Cromatografia de Liquidos de Alta Eficacia

1CROMATOGRAFA DE LQUIDOS DE ALTA EFICACIA (HPLC)

Curso de Anlisis InstrumentalInstituto de Ingeniera QumicaFacultad de Ingeniera - 2007

Juan Bussi

CROMATOGRAFA DE LQUIDOS DE ALTA EFICACIA (HPLC)

Determinacin de compuestos no voltiles (alto Peso Molecular, iones metlicos) o termolbiles.

Ampliamente utilizadaGran sensibilidad

Determinaciones cuantitativas exactas

Aminocidos, protenas, cidos nucleicos, hidrocarburos, carbohidratos, frmacos, terpenoides, plaguicidas, antibiticos, esteroides, etc.

Aplicabilidad a sustancias de inters general (industria, salud, medioambiente).

Interacciones qumicas entre la muestra, la fase mvil y el relleno de la columna, determina el grado de migracin y separacin de componentes contenidos en la muestra.

Solventes como Fase Mvil

Elucin politptica: se combinan varios tipos de tcnicas.

Elucin por gradiente: los distintos analitos son eludoscon incremento de la composicin de la fase mvil en la fase orgnica.

Elucin Isocrtica: composicin constante de la fase mvil

La fase mvil puede ser alterada en el transcurso del anlisis para manipular las interacciones de los componentes de la muestra conla fase estacionaria.

Compuestos con interacciones ms fuertes con la fase mvil que con la fase estacionaria eluirn ms rpidamente de la columna (tiempos de retencin menores).

2Peso

Mo

lecu

lar

106

105

104

103

102

Polaridad crecienteInsoluble en agua Soluble en agua

No Polar Inico

No InicoPolar

Adsorcin Reparto Intercambioinico

(Penetrabilidad sobre gel)

(Filtracin sobre gel)

(Repartoen fase inversa)

(Repartoen fase normal)

Exclusin portamao

APLICACIONES DE LA CROMATOGRAFA DE LQUIDOS

Distintos mtodos son complementarios.

Coeficiente de distribucin K = cS/cM

Velocidad lineal media v = u x ftVelocidad de migracin u

Factor de capacidad de una especie A:

v = u x 1 + KVS/VM

1

tM

tR tMkA =

kA = KA VS/VM

Definiciones

Tiempo de retencin: tM

Factor de selectividad para dos especies A y B

Altura de plato terico H = 2/LN de platos tericos N = L/H

(tR)A tM(tR)B tM = KB/KA = kB/kA =

Conceptos de Altura de Plato Terico y factores que lo afectan como en otras cromatografias.

Velocidades lineales menores que en CG

Eficacia de columnas para HPLC

H = A + B/u + (CS + CM) u (ecuacin de Van Deemter)

Altura de plato menor que en GC (1 orden de magnitud).

Longitud de columnas menor (25 a 50 cm).

3Efecto del tamao de partcula del rellenoCS y CM dP2

Aumento de eficiencia con disminucin del tamao de partcula (tamao usuales entre 2 y 10 m

Ms notorio en Adsorcin y Reparto

24DM

pipipipi r2uHex =

Reduccin del dimetro de tubos a menos de 2.5 mm.

Debido a diferencias de velocidad entre distintas capas del lquido que se desplaza en tubos de inyeccin, de conexin y detectores.

Ensanchamiento extracolumna

Efecto del tamao de muestra

Gradientes no se compensa por difusin.

4Instrumentacin

Elevadas presiones para alcanzar caudales necesarios.

Equipamiento sofisticado y caro.

Mtodo comn: filtracin a vaco a travs de filtro millipore de tamao de poro muy pequeo (eliminacin de gases disueltos y slidos en suspensin).

Recipientes para una o ms fases mvilesDe vidrio o acero de 0.2 a 1 L

Sistemas de pretratamiento de fases mvilesPara eliminacin de gases disueltos y slidos en suspensin

desgasificacin por vacocalentamiento

agitacin

inyeccin de gas de arrastre de baja solubilidad (Helio).Filtros para polvo y partculas slidas en suspensin.

Mejora de resolucin en tiempos de anlisis ms cortos.

: viscosidad: parmetro adimensional (valor cercano a 500 para

columnas bien empacadas)dP: dimetro de partcula del relleno

Cmara de mezcla para disolventes

Sistemas de bombeo

LuP =

dP2

Ventajas de la elucin con gradiente (relacin variable de volmenes de dos o ms disolventes)

Generacin de presiones superiores a 6000 psi.

