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CROMATOGRAFÍA
Cromatografía es el término con el que se denomina a un conjunto
de métodos analíticos utilizados para separar, identificar y
cuantificar los componentes de una muestra. Mediante una
cromatografía es posible separar analitos muy parecidos entre sí en
cuanto a sus propiedades físico-químicas. Por ejemplo nos permite
separar mezclas de aminoácidos; mezclas de proteínas; mezclas de
ácidos grasos; pigmentos; pesticidas; etc.
¿Por qué cromatografía?
La primera vez que se utilizó el método fue para separar
pigmentos vegetales a partir de un extracto de hojas y el resultado
obtenido fue una serie de
bandas coloreadas (verdes y amarillas correspondientes a
clorofilas y carotenoides) por lo que se denominó al método de
separación CROMATOGRAFIA,
término que deriva del griego “chromatos” que significa color
(1903, Tswett).
Para realizar una cromatografía se necesitan dos fases (fase
estacionaria y fase móvil) y un soporte:
1- Fase estacionaria (FE): será un componente que estará
contenido en un soporte adecuado y como su nombre lo indica
permanecerá fija en un espacio determinado. Puede ser sólida o
líquida. Según qué tipo de soporte que se utilice para contener a
la fase estacionaria las cromatografías pueden ser planas o en
columna.
2- Fase móvil (FM): será un compuesto químico, o una mezcla
sencilla de compuestos químicos y como su nombre lo indica debe
fluir (moverse) a través de la fase estacionaria. La fase móvil es
la que arrastrará a la muestra obligándola a atravesar la fase
estacionaria. Puede ser líquida o gaseosa dando lugar a las
denominadas “Cromatografías Liquidas” y “Cromatografías Gaseosas”
respectivamente.
Por lo tanto en toda cromatografía hay una fase estacionaria
inmovilizada en un soporte y una fase móvil que arrastrará a la
muestra a través de la fase estacionaria. Durante este proceso cada
componente de la muestra se va a desplazar según sus propias
características físico-químicas las que van a determinar que
interaccione más con la fase estacionaria o que prefiera a la fase
móvil. El concepto general será que aquellos analitos que prefieren
a la fase estacionaria son más retenidos, es decir van quedando más
atrasados, mientras que aquellos que prefieran a la fase móvil se
desplazarán más rápido.
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I- Existen al menos tres maneras de clasificar a las
cromatografías: 1- Clasificación de las cromatografías según el
estado de agregación de las fases. 2- Clasificación de las
cromatografías según el soporte que contiene a la fase
estacionaria. 3- Según el mecanismo físicoquímico por el que se
produce la separación de los analitos. 1- Clasificación de las
cromatografías según el estado de agregación de las fases:
2- Clasificación de las cromatografías según el proceso
fisicoquímico que se pone en juego para la separación de los
analitos
Nombre Algunas características
Cromatografía de Adsorción FE sólida y FM líquido o gas Los
analitos son adsorbidos por el sólido según su polaridad.
Cromatografía de Reparto FE líquido y FM líquido / gas Los
analitos se reparten entre dos líquidos según su polaridad.
Cromatografía de intercambio iónico
FE resina (sólido) con grupos unidos covalentemente de carga
opuesta al ión que intercambian. Hay resinas de intercambio
catiónico (con grupos sulfónicos negativos) y resinas de
intercambio aniónico (con grupos aminas cuaternarias positivas). FM
líquido Se basa en la atracción entre cargas opuestas.
Cromatografía de Exclusión molecular
FE gel poroso. FM líquido / gas Separa los analitos por tamaños.
Los poros del gel serán atravesados por las moléculas pequeñas pero
no por las moléculas grandes. Las moléculas pequeñas tardarán másen
atravesar la fase estacionaria.
