UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE MADRID FACULTAD DE CIENCIAS DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA MOLECULAR INVESTIGACIÓN EN TERAPIAS ESPECÍFICAS DE MUTACIÓN EN ENFERMEDADES METABÓLICAS HEREDITARIAS. RESPUESTA A COFACTORES Y TERAPIA ANTISENTIDO. Cristina Aguado Esteban TESIS DOCTORAL Madrid, 2008
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UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE MADRID
FACULTAD DE CIENCIAS
DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA MOLECULAR
INVESTIGACIÓN EN TERAPIAS ESPECÍFICAS DE MUTACIÓN EN ENFERMEDADES METABÓLICAS
HEREDITARIAS. RESPUESTA A COFACTORES Y TERAPIA
ANTISENTIDO.
Cristina Aguado Esteban
TESIS DOCTORAL
Madrid, 2008
UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE MADRID
FACULTAD DE CIENCIAS
DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA MOLECULAR
INVESTIGACIÓN EN TERAPIAS ESPECÍFICAS DE MUTACIÓN EN ENFERMEDADES METABÓLICAS
HEREDITARIAS. RESPUESTA A COFACTORES Y TERAPIA
ANTISENTIDO.
Directora de Tesis:
Dra. Lourdes Ruiz Desviat
Memoria presentada por la licenciada Cristina Aguado Esteban para optar al grado de Doctor en Ciencias
El presente trabajo ha sido realizado en el laboratorio de la Prof. Magdalena Ugarte, Catedrática del Departamento de Biología Molecular, en el Centro de Biología Molecular “Severo Ochoa” de la Universidad Autónoma de Madrid, y durante una estancia breve en el laboratorio de la Prof. Ruma Banerjee, en el Centro Redox de Biología, Departamento de Bioquímica, en la Universidad de Nebraska, EEUU, con la ayuda de una beca predoctoral concedida por el ministerio de Educación y Ciencia.
AGRADECIMIENTOS
En primer lugar quiero agradecer a Dios la vida y la gente tan genial que ha puesto en mi camino durante estos cinco años. Gracias por los buenos y malos momentos, porque nunca me he sentido sola, por ese amor tan grande que me muestra siempre.
Gracias a la Profesora Magdalena Ugarte por darme la gran oportunidad de realizar la tesis doctoral en su laboratorio. Por su gran ejemplo profesional y humano. Por presentarme a varios de sus niños.
Gracias a cada una de las personas del laboratorio 201‐210/204 porque me he sentido muy querida y muy cuidada y porque de cada uno he aprendido mucho, por poder hacer la tesis junto a ellos:
A Lourdes por ser mi directora de tesis, por haber escuchado siempre mis teorías, porque eso ha hecho que me ilusione este mundo. Por transmitirme mucha confianza y tranquilidad, por corregirme y regañarme en los momentos adecuados, por tener siempre una solución, por acertar siempre los resultados, por ser como eres; inteligente, práctica, clara y fuerte.
A Belén por ser la primera persona del laboratorio con la que hablé, por la fuerza, seguridad e inteligencia que transmite. A las dos por su ejemplo como investigadoras, por esa capacidad de integrar tantos temas científicos a la vez, por trabajar de forma tan complementaria.
A Rosa por ser tan buena gente, una de las mejores que conozco, por los mil detalles que ha tenido conmigo, por defenderme siempre, por escucharme aquel día a las tres de la mañana, por ser tan buena amiga.
A Ascen porque fue la primera persona con la que compartí poyata, por todo lo que me ha enseñado, por su paciencia, porque tiene una solución para cualquier problema, por sus buenos consejos.
A Fa por los viajes en el tren, por ser tan elegante trabajando, porque eres la única persona que me ha visto medio llorar, por las zapatillas de estar por casa, por estar atenta a lo que me pasaba, por escucharme siempre. A las tres Ascen, Fa y Rosa por la seguridad y unión que transmitís en el laboratorio.
A Ana Rincón por los cinco años compartiendo tesis, por ser mi ONG personal, por soportar mi enano gruñón, por “es un señor....”, por el intento de libro, por algún que otro secreto.
A Ana Vega por su sinceridad y franqueza siempre, por querer siempre entender lo que haces, por el viaje a Barcelona, por tu humor y por intentar enseñarme a bailar.
A Patricia porque me parece que te conozco desde hace mucho más tiempo, por aquel “me caes muy bien” después de la cena de Navidad, por compartir tus sentimientos, por la confianza que me transmites.
A Ana Jorge por ser tan trabajadora y luchadora. A Celia y a Begoña por contestar siempre mis preguntas, por transmitirme lo
maravilloso que es el diagnóstico de las enfermedades metabólicas. A Carmen por ser ejemplo de fuerza, por enseñarme tanto, por todas las
conversaciones en el cuarto de cultivo, por preocuparte tanto por la gente.. A Pilar por ser una de las mejoras profesoras que tuve en la carrera y por todos sus
buenos consejos. A Marga por hacerme siempre un hueco en el aparato, por explicarme tantas cosas.
A Palo por dejarme cotillear en los picos de los aminoácidos y por tantas conversaciones. A Fer por ser tan dispuesto y amable.
A Rocío alias “Irene”, por la tranquilidad que transmite, por aguantar mis bromas, por preguntarme y fiarte de mi.
A Irene y el niño porque fueron mis avanzados, por todas las historias que he vivido con ellos, por dejarse enseñar, por la paciencia con mis largas explicaciones, por los bollitos de su pueblo Rubén, por las historias con su hermano, por llevar tan bien lo del aire que le dio. Irene, por ser un ejemplo en empeño y paciencia hasta conseguir un experimento.
A los dos informáticos Julio y Gonzalo, por su paciencia con mis estropicios informáticos y por su gran humor, por las discusiones de religión, por los partiditos al baloncesto y por las cañas en los dardos.
A Sonia, a MA y a Ángel mis becarios predecesores por luchar cada uno a su manera por conseguir vuestros sueños Sonia por las bromas en los primeros tiempos, por acogerme en tu casa tras una comida de Navidad, por tus mil consejos, por los viajes en el tren, por llamarme cuando estaba en Nebraska. A María Ángeles por los cines por su dulzura y por su sinceridad. A Pey por enseñarme con tanta precisión, por ser un enamorado de su trabajo.
A Isaac por los partidos de baloncesto, por las partidas de dardos, porque aunque en muchas cosas pensamos diferente siempre me has escuchado, por tus bromas.
A Pedro por todas las conversaciones en el laboratorio y fuera de el, por los teatros compartidos, las cañas y porque siempre he aprendido cuando he hablado contigo, por tu humor.
A Gema, María, Charo, Yolanda, Nuria, María Jesús por tantas conversaciones en el lado de diagnóstico, por los experimentos que me habéis enseñado, por vuestra paciencia cuando me dejaba cosas en vuestro lado.
A la Richi por su sonrisa perenne, por contestar siempre mis preguntas y por ser tan cercana.
A las biosecre (Ana, Isa, Eva y Julia) por tener siempre una sonrisa aunque nos coláramos en la impresora con las secuencias y a la Juli en especial, por su humor, por su capacidad teatral, por comer con nosotras a las tres, por presentarme a un amigo común, por preocuparte por mi. A Maja, Abel y Lorena porque aunque habéis estado poco conmigo habéis hecho muy agradable el día a día en el laboratorio. Gracias a la gente de los diversos laboratorios y de los distintos servicios del CBM cuya ayuda ha sido importante para esta tesis. OS VOY A ECHAR MUCHO DE MENOS No se puede hacer una tesis sin una familia y unos amigos que te apoyen, quieran y acompañen durante los cinco años que dura este camino.
Por supuesto y en primer lugar gracias a mis padres, a mi padre por su ejemplo de trabajo, honradez y humor, a mi madre por su ejemplo de atención, detallismo y dulzura. A los dos gracias por la confianza que siempre habéis tenido en mi, por apoyarme siempre durante la carrera y durante estos cinco años de doctorado, pero sobre todo gracias por quererme tanto y siempre, porque no creo que me merezca unos padres tan buenos. A mi hermana, por su ejemplo de entrega total, por su fuerza y decisión, por que cada día descubro la gran suerte de tenerla, de poder hablar con ella, de que esté en ese pequeño
convento rezando por todos. A mi hermano por ser tan trabajador y por tener tan buen corazón.
A Raquel por los 24 años de amistad, por los tres años de compartir piso, por abrir tu corazón siempre, por tu fuerza de voluntad, porque hemos compartido mucho
A mis compis de piso del último año y medio, por las conversaciones del salón, por la libertad de esta casa, a María por los paseos de los últimos tiempos, por ese disco que me grabaste y que nunca dejaré de escuchar, a Ana Merino por los intentos de magdalenas y el triunfo del bizcocho, por tantas conversaciones espirituales, por ser tan alegre y vivaz, a Ana Barquero por su humor, por preocuparte por mi a altas horas de la madrugada, a Bea por ser tan generosa, por dar sin preguntar, ojala todo el mundo pudiera tener unas compañeras de piso tan geniales como ellas.
A los chavales de Fundamipf sobre todo Quique, Irene (Lala) y Laurita porque conocerles es una de las mejores cosas que me ha pasado en la vida y de las que más me ha cambiado, porque si he hecho la tesis en este laboratorio es gracias a encontrarme con ellos.
Al grupo de San Jorge, a los chavales, por la felicidad que transmitís, por todas las sonrisas, besos y abrazos que me habéis regalo durante estos dos años, por los campamentos, por el club de los martes y las celebraciones de los domingos. Gracias a los padres y a todos los monitores con los que he aprendido a cuidar y disfrutar de estos chavales tan especiales.
A mis amigos de Segovia por los más de 10 años que llevamos juntos, porque cada vez que vuelvo a Segovia es como si nunca me hubiera ido.
A la gente de lokos por hacerme disfrutar en cada viaje y en cada partido. A mi comunidad de Mirto con la que he crecido espiritual y humanamente estos
años, a Pablo, Marisa, Gabriella, María José, María “Kika”, Jorge, Vanesa, Abraham, Noemí, María Casado, Carmen, Quique, Javi, David,Pepa. En fin, muchas gracias a todos.
