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Desarrollo de Herramientas
Moleculares para el estudio de
enfermedades transmitidas porgarrapatas
Marisa Farber, PhDInst. Biotecnologia
INTA (National Institute for Agricultural Technology)
Buenos Aires, Argentina
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Babesiosis: Babes ia bov i s, Babes ia b igem inaAnaplasmosis: Anaplasma marg ina le.
En Argentina:
Las prdidas econmicas directas por reduccin de peso o mortalidad, y loscostos para el tratamiento y la prevencin de estas enfermedades, mediantevacunas vivas en la Argentina, se han estimado en US$ 38.9 millones al ao.
Tristeza bovina (Bovine Tick-Borne Diseases)
65W
33S
30S
Boophi lus microplus
Babesia enzootic area A. marginale enzootic area
Ticks & TBD free area
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Babesiosis: Babes ia bov is ,
Babes ia b igemina
Anaplasmosis: Anaplasma marg inale
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Ciclo de vida
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RELEVANCIA SOCIAL, ECONOMICA Y
PRODUCTIVA DEL PROBLEMA Demanda de alimentos en el mundo
Devaluacin del peso en el 2001, la suba del tipo de cambio real,
crecimiento de la economa Suba de precios internacionales
Ao Produccin (*) Exportacin (**) Expo/Prod. (%)
2000 2.489 342 12,6%
2001 2.526 152 6,1%2002 2.664 351 13,9%
2003 3.024 392 14,7%
2004 3.132 631 20,9%
2005 3.132 771 24,6%
2006 3.030 565 18,6%
(*) miles de toneladas res (**) miles de toneladas res con hueso
Fuente: SAGyPA
PRODUCCION DE CARNE VACUNA 2000-2006
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Distribucin de la produccin ganadera en
Argentina
Stock de 49.000.000 bovinos
Pampa hmeda concentra el 60%
NEA posee el 24% del stock
NOA tiene el 8,4%
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LABORATORIO DE HEMOPARASITOS
Un poco de historia
Comenz por el Diagnstico
Continu con Vacunas Se extendi a la Epidemiologa
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Aprovechamiento de la informacin
genmica para el desarrollo de
herramientas aplicadas al Estudio de la
Babesiosis y Anaplasmosis Bovinas
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GENOMAS
EPIDEMIOLOGIA DIAGNOSTICO
GENOMICA FUNCIONAL: ANTIGENOS VACUNAS
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En qu trabajamos?
Produccin de antgenos recombinantes paradeterminaciones serolgicas
Desarrollo de nuevos mtodos de diagnstico
Herramientas para aplicar a estudios epidemiolgicos
Estudios bsicos Protenas de exportacin y factores de virulencia
en Anaplasma
- Familia de Perforinas en Babesia sp. Bsqueda de nuevos antgenos
Sistemas de expresin heterloga
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En qu trabajamos?
Produccin de antgenos recombinantes paradeterminaciones serolgicas
Desarrollo de nuevos mtodos de diagnstico
Herramientas para aplicar a estudios epidemiolgicos
Estudios bsicos Protenas de exportacin y factores de virulencia
en Anaplasma
- Familia de Perforinas en Babesia sp. Bsqueda de nuevos antgenos
Sistemas de expresin heterloga
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La tcnica de Reverse Line Hybridization (RLB) puede serutilizada para la deteccin simultnea de diversas especies cepas de parsitos en muestras de aislamientos.
La introduccin de la sonda general (catch all) permite ladeteccin de parsitos an no descriptos.
Se ha desarrollado este mtodo para parsitostransmitidos por garrapata tales como Theileria ssp.,Babesia ssp., Ehrlichia ssp. y Anaplasma ssp.
Permite la caracterizacin de numerosas muestras en unmismo ensayo partiendo de un producto de PCR.