Cromatografía de Afinidad FE especialmente diseñada para atrapar
a un soluto en particular. Muy selectiva
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3- Clasificación de las cromatografías según el soporte que
contiene a la fase estacionaria:
A continuación podemos observar los esquemas que representan un
proceso cromatográfico, es decir la separación de los componentes
de una muestra a través de la interacción de los mismos con cada
una de las dos fases involucradas, cada banda de color representa a
un analito separado:
Cromatografía plana: Cromatografía en columna: (En este caso la
fase móvil asciende.) (En este caso la fase móvil desciende) 3.1-
Generalidades de las CROMATOGRAFÍAS PLANAS:
De acuerdo al soporte utilizado hay dos tipos de cromatografías
planas: cromatografía en papel y cromatografía en capa fina. En
ambos casos el soporte puede ser a su vez la fase estacionaria,
pero para ello se debe activar el papel o la “capa fina”, lo que
quiere decir que se colocarán en una estufa para quitar la humedad
ambiente. De lo contrario, la fase estacionaria será una fina
película de líquido adsorbido en la superficie del papel o de la
capa fina, en general agua (humedad ambiente).
Las cromatografías planas pueden realizarse en forma ascendente
o descendente. En la forma ascendente la fase móvil arrastra a la
muestra recorriendo la fase estacionaria desde abajo hacia arriba
mientras que en la forma descendente el camino será desde arriba
hacia abajo. En la cromatografía plana ascendente la fase móvil
sube por capilaridad mientras que en la descendente la fase móvil
se mueve principalmente por gravedad.
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El parámetro que se mide en una cromatografía plana se denomina
relación de frentes, Rf, y representa la distancia que recorre un
analito sobre la fase estacionaria respecto a la distancia que
recorre la fase móvil en la cromatografía: Rf A = distancia
recorrida por el analito A / distancia recorrida por la FM Este
parámetro puede tomar valores entre 0 y 1. Cuanto más cercano a 0
es el valor de Rf significa que el analito tiene afinidad por la
fase estacionaria (es muy retenido) mientras que cuanto más cercano
a 1 sea el valor de Rf significa que el analito tiene más afinidad
por la fase móvil, por lo tanto es poco retenido por la fase
estacionaria.
En general las cromatografías planas necesitan las siguientes
etapas (Figura 1): 1- Siembra de la muestra: consiste en colocar
una pequeña cantidad de la muestra a analizar en uno de los
extremos del soporte donde está contenida la fase estacionaria. 2-
Desarrollo del cromatograma: la fase móvil recorre la fase
estacionaria “empujando” a la muestra, cada analito se desplaza a
una velocidad diferente. Esta etapa finaliza cuando la fase móvil
llegue cerca del otro extremo del soporte. 3- Si los analitos
tienen color (por ejemplo los pigmentos vegetales) se puede
observar a simple vista la separación de los mismos sobre la fase
estacionaria. Si los analitos no tienen color al finalizar el
desarrollo no podremos ver la separación, es necesario realizar una
etapa de REVELADO para poner en evidencia donde quedó cada analito
separado. 4- Cálculo de Rf: realizar las medidas correspondientes
para calcular los valores de Rf de cada analito.
Figura 1: El rectángulo representa la fase estacionaria retenida
en un soporte plano. La línea trazada cerca del extremo inferior
representa la línea de siembra. El círculo azul sin relleno
representa la muestra sembrada (1). Es una cromatografía plana
ascendente por lo tanto la FM subirá por capilaridad a través de la
fase estacionaria durante el desarrollo hasta llegar cerca del
extremo superior, a esto se le denomina “frente de la fase móvil”
(2). Finalmente se realiza un revelado para observar los analitos
separados (3). Se miden las distancias recorridas para obtener el
Rf de cada analito. Las distancias se miden desde la línea de
siembra hasta el lugar donde llegó cada analito y en el caso de la
fase móvil desde la línea de siembra hasta el “frente” donde llegó
la fase móvil.
Comentario a tener en cuenta: Muchas veces en las
cromatografías
se suele denominar a la fase móvil como solvente, lo cual es
cierto
siempre que la cromatografía use como fase móvil un líquido
menos polar que el agua. En esos casos se suele decir “frente
del
solvente” en lugar de frente de fase móvil.