A mis padres: Hilario y Pilar
SUMMARY In this work, we have investigated specific mutation therapies in metabolic genetic diseases, specifically we have analyzed the mechanisms underlying cofactor and coenzyme responsiveness in phenylketonuria (PKU), propionic acidemia (PA), methylcrotonylglycinuria (MCG) and methylmalonic aciemia (MMA) and splicing therapies in PA. We have identified the mutations present in Spanish PKU patients who respond to BH4 and we have selected some mutations associated to responsiveness for expression analysis. We have analyzed in total 14 missense mutations using different prokaryote, eukaryote and cell‐free systems. Five mutations were expressed in vitro in E.coli as MBP‐PAH fusion proteins, we have determined PAH steady‐state kinetic properties in order to detect possible defects in BH4 affinity. The majority of the mutations affected kinetic and regulatory properties. Only one mutation showed slightly reduced affinity for the cofactor under steady‐state conditions. We have also measured the degradation rates of 11 mutant PAH proteins expressed in a cell‐free system, using pulse‐chase analysis and presence or absence of BH4 and determined the amount of three of the mutant proteins after transfection in Hep3B as FLAG‐PAH fusion proteins in presence of different levels of BH4. The results show that high concentrations of BH4 protect some mutant proteins against degradation and result in an increase in the steady‐state amounts of protein in hepatoma cells. In the hepatoma cellular model, BH4 levels don’t affect the expression of the PAH gene.
In MMA cblB type we have selected two mutations previously associated with responsiveness to OHcobalamin. We have expressed the ATR protein in E. coli to determine steady‐state kinetic properties in order to detect possible defects in cobalamin affinity. The results suggest a stability defect for one of the mutant proteins, with reduced enzymatic activity but with K(m) for ATP and Kd for cob(I)alamin similar to wild‐type values.
The last coenzyme analyzed in this work was biotin, for which there is no consensus in the literature if it affects the expression of biotin‐dependent carboxylases. In Hep3B cells we have analyzed the effect of different levels of biotin in the activity, amount of functional active protein and mRNA levels of two carboxylases, PCC and MCC, that when defective cause PA and MCG, respectively. In our model, biotin does not affect the expression of the enzymes but favours the conversion of apocarboxylase to holocarboxylase. Finally, we describe the use of antisense morpholino oligonucleotides (AMOs) to restore normal splicing caused by intronic molecular defects identified in PA. The two point mutations described in deep intronic regions increase the splicing score of pseudoexonic regions or generate consensus binding motifs for splicing factors, such as SRp40, which favour the intronic inclusion in PCCA (r.1284ins84) and PCCB (r.654ins72) mRNAs. AMOs were targeted to the 5´ and 3´ cryptic splice sites of the pseudoexons to block the access of the splicing machinery. Using this antisense therapeutics, we have obtained correctly spliced mRNA that was efficiently translated and PCC activities were rescued in patients´fibroblasts. Our results demonstrate that the aberrant inclusions of the intronic sequences are disease‐causing mutations in these patients and that the use of AMOs is an effective therapeutic strategy in this genetic disorder.
ABREVIATURAS ACC: Acetil‐CoA carboxilasa AdoCbl: Adenosilcobalamina ADP: Adenosina difosfato AON: Oligonucleótiodo antisentido AP: Acidemia propiónica ATP: Adenosina trifosfato ATR: ATP: cobalamina adenosil transferasa BH4: (6R)‐L‐eritro‐5,6,7,8‐tetrahidrobiopterina BPS: Secuencia de ramificación (branch point sequence) BSA: Albúmina de suero bovino cAMP: Adenosina monofosfato cíclica Cbl: Cobalamina CBR: Región de unión del cofactor cDNA: DNA complementario DAHP: 2,4‐Diamino‐6‐hydroxypyrimidine DMSO: Dimetil sulfóxido. DNA: Ácido desoxirribonucleico dNTP: Desoxinucleótido trifosfato DTT: 1,4‐ditio‐L‐treitol EDTA: Ácido etilen‐diamino‐tetraacético EGTA: Ácido etilen‐glicol‐tetraacético EMH: Enfermedades metabólicas hereditarias ESE: Secuencia exónica potenciadora de splicing (exonic splicing enhancer) FAS: Sulfato amónico ferroso FBS: Suero fetal bovino. FPLC: Sistema de separación rápida de proteínas por cromatografía de
líquidos GAPDH: Gliceraldehído‐fosfato deshidrogenasa gDNA: DNA genómico h: Índice o coeficiente de Hill HCS: Holocarboxilasa sintetasa Hepes: Ácido N‐2‐hidroxietilpiperazina‐N´‐2‐etanosulfónico HPLC: Cromatografía líquida de alto rendimiento HFA: Hiperfenilalaninemia suave o benigna IPTG: Isopropil 1‐tio‐β‐D‐galactopiranósido IVS: Intrón (Intervening Sequence) kb: Kilobases Kd: Constante de disociación kDa: Kilodaltons Km: Constante de Michaelis‐Menten LB: Medio Luria Broth
L‐Phe: L‐Fenilalanina L‐Tyr: L‐Tirosina MBP: Proteína de unión a maltosa MBP‐PAH: Proteína de fusión, proteína de unión a maltosa‐fenilalanina
hidroxilasa MBP‐PAHtet: Proteína de fusión, proteína de unión a maltosa‐fenilalanina hidroxilasa tetramérica MCC: 3‐metilcrotonil‐CoA carboxilasa MCG: Metilcrotonilglicinuria MCM: Metilmalonil‐CoA mutasa MeCbl: Metilcobalamina MEM: Medio mínimo esencial de Eagle Met: Metionina MMA: Acidemia metilmalónica mRNA: RNA mensajero Na‐Hepes: Hepes 20 mM NaCl 200 mM pH 7.0 NBCS: Suero de ternera recién nacida NMD: Sistema de (nonsense mediated decay) nt: Nucleótido OH‐Cbl : Hidroxicobalamina PAH: Fenilalanina hidroxilasa PAHtet: Fenilalanina hidroxilasa tetramérica pb: Par de bases PBS. Tampón fosfato salino PC: Piruvato carboxilasa PCC: Propionil‐CoA carboxilasa. PCR: Reacción en cadena de la polimerasa PDB: Banco de datos de proteínas (Protein Data Bank). PKU: Fenilcetonuria PMSF: Fenilmetilsulfonil fluoruro PVDF: Fluoruro de polivinilo Pm: Peso molecular qRT‐PCR: Retrotranscripción y reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa RNA: Ácido ribonucleico RT‐PCR: Retrotranscripción y reacción en cadena de la polimerasa S0,5: Concentración de velocidad semi‐máxima SDS: Dodecilsulfato sódico SDS‐PAGE: Electroforesis en geles de poliacrilamida en presencia de SDS t1/2 : Vida media TAE: Tris acetato‐EDTA TBE: Tris borato‐EDTA TCA: Ácido tricloroacético Tm: Temperatura de semidesnaturalización
TNT: Sistema transcripción‐traducción acoplada Tris: Tris (hidroximetil) aminometano Vmax: Velocidad máxima o limitante wt: Salvaje o normal
Algunos términos ingleses, ampliamente utilizados en Biología Molecular y sin clara traducción en castellano, se presentan en cursiva.
1.2. RESPUESTA A COFACTORES EN EMH ............................................................. 5
1.2.1. FENILCETONURIA Y RESPUESTA A TETRAHIDROBIOPTERINA (BH4) ................................................................................................................ 7
1.2.1.1. Estructura y función de la fenilalanina hidroxilasa .................... 10 1.2.1.2. El cofactor tetrahidrobioterina ....................................................... 12
1.2.2. ACIDEMIA METILMALÓNICA AISLADA Y RESPUESTA A
COBALAMINA ............................................................................................ 14 1.2.2.1. Estructura y función de la ATP:cob(I)alamina
1.2.3. ACIDEMIA PROPIÓNICA Y METILCROTONILGLICINURIA Y RESPUESTA A BIOTINA........................................................................... 18
1.2.3.1. Estructura y función de la propionil‐CoA carboxilasa y metilcrotonil‐CoA carboxilasa........................................................ 21
1.2.3.2. El cofactor biotina............................................................................. 21
1.3. SPLICING Y ENFERMEDADES GENÉTICAS ................................................... 24
3 MATERIALES Y MÉTODOS.................................................................... 28 3.1. MATERIALES.......................................................................................................... 29
3.1.1. Reactivos y aparatos..................................................................................... 29 3.1.2. Material biológico......................................................................................... 30
3.2.1. Tratamiento de ácidos nucleicos ................................................................ 31 3.2.2. Electroforesis en geles con gradiente de desnaturalización (DGGE) ... 35 3.2.3. Expresión y purificación de proteínas en E. coli ...................................... 35
3.2.3.1. Expresión y purificación de la proteína de fusión MBP‐PAH............ 35
1
3.2.3.2. Expresión y purificación de la proteína hATR.................................... 36 3.2.4. Cromatografía en gel ................................................................................... 38 3.2.5. Electroforesis, transferencia y detección de proteínas ........................... 38
3.2.5.1. Electroforesis, transferencia e inmunodetección de la proteína PAH .................................................................................................... 38
3.2.5.2. Electroforesis, transferencia y detección de la proteína α‐PCC mediante marcaje con avidina conjugada a fosfatasa alcalina ............................ 39
carboxilasa ........................................................................................... 41 3.2.7. Síntesis in vitro y pulso caza de las proteínas PAH ............................... 42 3.2.8. Cultivo celular............................................................................................... 43
3.2.8.1. Expresión transitoria en células eucariotas Hep3B ............................ 43 3.2.8.2. Transfección de oligonucleótidos antisentido tipo morfolinos en
4 RESULTADOS ..................................................................................................... 46 4.1. BASES MOLECULARES DE LA RESPUESTA A BH4 EN FENILCETONURIA
.................................................................................................................................... 47 4.1.1. Identificación de mutaciones asociadas a respuesta a BH4 en
pacientes fenilcetonúricos españoles ......................................................... 47 4.1.2. Expresión de proteínas PAH mutantes implicadas en la respuesta
a BH4 .............................................................................................................. 50 4.1.2.1. Análisis cinéticos................................................................................. 51 4.1.2.2. Análisis del efecto del cofactor BH4 sobre la estabilidad de las
proteínas PAH normal y mutantes .................................................... 53 4.1.3. Efecto de la BH4 sobre la transcripción y traducción del gen PAH...... 57
4.2. BASES MOLECULARES DE LA RESPUESTA A COBALAMINA (VIT B12)
EN ACIDEMIA METILMALÓNICA AISLADA ................................................ 61 4.2.1. Expresión de proteínas mutantes implicadas en respuesta in vitro
a B12; Análisis cinéticos ............................................................................... 61
4.3. BASES MOLECULARES DE LA RESPUESTA A BIOTINA EN ACIDEMIA PROPIÓNICA Y METILCROTONILGLICINURIA........................................... 66
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4.4. TERAPIAS MODULADORAS DE MUTACIONES DE SPLICING EN ACIDEMIA PROPIÓNICA .................................................................................... 71 4.4.1. Análisis del efecto de drogas sobre mutaciones de splicing
que producen niveles detectables de transcritos normales ................... 71 4.4.2. Análisis del efecto de oligonucleótidos antisentido sobre la
inclusión aberrante de pseudoexones. ...................................................... 73
5 DISCUSIÓN........................................................................................................... 77 5.1. RESPUESTA A COFACTORES EN EMH ........................................................... 78
5.1.1. Respuesta a tetrahidrobioterina en fenilcetonuria .................................. 78 5.1.2. Respuesta a cobalamina en acidemia metilmalónica aislada................. 84 5.1.3. Respuesta a biotina en acidemia propiónica y en
metilcrotonilglicinuria ................................................................................. 86 5.2. TERAPIAS MODULADORAS DE MUTACIONES DE SPLICING EN
ACIDEMIA PROPIÓNICA .................................................................................... 88 5.2.1. Efecto de drogas sobre mutaciones de splicing que producen niveles
detectables de transcritos normales. .......................................................... 88 5.2.2. Efecto de la terapia con oligonucleótidos sobre mutaciones de splicing
que producen inclusión de pseudoexones................................................ 89 6 CONCLUSIONES .............................................................................................. 93
Etimológicamente el origen de la palabra metabolismo procede del griego metabolé (μεταβολισμος) que significa cambio, transformación. El metabolismo es el conjunto regulado y coordinado de reacciones químicas que tienen lugar en un organismo vivo. Las enfermedades metabólicas son aquellas patologías causadas por alteraciones adquiridas o congénitas en las proteínas implicadas en estas reacciones. Cuando el defecto es hereditario hablamos de enfermedades metabólicas hereditarias (EMH).