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RLB
Primers:
Anaplasma ssp.HER-F: AGAGTTGGATCMTGGYTCAG
EHR-R: AGAAGAAGTCCCGGCAAACT
Babesia ssp .
RLB-F2: GACACAGGGAGGTAGTGACAA
RLB-R2: B-CTAAGAATTTCACCTGTGACAGT
Sondas:
A. centrale especfica:
TCGAACGGACCATACGC
A. marginaleespecifica:
GACCGTATACGCAGCTTG
Anaplasma ssp. catch all:
GGGGGAAAGATTTATCGCTA
B. bovis especfica:CAGGTTTCGCCTGTATAATTGAG
B. b igeminaespecfica:
CGTTTTTTCCCTTTTGTTGG
Babes ia ssp. cat ch al l.
CTGTCAGAGGTGAAATTCT
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Reverse Line Blot Hybridization para la deteccin
e identificacin de Babesia spp y Anaplasma spp.
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Deteccin de polimorfismo en la sonda especfica
para B. bigem ina
Observations Name
Currenly used probe MEXICO C G T T T T T T C C C T T T T G T T G G
BgM2P C G T T T T T T C C C T C T T T T C G G CLONED Jul-04
C G T T T T T T C C C T C T T T T T G G
G G G C
T
C G T T T T T T C C C T C T T T T C G G
C G T T T T T T C C C T T T T G T T G G
C G T T T T T T C C C T G G T T T T G G
C G T T T T T T C C C T C G T T T T G G
BgS1A C G T T T T T T C C C T G G T T T T G G CLONED Jul-04
C G T T T T T T C C C T G G T T T T G G
C
BgS2P C G T T T T T T C C C T C T T T T C G G CLONED Jul-04
BgS2P.clone1 C G T T T T T T C C C T C G T T T T G G C LO NE D S ep -04
BgS2P.clone2 C G T T T T T T C C C T C T T T T C G G C LO NE D S ep -04
BgS2P.clone3 C G T T T T T T C C C T C T T T T C G G C LO NE D S ep -04
C G T T T T T T C C C T C T T T T C G G
G T
C G T T T T T T C C C T C G T T T T G G
G T
C G T T T T T T C C C T G G T T T T G G
C T G
T
C G T T T T T T C C C T G T T T T T G G
T G G C
C
Secuencias para membrana
C G T T T T T T C C C T T T T G T T G G
C G T T T T T T C C C T C T T T T C G G
C G T T T T T T C C C T G G T T T T G G
C G T T T T T T C C C T C G T T T T G G
B. bigemina P
B. bigemina A
B. bigemina T
B. bigemina M
BgS1A
Possible options for BgM2P sequences
BgS2P
Pathogenic B. bigeminafrom Alen-Cue,
Corrientes, ArgentinaBgM1P
AttenuatedB. Bigemina
PathogenicB. bigemina
BgM2P PCR
Sequence
Reference sample
Details
PCR Nov-04
Nov-04
AttenuatedB. Bigemina from Alen-Cue,
Corrientes, ArgentinaBgM1A PCR Nov-05
Sep-II-04
PCR Sep-II-04
PCR
Pathogenic B. bigeminafrom Chavarria,
Corrientes, Argentina
PCR Nov-05
B. bigeminafrom Brasil PCR Nov-05
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Reverse Line Blot Hybridization para la deteccin
e identificacin de Babesia spp y Anaplasma spp.
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Deteccin de B. bigeminapor PCR:
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Inmunosensor ptico basado en MSP5 para el
diagnstico de A. marginale
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0
1
2
3
4
5
6
7
10-20
21-30
31-40
41-50
51-60
61-70
71-80
81-90
91-100
>101
F.A.U at 670 nm
Numberofsera
Anaplasma spp uninfected cattle
Anaplasma spp infected cattle
Distribucin de Unidades Arbitrarias de Fluorescencia (F.A.U) de 12 sueros
negativos (barras negras) y 9 sueros de bovinos infectados con A. marginale.
