

• Región en base

a MoAb (CD45)

vs. SSC

• TRI-Test

CD8/CD4/CD3

• CD3/CD4/CD45

CD3/CD8/CD45

• Multi-Check

CD3/CD8/CD4/CD45

GATING: Estrategia de análisis

R1

Estudio de poblaciones heterogéneas Selección de eventos

Density Dot Plot Contour Plot

Los colores informan la Identificación de las poblaciones

frecuencia de los eventos mediante líneas de contorno

Análisis de 3 colores

R1

COULTER EPICS XL

Tri-Test CD4/CD8/CD3

• Gate morfológico (FSC vs SSC)

Simul-Test CD3/CD4/CD45

CD3/CD8/CD45

• Gate en SSC vs. CD45

FACS CANTO 4 COLORES

CD3/CD8/CD45/CD4

CD3/CD56-16/CD45/CD19

Se utilizan con Doble Plataforma

(Hemograma+Citometría) Clinico

Simple Plataforma con tubos Tru-Count

DIVA

MULTI-TEST

PROTOCOLO

• Donantes de banco de sangre

• Serología negativa

• 105 muestras obtenidas post-donación

• Vacutainer con EDTA

• Procesadas en el día

COMPARACIÓN DE CMF Y

SOFTWARE

CMF

SOF

T

CD3 CD4 CD8 CD19 CD56

BDS

P

1361

(1038-1717)

898

(662-1042)

437

(298-670)

234

(176-323)

187

(149-299)

BDD

P

1375

(1057-1724)

883

(654-1122)

408

(315-601)

229

(157-341)

195

(143-302)

CL45 1367

(1080-1691)

894

(677-1076)

413

(307-623)

236

(160-330)

182

(154-280)

CLTT 1327

(1058-1658)

837

(650-1076)

420

(312-625)

LEUCODEPLECIÓN

• Remover los leucocitos de una UGRD o

de C. plaquetarios con el fin de prevenir

la aloinmunización a antígenos HLA

• Previene la repetición de reacciones

febriles no hemolíticas

• Utilizado en pacientes poli-transfundidos

METODOLOGÍAS DE

LEUCODEPLECIÓN

• En etapa pre-almacenamiento por filtros

integrados a equipos de recolección

• En etapa post-almacenamiento (bed-side)

por medio de filtros

LEUCO-COUNT

• Muestras de sangre Pre y Post filtración

• Recuento de GB automático o manual

con cámara de Nageotte

• Se marca para CMF con IP (tinción para

DNA/RNA) presente en células nucleadas

ausente en GR y plaquetas

• Tubos Tru-Count para recuento absoluto

de GB presente en las muestras.

• Controles 1.9 GB/ul +/- 1.5 (bajo) y 2.5

GB/ul +/- 1.5 (alto)

MUESTRA PRE FILTRADA

MUESTRA POST FILTRADA

Muchas Gracias