El análisis sistemático de los errores innatos del metabolismo lo
inició Garrod (Fig. 1), con sus estudios sobre alcaptonuria, observó que los pacientes con esta enfermedad excretaban grandes cantidades de ácido homogentísico y determinó que esta acumulación era debida a una alteración en una enzima del metabolismo de la tirosina (Garrod 1908). Además determinó que la herencia de la enfermedad se podía explicar según las leyes de Mendel. Garrod definió el concepto de que determinadas enfermedades se producen debido al fallo o ausencia de una enzima que cataliza un paso específico de una ruta metabólica
Las EMH representan en su raíz inicial, alteraciones en el material genético
(DNA), cuando se altera un gen (mutación), el patrón de su producto génico específico puede ser dañado, producir la pérdida de sus funciones y como consecuencia alterar la homeostasis fisiológica (patogénesis) induciendo las manifestaciones clínicas y el fenotipo (enfermedad). Las alteraciones homeostáticas más comunes que se presentan en las enfermedades metabólicas hereditarias se deben a fenómenos por acúmulo de sustrato (y derivados de este) y/o fenómenos por defecto del producto que deja de metabolizarse. Las diferencias en las manifestaciones fenotípicas dependen del grado de afectación del gen, del tipo y función del producto génico que queda alterado, de eventos post‐traducción, factores celulares, genes situados en otros loci y factores ambientales y estocásticos, por lo que las EMH se comportan frecuentemente como caracteres complejos (Pàmpols Ros 2006).
Las EMH se heredan en forma monogénica: el 60% en forma autosómica recesiva, el 20% autosómica dominante y el 12% ligada al X. Alrededor de un 8% están relacionadas con alteraciones en el genoma mitocondrial (Blau et al. 2001).
Las frecuencias individuales de las EMH son muy bajas, por lo que son
consideradas enfermedades raras (definidas según European Organisation for Rare Disease (EURORDIS) y según la Unión Europea (UE) como aquellas que afectan a menos de 1 individuo cada 2000), sin embargo debido a que se han descrito mas de
Figura 1:A. Garrod
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500 EMH diferentes y se reportan nuevas casi continuamente en su conjunto afectan a un número elevado de individuos.
Las dos características definitorias de las EMH, su gran diversidad y su baja
frecuencia individual, determinan que tanto el diagnóstico, el tratamiento como el análisis bioquímico‐molecular sean complejos. La capacidad para reconocer y diagnosticar EMH se ha incrementado enormemente debido al desarrollo de la tecnología analítica, el conocimiento bioquímico en general y el desarrollo de la biología celular y de la tecnología del DNA.
En general las EMH debutan en el periodo neonatal, siendo muy característico
una sintomatología clínica aguda (convulsiones, insuficiencia hepática, insuficiencia cardíaca, hipotonía, letargia…) en recién nacidos tras un periodo de normalidad. Para algunas enfermedades en las que existe un intervalo de tiempo cercano a un mes entre la presencia de alteraciones bioquímicas y el comienzo de la sintomatología clínica es posible la identificación del transtorno metabólico en el periodo neonatal y en fase preclínica, pudiéndose instaurar un tratamiento y evitando la sintomatología negativa (la fenilcetonuria es un caso clásico de este tipo de EMH).
Al igual que la capacidad para reconocer y diagnosticar las EMH ha aumentado en los últimos treinta años, el tratamiento de estas alteraciones también lo ha hecho, pero mas lentamente, actualmente el 12 % de los EMH tienen tratamiento eficaz, un 54 % obtiene un beneficio en grado variable y en un 34 % no hay respuesta a ningún tratamiento (Scriver and Treacy 1999).
Debido a que en las EMH el defecto primario reside en el DNA la posibilidad de obtener información clínica relevante sobre la severidad fenotípica de la enfermedad a partir del genotipo del paciente es el motor que impulsa los cada vez más numerosos análisis genéticos. En estas y otras enfermedades genéticas, una vez identificados los genes involucrados y las mutaciones patogénicas, la investigación se centra en el estudio de los mecanismos moleculares responsables del defecto, tanto a nivel de DNA y RNA (genómico y transcripcional) como a nivel de proteína, en la estabilidad y/o funcionalidad de las mismas. Estas investigaciones proporcionan una base científica para establecer la relación genotipo‐fenotipo y para el desarrollo de terapias específicas de mutación en lo que se conoce como medicina genómica.
En la mayoría de las EMH un porcentaje muy elevado de mutaciones originan un cambio de aminoácido (representan cerca del 50% de los cambios registrados según la Human Gene Mutation Database (HGMD ®)), en este caso, así como para mutaciones que generan deleciones en fase, codones de parada de traducción cercanos al original y cambios puntuales que afectan al splicing, es difícil predecir su
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efecto. Además para el caso de pacientes con mutaciones de cambio de aminoácido la heterogeneidad es muy elevada y por lo tanto la relación genotipo‐fenotipo es más compleja, ya que es necesario valorar la contribución de cada variante alélica.
Frecuentemente se han empleado para el análisis funcional de las variantes alélicas de los genes distintos sistemas de expresión eucariotas (células de mamífero), procariotas (fundamentalmente Escherichia coli (E. coli)) y libres de células (Desviat et al. 2003b; Waters 2003) todos ellos basados en la expresión de los correspondientes cDNA clonados en vectores adecuados. Estos sistemas permiten determinar las propiedades bioquímicas, catalíticas y estructurales de las proteínas. Se ha observado que las mutaciones missense producen fundamentalmente defectos en la estabilidad (mutaciones estructurales) o defectos en las propiedades catalíticas (Cohen and Kelly 2003; Gregersen et al. 2000; Pey et al. 2003).
Este conocimiento ha permitido el desarrollo de diferentes estrategias
terapéuticas, como el uso de dosis farmacológicas de cofactores, uso de chaperonas químicas o uso de drogas reguladoras de la expresión génica que producen diversos efectos sobre las proteínas mutantes. Algunos de estos efectos son: estabilización de las proteínas mutantes (uso de chaperonas específicas de sitio activo (1‐deoxigalactonojirimicin) en la enfermedad de Fabry (Fan and Ishii 2007)), la compensación de defectos cinéticos (uso de biotina en defectos de holocarboxilasa sintetasa (Suzuki et al. 1996)) o aumento de la transcripción o traducción de las proteínas mutantes. (uso de bezafibrato en defectos de la acil CoA dehidrogenasa de cadena muy larga (Djouadi et al. 2005)).
Aproximadamente un 15% de las mutaciones puntuales asociadas a estas enfermedades afectan al procesamiento del mRNA. El conocimiento que el efecto que cada mutación produce, no sólo referente a su severidad sino también en términos de su mecanismo de acción, obtenida de diversos estudios de expresión como la utilización de vectores apropiados en los que se introducen regiones discretas del DNA genómico para generar los llamados minigenes (Clavero et al. 2004; Vockley et al. 2000) ha abierto nuevas y prometedoras vías terapéuticas genéticas, como es la inhibición de la expresión de determinados transcritos mutantes con oligonucleótidos antisentido (AONs) y RNA de interferencia (RNAi) o la utilización de efectores transcripcionales y drogas que modulan la expresión de mutaciones de splicing (Hims et al. 2007; Takeshima et al. 2006; Wood et al. 2007).
Las cuatro enfermedades estudiadas en este trabajo (fenilcetonuria, acidemia propiónica, metilcrotonilglicinuria y acidemia metilmalónica aislada) pertenecen al grupo de enfermedades metabólicas hereditarias que ocasionan intoxicación aguda (Saudubray et al. 2006).
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Los distintos estudios realizados sobre los genes asociados a estas cuatro EMH ha revelado que desde el punto de vista genético las mutaciones son mayoritariamente mutaciones de cambio de aminoácido seguidas de pequeñas deleciones en fase y de mutaciones que afectan al proceso de splicing (http://www.pahdb.mcgill.ca(Perez et al. 2003; Ugarte et al. 1999; Yang et al. 2004a; Yang et al. 2004b).
La restricción proteica es la base del tratamiento a largo plazo en estas cuatro
EMH y su finalidad es eliminar la formación de las sustancias tóxicas que se acumulan y sus precursores, esta estrategia terapéutica incluye la administración de drogas que unen los metabolitos acumulados y favorecen su excreción.
Las dietas necesarias en estos tratamientos conllevan una dura carga social y psicológica para los pacientes y sus familias, además en algunos casos no son suficientes para una mejora significativa de los individuos por lo que se hace necesaria la búsqueda de nuevas terapias eficaces que mejoren la vida de estos enfermos.