PositivosNegativos
Positivos 25 6
IS
Negativos 1 1
Valor de corte: 40 F.A.USensibilidad 95%
Especificidad 83%
Concordancia entre las dos
pruebas: 88%
Comportamiento del inmunosensor en muestras de campo: concordancia con el
ELISAc como gold standard
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En qu trabajamos?
Produccin de antgenos recombinantes paradeterminaciones serolgicas
Desarrollo de nuevos mtodos de diagnstico
Herramientas para aplicar a estudios epidemiolgicos
Estudios bsicos Protenas de exportacin y factores de virulencia
en Anaplasma
- Familia de Perforinas en Babesia sp. Bsqueda de nuevos antgenos
Sistemas de expresin heterloga
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Muestreo NEA y NOA
Diseo del muestreo: Establecer zonas de riesgo en funcin del nmerode generaciones de garrapatas que nos permite definir 3 regiones de baja,media y alta transmisibilidad respectivamente, las cuales se asocian
indirectamente las condiciones climticas, uso de garrapaticida, etc.
Hiptesis de trabajo: Definir marcadores moleculares que permitanasociar los indicadores de riesgo con la variabilidad gentica de los
aislamientos.
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Marcadores moleculares
Regiones repetidas en tandem en genes que codifican paraprotenas de superficie:A. marginale (MSP1a), B. bovis (Bv80, TRAP,P200, Antigen 3, Desmoyokin), B bigemina (P200, PLP)
MACF
Primer For
Primer Rev
1 2 3 4 5 6 7 8 9
PCR amplification of the repeat region fromdifferent isolates of 1:BgS2P,2:BgS1A, 3:BgM1P, 4:BgM1A, 5 and 6:BgMx
(Jg29), 7:BgBr, 8:BgM2P, 9:negative control.
B. bigemina.
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Marcadores moleculares
VNTR (Variable number of tandem repeats) :A. marginale (AMTR 15 yAMTR11). En desarrollo para Babesia sp
MLST (Multilocus Sequence Typing): seleccin de los genes blanco(housekeeping genes), determinacin de la especificidad,secuenciacin de los fragmentos amplificados, bsqueda depolimorfismo de nucletidos simples (SNPs), determinacin de la tasade sustitucin para verificar que los genes seleccionados respondan amodelos de evolucin neutra.
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DataBase
The ACCESS data base (DB) includes information about4189 bovine samples from Northeast (1198) andNorthwest (2991) Argentina.
DB fields correspond to information describing sampling(date, responsible, place of work), the field (region,province, locality, department, field coordinates), thecattle (breed, age, tick control strategies), the sampleevaluation (ELISA, PCR, RLBH), molecularcharacterization: Polymorphic genes, VNTR, MLST.
Based on the information required, different queries weredesigned. These queries enable the DB user to easilyextract information about the 4189 samples.
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RLBH detection
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
%Bbo
tot
%Bbi
tot
%Am
tot
%Eo
tot
%Bbo
%Bbi
%CA+
Bbo-Bb
i-
%Am
%Eo
%Neg
%Bbo
Bbi
%Bbo
Am
%Bbo
Eo
%Bbi
Am
%BbiEo
%AmEo
%Bbo
Bbi
Am
%Bbo
BbiEo
%Bb
iAmEo
%Bbo
AmEo
%Bbo
Bbi
AmEo
NEA
NOA
Total
La proporcin de animales co-infectados conA. marginale y Babesia sp result
significativamente alta (P
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En qu trabajamos?
Produccin de antgenos recombinantes paradeterminaciones serolgicas
Desarrollo de nuevos mtodos de diagnstico
Herramientas para aplicar a estudios epidemiolgicos
Estudios bsicos Protenas de exportacin y factores de virulencia
en Anaplasma
- Familia de Perforinas en Babesia sp. Bsqueda de nuevos antgenos
Sistemas de expresin heterloga
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Seleccin de antgenos candidatos
PCR sustractiva
Library phoA Bibliografa
Bioinformtica
Antigeno Identificacin Caractersticas
TolC Library PhoAC OMP conservada.
