CROMATOGRAFIA - laura mascolini · CORSO ANALISI CHIMICA Cromatografia: parametri U.D.2 ITIS VIOLA A.S. 2016/2017 RIPASSO 1. Descrivi cosa si intente per TLC-RP 2. Descrivi il …

CORSO ANALISI CHIMICA Cromatografia: parametri U.D.2ITIS VIOLA A.S. 2016/2017

CROMATOGRAFIA

PARTE GENERALE: parametri


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Schema

Dalla combinazione dei meccanismi e dei supporti, si possono avere numerose varianti di tecniche cromatografiche


RIPASSO

1. Descrivi cosa si intente per TLC-RP

2. Descrivi il meccanismo di base della cromatografia

3. Descrivi il meccanismo di una cromatografia a scambio ionico

4. Descrivi il meccanismo di una cromatografia di ripartizione

5. Descrivi il meccanismo di una cromatografia di esclusione molecolare

6. Definizione di picco cromatografico

7. Disegnare un picco cromatografico ed individuarne i parametri relativi


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Il “prodotto” della cromatografia con rivelatore in uscita


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IL PICCO CROMATOGRAFICO: parametri relativi alla banda singola

Tempo di ritenzione (tR)

tempo impiegato da ciascuna sostanza per scorrere attraverso la colonna, misurato a partire dall’istante in cui la miscela viene introdotta nello strumento, fino all’istante in cui si registra il massimo del tracciato Cromatografico

Tempo morto (tM) tempo di ritenzione di una sostanza non trattenuta dalla fase stazionaria

Tempo di ritenzione corretto (t’R) tempo effettivamente speso da ogni sostanza eluita nelle interazioni

chimico-fisiche con la fase stazionaria


Altezza del picco (h)

distanza tra il punto massimo e la linea di base

Larghezza alla base del picco (wb)

lunghezza del segmento interpolato all’intersezione fra le tangenti ai flessi della gaussiana e la linea di base

Larghezza a metà altezza (wh)

larghezza del picco misurata a metà altezza


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ALTRI PARAMETRI BANDA SINGOLA GRANDEZZE

VOLUME DI RITENZIONE/ELUIZIONE: V’r• Volume di fase mobile eluita dal momento dell’ingresso al momento dell’uscita dalla colonna di una determinata sostanza

VOLUME MORTO: Vm • volume di colonna non occupato dalla fase fissa

VOLUME DI RITENZIONE CORRETTO: V’r

V’r=Vr - Vm VALE:

Vr=trxFc V’r=t’rxFc


La posizione dei picchi sull’asse dei tempi puo’ servire ad identificare i componenti del campione

IL PICCO CROMATOGRAFICO: impieghi dei parametri relativi alla banda singola

PERCHE’?ogni sostanza ha affinità diverse per FS e FM

L’area sottesa dai picchi:è proporzionale alla quantità di ogni singolo componente e può essere utilizzata a scopo quantitativo


SEPARARE CON PICCHI RISOLTI E SIMMETRICI ED IN TEMPI RAGIONEVOLI



• AGISCO SU AMPIEZZA

• AGISCO SU VELOCITA’ USCITA


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INTRODUZIONE PARAMETRI SIGNIFICATIVI


PRIMA PARTE

PARAMETRI RELATIVI A COPPIE DI BANDE:

• che influenzano la velocità di uscita• possono essere ricavati dal picco e da altri valori

sperimentali

1. COSTANTE DI DISTRIBUZIONE

2. FATTORE DI RITENZIONE

3. FATTORE DI SEPARAZIONE


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COSTANTE DI DISTRIBUZIONE

In ogni istante nel processo cromatografico le sostanze tendono a distribuirsi tra le due fasi in modo specifico.

Supponiamo quindi che si raggiunga una situazione di equilibrio dinamico dove:

CM CS

a cui corrisponde una costante (o anche coefficiente) di distribuzione

KC = CS/CMVd figura 18.11 libro


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DA COSA DIPENDE Kc?

La costante di distribuzione è una grandezza termodinamica dipende:• dalla natura della fase mobile e della fase stazionaria, • dalla temperatura di lavoro

CONSIDERAZIONI

Se KC è grande:la sostanza è più affine alla fase stazionaria e quindi vi rimarrà più a lungo che nella fase mobile

Per le sostanze che non vengono trattenute dalla fase stazionaria si ha KC = 0 in quanto CS = 0.

Kc influenza tempi e volumi di ritenzione

KC = CS/CM


Se 2 sostanze hanno Kc simili come si può intervenire?

VR = VM + KcVS

COME RICAVO Kc?


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FATTORE DI RITENZIONE

k = nS/nM

Che relazione ha con Kc?

Considerando la relazione tra numero moli e conc.molare e la definizione di Kc si ricava:

KC = CS/CM

k = (VS/VM) KC Quali fattori lo influenzano?