En base al conocimiento de los efectos que las mutaciones producen a nivel de proteína, RNA y DNA se están postulando diversas aproximaciones terapéuticas como terapias alternativas para estas enfermedades, entre ellas la suplementación con el cofactor de la enzima implicada y el uso de oligonucleótidos y drogas moduladoras de splicing. 1.2 RESPUESTA A COFACTORES EN EMH
En la actualidad se están utilizando dosis altas de cofactores en el tratamiento de numerosas enfermedades genéticas humanas. La investigación en este campo está siendo potenciada por su gran relevancia clínica ya que posibilita la implantación de tratamientos individualizados.
Se calcula que un tercio de las mutaciones en los genes asociados a enfermedades hereditarias humanas producen una disminución en la afinidad (aumento de la constante de Michaelis‐Menten (Km)) por el cofactor o por el sustrato. El uso de niveles terapéuticos de cofactores aumenta las concentraciones intracelulares de estos compuestos y sus derivados, compensando así la baja afinidad de las enzimas defectuosas por ellos y recuperando la actividad (Ames et al. 2002). En un principio se pensaba que este era el único mecanismo implicado en la respuesta a cofactores.
Para otros dos tercios de genotipos asociados a enfermedades hereditarias
humanas el defecto responsable de la enfermedad no es un defecto de Km. La respuesta a dosis farmacológicas de cofactores está asociada no sólo a mutaciones de Km sino a otras que presentan una afinidad normal por el cofactor, por lo que se
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postulan otros mecanismos llevados a cabo por el cofactor como son la estabilización (chaperona química) de proteínas mutantes o la alteración en el patrón de transcripción y traducción. Para algunos de estos cofactores ya se ha demostrado su efecto regulador a nivel genético (Chauhan and Dakshinamurti 1991; Dakshinamurti and Li 1994; Hyland and Munk‐Martin 2001) siendo muy interesante el estudio de estos posibles mecanismos. Los cofactores asociados a las cuatro enfermedades estudiadas en este trabajo y
que en algunas de ellas ya están siendo utilizados como terapia son, la tetrahidrobiopterina (6(R)‐L‐eritro‐5,6,7,8–tetrahidrobiopterina, BH4) en fenilcetonuria, la biotina en acidemia propiónica y metilcrotonilglicinuria y la hidroxicobalamina (OHCbl) en acidemia metilmalónica aislada.
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1.2.1 FENILCETONURIA Y RESPUESTA A TETRAHIDROBIOPTERINA (BH4)
La fenilcetonuria (PKU; OMIM: 261600) es una enfermedad metabólica humana con base genética que se hereda con carácter autosómico recesivo y cuyo origen es la deficiencia en la enzima fenilalanina hidroxilasa (fenilalanina 4‐monooxigenasa, PAH, EC.1.14.16.1). El defecto de esta proteína genera un aumento patológico en la concentración de fenilalanina en todos los fluidos fisiológicos. La incidencia de esta enfermedad es dependiente de la zona geográfica de estudio, para Europa es de 1:10000 recién nacidos (Scriver and Kaufman 2001) y la estimación de portadores por lo tanto es 1 de cada 50 individuos. Algunas características de la enfermedad se encuentran recogidas en la Tabla 1.
La fenilalanina hidroxilasa es una monooxigenasa de función mixta que lleva
a cabo la parahidroxilación de L‐fenilalanina a L‐tirosina. En la reacción interviene el oxígeno molecular, como co‐sustrato y el cofactor BH4, como donador de electrones (Fig. 2).
N
N N
N
H2N
O OH
OH
H
N
N N
N
H2N
O OH
OH
H
HHO
HN
N NH
NH
O OH
OHH2N
+H3N
H-OOC
+H3NOH
H-OOC
HN
N NH
NHO
H2N
O
O
+ O2
L-Phe L-Tyr
BH4
4-OH-BH4
q-BH2
GTP7,8-DHNP
6-PTP
PAH
PCD
H2O
DHPR
NAD(P)H
NAD(P)+
GTPCHPTPS
SR
L-Phe
BH4
+-
2 H2OHCOOH
O
HN
N N
N
H2N
OH OH
P
O O O
-O
-O -O -O
O CH2 OO PO P
P
O O O
-O
-O -O -O
O PO P O H
N
N N
N
H2N
O OH
OH
H
HO-PO PO O
-O-O-O
OOO
P
2 NAD(P)H
2 NAD(P)+
Figura 2. Esquema del ciclo catalítico de la fenilalanina hidroxilasa (PAH) en presencia del cofactor natural BH4 (en rojo), en el que se incluyen las rutas principales de biosíntesis de BH4 (en azul) y de reducción del cofactor oxidado (en verde). Se indica la regulación ejercida por L‐Phe (+) y BH4 (‐) sobre la etapa limitante en la biosíntesis de BH4. Las enzimas implicadas en estos procesos se muestran en recuadros. Abreviaturas: BH4.‐ (6R)‐L‐eritro‐5,6,7,8‐tetrahidrobiopterina; 4‐OH‐BH4.‐ 4α‐carbinolamin‐tetrahidrobiopterina; q‐BH2.‐ 7,8‐dihidrobiopterina quinoinoide; 6‐PTP.‐ 6‐piruvoil‐5,6,7,8‐tetrahidropterina; 7,8‐DHNP.‐ 7,8‐dihidroneopterina‐trifosfato; PCD.‐ 4α‐carbinolamin‐tetrahidropterina deshidratasa; DHPR.‐ dihidropteridina reductasa; SR.‐ sepiapterina reductasa; PTPS.‐6‐piruvoil‐5,6,7,8‐tetrahidropterina sintasa; GTPCH.‐ GTP ciclohidrolasa I
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Tabla 1: DIAGNÓSTICO, TRATAMIENTO Y CARACTERÍSTICAS CLÍNICAS, BIOQUÍMICAS Y GENÉTICAS DE LA FENILCETONURIA (OMIM 261600)
CLÍNICA BIOQUÍMICA
• En los casos más graves, no tratados, se produce alteración en las funciones y desarrollo cerebrales
Hiperfenilalaninemia Elevación de metabolitos derivados de la fenilalanina: ácido mandélico, o‐hidroxifenilacético, fenilpirúvico, fenilláctico
DIAGNÓSTICO
Niveles de fenilalanina y otros aminoácidos en plasma. Análisis de pterinas, aminoácidos y ácidos orgánicos en orina Medida de actividad DHPR en sangre total o en papel. Análisis de mutaciones en el gen PAH.
GEN cDNA GENÉTICA
PAH (GenBank: NM_000277) ,
171 Kb, 13 exones 12q22‐q24.1
PAH (GenBank: NM_000277) 2,4 Kb, codifica para una proteína de 51,7 KDa.
Mas de 500 mutaciones descritas: 63% de cambio de aminoácido, 13% pequeñas deleciones y 11% afectan al procesamiento del mRNA (http://www.pahdb.mcgill.com). El mecanismo patogénico más frecuente parece ser la inestabilidad conformacional (Cohen and Kelly 2003; Desviat et al. 2003b; Gamez et al. 2000).
TRATAMIENTO El tratamiento clásico es una restricción en la dieta del aminoácido fenilalanina. Dosis farmacológicas de tetrahidrobiopterina o derivados (en fase clínica dosis farmacológicas de sapropterina)(Levy et al. 2007) En fase de estudio: Terapia de reemplazamiento enzimático con la enzima recombinante fenilalanina amonio‐liasa (PAL) y terapia génica.
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El sistema de hidroxilación de la fenilalanina a tirosina es también dependiente de otra serie de enzimas implicadas en la regeneración y síntesis del cofactor BH4 (Fig 3). La regeneración del BH4 desde la forma oxidada pterin‐4α‐carbinolamina mediante su deshidratación y posterior reducción es llevada a cabo por las enzimas pterin‐4α‐carbinolamina dehidratasa (PCD) y dihidropteridina reductasa (DHPR). Por otro lado la ruta de biosíntesis del BH4, a partir de GTP, es llevada a cabo por tres enzimas GTP ciclohidrolasa I (GTPCH), 6‐piruvoil‐5,6,7,8‐ tetrahidropterina sintasa (PTPS) y sepiapterina reductasa (SR). Existe además una ruta de síntesis minoritaria a partir de sepiapterina en la que está implicada la sepiapterina reductasa y la DHFR (dihidrofolato reductasa). El principal punto de regulación de la síntesis del cofactor es la primera enzima de la ruta, la GTPCH, siendo modulada positivamente por niveles elevados de L‐Phe y negativamente por niveles elevados de BH4. Aunque el defecto en cualquiera de las actividades de estas rutas puede conducir a una hiperfenilalaninemia, las mutaciones en el gen de la PAH son la causa más frecuente de la enfermedad, representando un 98 % de los casos descritos (Scriver and Kaufman 2001; Thony et al. 2000)
El diagnóstico neonatal de la fenilcetonuria y la implantación temprana de la
restricción proteica permiten una prevención total de la sintomatología clásica de la enfermedad recomendándose una continuación durante toda la vida de la dieta y en especial en el caso de madres afectadas por la enfermedad, cuyos fetos pueden sufrir hiperfenilalaninemia materna.
Los pacientes con fenilcetonuria por defectos en el gen PAH se clasifican en grupos fenotípicos en base a la ingesta diaria de L‐Phe que toleran para mantener niveles plasmáticos en un rango terapéutico (Scriver and Kaufman 2001) normalmente por debajo de 400 μM y en base a los niveles de L‐Phe en sangre en el momento del diagnóstico. En general se distinguen 4 grupos fenotípicos PKU (Desviat et al. 1997) (Tabla 2). Tabla 2. Clasificación de los pacientes PKU en función de los niveles de L‐Phe plasmáticos y las cantidades diarias de L‐Phe toleradas en la dieta. Frecuencia de fenotipos en la población española. Phe en plasma a Tolerancia a la Phe b Frecuenciac PKU clásica >1800 μM < 400 mg/día 15,7 % PKU moderada 1200‐1800 μM 400‐500 mg/día 9.0 % PKU leve 900‐1200 μM 500‐1000 mg/día 23.0 % HFA < 600 μM > 1000 mg/día 52.3 % aDatos en el momento del diagnóstico. b Datos relativos a niños de 5 años. c según (Pérez et al. 1999)
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Estructura y función de la fenilalanina hidroxilasa La forma funcionalmente más activa de la PAH es el homotetrámero, un
dímero de dímeros unidos por la región de tetramerización (Fusetti et al. 1998) aunque esta forma coexiste en equilibrio con la estructura dimérica. La actividad de esta enzima hidroxilasa requiere la presencia de un átomo de hierro no hemínico y de tetrahidrobiopterina para catalizar la incorporación de un grupo hidroxilo, procedente del oxígeno molecular al anillo aromático de su sustrato (L‐Phe).