Sistema secrecin TipoI.OMP85 Library PhoAC OMP conservada.
Antgeno protectivo
OMP 4 Library PhoAC Familia de antgenos superficie
PhoAc Library PhoAC OMP Cluster conservadopatgenos y simbiontes
intracelulares.
L22 PCR sustractiva
Adh Dominiostransmembrana
Probable adhesina
AM 742 Dominiostransmembrana
Hypotetical protena -
Caracterizacin bioinformtica
Verificar la transcripcin
Expresin de protenas recombinantes
Ensayos de linfoproliferacin
Perfil de estimulacin de citoquinas
Western blot
Inmunogenicidad de protenas de membrana o exportacin
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Los genes que codifican protenas
exportadas pueden identificarse mediantefusiones traduccionales al gen de la fosfatasaalcalina (phoA) de Escherichia col i.
La actividad de fosfatasa alcalina se manifiesta
cuando la enzima se encuentra fuera del mbito
citoplasmtico.
El gen reportero phoA utilizado no poseesu promotor ni la regin que codificael pptido seal amino terminal.
La actividad PhoA se detecta fcilmenteutilizando BCIP como sustrato.
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Actividad de PhoA de acuerdo con la localizacin subcelular
Membrana externa
CITOPLASMA
MEDIO EXTERNO
PERIPLASMA
Membrana interna
NH2
NH2
NH2
NH2NH2
NH2
NH2
NH2
PhoA enzimticamente inactiva
PhoA enzimticamente activa
Segmento hidrofbico
de transmembrana
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Bsqueda de protenas exportables
Clonado y expresin de fusiones a
PhoA en Escherichia coliCC118
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Caracterizacin bioinformtica
Seleccin de antgenos candidatos
Verificar la transcripcin
Expresin de protenas recombinantes
Ensayos de linfoproliferacin
Perfil de estimulacin de citoquinas
Western blot
Inmunogenicidad de protenas de membrana o exportacin
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PredictedORF
Signalpeptide
TMDomains Conserved
domainBlast2GO Uniprot
Ortologos
ID Name Annotation Nucleotide Signal P TM Pred
Conservedcluster withinintracellular
pathogens andendosymbionts
AM1108
PhoACHypothetical
protein2076 +
1Pentapeptide
repeat
Pentapeptiderepeat
Pentapeptiderepeat domain
protein2
AM127
L22Hypothetical
protein3000 +
1B-Lectin
-Acetamidaseformamidasefamily protein2
AM
216
AdhHypothetical
protein
2529 +
- Conservedcluster within
Anaplasmasand Ehrlichias1
PhoAC Orf L22 Adh
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Verificar la transcripcin
Seleccin de antgenos candidatos
Caracterizacin bioinformtica
Expresin de protenas recombinantes
Ensayos de linfoproliferacin
Perfil de estimulacin de citoquinas
Western blot
Inmunogenicidad de protenas de membrana o exportacin
Confirm la expresin de los
genes candidatos
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Expresin de protenas recombinantes
Inmunogenicidad de protenas de membrana o exportacin
Seleccin de antgenos candidatos
Caracterizacin bioinformtica
Verificar la transcripcin
Ensayos de linfoproliferacin
Perfil de estimulacin de citoquinas
Western blot
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Ensayos de linfoproliferacin
N IDInfectados/ no
infectadosMsp5-PCR
ControlNo
infectado- -
282 Infectado Aguda +
285 Infectado Crnico +
99 Infectado Crnico +
Inmunogenicidad de protenas de membrana o exportacin
Seleccin de antgenos candidatos
Caracterizacin bioinformtica
Verificar la transcripcin
Expresin de protenas recombinantes
Perfil de estimulacin de citoquinas
Western blot
Ensayos con animales naturalmenteinfectados (Mercedes, Corrientes)
Confirm la infeccin por pcrdiagnostica del gen msp5Respuesta positiva fuerte para PhoAC ORF yAdh Cterm ymas dbil para los antgenos L22 N term y Adh Nterm