Cada de presin en una columna:

5Intervalo de caudales entre 0,1 y 10 mL/min

Flujo libre de pulsaciones (minimizacin de errores de medicin)Variaciones menores a 1% son normales

Caudal = Dimetro Pistn*desplazamiento - *P*V-P*compr.sellos y burbujas.

dP

dV

V

1 =

T

Programacin por microprocesadores que corrige desvos

Control y reproducibilidad de caudal mejor al 0,5%.Cambio de volumen de lquidos y sellos al cambiar la contrapresin:

En sistemas de bombeo por jeringa (250 mL) la compresin del solvente (a 400 atm) puede requerir varios mL de desplazamiento del pistn.

Coeficientes de compresibilidad isotermos de algunos solventes usados en HPLC.

185Dietil ter105cloroformo100Isopropanol100n-octano150n-hexano45Agua120Metanol

(10-11Pa-1)Solvente

vara para mezclas de solventes en anlisis con elucin por gradiente

Altas presiones no suponen riesgo de explosin (s riesgo de incendio).

Componentes resistentes a corrosin (juntas de acero inox o tefln).

Desventajas: flujo con pulsaciones.

Bombas recprocas

Las ms utilizadas

Movimiento cclico de uno o ms pistones con vlvulas de entrada y salida.

Elementos compresibles en el circuito atenan variaciones.

2 Pistones es la opcin ms adecuada

Ventajas: pequeo volumen interno (35 a 400 L), altas presiones (>10000 psi), fcil adaptacin a sistemas por gradiente y caudales constantes e independientes de la contrpresin de la columna y viscosidad del disolvente.

6Prdidas en vlvulas

Apagar la bomba y registrar cada de presin en funcin del tiempo (normal < 2 atm/min)

Funcionamiento normal:prdidas pequeas y constantes

Mayor incidencia a bajos caudales (L/min).Fabricantes suministran diagnsticos para deteccin de prdidas

Test para prdidasReemplazo de columna por una vaca de V=1.5 mL

Llenado con disolvente y tapado.

Prender la bomba hasta que la presin alcanza 300 atm.

Desventajas: capacidad de bombeo limitada (0.25 L), poco prctica para reposicin y cambio de disolvente.

Bombas de desplazamiento

Cmara con un mbolo impulsado por un motor

Ventajas: flujo libre de pulsos, independiente de viscosidad y contrapresin

No sirven para elucin con gradiente.

Programa de Ordenador

Bombas neumticas

Control de caudal

Ventajas: baratasExentas de impulsosDesventajas:Capacidad limitada y de presin de salida.Caudal dependiente de la viscosidad del disolvente y de la contrapresin.

Presiones menores a 2000 psi.

Medicin de caudal mediante cada de presin a travs de un tubo en la salida de la bomba.

Volmenes de bucles entre 0,5 y 500 L.

Sistema de inyeccin de muestra

Volmenes pequeos para evitar ensanchamiento de picos (dcimas de L a 500 L).Inyeccin manual.Sencilla

Evitar despresurizacin (microjeringas capaces de resistir 1500 psi).Inyecciones a flujo detenidoReproducibilidad: dispersin 2%-3% o mayor

Inyeccin con buclesVentajasInyeccin a presiones de hasta 7000psiPrecisin de dcimas por ciento.

7Columnas de alta eficacia de menores dimensiones con hasta 100000 platos/metro.

Columnas

Tubos rectos de acero inoxidable

Tubos de vidrio hasta presiones de 600 psi

Longitud entre 10 y 30 cm

Acoplables

Dimetro interno entre 4 y 10 mm

Tamaos de partculas entre 5 y 10 m

Columnas comunes: longitud 25 cm, dimetro interno 4.6 mm, relleno de partculas de 5 m: 40000 a 60000 platos/metro

Columna termostatizada

Precolumnas

Eliminacin de materia en suspensin y componentes que se unen irreversiblemente al relleno.

Saturacin del solvente con la fase estacionaria (minimiza prdidas de relleno.

Tamao de partcula mayor al de la columna

Entre temp. ambiente y 100-150C.Partculas porosas.

Bolas de vidrio o polmero, no porosas y esfricas con dimetrosentre 30 y 40 m.

Rellenos

Recubrimiento con pelculas orgnicas unidas qumicamente o fsicamente.

Micropartculas porosas con dimetro entre 3 y 10 m.

Ampliamente utilizados en precolumnas

Tratamientos qumicos para mejorar fijacin.