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Ejemplo de cálculo del parámetro Rf (relación de frentes):
¿Qué utilidad práctica puede tener una cromatografía plana y su
parámetro Rf?
Rf como criterio de NO IDENTIDAD
El valor de Rf es un parámetro que nos permite asegurar la
ausencia de un analito en una muestra, pero por si sólo no puede
garantizar la presencia del analito. Esto se denomina criterio de
NO IDENTIDAD y es una herramienta útil en los análisis para el
control del uso de compuestos no permitidos. Ejemplos de aplicación
de este concepto: detectar la presencia de pesticidas en frutas y
verduras; detectar la presencia de algún metal pesado en pinturas
para maderas; detectar algún compuesto que revele adulteración de
un producto. Uso del criterio de NO IDENTIDAD para controlar el uso
de un pesticida no habilitado en un cultivo de lechuga: 1- Aplicar
el criterio de NO IDENTIDAD implica conocer el valor de Rf del
analito de interés, en este caso el pesticida no habilitado para
lechuga. 2- Se realizan las cromatografías planas de un gran número
de muestras: extractos de hojas de lechuga provenientes de la
producción que se está controlando. 3- Se analizan los Rf obtenidos
en cada muestra de lechuga. 4- Interpretación de resultados:
Si la muestra de lechuga no tiene un valor de Rf que sea igual
al del pesticida prohibido podemos asegurar que NO TIENE el
pesticida prohibido por lo tanto se acepta la lechuga.
Si alguna muestra de lechuga dio positivo para el pesticida ya
que algún componente dio un valor de Rf igual al del pesticida la
lechuga se descarta momentáneamente hasta que el resultado se
confirme por otro método.
Frente de FM
Posición final
del analito
Punto de
siembra
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3.2- Generalidades de las CROMATOGRAFÍAS EN COLUMNA:
En las cromatografías en columna, se usa como soporte un tubo de
vidrio que contiene en su interior una fase estacionaria sólida
finamente molida (sacarosa, silicagel, alúmina, resinas activas) o
bien un tubo de vidrio relleno con un sólido inerte finamente
molido, lo que en conjunto actuará como soporte de una fase
estacionaria líquida absorbida en ese sólido. También pueden
utilizarse columnas capilares en las cromatografías que tienen FM
gaseosa.
Las cromatografías en columna se suelen denominar según la
naturaleza de la fase móvil: “Cromatografía líquida” y
“Cromatografía gaseosa”. En las cromatografías en columna la fase
móvil se desplaza sobre la fase estacionaria por acción de la
gravedad y/o por aplicación de una presión para que sea posible la
circulación del fluido por el interior de la columna de diámetro
pequeño.
Las cromatografías en columna se realizan generalmente
utilizando un equipo denominado CROMATÓGRAFO, el que permite
obtener un registro de la cromatografía realizada que se denomina
CROMATOGRAMA.
Las etapas necesarias para realizar una cromatografía en columna
son (Figura 3): 1- Inyección de la muestra: es el equivalente a
sembrar la muestra en la cromatografía plana, el lugar de inyección
será en un extremo de la columna. 2- Desarrollo de la
cromatografía: la fase móvil empuja a los analitos obligándolos a
atravesar la fase estacionaria contenida en la columna. Durante
este proceso los analitos se separan dentro de la columna. 3-
Elución: en las cromatografías en columna es necesario que los
analitos separados dentro de la columna lleguen a salir de la
columna para poder detectarlos. Se hace circular fase móvil hasta
que los analitos se recuperen a la salida de la columna.Por este
motivo muchas veces se nombra a la fase móvil como “eluyente”.
Figura 3: Representación esquemática de las etapas de una
cromatografía en columna. 1 representa la inyección de la muestra;
2 el desarrollo de la cromatografía y 3 representa la elución de
analitos.
El parámetro que se mide en una cromatografía en columna es el
tiempo de retención (tr) o el volumen de retención (Vr), ambos
parámetros tienen la misma interpretación sólo que se miden en
distintas unidades: Tiempo de retención: es el tiempo que
transcurre desde que se inyectó la muestra hasta que el analito
sale de la columna.