Il fattore di ritenzione è un parametro che caratterizza il comportamento di un analita in una determinata coppia di fasi (mobile e stazionaria) in un determinato tipo di colonna

dipende quindi da:

• Granulometria/impaccamento Fs• Temperatura• Affinità analita per le fasi• Non dalla geometria della colonna: se si allunga la colonna VS

e VM variano proporzionalmente


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Come si ricava?

Il fattore di ritenzione, se il flusso di eluente è costante durante la separazione, può essere ricavato direttamente da due parametri che si ottengono dal cromatogramma:

il tempo di ritenzione corretto e il tempo morto.

K= t’R/tM

QUALI SONO I VALORI IDEALI?

Quando il fattore di ritenzione è 1, l’analita esce con la fase mobile Fattori di ritenzione elevati (> 20) sono indice di lunghe eluizioni.

I fattori di ritenzione ideali sono compresi tra 1 e 5.


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SELETTIVITA’

Una separazione cromatografica per essere efficace deve essere selettiva: le sostanze devo uscire in tempi distanti l’una dall’altra in modo da avere picchi separati

La selettività di un sistema cromatografico viene espressa dal cosiddetto fattore di separazione o ritenzione relativa

α = t'R2\t'R1

Prametro termodinamico, dipende dal tipo di interazione delle sostanze con le due fasi: quindi dal meccanismo di separazione


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CHE VALORI DEVE AVERE?

•Per effettuare una buona separazione cromatografica fra le due sostanze, è necessario che α sia maggiore di 1 e in pratica è consigliabile che sia maggiore di 1,2.


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• FINE 1° PARTE


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DOMANDE RIPASSO

1) Qual è la missione dell’analista che utilizza la cromatografia strumentale?

2) Cosa si intende per Kc?

3) Cosa fare se 2 sostanze hanno simile Kc?

4) Cosa succede se in un sistema cromatografico una sostanza ha Kc=0?

5) Posso ricavare il fattore di ritenzione dal cromatogramma?

6) Cosa significa se due sostanze hanno il fattore di selettività uguale a 1?


SELETTIVITA’

Una separazione cromatografica per essere efficace deve essere selettiva: le sostanze devo uscire in tempi distanti l’una dall’altra in modo da avere picchi separati

La selettività di un sistema cromatografico viene espressa dal cosiddetto fattore di separazione o ritenzione relativa

α = t'R2\t'R1

Dipende dal tipo di interazione delle sostanze con le due fasi: quindi dal meccanismo di separazione


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Agendo su Kc/k/alfa si interviene sulla velocità di uscita degli analiti ma come intervenire sull' ampiezza dei picchi?


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NON SOLO SELETTIVITA’ MA ANCHE EFFICIENZA

• L’efficienza indica la capacità di un sistema cromatografico di eluire tutte le particelle di una data specie chimica con la stessa velocità, in modo da formare bande strette, che forniscono picchi molto stretti

• Il parametro più semplice con cui esprimere l’efficienza è la larghezza alla base del picco (wb), che in genere è diversa per ogni specie chimica in un dato sistema Cromatografico.


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Risoluzione cromatografica

Efficienza e selettività influenzano il risultato finale della separazione cioè il grado di separazione dei picchi ottenuti al rivelatore di un sistema cromatografico;

La risoluzione misura la capacità di un sistema cromatografico di separare due analiti con caratteristiche simili:

• bande ben separate lungo la colonna generano picchi distinti e sufficientemente stretti da non sovrapporsi.

• In tal caso si dice che i picchi sono “ben risolti”. :

Se la risoluzione non è sufficiente (R < 1), i due picchi non possono essere quantificati in maniera corretta


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AnalisiHPLColio essenzialeCamomilla


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Storicamente il primo approccio teorico ha tenuto conto:

1) il picco e' una gaussiana: posso usare parametri statistici per interpretarlo

2) la colonna cromatografica assomiglia ad una colonna di distillazione: teoria dei piatti

Come si arriva a pianificare una separazione selettivaefficiente e quindi con picchi ben risolti?


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Teoria dei piatti (1941 da Martin e Synge)

Il sistema cromatografico è immaginato simile ad

una colonna di distillazione, cioè composta da una serie di strati sottili orizzontali contigui chiamati piatti teorici;

Il piatto teorico è:

l’ideale tratto di colonna in cui l’analita si trova in equilibrio tra le due fasi prima che l’eluente lo trascini nella fase successiva


in ognuno di questi microelementi della colonna si realizza, durante l’eluizione un equilibrio di distribuzione del soluto tra fase stazionaria e fase mobile.