Recubrimiento con una capa delgada y porosa de distintos compuestos y recubrimiento adicional de fase estacionaria lquida y retenida por adsorcin.

Pelicular:

Preparadas por aglomeracin a partir de partculas pequeas.

8slice, almina, resinas de poliestireno. divinilbenceno o carbohidratos.

Materiales ms utilizados como soportes

Parmetros qumicos. Polaridad, acidez-basicidad, estabilidad frente a solventes y pH, reactividad superficial.

Parmetros fsicos: porosidad, tamao de poro, tamao y rigidez de partcula, tamao.

Detectores de diodos permiten recoger el espectro completo en 1 segundo (cromatografa tridimensional.

Detectores

Propiedades de la fase mvil (Indice de Refraccin, constante dielctrica, densidad)Propiedades del soluto (absorbancia, fluorescencia, corriente lmite).

Detectores de absorbancia (71%)Volumen de 1 a 10 L, longitud de 2 a 10 mmPresiones < 600 psi (necesitan reductores de presin)Dispositivos de doble haz (los ms comunes)Seal proporcional al Log I/IoFiltros (longitudes de onda determinados)Monocromadores (redes de difraccin)(UV y Visible)Cromatogramas a una fija o variable segn el analito.Barrido de para un analito con detencin de flujo

9Limitacin: baja transparencia de los disolventes (agua, alcoholes)

Tratamiento previo para dar derivados fluorescentes.

Detectores de absorbancia en el infrarrojoBarrido de entre 2.5 y 15 mCubetas con ventanas de NaCl o CaF2, long. 0,2 y 1,0 mm, volumen 1,5 a 10 L.

Detectores de fluorescenciaDetector colocado perpendicularmente al haz de excitacinFuente de excitacion

de Hg y filtrosXenn y monocromador de redlser sintonizables en desarrollo

Alta sensibilidad (materiales de inters farmacutico, clnico, productos naturales y del petrleo).

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Menor sensibilidad que otros detectores.

Detectores de ndice de refraccinDetector universalNo dependen del caudalRobustosSensible a cambios de temperatura

Electrodo indicador de platino, oro, carbn vtreo o pasta de carbono, electrodo de referencia y contraelectrodo se colocan ms adelante en el canal de flujo.

Detectores electroqumicosElevada sensibilidad, sencillez, extensa aplicabilidad

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Espectros de impacto electrnico

Detectores por espectrometra de masas

Sistemas para introduccin de la fase mvil en cmara de vaco

Introduccin directa de una pequea cantidad de lquido

Vaporizacin previa de solvente y posterior desorcin-ionizacin de solutos.

Termovaporizador-ionizador

Aplicable a compuestos termoestables y no voltiles (pptidos, nucletidos.

Efecto de la longitud de cadena en eficacia de columnas de siloxano en fase inversa (Figura 28.15 Skoog).pH

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Slice hidrolizada con HCl 0.1 M en caliente durante uno o dos dasmol/m2 de grupos OH

Inmovilizacin qumica (90% de rendimiento)

siloxanoorganoclorosilanoslice

OHSi + X Si (CH2)n L OSi Si (CH2)n L

n = 8 o 18

L: metil, amino, carboxil, ciano, diolRecubrimiento mximo 4 mol/m2 de grupos.Silanos residuales se desactivan con clorotrimetilsilano

Relleno polar (agua o trietilenglicol soportado sobre slice o almina y fase mvil apolar.

Solventes no polares (etilter, cloroformo y n-hexano).

Rellenos tipo siloxano para fase normal: amino (C3H6NH2) (los ms polares) diol (C3H6OCH2CHOHCH2OH) (polaridad intermedia) dimetilaminopropil (C3H6N(CH3)2) (polaridad intermedia) ciano (C2H4CN) (los menos polares)

Ecuacin de Soczewinski: ln ki = ln ki(2) Si lnx2X2: fraccin molar del componente de ms polaridad

Competencia del disolvente y del analito por el relleno es determinante de los factores de retencin.

Cromatografa de fase normal

Cambios de solvatacin del analito en el disolvente es determinante de cambios de factores de retencin.

Cromatografa de fase inversaFase estacionaria no polar (hidrocarburo) y fase mvil polar (agua, metanol, acetonitrilo).