1 2 3 3
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Volumen de retención: es el volumen de FM que circuló por la
columna desde que se inyectó la muestra hasta que el analito sale
de la columna. Un analito con un bajo tiempo de retención (o
volumen de retención) tendrá alta afinidad por la FM, interacciona
poco con la fase estacionaria y por lo tanto sale pronto de la
columna. Por el contrario, un analito que tiene alta afinidad por
la FE será retenido mucho tiempo dentro de la columna y tardará en
salir de la misma. Tiempo muerto de la columna: algunas veces en el
cromatograma aparece el “tiempo muerto” (tm) o “volumen muerto”
(Vm) de la columna que corresponde al primer pico del gráfico y
aparece rápidamente (es un tiempo muy corto). Corresponde a un
analito que no interacciona con la fase estacionaria y por lo tanto
es una medida del tiempo (o volumen de FM) que se necesita para
recorrer la columna desde que se inyectó la muestra. Si el
cromatograma tiene un dato de tm, todos los tiempos de retención se
corrigen respecto a él y se denominan tiempo de retención neto.
Volveremos a estudiar estos conceptos en la sección de la guía:
¿Qué parámetros podemos obtener de un cromatograma?
II- Componentes del CROMATÓGRAFO GASEOSO (Figura 4)
(Cromatografía en columna)
En este caso la FM es gaseosa, por lo tanto el recipiente que
contiene a la FM (eluyente) es una garrafa con su correspondiente
regulador de presión. Antes de llegar a la columna habrá un
regulador de flujo que permite controlar a qué velocidad se hará
circular la FM a través de la columna. Dentro del horno que nos
permite regular la temperatura de trabajo encontramos la columna
donde está contenida la FE. En el extremo de la columna próximo al
ingreso de la FM se encuentra el inyector, donde se va a colocar la
muestra que se analizará. En el extremo opuesto de la columna, que
corresponde a la salida de la columna, estará ubicado el detector.
Finalmente y nuevamente fuera del horno encontramos el procesador y
el registro del CROMATOGRAMA.
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III- Componentes del CROMATÓGRAFO LÍQUIDO (Figura 5)
(Cromatografía en columna) En el reservorio de FM, que en este caso
es un líquido, está conectada una bomba de alta presión que permite
seleccionar con que presión se hará circular la FM líquida a través
de la columna que contiene la fase estacionaria. Antes de la
columna encontramos el inyector donde se colocará la muestra, luego
la columna que contiene a la FE y luego de la columna el detector
que permite obtener los datos necesarios para obtener finalmente el
CROMATOGRAMA.
ESQUEMA BÁSICO PARA AMBOS CROMATÓGRAFOS
¿Dónde se produce la separación de analitos? IV- CROMATOGRAMA
(Cromatografía en columna)
Es el gráfico donde se registran los analitos separados durante
el proceso cromatográfico. Este registro se logra mediante un
detector ubicado a la salida de la columna del cromatógrafo. El
detector dará una señal base (línea de base) cuando por la salida
de la columna circule la fase móvil. Cuando la fase móvil contenga
un analito la señal
Reservorio de FM
Reservorio de FM Detector Inyector Columna (FE) Registro:
Cromatograma
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del detector se levantará dando lugar a un pico correspondiente
al analito que está saliendo con la fase móvil (Figura 6).
Figura 6- Representación esquemática de un cromatograma en el
que se obtuvieron tres analitos separados: a, B y C. En el eje Y se
grafica la señal del detector y en el eje X se grafica el tiempo en
minutos desde que se inyectó lamuestra hasta que sale el analito.
En este esquema t1 t2 y t3 representan los minutos a los que salió
cada analito (A, B y C respectivamente). En algunos cromatógrafos
el cromatograma que se obtiene representa la señal del detector (en
el eje Y) en función del volumen de fase móvil que circula desde la
inyección de la muestra (en el eje X) en lugar del tiempo que
transcurrió desde la inyección de la muestra.