(A) fase mobile = (A) fase stazionaria



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•

• Teoria superata• Terminologia ancora in uso e ricavata da

parametri statistici

• N=L/H


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il picco cromatografico è una gaussiana

H= σ2/L

N=16(tr/wb)2

Uso il cromatogramma per ricavare il numero

di piatti

Più il picco è stretto più alto è N


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EFFETTO DEL N° DI PIATTI SUL PICCO

Maggiore è il numero di piatti più compatto è il picco

RIASSUMENDO:

La teoria dei piatti spiega la separazione mettendola in funzione della costante di distribuzione e dell’altezza di H


Esempio : un analita eluisce da una colonna sotto forma di un picco Gaussiano con un tempo di ritenzione di 7 min 45 s e una larghezza della base del picco di 30 s.

Calcolate: (i) il numero di piatti teorici della colonna; (ii) l’altezza dei piatti se la colonna e’ lunga 7 cm

N = 16 x (465/30)^2, quindi N = 3844

(ii) H = L/N = 7.5 x 10^4 / 3844, quindi H = 19.5 μm


Esercizio


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TEORIA DELLE VELOCITÀ

Studia la funzione H = f(ū) altezza del piatto teorico in funzione della velocita' della fase mobile

APPROCCIO DINAMICO NELLO STUDIO DEI FATTORI

CHE INFLUENZANO L’EFFICIENZA DELLA SEPARAZIONE

L’andamento caratteristico di questa funzione è:


J. C. Giddings was an American physical chemist and was one of the pioneers in developing chromatography theory.

In 1965 he published his classic work entitled the Dynamics of Chromatography

Nel suo lavoro mette in relazione l’allargamento delle bande con 3 possibili fenomeni che avvengono all’interno della colonna:

-A: Percorsi multipli -B: Diffusione molecolare -C: Trasferimento di massa fra le fasi.


Nel 1956 il chimico olandese JJ van Deemterelabora una equazione matematica che mette in relazione H con i fattori indivuati da Giddins:

H = A + (B\ū) + Cū

-A: Percorsi multipli -B: Diffusione molecolare -C: Trasferimento di massa fra le fa


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FATTORE A: PERCORSI MULTIPLI (diffusione microvorticosa)

Da cosa dipende A?

• Dipende da granulometria e grado di impaccamento della fase stazionaria.

• La presenza di disomogeneità determina canali di dimensioni diverse in cui la fase mobile fluisce con tempi diversi

• Quindi le molecole di una stessa sostanza, pur partendo assieme, possono percorrere cammini diversi, arrivare al rivelatore in tempi diversi e provocare un allargamento della banda.


COME CONTENERE A?

Per diminuire questo fenomeno si può intervenire :

– sulla granulometria della fase stazionaria usando particelle sferiche omogenee

– sull’impaccamento distribuzione omogenea– usare in GC colonne capillari (A si annulla)


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FATTORE B : DIFFUSIONE MOLECOLARE LONGITUDINALE

• La diffusione molecolare si ha per effetto del gradiente di concentrazione che si genera nel tratto di colonna in cui la sostanza si trova concentrata.

• Le molecole tendono a diffondere verso zone a bassa concentrazione (parallelamente alla direzione del flusso) portando ad allargamento del picco


Per minimizzare la diffusione longitudinale si può intervenire su Viscosità’ FM, Temperatura e Pressione

Come?

•aumentare la viscosità della fase mobile: diminuendo la velocità di diffusione dell’analita nella fase•diminuire la temperatura della separazione: diminuendo energia cinetica molecole•aumentare la pressione (elevate pressioni e basse T aumentano viscosita’)•aumentare il flusso della fase mobile

Come contenere B?


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FATTORE Cu: TRASFERIMENTO DI MASSA FRA LE FASI

Rappresenta la difficoltà che ha l’analita a distribuirsi tra le due fasi:

un equilibrio ha bisogno di tempo per instaurarsi

• All’inizio le molecole del componente A si trovano tutte insieme nella fase mobile.

• Poi una parte della molecole diffonde nella fase stazionaria secondo il meccanismo della separazione scelta (ripartizione, scambio ecc)

• Più sfasate sono la velocità di efflusso della fase mobile e la velocità dell’equilibrio della separazione peggiore è l’efficienza della separazione


•Natura chimica delle fasi in riferimento all’analita

•Temperatura: se la aumento velocizzo i trasferimenti

•Viscosità, Densità fase mobile

•Velocità di flusso: flussi lenti minimizzano C ma allungano tempi lavoro

•In LC uso film sottili

Come si interviene su C?


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H = A + (B\ū) + Cū

Riassumendo:

• A non dipende da velocità flusso

• Se aumento velocità minimizzo B ma aumento C

L’ equazione serve per valutare l’efficienza di un sistema cromatografico usando degli std quando si devono mettere a punto nuovi metodi

CROMATOGRAFIA - laura mascolini · CORSO ANALISI CHIMICA Cromatografia: parametri U.D.2 ITIS VIOLA A.S. 2016/2017 RIPASSO 1. Descrivi cosa si intente per TLC-RP 2. Descrivi il …

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