La estructura tridimensional de la proteína fenilalanina hidroxilasa (Fig. 3) ha sido obtenida mediante la caracterización estructural de diversas formas truncadas cristalizadas (Andersen et al. 2001, 2002; Flatmark and Stevens 1999; Fusetti et al. 1998), con esta información y con la obtenida por diversos estudios sobre propiedades funcionales y reguladoras se ha podido comprobar la existencia de tres dominios diferenciados en la enzima: un domino de tetramerización carboxilo terminal (residuos 411‐452) formando una lámina β antiparalela implicada en dimerización (residuos 411‐427) seguida de un motivo de tetramerización coiled‐coil (residuos 428‐452) (Fusetti et al. 1998), un dominio catalítico (residuos 111‐410) en el que se halla el centro activo de la enzima, con el átomo de hierro esencial para la catálisis y los sitios de unión para sustrato y cofactor (Andersen et al. 2002) y un dominio amino‐terminal (residuos 1‐110) que contiene una secuencia autorreguladora corta (ARS). Esta ARS comprende los residuos 19‐33 y tapa la entrada del centro activo catalítico restringiendo el acceso del sustrato y cofactor y está implicada en la regulación de la enzima.
Figura 3: Estructura en dominios de un monómero de PAH, dominio catalítico (rojo), dominio regulador (verde) y dominio de tetramerización (amarillo). El cofactor BH4 (azul) se une al dominio catalítico.
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En condiciones fisiológicas los efectos reguladores más destacables sobre la actividad enzimática PAH son ejercidos por:
L‐Phe: es un modulador alostérico positivo homotrópico. Se propone que la L‐Phe induce un cambio conformacional que desplaza la secuencia autorreguladora del sitio activo (Thorolfsson et al. 2003).
BH4: Actúa como efector negativo manteniendo la proteína en estado de baja actividad específica y dificultando su activación por L‐Phe.
Fosforilación de la Ser 16: In vitro la fosforilación de la serina 16 aumenta la actividad específica, en ausencia de preincubación con L‐Phe, de la enzima recombinante (Miranda et al. 2002). In vivo esta serina es fosforilada por proteín quinasas dependientes de cAMP y Ca2+/Calmodulina (Kaufman 1993).
Dentro de la estructura de la enzima existen una serie de aminoácidos
directamente implicados en la función hidroxilante de la enzima y que configuran el centro activo. La His‐285, His‐290 y Glu‐330 forman un complejo de coordinación octaédrico con el átomo de hierro en estado férrico que se encuentra en el centro activo de la enzima, en el mecanismo catalítico de la PAH el hierro es reducido por el cofactor. Los residuos que interaccionan o están en la proximidad del cofactor han sido incluidos en unas regiones denominadas regiones de unión al cofactor (cofactor binding regions, CBR), estas regiones son CBR#1 (residuos 245‐266), CBR#2 (residuos 280‐283), CBR#3 (residuos 322‐326) y CBR#4 (residuos 377‐379) (Erlandsen and Stevens 2001). Por su parte la L‐Phe establece un puente salino con la Arg270 y puentes de hidrógeno con la Tyr277 y Ser349, e interacciones de Van der Waals con los residuos Trp326 y Phe 331, localizados en un cluster hidrofóbico (Andersen et al. 2002; Teigen et al. 1999).
Para concocer el efecto de las mutaciones PAH identificadas en pacientes se han empleado sistemas de expresión procariotas, fundamentalmente E. coli, y eucariotas, tanto células de mamífero en cultivo como sistemas libres de células (Desviat et al. 2003b; Waters 2003). La expresión en estos sistemas conduce a la obtención de proteínas cuyas propiedades bioquímicas y catalíticas son comparables (Gamez et al. 2000; Knappskog et al. 1996a; Knappskog et al. 1996b), y a su vez muy similares a las de la proteína normal obtenida de rata y humanos (Baker and Shiman 1979; Gamez et al. 2000; Martínez et al. 1995; Smith et al. 1984; Solstad and Flatmark 2000).
Para las mutaciones PKU, el mecanismo patogénico más frecuente parece ser la inestabilidad conformacional. En bacterias, muchas de las proteínas mutantes presentan menor estabilidad térmica (Gamez et al. 2000; Pey et al. 2003) y una mayor tendencia a la agregación, resultando en proteínas más insolubles y/o en proteínas solubles con una mayor fracción de proteína agregada, y por lo tanto con una actividad PAH disminuida (Bjørgo et al. 1998; Gamez et al. 2000; Gjetting et al. 2001;
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Waters et al. 2000). En células eucariotas, la inestabilidad se manifiesta como un descenso de proteína inmunorreactiva, posiblemente debido a una combinación de degradación proteolítica incrementada y menor solubilidad (Gamez et al. 2000; Waters et al. 2000). Cuando las proteínas mutantes son expresadas en sistemas eucariotas libres de células se observa una degradación proteolítica acelerada (Desviat et al. 2003b; Gamez et al. 2000; Pey et al. 2003; Waters et al. 2000). El cofactor tetrahidrobioterina
La tetrahidrobiopterina es un cofactor perteneciente al grupo de las pterinas, estructuralmente está constituida por una cadena de pteridina con las sustituciones 2‐amino, 4 oxo y 5,6,7,8 tetrahidro. En humanos la BH4 se encuentra en todos los tejidos y fluidos biológicos y puede ser tanto reciclada como sintetizada de novo (Fig. 3). La BH4 actúa como cofactor de la oxido nítrico sintasa y de la gliceril eter monooxigenasa aunque la función mejor establecida y más estudiada para la BH4 en humanos es su actuación como cofactor de tres enzimas implicadas en la hidroxilación de aminoácidos aromáticos; la fenilalanina‐4‐hidroxilasa, la tirosina‐3‐hidroxilasa y la triptófano‐5‐hidroxilasa, estas enzimas son claves en la biosíntesis de aminas biógenas.
En las hiperfenilalalinemias para distinguir las deficiencias producidas por defectos en la síntesis o regeneración del cofactor BH4 (Fig. 4) de las debidas a defectos en el gen de la PAH se realiza un test de sobrecarga oral con BH4, aunque para un diagnóstico exacto es necesario además el análisis de los niveles de pterinas en la orina y la actividad dihidropterina reductasa en eritrocitos. En general, los pacientes con alteraciones en las enzimas implicadas en la síntesis y regeneración de la BH4 presentan una normalización de los niveles de L‐Phe plasmática muy rápida (4‐8 horas después de la sobrecarga) tras la ingesta oral de dosis moderadas de este cofactor (Fig. 4).
Deficiencia en PTPS
0-
5-
10-
15-
20-
25-
30-
35-
0 horas 4 horas 8 horas
Defeciencia en PAH
Deficiencia en DHPR
Feni
lala
nina
plás
mat
ica
(mg/
dl)
Figura 4: Niveles de fenilalanina plasmática antes y después de una sobrecarga en un paciente con deficiencia en PAH, uno con deficiencia en PTPS y un caso de deficiencia en DHPR. Considerando niveles plasmáticos en rango terapéutico (Scriver and Kaufman 2001) normalmente por debajo de 7 mg/dl (400 μM).
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Para la deficiencia en PAH lo esperable es que no se produzca esta disminución de L‐Phe tras las sobrecarga con BH4, pero en 1999 Kure y colaboradores (Kure et al. 1999) describieron en detalle, por primera vez, cuatro casos de pacientes con mutaciones en el gen de la PAH que respondían favorablemente a la suplementación con el cofactor. Este trabajo abrió la posibilidad de una nueva estrategia terapéutica para algunos pacientes PKU. Los pacientes de este primer trabajo de Kure, eran individuos con un fenotipo leve de la enfermedad, en posteriores trabajos se ha demostrado que existe una mayor proporción de respuesta positiva en las formas clínicas leves y moderadas (Blau and Erlandsen 2004; Muntau et al. 2002; Spaapen et al. 2001), aunque también se ha descrito una respuesta positiva en algunos pacientes con fenotipos mas graves.
Uno de los objetivos de los estudios de suplementación con BH4 es poder
determinar la viabilidad de esta terapia a largo plazo con el fin de poder sustituir parcial o totalmente la restricción proteíca que llevan los enfermos fenilcetonúricos. Recientemente se han descrito casos en los que el tratamiento con BH4 ha desplazado totalmente la restricción dietética en L‐Phe (Shintaku et al. 2004). Otro de los objetivos fundamentales en los estudios de sobrecarga es intentar establecer una relación entre el genotipo y el fenotipo de la enfermedad, para poder determinar diversos grados de potencialidad en la respuesta para las distintas mutaciones PKU. A partir de los datos de estos estudios se ha configurado una base de datos que contiene los genotipos relacionados con una respuesta positiva a BH4 (http://www.BH4.org).
Los estudios de localización de las mutaciones presentes en la PAH asociadas
a respuesta han revelado que sólo un pequeño porcentaje de ellas se localizan en las regiones de unión al cofactor. Por ello se han propuesto varios mecanismos para explicar la respuesta: efecto catalítico (mutantes de Km), efecto sobre la estabilización de la enzima PAH, efecto sobre la estabilización del mRNA de la PAH y efecto sobre la regulación de la expresión génica de la PAH, estos dos últimos basados en que para la proteína oxido nítrico sintasa, de la que la BH4 es también cofactor, se ha descrito un aumento en los niveles de mRNA asociado a un aumento en los niveles de BH4 (Saura et al. 1996) y para un ratón transgénico con defecto en la GTP ciclohidrolasa I, se ha descrito un aumento de actividad, niveles de proteína y mRNA para la PAH en hígado tras administración oral de cofactor (Hyland and Munk‐Martin 2001).
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1.2.2 ACIDEMIA METILMALÓNICA AISLADA Y RESPUESTA A COBALAMINA
La acidemia metilmalónica aislada (OMIM 251110) es una enfermedad metabólica genéticamente heterogénea, de herencia autosómica recesiva con una prevalencia de 1:50.000 nacidos vivos (Coulombe et al. 1981; MacMahon 1995).
Se caracteriza por la acumulación de ácido metilmalónico y metabolitos derivados del mismo en sangre y orina debido a un bloqueo en el paso mitocondrial de isomerización de L‐metilmalonil‐CoA a Succinil‐CoA (Fig. 5). Este paso, implicado en el catabolismo de aminoácidos ramificados, ácidos grasos de cadena impar y la cadena lateral del colesterol es catalizado por la enzima metilmalonil‐CoA mutasa (MCM) cuya actividad depende del cofactor Adenosilcobalamina (AdoCbl) (Gurnani et al. 1960). Defectos tanto en la apoenzima MCM como en algunas de las enzimas implicadas en la activación del cofactor B12 producen acidemia metilmalónica aislada
.