Ejemplo de un cromatograma real obtenido en un cromatógrafo
líquido de alta presión (HPLC) (figura 7)
Figura 7- En el eje Y se representa la señal del detector y en
el eje X el tiempo en min. Corresponde a la separación de azúcares
solubles a partir de un extracto etanólico de pulpa de un
fruto.
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¿Qué parámetros podemos obtener en un cromatograma? 1- Tiempo de
retención (tr): Es el tiempo que tarda en salir un analito de la
columna, este valor se mide en minutos a partir de la inyección de
la muestra. Un analito con un tr bajo es un analito que tiene baja
afinidad por la fase estacionaria, es decir que es poco retenido en
la fase estacionaria. Por el contrario, un tr alto será un analito
que tiene gran afinidad por la fase estacionaria y por lo tanto es
fuertemente retenido y tardará más tiempo en salir de la
columna.
Si el cromatograma representa la señal del detector en función
del volumen de fase móvil que circula el parámetro se denomina
Volumen de retención (Vr) y se interpreta del mismo modo que el
tiempo de retención.
Tiempo muerto (tM): tiempo que tarda en recorrer la columna la
fase móvil desde que se inyectó lamuestra. Para determinar el
tiempo muerto es necesario agregarle a la muestra un analito que a
priori sabemos que no interactúa en absoluto con la fase
estacionaria. No todos los cromatogramas tendrán este dato. En
aquellos cromatogramas que tienen el valor de tM se calculan los
tiempos de retención netos para cada analito restándole el tiempo
muerto al valor del tiempo de retención (figura 8).
tR´ = tR - tM Figura 8- Tiempo muerto, de retención y de
retención neto.
2- Área bajo el pico: es proporcional a la cantidad del analito
al que corresponde ese pico. Podemos decir que cuanto mayor es el
área bajo el pico, mayor la cantidad del analito que representa ese
pico. Para poder cuantificar es necesario previamente realizar una
calibración de la cromatografía (como ocurre con todos los métodos
instrumentales) (Figura 9).
Figura 9- Cromatograma del mismo analito pero en cantidades
diferentes. A mayor concentración en la solución, mayor el área del
triángulo. Para calcular el área se aproxima el dibujo a un
triángulo y se calcula el área del triángulo: (base x altura
/2)
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3- Ancho en la base del pico (W): se mide en las unidades que se
grafican en el eje X (minutos o mililitros) y es un parámetro que
permite interpretar si la cromatografía es eficiente para separar
prolijamente un analito. Si la cromatografía es eficiente significa
que el analito queda concentrado en una porción estrecha de la fase
estacionaria contenida en la columna (no existe efecto de
“desparramo” dentro de la columna (Figura 10). Concretamente cuanto
menor es el ancho de la base del pico más eficiente es la
cromatografía (menor efecto desparramo).
Figura 10- Eficiencia de un pico en un cromatograma. Cuanto más
finito (agudo) es el pico obtenido para un analito, más eficiente
es la cromatografía para ese analito.
La Eficiencia de la cromatografía realizada se puede calcular
para cada analito obtenido a partir de los datos del pico
correspondiente: tiempo de retención y ancho de la base del pico.
Asumiendo que los picos son simétricos alrededor del máximo,
asumimos que la eficiencia se calcula con la siguiente fórmula:
Eficiencia = 16 (tr/W)2 4- Resolución de la cromatografía: es un
parámetro que nos permite evaluar si los analitos fueron separados
correctamente (están resueltos) o si hay desprolijidades en la
separación, lo que significa que hay zonas a la salida de la
columna donde dos analitos consecutivos salen mezclados. La
resolución se calcula a partir de los datos del cromatograma para
dos picos consecutivos. Corresponde a la diferencia entre los
tiempos de retención divido el promedio del ancho de bases:
Rs = ( trB-trA ) (WA + WB) Rs debe ser ≥1,5 2
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Figura 11- Representación de tres cromatogramas para los
analitos A y B. Los analitos se separaron bien en el gráfico
inferior donde la resolución (Rs) dio por lo menos 1,5. En los
otros dos casos las resoluciones dieron valores menores a 1,5 y
como se observa en el dibujo los dos picos no están bien
separados.