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msp5 PhoAC Adh- Adh+
L22 Cterm PhoACPhoAc 5
Western blot
Seleccin de antgenos candidatos
Caracterizacin bioinformtica
Verificar la transcripcin
Expresin de protenas recombinantes
Ensayos de linfoproliferacin
Perfil de estimulacin de citoquinas
Inmunogenicidad de protenas de membrana o exportacin
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RT qPCR Citokine expression profile
AM1108 PhoAC ORF
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
5
IL2 IL10 IL12p35 TNF INFFactorofUP-regulatation
AM216 Adh-
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
5
IL2 IL10 IL12p35 TNF INF
Results were presented as ratios calculated with the Relative expression software tool (REST@)
application described by Plaffl et al. The value of PCR efficiency for all transcripts was 2, as
calculated following the formula: E = 10[-1/slope].
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Regulation factor of cytokine profile
IL2 IL10 IL12p35 TNF IFN Enhanced expression
PhoAC 1,18 1,39 1,49 2,71 1,98 TNF, IFN
Adh- (C-term) 1,41 2,27 1,46 1,63 2,52IL2,IL10, IL12, TNF,
IFN
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Caracterizacin bioinformtica
Seleccin de antgenos candidatos
Verificar la transcripcin
Expresin de protenas recombinantes
Ensayos de linfoproliferacin
Perfil de estimulacin de citoquinas
Western blot
Inmunogenicidad de protenas de membrana o exportacin
Identificacin y caracterizacin de nuevos
antgenos candidatos capaces de estimularuna respuesta inmunolgica especfica
Blancos potenciales para ser
estudiados en nuevas
formulaciones vacunales.
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Twin arginine translocation pathway: TAT system
Sistema de traslocacin de protenas plegadas a travs de lamembrana interna de bacterias Gram-negativas.
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Identificacin de los componentes del sistema: tatA, B y Cy su organizacin
en el genoma en las alphaproteobacterias.
Twin arginine translocation pathway: TAT system
Estudio la transcripcin de los genes y la regulacin.
Funcionalidad de tatABCen sistema heterologo de mutantes de Escherichia
coli.
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Identificacin de los componentes del sistema: tatA, B y Cy
su organizacin en el genoma
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Anaplasma marginale Brucella abortus
tatAB tatBC tatC-Ser
A
B
Dispersa Operon
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Funcionalidad de tatABCen sistema heterologo de Escherichia coli
Viabilidad en SDS 2%
pUNIp
3404 bp
AmaTatA,B,C
Promotor Tat Ecoli
Anaplasma marginale
Brucella abortus
Escherichia coli (Controles)
TatA,B y C
E coliTatC-
E coliTatB-
E coliTatA-
A marginale B abortus
Tat A Funcional ?
TatB No funcional Funcional
TatC No funcional Funcional
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En qu trabajamos?
Produccin de antgenos recombinantes paradeterminaciones serolgicas
Desarrollo de nuevos mtodos de diagnstico
Herramientas para aplicar a estudios epidemiolgicos
Estudios bsicos Protenas de exportacin y factores de virulencia
en Anaplasma
- Familia de Perforinas en Babesia sp. Bsqueda de nuevos antgenos
Sistemas de expresin heterloga
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Anlisis de la regin que contiene el dominio MACPF
Estudio in si l ico (colaboracin Natalia Rego y Hugo Naya de la Divisin deBioinformtica del Instituto Pasteur de Montevideo)
Prediccin de estructura de los genes con dos gene finders basados en HMM:
Fgenesh entrenado con P. falciparum y Glimmer HMM entrenado con el
cromosoma II y III de B. bovis.