Cbl(II?)
Propionil‐CoA
D‐Metilmalonil‐CoA
Succinil‐CoA
PCC
cblHcblD
L‐Metilmalonil‐CoA
MCMmut
cblA
Adocbl
ATRcblB
Cbl(II)
Figura 5. Ruta catabólica del metilmalonil‐CoA. El enzima ATR (ATP:cob(I)alamina adenosiltransferasa) en rojo convierte la cobalamina reducida (Cbl(I)) a adenosilcobalamina (verde), que es cofactor de la MCM (Metilmalonil‐Co mutasa). El L‐Metilmalonil‐CoA dará en último término Succinil‐CoA, que podrá ser sustrato de la ruta de degradación de los ácidos tricarboxílicos.
La cobalamina (vitamina B12) es una molécula compleja que contiene un átomo central de cobalto rodeado por un anillo de corrina similar al de porfirina y una compleja cadena lateral DMB (5,6‐dimetil‐benzimidazol fosforibosil). La molécula se completa por la unión de manera covalente a diferentes radicales libres, si este radical es un grupo metil da lugar a la metilcobalamina (MeCbl) que es el cofactor de la metionina sintasa que cataliza la formación de metionina a partir de homocisteína (Cauthen et al. 1966; Drummond and Matthews 1993) y si el grupo que
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se une covalentemente a la cobalamina es la 5´‐deoxiadenosil se forma la adenosilcobalamina que es cofactor de la MCM.
Para que se formen estos dos cofactores la cobalamina de la dieta ha de ser
absorbida, transportada y endocitada al interior de las células, donde sufrirá todo un procesamiento complejo y todavía no conocido totalmente en el que el átomo de cobalto reducirá su estado de oxidación de Co(III) a Co(I) (Walker et al. 1969) y posteriormente unirá el ligando correspondiente.
Hasta la fecha mediante estudios bioquímicos y de fusión de células somáticas
de individuos con acidemia metilmalónica se han caracterizado diferentes formas químicas asociados a la síntesis de estos cofactores, en total se han descrito 9 grupos de complementación genética (cbl A, B, C, D (variantes 1 y 2), E, F, G y H) (Kapadia 1995). La AdoCbl y la MeCbl comparten varios pasos citoplasmáticos de su síntesis y mientras que la MeCbl completa su síntesis en el citoplasma, la formación de la AdoCbl es finalizada en el interior de la mitocondria.
Los defectos en los pasos implicados únicamente en la síntesis mitocondrial de
la AdoCbl incluyen los grupos de complementación cblA, cblB, cblH y cblD y conllevan la deficiencia indirecta de la actividad de la MCM produciendo acidemia metilmalónica aislada (Fig. 5).
Se postula que los grupos de complementación cblD y cblH podrían estar causados por deficiencias en un solo gen (MMADHC). Mutaciones en las distintas regiones de este locus causarían las tres variantes fenotípicas diferentes asociadas a estos grupos de complementación, una de las cuales es responsable de aciduria metilmalónica aislada. (Coelho D 2007).
El grupo de complementación cblA es causado por mutaciones en el gen MMAA que codifica para una proteína de función todavía desconocida, aunque ha sido descrito que tiene actividad GTPasa y se postula que forma un complejo con la MCM interviniendo en su unión a la AdoCbl (Banerjee 2006).
La enzima deficiente en el grupo de complementación cblB es la ATP:
cob(I)alamina adenosiltransferasa (ATR) (EC 2.5.1.17) que cataliza la transferencia de un grupo adenosilo desde el ATP a la cobalamina para generar la adenosilcobalamina. El gen que codifica para esta proteína es el MMAB (Dobson et al. 2002a), las características de la acidemia metilmalónica causada por la deficiencia en este gen se resumen en la Tabla 3. Estructura y función de la ATP:cob(I)alamina adenosiltransferasa (ATR)
La estructura de la ATR humana unida a ATP es de un trímero constituido
por 3 monómeros idénticos (24 KDa.), formados cada uno de ellos por 5 hélices α y dos láminas β, el sitio de unión a ATP está en las interfases entre los monómeros
16
adyacentes indicando que la ATR es funcional como un trímero. Aunque hay tres interfases, la interacción con el ATP solo ocurre en dos de ellas (Fig. 6). La unión a ATP produce un cambio conformacional que contribuye a la formación del sitio de unión a la cobalamina (Schubert and Hill 2006).
. Figura 6: Estructura trimérica de la hATR, se observan los tres monómeros (verde, amarillo y azul) y las dos moléculas de ATP (rojo) en las interfases entre dos monómeros adyacentes.
Aproximadamente un 40% de los pacientes pertenecientes al grupo de
complementación cblB manifiestan un efecto positivo in vivo a la suplementación con cobalamina (en forma de OH‐Cbl) con una disminución de los niveles de metabolitos excretados (Matsui et al. 1983). Los estudios in vitro muestran un porcentaje similar de recuperación de la vía de incorporación del propionato (medida indirecta de la actividad MCM) en respuesta a niveles elevados de OH‐Cbl en fibroblastos de pacientes en cultivo.
El conocimiento de los mecanismos moleculares asociados a esta respuesta y
la búsqueda de la relación genotipo‐respuesta ha producido diversos estudios para analizar el efecto estructural y catalítico de mutaciones presentes en pacientes del grupo de complementación cblB. Para la expresión y caracterización de las proteínas mutantes se han utilizado varios sistemas de expresión entre ellos sistemas procariotas como E.coli (Leal et al. 2004; Zhang et al. 2006), además del análisis de la proteína ATR endógena en fibroblastos de los pacientes. Los diferentes estudios han permitido observar que algunas de las mutaciones producen inestabilidad de las proteínas y/o actividad nula o disminuida. Hasta la fecha sólo existe una mutación descrita, R191W que disminuye su afinidad por los sustratos ATP y cob(I)alamina (Zhang et al. 2006).
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Tabla 3: DIAGNÓSTICO, TRATAMIENTO Y CARACTERÍSTICAS CLÍNICAS, BIOQUÍMICAS Y GENETICAS DE LA ACIDURIA METILMALÓNICA tipo cblB (OMIM 251110)
CLÍNICA BIOQUÍMICA • Gran heterogeneidad tanto en la gravedad como en el inicio
de los primeros síntomas (Matsui et al. 1983). Síntomas más comunes son letargia, fallo en el desarrollo, vómitos recurrentes, deshidratación, problemas respiratorios, hipotonía muscular.
Cetonemia, cetonuria, hiperamonemia, hiperglicinemia Cantidades elevadas de ácido metilmalónico, propionilcarnitina, propionilglicina, 2‐metilcitrato y 3‐hidroxipropiónico en fluidos fisiológicos
DIAGNÓSTICO Medida de los ácidos metilmalónico, 3‐hidroxipropiónico, metilcítrico y glicina en fluidos fisiológicos Medida de la actividad metilmalonil‐CoA mutasa. Estudios de complementación celular con líneas celulares “tester”. Diagnóstico enzimático por medida de la incorporación de 14C‐propionato en proteínas en células en cultivo con medio basal y suplementado con hidroxicobalamina.
Análisis de mutaciones en el gen MMAB. GEN cDNA GENÉTICA MMAB
(GenBank: AF550404) 9 exones 12q24
MMAB (GenBank: NM_052845) 4,1 Kb, codifica para una proteína de 24 KDa.
Las mutaciones más frecuentes son las mutaciones missense (50%) seguidas de las mutaciones que afectan al splicing.
TRATAMIENTO Limitación de la ingesta proteica combinado con suplemento especial exento de aminoácidos precursores de ácido propiónico. Suplementación con L‐carnitina. Suplementación con cobalamina (CN‐Cbl o preferiblemente OH‐Cbl intramuscular). Metronidazol para inhibir la síntesis de propionato bacteriano.
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1.2.3 ACIDEMIA PROPIÓNICA Y METILCROTONILGLICINURIA Y RESPUESTA A BIOTINA
Dos de las acidemias orgánicas más frecuentes en humanos son la acidemia
propiónica y la metilcrotonilglicinuria, ambas son enfermedades genéticas debidas al déficit de una enzima mitocondrial dependiente de biotina. Algunas características de estas dos EMH se encuentran recogidas en las Tablas 4 y 5.
La acidemia propiónica (AP; MIM 606054) está causada por la deficiencia
genética en el enzima mitocondrial biotina‐dependiente propionil‐CoA carboxilasa (PCC). La propionil‐CoA carboxilasa (PCC; E.C. 6.4.1.3) genera D‐metilmalonil‐CoA al llevar a cabo la carboxilación del propionil‐CoA (Fig. 7), este sustrato proviene del catabolismo de los aminoácidos valina, isoleucina, metionina y treonina, catabolismo de los ácidos grasos de cadena impar y de la cadena lateral del colesterol y de la fermentación realizada por bacterias de la flora intestinal (Bain et al. 1988; Thompson and Chalmers 1990; Thompson et al. 1990).
D-Metilmalonil-CoAPropionil-CoA
Valina, isoleucina, metionina, treonina Acidos grasos de cadena impar.
Cadena lateral del colesterol
H2C‐CH3
CO‐S‐CoA+ HCO3
COOH
HC‐CH3
CO‐S‐CoA
Propionil‐CoAcarboxilasa (PCC)
Biotina ATP Mg2+
Figura 7. Ruta catabólica del propionil‐CoA. El enzima propionil‐CoA carboxilasa cataliza la conversión dependiente de biotina del propionil‐CoA hasta D‐metilmalonil‐CoA.
La metilcrotonilglicinuria (MCG; MIM 210200, 210210) está causada por la
deficiencia en la enzima mitocondrial biotina‐dependiente 3‐metilcrotonil‐CoA carboxilasa (MCC; E.C.6.4.1.4). Esta enzima está implicada en la ruta de degradación de la leucina y cataliza la carboxilación del 3‐metilcrotonil‐CoA a 3‐metilglutaconil‐CoA (Sweetman and Williams 2001)(Fig 8).
3-Metilcrotonil-CoA
3-Metilcrotonil-CoACarboxilasa
AcetilCoA3-Metilglutaconil-CoAÁcido Acetoacético
Ácido MevalónicoL-Leucina
Biotina ATPMg+2
Figura 8. Ruta catabólica de la L‐Leucina. El enzima 3‐metilcrotonil‐CoA carboxilasa cataliza la conversión dependiente de biotina del 3‐metilcrotonil‐CoA hasta 3‐Metilglutaconil‐CoA.