Una mala eficiencia termina complicando la resolución. Picos
anchos aumentan las chances de obtener picos superpuestos (mala
resolución). Cuanto más angostos son los picos (picos agudos) mayor
la probabilidad de obtenerlos separados. FACTORES QUE AFECTAN LA
EFICIENCIA DE UNA CROMATOGRAFIA Básicamente los cuatro factores que
determinan la eficiencia de una cromatografía en columna son los
siguientes: 1-Naturaleza de la fase estacionaria (calidad del
empaquetamiento en caso de columnas rellenas y resistencia a la
transferencia de materia que ofrece la FE). 2-Naturaleza de la fase
móvil (resistencia a la transferencia de materia que ofrece la FM)
3-Velocidad a la que circula la fase móvil (para cada cromatografía
diseñada existirá una velocidad óptima para la circulación de la
FM). 4-Temperatura de trabajo (modifica la resistencia a la
transferencia de materia de las fases involucradas y modifica el
coeficiente de difusión de los analitos). En la práctica estos
cuatro factores representan las características del método
cromatográfico que podemos cambiar para lograr que los picos anchos
de un cromatograma se transformen en picos angostos.
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ACTIVIDADES DE LABORATORIO
1- Cromatografía plana Separación de Fe+3, Ni+2, Cu2 por
cromatografía de reparto en papel Se realizará una cromatografía
para separar iones metálicos, utilizando un papel de filtro como
soporte, una fina película de agua como FE y un”solvente” como FM.
Composición de la FM: 17 ml de acetona- 1 ml de agua-2 ml de HCl
(concentrado). La cromatografía de papel es un método de reparto o
partición que utiliza como soporte de a fase estacionaria la
celulosa de una hoja de papel de filtro especial (Whatman o
Schleicher & Schull). Procedimiento: Etapas de la cromatografía
plana
1- Siembra de la muestra: La muestra se disuelve en un solvente
volátil (para que se seque fácilmente) con una concentración de por
lo menos 10 mg/ml (10μg/μl). Se utiliza una tira de papel
rectangular. Para efectuar la siembra de la muestra sobre el papel
se traza con un lápiz la “línea de siembra” a aproimadamente 1cm
del extremo de la tira de papel. Mediante una pipeta capilar (0,5
mm de diámetro) se deposita una pequeña gota tal que al extenderse
sobre el papel sea de aproximadamente 2 a 3 mm de diámetro. Dejas
secar la gota y repetir el procedimiento colocando una segunda gota
en el mismo lugar. 2-Desarrollo del cromatograma: Una vez sembrada
la muestra, la hoja de papel se coloca dentro de la cámara que está
saturada con los vapores de la mezcla de solventes (Fase móvil) que
se van a emplear para el desarrollo del cromatograma. Se deja en
esas condiciones durante un período variable que se llama periodo
de equilibrado, durante el cual el papel se satura sin entrar
directamente en contacto con el solvente. Luego se sumerge el borde
inferior del papel en el solvente contenido en el fondo de la cuba
(cromatografía ascendente). El reparto o partición se lleva a cabo
entre el agua (fase estacionaria) retenida por la celulosa del
papel y el solvente empleado en el desarrollo del cromatograma
(fase móvil). Es decir que a medida que el solvente se desplaza
sobre el papel, se produce un reparto o distribución de los
analitos de la muestra entre el solvente orgánico (FM) y el agua
retenida (FE), lográndose así una separación de los componentes de
una mezcla según sus respectivos coeficientes de reparto. Como
consecuencia de esto, los componentes es moverán con distintas
velocidades. Cuando el frente del solvente (FM) llega a una
adecuada distancia del borde superior se retira el papel, se marca
con lápiz el “frente del solvente (FM)” se seca y se revela.