La anotacin pblica de cromosomas de B. bovis y Theileria sp. permiti el estudio de la
ortologa y sintenia entre estos cromosomas y los contigs de B. bigemina
Hasta el momento hemos identificado 6 genes con dominio MACPF y estamos
trabajando en la anotacin y la verificacin de los resultados con estudios in vitro
BbiPLP1
CDS de 1 Exn:BbiPLP1 3721 pb; BbiPLP2 3240pb
Seal TATA
Pptido seal
Regin polimrfica (PLR: perforin likerepeat)
Dominio MACPF (Smart)BbiPLP1: 623pb y BbiPLP2: 655pb
Sitio Poly A
BbiPLP2
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Verificacin de la expresin de la BbiPLP1
RT- PCR. A: cDNA Merozotos BbiMx, B: cDNA Merozotos BbiS3 y
C: cDNA Fases sexuales BbiMx
A B C
RT + RT- ADNg ADNg RT+ RT- RT+ RT- ADNg
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En qu trabajamos?
Produccin de antgenos recombinantes paradeterminaciones serolgicas
Desarrollo de nuevos mtodos de diagnstico
Herramientas para aplicar a estudios epidemiolgicos
Estudios bsicos Protenas de exportacin y factores de virulencia
en Anaplasma
- Familia de Perforinas en Babesia sp. Bsqueda de nuevos antgenos
Sistemas de expresin heterloga
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Identificacin de potenciales nuevos antgenos de B .
b igeminaa partir de un anlisis protemico
Optimizacin de la purificacin de protenas totales de merozotos del aislamiento argentino BbiS2P
-Infeccin experimental con BbiS2P de terneros esplenectomizados
- Purificacin de merozotos (estado intraeritroctico) con gradiente de Percoll
- Preparacin del extracto de protenas solubles totales
- Optimizacin del Isoelectroenfoque
- Optimizacin del SDS- PAGE
- Optimizacin del mtodo de deteccin de las protenas (Coomassie coloidal)
-Transferencia de los perfiles proticos a membranas PVDF- Inmunoscreening con sueros bovinos
Gel en 2D teido. IEF: tiras de 7 cm, rango de pH 4-7 y SDS-
PAGE 10%. A: protenas de merozotos de BbiS2P. B: protena de
eritrocitos no infectados
A B
+ - + -
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Descubrimiento de biomarcadores peptdicos para
diagnstico: aplicacin para el diagnostico de la
babesiosis bovina-Se utilliz una pipeline bioinformatica (desarrollada por Santiago Carmona y Fernan
Agero- IIB UNSAM) diseada para identificar antigenos peptidicos a partir del genomaanotado de parasitos patgenos.
-La pipeline define una funcin lineal que permite hacer un ranking de pptidos solapadosde 12 residuos aminoacidicos a partir de los fragmentos virtuales provenientes del
proteoma in silicodel parasito (Babesia bovis)
-Se consideraron los siguientes atributos para obtener la puntuacin de los peptidos:
Atributos Positivos
-regiones estructuradas vs. no estructuradas
-repeticiones
-sitios de glicosilacin
-localizacin subcelular-Medida del sesgo en el uso de codones (CAI)
Atributos Negativos
-Secuenciaas conservadas en el proteoma bovino
-Secuencias conservadas en el proteoma deTheileria
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Diseo del microarray de peptidos
Luego de inspeccionar manualmente los peptidos con mayor puntaje se seleccionaron 83peptidos, entre lo que se incluyen peptidos de reactividad conocida y los nuevos candidatos.
Se imprimieron los vidrios con los 85 peptidos y otros peptidos utilizados como control (JPTPeptide Technologies, Alemania)
Durante los proximos periodos se interrogar el array con grupos de sueros de bovinosinfectados y sueros control.