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Tabla 4: DIAGNÓSTICO, TRATAMIENTO Y CARACTERÍSTICAS CLÍNICAS, BIOQUÍMICAS Y GENÉTICAS DE LA ACIDEMIA PROPIÓNICA (OMIM 606054)
Cetoacidosis con o sin hiperamonemia. Niveles elevados de ácido propiónico y metabolitos derivados (metilcitrato, 3‐OH propiónico, propionilglicina y tigliglicina en fluidos fisiológicos (sangre y orina) y propionilcarnitina (C3) en plasma.
Hiperglicinemia, hipocarnitinemia y aumento relativo de los ácidos grasos largos de cadena impar en plasma.
DIAGNÓSTICO Cuantificación en sangre y orina del ácido propiónico y de sus metabolitos derivados (3‐OH propiónico, metilcitrato, propionilglicina) Determinación de la actividad enzimática propionil‐CoA carboxilasa en linfocitos o en fibroblastos de piel. Estudios de complementación celular con líneas celulares “tester”.
Análisis de mutaciones en los genes PCCA y PCCB. GEN cDNA MUTACIONES
PCCA (GenBank:AY035786– AY035808), 24 exones , 13q32 (codifica para la subunidad α)
PCCB (GenBank:AJ006499–AJ006487), 15exones, 3q13.3‐q22 (codifica para la subunidad ß)
PCCA (GenBank: AF385926) 2,9 Kb, codifica para una proteína de 72 KDa.
PCCB (GenBank:NM000532) 2,0 Kb, codifica para una proteína de 56 KDa.
Existen más de 40 mutaciones descritas en el gen PCCA y más de 50 en el gen PCCB En ambos genes las mutaciones más frecuentes (40%) son las que implican cambio de aminoácido seguidas de pequeñas inserciones‐deleciones y mutaciones de procesamiento de mRNA.
TRATAMIENTO Limitación de la ingesta proteica combinado con suplementos especiales exentos de aminoácidos precursores de ácido propiónico. Metronidazol para disminuir la producción bacteriana de propionato intestinal (Thompson et al. 1990) Suplementación con L‐carnitina. Suplementación con biotina. Transplante hepático en casos con agravamiento progresivo y descompensaciones frecuentes(van ʹt Hoff et al. 1998).
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Tabla 5: DIAGNÓSTICO, TRATAMIENTO Y CARACERÍSTICAS CLÍNICAS, BIOQUÍMICAS Y GENÉTICAS DE LA
• Presentación clínica entre primer y segundo año de vida con Síndrome de Reye, retraso psicomotor, movimientos involuntarios y convulsiones.
• Existen casos asintomáticos.
Acidosis metabólica, transaminasas altas, hipoglucemia, hiperamonemia y moderada cetonuria en plasma.
Niveles elevados de 3‐metilcrotonilglicina y ácido 3‐OHisovalérico en orina y de 3‐OHisovalerilcarnitina (C5OH) en plasma.
Hipocarnitinemia.
DIAGNÓSTICO Medida de 3‐hidroxiisovalerilcarnitina en sangre y de 3‐metilcrotonilglicina y ácido 3‐OHisovalérico en orina. Diagnóstico enzimático por medida de la actividad metilcrotonil‐CoA carboxilasa en linfocitos y fibroblastos. Estudios de complementación celular con líneas celulares “tester”.
Análisis de mutaciones en los genes MCCC1 y MCCC2. GEN cDNA GENÉTICA
MCCC1(codifica para la subunidad α), 19 exones, 3q25‐q27 (GenBank: NM_020166) MCCC2(codifica para la subunidad β), 17 exones, 5q12‐q13.1 (GenBank:NM_022132)
MCCC1 (GenBank: AF310972) 2,6 Kb, codifica para una proteína de 80 KDa.
MCCC2 (GenBank: AF 310971)2,3 Kb, codifica una proteína de
62 KDa.
El espectro de mutaciones incluye mayoritariamente mutaciones missense junto con mutaciones de splicing y pequeñas inserciones/deleciones (Baumgartner et al. 2001b; Desviat et al. 2003a; Gallardo et al. 2001; Holzinger et al. 2001). Existe una mutación en el gen MCCC1 R385S que ha sido descrita como una mutación dominante negativa y con respuesta a biotina (Baumgartner et al. 2004).
TRATAMIENTO
Dieta con moderada restricción proteica Suplementación con L‐carnitina. Suplementación con biotina.
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Estructura y función de la propionil‐CoA carboxilasa y de la metilcrotonil‐CoA carboxilasa.
La PCC y la MCC son dos de las cuatro carboxilasas dependientes de biotina
existentes en humanos, ambas se localizan en la matriz mitocondrial y son enzimas heteroméricas compuestas por dos tipos de subunidades, α y β y con una estructura nativa correspondiente a un heteropolímero α6β6 (Chloupkova et al. 2000; Hector et al. 1980). La subunidad α es de mayor tamaño para las dos proteínas y contiene el sitio de unión a biotina (Kalousek et al. 1980) en la región carboxi teminal con el motivo conservado A‐M‐K‐M, y los sitios de unión a ATP y bicarbonato. La subunidad β en cuya región carboxilo terminal del polipéptido se localiza el dominio de unión al propionil‐CoA o metilcrotonil‐CoA, (Lamhonwah et al. 1990; Samols et al. 1988), posee la actividad carboxiltransferasa y es de un tamaño menor.
La reacción catalizada por estas dos enzimas tiene lugar en dos etapas. En la primera reacción, la cual requiere ATP y Mg2+, el bicarbonato (fuente del grupo carboxilo) se une al nitrógeno N1 de la biotina, formando un intermediario carboxibiotina‐apoenzima. En la segunda etapa, este complejo reacciona con un carbono del sustrato (propionil‐CoA para el caso de PCC y 3‐metilcrotonil‐CoA para la MCC), transfiriendo el grupo carboxilo de la biotina. El cofactor biotina
La biotina es una vitamina hidrosoluble esencial para el metabolismo y crecimiento celular (Wolf 2001). Su función es ser transportador de grupo carboxilo en reacciones de carboxilación, decarboxilación y transcarboxilación (Knowles 1989). En mamíferos es el cofactor de cuatro carboxilasas, tres de ellas mitocondriales, propionil‐CoA carboxilasa (PCC), 3‐metilcrotonil‐CoA carboxilasa (MCC) y piruvato carboxilasa (PC), la cuarta, la acetil‐CoA carboxilasa se presenta como dos proteínas genéticamente diferentes, una mitocondrial (ACC2) y la otra citoplasmática (ACC1). La PCC y la MCC al igual que el resto de carboxilasas dependientes de biotina se sintetizan en forma de apoenzima y son posteriormente biotiniladas por el enzima holocarboxilasa sintetasa (HCS), enzima que se localiza tanto en el citosol como en la mitocondria. La HCS lleva a cabo la reacción, ATP dependiente, de unión covalente de la
biotina al grupo amino ε de un residuo de lisina de la carboxilasa (Chapman‐Smith and Cronan 1999). Esta lisina está presente en un dominio de unos 60‐80 aminoácidos de longitud en cuyo interior se encuentra la secuencia universal aceptora de biotina (A/V)MKM, común a todas las carboxilasas dependientes de biotina y altamente conservado desde bacterias a mamíferos.
La biotina es sintetizada en microorganismos, levaduras y plantas (Streit and Entcheva 2003), mientras que los humanos y otros mamíferos no tienen la capacidad
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de producir su síntesis, por ello tienen que adquirirla mediante la dieta y a través de la síntesis de novo de las bacterias intestinales y han desarrollado un complejo mecanismo conocido como el ciclo de la biotina para optimizar la utilización de este nutriente esencial. En el ciclo de la biotina están implicadas la HCS, responsable de la transferencia a carboxilasas y la biotinidasa responsable del reciclaje de la biotina, catalizando la hidrólisis de biotina a partir de biocitina (biotinil‐lisina) o pequeños péptidos biotinilados (Pacheco‐Alvarez et al. 2002). El delicado balance en la utilización y reciclaje de la biotina puede ser alterado por desórdenes genéticos en la biotinidasa (Hymes et al. 2001) o en la HCS (Sakamoto et al. 1999) con graves consecuencias en la homeostasis metabólica.
La biotina tiene toda una serie de efectos sobre procesos sistémicos como el
desarrollo (Watanabe and Endo 1990), la inmunidad (Baez‐Saldana et al. 1998) y el control de la expresión génica en animales de laboratorio y células en cultivo. La lista de proteínas afectadas por la biotina incluye enzimas implicadas en el metabolismo de la glucosa, enzimas asociadas a la homeostasis de la biotina, transportadores de vitaminas, factores de transcripción, citokinas y sus receptores y oncogenes (Baur et al. 2002; De La Vega and Stockert 2000; Pacheco‐Alvarez et al. 2002).
Utilizando como modelo la rata se ha demostrado que la biotina estimula la síntesis de glucokinasa hepática y reprime la fosfoenol piruvato carboxikinasa (Chauhan and Dakshinamurti 1991; Dakshinamurti and Li 1994; Dakshinamurti et al. 1970). En células de hepatoma la biotina regula a nivel postranscripcional los niveles del receptor de asialoglicoproteínas (Collins et al. 1988; Stockert and Morell 1990; Stockert et al. 1992).
Con respecto al efecto de la biotina sobre la expresión génica de proteínas implicadas en la homeostasis de la biotina existen múltiples trabajos con diferentes resultados. León del Río y colaboradores (Solorzano‐Vargas et al. 2002) observaron una disminución en la expresión de HCS, PCCA y ACC1 en células HepG2 y en fibroblastos normales en respuesta a la deficiencia de biotina. Velázquez y colaboradores (Rodriguez‐Melendez et al. 2001; Rodriguez‐Melendez et al. 1999) reportaron disminución en la expresión de HCS en hígado, riñón, músculo y cerebro en ratas después de una deficiencia progresiva en biotina y no encontraron cambios significativos en la expresión de PC y PCC. Zempleni y colaboradores (Manthey et al. 2002) utilizando células Jurkat deficientes en biotina no detectaron cambios de expresión en PCCA aunque si encontraron aumentada la expresión del gen MCCA en células mononucleares de sangre periférica (PBMC) obtenidas de pacientes suplementados con biotina (Wiedmann et al. 2003). Mock y colaboradores (Vlasova et al. 2005) no encontraron diferencias significativas en la expresión de los genes que codifican para PCCA, PCCB, MCCA, MCCB, PC, ACC1, ACC2, HCS, biotinidasa o
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transportador de vitaminas dependiente de sodio (SMVT) en linfocitos transformados (EBVL).