3-Revelado del cromatograma: Una vez desarrollado el cromatograma,
se rocía el papel seco con una solución alcohólica de
dimetilglioxima, exponiendo luego el papel a los vapores de NH3 La
aparición de una mancha de color rojo de Ni-dimetilglioxima indica
la presencia de Ni+2. Luego se rocía el resto del papel con
solución acuosa de ferrocianuro de potasio. La aparición de una
mancha azul y de una mancha de color marrón revelan la presencia de
Fe+3 (mancha azul de ferrocianuro férrico) y de Cu+2 (mancha marrón
ferrocianuro cúprico) respectivamente. Se marcan con lápiz el
centro de cada mancha (o la zona donde el color es más intenso). 4-
Cálculo de los Rf correspondientes: Todas las distancias se miden
desde la “línea de siembra”. Con los datos obtenidos en el papel
(distancias medidas con una regla) se podrá calcular las relaciones
de frente.
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solventeelporrecorridadistancia
muestralaporrecorridadistanciafR
La relación de frentes Rf se calcula para cada componente
midiendo las distancias desde a línea de siembra hasta el centro de
la mancha correspondiente a cada analito y desde la línea de
siembra hasta el frente del solvente (FM). 5- Interpretación de los
resultados
2- Cromatografía en columna Eliminación de la “Dureza de agua”
por cromatografía de intercambio iónico
Cromatografía de intercambio iónico: En este tipo de
cromatografía se utiliza como FE un sólido particular: una resina
que presenta unidos covalentemente muchos grupos de carga opuesta a
los iones que se van a intercambiar. Si es una resina de
intercambio catiónico tendrá unidos covalentemente grupos negativos
(sulfónicos: RSO3 -) mientras que si se trata de una resina de
intercambio aniónico, tendrá unidos covalentemente grupos de carga
positiva (aminas cuaternarias: NH3
+). La FM en este tipo de cromatografía es un líquido que
llevará disueltos a los iones que queremos separar. Por lo tanto
cuando la FM empuje a los iones a través de la FE, los analitos de
carga opuesta a la fase estacionaria serán atraídos y retenidos por
una fuerza electrostática. Reacción química que interpreta el
funcionamiento de una resina de intercambio catiónico: R-SO3 H +
Ca
+2 (R-SO3)2 Ca + 2H+
La condición inicial de la resina será cuando está equilibrada
con agua destilada, por lo tanto el grupo sulfónico estará unido a
un protón (H+). Cuando intercambie el protón por los cationes
calcio tendrá como consecuencia la acidificación el agua. Una vez
que la resina se agota (todos los sitios ya fueron intercambiados)
se pueden reciclar usando HCl para recuperar la condición
inicial.
¿Cómo funcionaría una resina intercambiadora de aniones? ¿Qué
pasaría con el agua entonces?¿Cómo la reciclaríamos?
Muchas sustancias sólidas, naturales o sintéticas, pueden
emplearse como
intercambiadores de iones. Las arcillas (naturales) son
componentes de los suelos que
actúan como intercambiadoras de iones por lo tanto tendrán
influencia en la
“disponibilidad de iones”. Las resinas sintéticas de intercambio
de iones son polímeros
de alto peso molecular que fueron producidas por primera vez en
1935 y desde entonces
han hallado gran aplicación en el laboratorio y la industria
para ablandamiento de
aguas (eliminación de Ca+2 y Mg+2), desionización de aguas,
purificación de
soluciones y separación de iones.
En el trabajo práctico se utilizará como soporte una columna de
vidrio rellena con una resina de intercambio catiónico (cargada con
grupos sulfónicos) la que va a retener fuertemente los iones Ca+2 y
el Mg+2 cuando una muestra de agua circule a través de la
misma.
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Soporte: Columna FE: resina de intercambio catiónico (sólida)
FM: agua La retención de los iones dentro de la columna se pondrá
en evidencia mediante el uso de Indicadores metalocrómicos los que
permiten fácilmente revelar la presencia o ausencia de los iones
Ca+2 y Mg+2.