Cambio de 2 unidades en P cambio de k en un factor de 10

k1

(P1 P2)/2= 10

k2

Criterios de seleccinPolaridad de la fase estacionaria similar a la de los analitos. (Evitar tiempos de retencin muy altos).Fase mvil con polaridad distinta a la fase estacionaria

Polaridad creciente:

Hidrocarburos < teres < steres < cetonas < aldehdos < amidas < aminas < alcoholes < agua

k (factor de retencin) entre 2 y 5Indice de polaridad P de Synder (J. Chromatog. Sci 1978, 16, 223)Para una mezcla de solventes A y B: P = APA + BPB

A B: fracciones en volumenPA, PB: ndices de polaridad

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Selectividad En fase inversa se ajusta con 3 disolventes: metanol, acetonitriloy tetrahidrofurano. Agua para ajustar k.En fase normal se ajusta con etilter, cloruro de metileno y cloroformo, nhexano para ajustar k.

Formacin de derivados1) Reduccin de polaridad que haga posible el uso de

cromatografa de reparto2) aumento de respuesta del detector3) aumento de selectividad de la respuesta

Cromatografa de pares inicosFase mvil: agua + disolvente orgnico (metano o acetonitrilo + compuesto inico con contrain de carga opuesta a la del analito.Contrain forma un par inico con el analito: especie neutra retenida por el relleno de fase inversa.

Cromatografa con fases estacionarias quiralesMs apropiada en HPLC que en CGRelleno recubierto con un ismero pticamente activo.

cidos biliares, metabolitos de drogas, extractos de orina, estrgenos.

Medicina clnica

Drogas, venenos, alcohol en sangre, narcticos

Qumica forensePesticidas, herbicidas, fenoles, PCBContaminantes

Aromticos condensados, tensioactivos, propulsores, colorantes

Productos de la industria qumica

Edulcorantes artificiales, antioxidantes, aflatoxinas, aditivos

Productos de alimentacin

Aminocidos, protenas, carbohidratos, lpidos

Bioqumica

Antibiticos, sedantes esteroides, analgsicos

FrmacosMezclas tpicasCampo

Aplicaciones de la Cromatografa de Reparto

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Cromatografa de Adsorcin (Lquido-slido)Fases estacionarias: slice y alminaSeleccin del disolventeFuerza del disolvente 0 (energa de adsorcin por unidad de superficie).0 vara no linealmente con la relacin de volmenes de dos disolventes.

Eleccin de disolventesUn aumento de 0.05 unidades de 0 disminuye k en un factor de 3-4.Cambios de se logran por ensayos previos con distintos disolventes.Ensayos por cromatografa de capa fina Aplicaciones de la cromatografa de adsorcinPara compuestos no polares con masa molecular < 5000Compuestos con solubilidad limitada en disolventes acuososComplementario con RepartoSepara ismeros

Equilibrio de intercambio entre iones de la fase mvil y iones del mismo signo en la superficie de la fase estacionaria (resinas deintercambio).

xRSO3-H+ + Mx+ (RSO3-)x + xH+slido disolucin slido disolucin

xRN(CH3)3 OH- + Ax- [RH(CH3)3+]xAx- + xOH-slido disolucin slido disolucin

Primera etapa: adsorcin de iones en la cabeza de la columnaSegunda etapa: elucin de iones adsorbidos con una disolucin diluida de cido clorhdrico.

Cromatografa inica

[RSO3-H+]s[B+]ac[RSO3-B+]s[H+]ac

KII =

[RSO3-H+]s[H+]ac

= KII[RSO3-B+]s

[B+]ac

[H+]ac y [RSO3-H+]s >> [B+]

CSCM

= KII =[RSO3-B+]s

[B+]ac

Kex alta tiempo de retencin elevadoTl+ >Ag+>Cs+>Rb+>K+>NH4+>Na+>H+>Li+

Ba2+>Pb2+>Sr2+>Ca2+>Ni2+>Cd2+>Cu2+>Cp2+>Zn2+>Mg2+>UO22+

SO42->C2O42->I->NO3->Br->Cl->HCO2->CH3CO2->OH->F-

RellenosPartculas esfricas porosas copolmeros de estireno y divinilbenceno (8%) emulsionados (estables entre pH 0 y 14).Activacin por grupos cidos (sulfnico) o bsicos (aminas cuaternarias).Nuevos desarrollos: partculas esfricas (30 a 40 m), no porosa, de vidrio o polmero, recubierta con resina de intercambio inico (menor difusin)

Fase mvilDisoluciones acuosas con metanol u otros disolventes orgnicos y especies inicas para formar un buffer.