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En qu trabajamos?
Produccin de antgenos recombinantes paradeterminaciones serolgicas
Desarrollo de nuevos mtodos de diagnstico
Herramientas para aplicar a estudios epidemiolgicos
Estudios bsicos Protenas de exportacin y factores de virulencia
en Anaplasma
- Familia de Perforinas en Babesia sp.
Bsqueda de nuevos antgenos
Sistemas de expresin heterloga
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Vectores virales: Capaces de estimular las diferentes vasdel sistema inmune generando proteccin efectiva.
Poxvi rusrecombinantes: renen estas caractersticas.
Genticamente atenuados.
Llevar secuencias de inters en posiciones que no sean esenciales para la
replicacin viral.
Fcil produccin (bajo costo) y administracin.
Estables, inocuos.
En Poxvirus, el ADN forneo se inserta por recombinacin homloga in vivo y
la expresin se consigue insertando el gen de inters bajo regulacin de
secuencias promotoras tempranas de poxvirus.
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pE: promotor temprano de poxvirus
X: gen de inters.
t: terminador de transcripcin y traduccin
poxvirus recombinante
poxvirus
pE- X - t
Sitio blanco de insercin
pE- X - t
recombinacin
homloga in vivo
Vector de transferencia
Teniendo en cuenta que:
La eficiencia de transfeccin es baja en cultivos primarios.
La frecuencia de ocurrencia de doble recombinacin (intercambio allico) no se puede cuantificar.
El virus salvaje replica normalmente.
Screening por actividad de una enzima marcadora
Actividad de la enzima B-glucuronidasa codificada por el
gen bacteriano uidA. Screening con X-Gluc (sustrato de la
enzima GUS)
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Poxvirus
pH6- GUS- t pE/L-XX - t
Gen no esencial
Poxvirus recombinante pH6-GUS- t pE/L -XX - t
recombinacin homloga in vivo
Vector de transferencia
1- Subclonar el gen de inters en el vector de transferencia.
2- Infeccin de un cultivo celular con el virus salvaje.
3- Transfeccin del VT con las clulas infectadas.
4- Seleccin de los poxvirus recombinantes.
5- Obtencin de un stockpuro.6- Caracterizacin molecular y biolgica de los recombinantesseleccionadas.
Obj i
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Objetivo
Disear, construir y caracterizar un MVA recombinante (MVAr) que exprese un
multiantgeno consistente en epitopes de tipo B y T de tres protenas
inmunognicas de B. bovis.
Rap-1 Msa-2c Hsp20
Epitopes T S ND S
Espitopes B S S S
Produccin INF - S ND S
Estado donde esta presente Merozoto Esporozoto Espor/Mero
Conservacin entre cepas S S S
Localizacin subcelular Roptrias Mem. Plsm. Citosol y MP
Construccin delMultiantgeno
Secuenciacin para verificar correcta orientacin.
Extraccin de ADNg o ARN de merozotos y amplificacin de los genesen cuestin conprimers especficos.
Clonado en vector de tipo T por separado e ingeniera gentica para
subclonar y fusionar los genes.
ND: No determinado
1 Subclonar el gen de inters en el vector de transferencia
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1- Subclonar el gen de inters en el vector de transferencia.
2- Infeccin de un cultivo celular con el virus salvaje.
3- Transfeccin del VT con las clulas infectadas.
4- Seleccin de los poxvirus recombinantes.
5- Obtencin de un stock puro.
6- Caracterizacin molecular y biolgica de los recombinantesseleccionados.
1) Anlisis mediante PCR sobre ADN total purificado de FEP infectados o no para
determinar:
M 21 22 23 24 WT M 21 22 23 24WT C
B) Pureza de stocks recombinantes
(homogneos)M 22 23 24WT C
A) Presencia del gen de inters, pero stocks no
puros (no homogneo)
1.81.8
0.54 0.54