Procedimiento en el trabajo práctico:
a) Se toman 10 ml de una muestra de agua sin tratar, se agregan
5 ml buffer pH 10 (mezcla de NH4Cl y NH4OH)) y se agrega una pizca
de indicador negro de eriocromo. La coloración rojo vinoso indica
la presencia de Ca+2 y Mg+2.
b) Se toma otra alícuota de la misma muestra, se hace pasar
lentamente por la resina intercambiadora de cationes y se recoge la
muestra a la salida de la columna en un vaso de precipitado. Se
agregan 5 ml de buffer pH 10 y una pizca de negro de eriocromo. La
aparición de una coloración azul indica la ausencia de los cationes
Ca+2 y Mg+2, que fueron entonces retenidos por la resina dentro de
la columna.
Cuestionario 1. ¿Qué entiende por cromatografía? 2. ¿Cómo puede
clasificar los procesos cromatográficos según los ecanismos por los
que
se separan los analitos? 3. ¿Cuáles son los componentes básicos
de cualquier sistema cromatográfico? 4. ¿Cómo clasifica las
técnicas cromatográficas según el estado de agregación de la
fase
móvil? 5. ¿Cómo clasifica a las cromatografías según el soporte
utilizado? 6. Defina y explique el parámetro que se utiliza en una
cromatografía plana y en una
cromatografía en columna asociado a un analito. 7. ¿Cuáles son
las partes constitutivas de un cromatógrafo gaseoso? ¿Cuál es el
orden de
estos componentes? 8. ¿Qué tipo de columnas pueden utilizarse en
la cromatografía gas-líquido? 9. ¿En el caso de las cromatografías
en columna a que llamamos cromatograma? ¿Qué
parámetros puedo obtener en el mismo? 10. ¿Cómo se calcula la
eficiencia de una cromatografía en base a los datos del
cromatograma? 11. ¿Cómo se calcula la resolución de una
cromatografía? ¿Qué significado tiene este
parámetro? 12. ¿Cómo se puede mejorar experimentalmente la
eficiencia de una cromatografía en
columna? 13. ¿Qué tipo de cromatografía puede utilizar para
ablandar un agua? ¿Qué tipo de
sustancia utiliza como soporte? 14. ¿Cómo funcionan las resinas
de intercambio iónico? 15. Una vez agotadas las resinas de
intercambio, ¿cómo puede regenerarlas? 16. ¿En la cromatografía de
papelque realizó en el trabajo práctico, cuál es fenómeno que
permite la separación? 17. En la cromatografía de papel ¿cuál es
la fase estacionaria, la fase móvil y cuál es el
soporte que se emplea?
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18. Explique los procesos de sembrado, desarrollo y revelado del
cromatograma en la cromatografía de papel.
19. ¿Qué es el Rf? ¿Para qué se utiliza? ¿Qué valores puede
tomar? ¿Qué significan?
Problemas
1- El dibujo muestra los resultados obtenidos en una
cromatografía
plana en la que se estudió la presencia de un pesticida (P) en
la
cáscara de 3 duraznos (D1, D2 yD3). De acuerdo a los datos
obtenidos, ¿qué puede concluir sobre la posible contaminación de
los
duraznos con el pesticida?
2- Los cromatogramas de los compuestos A y B que se muestran en
la figura se obtuvieron
empleando dos columnas de la misma longitud y con el mismo
caudal
a) ¿Cuál de las dos columnas es más eficiente para los analitos
A y B? b) ¿Qué columna tiene mayor resolución?
3- El cromatograma de una mezcla de especies A, B, C y D
proporcionó los siguientes datos:
Tiempo de retención en min Ancho de la base en min
No retinada 3,1 -
A 5,4 0,41
B 13,3 1,07
C 14,1 1,16
D 21,6 1,72
Calcular: el tiempo de retención neto, la eficiencia para cada
analito y la resolución. A
partir de los resultados obtenidos para la resolución indique si
los componentes han
sido separados satisfactoriamente.