Cromatografa inica con columnas supresorasElectrolito eluyente enmascara la respuesta del Detector de conductividad a los iones del analito.

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Columna supresora convierte iones de la fase mvil en especies poco ionizadasEjemplo: H+(ac) + Cl-(ac) + Resina+OH-(s) Resina+Cl-(s) + H2O

Na+(ac) + HCO3-(ac) + Resina-H+(s) Resina-Na+(s) + H2CO3 (ac)

Bomba

Eluyente NaOH

NaBrNaOHNaClNaF

HBrH2OHClHF

Columna separadoraResina+OH-(s)

Columna supresoraResina-H+(s)

NaBr, NaCl, NaF, NaOH (diluyente)

Inyector

Detector

Residuos

Con

duct

anci

a

Tiempo

Sistema para separacin de analitos aninicos usando columna supresora

Cromatografa inica con una sola columna: deteccin debida a pequeas diferencias de conductividad entre iones del analito y del eluyente.Mtodo fotomtrico para deteccin de iones no absorbentes (figura 28-24

Regeneracin (cada 8 10 horas)Desarrollo reciente de supresores de membranas supresoras de intercambio inico con regeneracin continua: alta velocidad de intercambio.

Aplicaciones orgnicas y bioquimicasAminocidos, vitaminas, azcares y preparaciones farmacuticas, alimentos. (figura 28-25)Cromatografa de exclusin de iones (para cidos dbiles)Fase mvil: solucin acuosa de HCl diluidoFase estacionaria: resina de intercambio catinico en su forma cidaColumna supresora de resina catinica con Ag para supresin de contribucin inica del eluyente.Para cidos y bases dbiles (y sus sales): coeficientes de distribucin se relacionan inversamente con las constantes de disociacin.Aplicaciones a especies cidas en leche, caf, vino, etc.

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Para masas moleculares elevadasRelleno: partculas polimricas con una red de poros uniforme (10 m) en los que pueden difundir molculas del soluto y del disolvente.Tiempo de residencia depende del tamao efectivo de las molculas. Molculas ms grandes no se retenidas y eluyen primero.Separacin por tamao, no implica interacciones qumica o fsica con el relleno.

Rellenos de slice: retienen por adsorcin y catalizandescomposiciones. Se modifican por sustituyentes orgnicos (sililacin).Rellenos de copolmeros estireno-divinilbenceno: hidrofbicos.

Cromatografa de exclusin por tamao Propiedades de los rellenos comerciales tpicos para la cromatografa de exclusin por tamao

(0.2 a 5) x 104(0.03 a 1) x 105(0.05 a 5) x 105(5 a 20) x 105

1253005001000

10Slice

700(0.1 a 20) x 104(1 a 20) x 104

(0.1 a 20) x 105(5 a >10) x 106

102103104105106

10Poliestireno-divinilbenceno

Lmite de exclusin en peso molecular

Tamao promedio de

poro, A

Tamao de partculam

Tipo

TeoraVt = Vg + Vi + VoVt: volumen total de la columnaVg: volumen ocupado por matriz slida del gelVi: volumen del disolvente retenidoVo: volumen libre exterior

Volumen de elucin = Vo: analitos no retenidosVolumen de elucin = Vo + K Vi analitos de tamao intermedio (K entre 0 y 1).Lmite de exclusin: peso molecular por encima del que no existe retencin.Lmite de penetracin: peso molecular por debajo del cual las molculas pueden penetrar completamente en los poros.

AplicacionesFiltracin sobre gelDisolventes acuosos y relleno hidroflicosPenetrabilidad sobre gel: disolventes orgnicos no polares y rellenos hidrofbicos.Separacin de productos naturales de alto peso molecular.Separacin de homlogos y oligmerosDeterminacin de la distribucin de pesos moleculares en polmeros o productos naturales (comparacin con patrones).VentajasTiempo de separacin cortos y bien definidos (entre Vo y Vo+Vi)Bandas estrechasNo hay prdida de muestraNo hay desactivacin de la columna

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DesventajasNmero limitado de bandas No diferencia compuestos de tamao semejante (ismeros)

Cromatografa de Capa Fina (cromatografa bidimensional)

Capa delgada de un Soporte inmovilizado sobre una superficie plana de vidrio, plstico o metal.Fase mvil se mueve por capilaridad, por gravedad o por un potencial elctrico.Otras modalidades menos usadas (en papel, electrocromatografa)Caractersticas: Rapidez y Bajo costo. Aplicaciones:Ensayos previos a los de columnaControl de pureza en la industria.