Se han postulado varios mecanismos a través de los cuales la biotina podría ejercer un efecto regulador sobre la expresión génica:
1. Regulación vía cascada de señalización mediada por HCS, biotinil‐AMP, guanilato ciclasa soluble (sGC), GMPc y proteín‐kinasas dependiente de GMPc. Niveles elevados de biotina estimulan la activación, mediada por esta cascada, de proteínas kinasa G que producen la fosforilación y activación de proteínas que a su vez aumentan la actividad transcripcional de diversos genes, entre ellos HLCS (Solorzano‐Vargas et al. 2002).
2. Regulación de la vía de señalización celular dependiente del factor de transcripción NF‐кB. La deficiencia de biotina produce una translocación celular de este, favoreciendo la actividad transcripcional de genes diana de NF‐кB (Rodriguez‐Melendez and Zempleni 2003).
3. Remodelación de la cromatina por biotinilización de histonas. (Hymes and Wolf 1999; Stanley et al. 2001).
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1.3 SPLICING Y ENFERMEDADES GENÉTICAS.
Aproximadamente un 15% de las mutaciones puntuales asociadas a enfermedades genéticas humanas afectan al procesamiento del mRNA. Durante este proceso de splicing los intrones son eliminados, la correcta identificación y unión de los exones es llevada a cabo por un complejo macromolecular denominado spliceosoma, compuesto de 5 partículas ribonucleoproteicas (snRNPs) (U1, U2, U4, U5 y U6) y más de 50 proteínas. Cada snRNP está compuesto de un RNA pequeño nuclear, rico en uridinas (snRNA) y múltiples proteínas asociadas. El spliceosoma debe reconocer las secuencias exónicas inmersas entre largas secuencias intrónicas y eliminar estas últimas. Los límites exón‐intrón están definidos por una serie de secuencias más o menos conservadas que serán reconocidas por la maquinaria de splicing: el sitio donador 5´ de splicing, el sitio aceptor 3´ de splicing, la secuencia de ramificación (BPS) y el tracto polipirimidínico.
La maquinaria de splicing en ocasiones requiere secuencias reguladoras adicionales en cis para modular el procesamiento. Estas secuencias que se encuentran localizadas tanto en exones como en intrones, pueden actuar bien estimulando la eliminación intrónica (potenciadores de splicing o enhancers) o bien impidiéndola (silenciadores de splicing). Los elementos reguladores de splicing ejercen su acción a través de factores proteicos. En concreto, los silenciadores parecen interaccionar con una serie de reguladores negativos, frecuentemente pertenecientes a la familia de las ribonucleoproteínas heterogéneas nucleares (hnRNPs). Los enhancers exónicos de splicing (ESEs) son sitios de unión de factores proteicos ricos en serina y arginina, conocidos como proteínas SR, a través de los cuales realizan su función activadora.
La identificación de las secuencias consenso de unión para factores reguladores
de splicing (proteínas SR)(Liu et al. 2000) ha permitido la generación de diferentes programas informáticos (ESEfinder (Cartegni et al. 2003), Rescue‐ESE, PESX) mediante los cuales se pueden predecir los posibles ESE de una secuencia nucleotídica a estudiar. Para validar el efecto que ejercen las mutaciones sobre el procesamiento del mRNA se hace necesario utilizar otras aproximaciones experimentales que impliquen la expresión de regiones discretas del DNA genómico y no sólo del cDNA, como son los sistemas modelo de splicing que utilizan vectores apropiados para generar los llamados minigenes (Clavero et al. 2004; Vockley et al. 2000).
Cualquier cambio en las secuencias conservadas y reguladoras puede alterar el patrón de splicing. Se ha calculado que el 60% de las mutaciones asociadas a splicing afectan a secuencias conservadas (sitios 5’ donador y 3’ aceptor de splicing, secuencia de ramificación y tracto polipirimidínico) y el 40 % afecta a secuencias reguladoras (Krawczak et al. 1992). En los últimos años se han definido ciertas mutaciones puntuales que afectan a secuencias reguladoras de splicing y en concreto a ESEs (exonic splicing enhancers), y que fueron incorrectamente clasificadas como mutaciones de
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cambio de aminoácido, mutaciones nonsense o incluso polimorfismos silenciosos debido a la ausencia de análisis a nivel de cDNA (RT‐PCR) y a la utilización de sistemas de expresión inadecuados
Las dos consecuencias más comunes de las mutaciones de splicing son el skipping exónico, eliminación de un exón que no se incluye en el mRNA maduro y la activación de sitios crípticos cuya consecuencia es la inclusión de secuencias aberrantes o la eliminación de secuencias codificantes. La mayoría de las mutaciones de splicing producen una secuencia madura de mRNA con un codón prematuro de terminación, este triplete activa un sistema de degradación presente en la célula (denominado sistema nonsense mediated decay (NMD)) y cuya función es evitar la generación de proteínas truncadas potencialmente tóxicas (Maquat 2004).
Algunas mutaciones de splicing impiden el reconocimiento exónico o producen
la inclusión de secuencias aberrantes en el total de los transcritos produciendo solamente mRNA aberrantes, otras mutaciones sin embargo producen transcritos correctamente procesados y transcritos aberrantes, el porcentaje de transcritos correctos e incorrectos determinara la severidad de los fenotipos (Clavero et al. 2004; Lualdi et al. 2006).
El conocimiento de las consecuencias que cada mutación produce en términos
de su mecanismo de acción a nivel de DNA y mRNA, ha abierto nuevas y prometedoras vías terapéuticas genéticas en estas alteraciones del splicing. La modulación del splicing, que permitirá modificar los transcritos incorrectamente procesados y por lo tanto alterar la expresión fenótipica de la mutación se puede llevar a cabo mediante:
• Sobreexpresión de factores específicos de splicing o uso de drogas como butirato sódico, kinetina, valproico, aclarubicina que favorecen el correcto procesamiento de los transcritos. (Andreassi et al. 2001; Hims et al. 2007; Nissim‐Rafinia et al. 2004).
• Uso de oligonucleótidos antisentidos (AONs) que son pequeñas cadenas de análogos de deoxiribonucleotidos que hibridan con el mRNA complementario vía apareamiento de bases descrito por Watson y Crack formando los heteroduplex AONs‐mRNA. Los mecanismos mediante los cuales los AONs llevan a cabo la regulación de la expresión génica incluyen inducción de la actividad RNasa H endonucleasa que degrada el mRNA, interferencia de la traducción por impedimento estérico de la actividad ribosomal e interferencia de la maduración del mRNA por inhibición del splicing (Kurreck 2003). La terapia antisentido ha sido usada en fibrosis cística y la distrofia muscular de Duchene (Takeshima et al. 2006) para interferir el proceso de splicing y originar proteína funcional.
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2. OBJETIVOS
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Los objetivos principales de este trabajo han sido el análisis de los mecanismos moleculares asociados a la terapia farmacológica con cofactores y el ensayo de terapias moduladoras de splicing en enfermedades metabólicas hereditarias. Para ello se establecieron una serie de objetivos específicos.
1. Caracterización genética de pacientes fenilcetonúricos que responden in vivo al tratamiento con tetrahidrobiopterina.
2. Caracterización de los mecanismos moleculares (cinéticos, de estabilización y
sobre la expresión génica del gen PAH) asociados a la respuesta a BH4 en fenilcetonuria.
3. Caracterización cinética de proteínas ATR mutantes asociadas a respuesta a
cobalamina en acidemia metilmalónica aislada.
4. Caracterización del efecto de distintas concentraciones de biotina sobre la actividad, estabilidad y expresión génica de la propionil‐CoA carboxilasa y de la metilcrotonil‐CoA carboxilasa.
5. Estudio del efecto de drogas como posible terapia aplicada a mutaciones de splicing que producen niveles detectables de transcritos normales en acidemia propiónica.
6. Estudio de la terapia antisentido en el contexto de mutaciones de splicing que
producen activación de pseudoexones en acidemia propiónica.
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3. MATERIALES Y MÉTODOS
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3.1 MATERIALES 3.1.1Reactivos y aparatos
Los reactivos químicos utilizados en este estudio fueron suministrados por: Amersham Pharmacia Biotech, Aldrich, BiotechBio‐Rad Laboratories, Cambrex, Difco Laboratorios, Fluka, GibcoBRL, Merck, Panreac Quimica, Perkin‐Elmer, Pierce, Pronadisa, Promega, Sigma, Stratagene, Roche Diagnostics, Schircks Laboratorios, Scharlau, DBH laboratorios. La agarosa y la agarosa NuSieve®GTG® son de las casas comerciales Pronadisa y Cambrex y la acrilamida y bisacrilamida de Bio‐Rad. La (6R)‐L‐eritro‐5,6,7,8‐tetrahidrobiopterina y la L‐sepiapterina fueron suministradas por Schircks Laboratorios. La 3,3´‐Metilen‐bis(4‐hidroxicoumarina)(dicumarol), la kinetina, el ácido valproico, el butirato sódico, la Actinomicina D y la Puromicina dihidroclorido fueron adquiridos de Sigma. El 2,4‐Diamino‐6‐hydroxypyrimidin (DAHP) fue de Aldrich. La avidina conjugada con fosfatasa alcalina de Pierce.
La mezcla marcada radiactivamente L‐[35S]‐Met+ L‐[35S]‐Cys (PromixTM L‐[35S] in vitro cell labelling mix; >1000 Ci/mmol) y el isótopo radiactivo NaH[14C]O3, con una actividad de 56 mCi/mmol NaHCO3 y 2 mCi/ml fue suministrada por Amersham Pharmacia Biotech.
Los anticuerpos utilizados fueron anticuerpo monoclonal comercial anti‐tirosina, anti‐triptófano y anti‐fenilalanina hidroxilasa PH8 (Pharmingen), anticuerpo secundario de cabra anti‐ratón conjugado a peroxidasa (Nordic y Santa Cruz), Anti‐Flag M2 (Promega) y anticuerpo secundario antiratón Ig conjugado a peroxidasa (Santa Cruz).
Los tubos de filtración empleados para concentrar las muestras de proteína fueron obtenidos de Amicon.
La cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) fue realizada usando los sistemas suministrados por Shimadzu (Serie VP) y Agilent Technologies (Serie HP 1100), las columnas procedentes de Whatman y Agilent Technologies, y los reactivos de alto grado de pureza (analytical grade o HPLC grade) de Merck, Scharlau y DBH laboratories.
En el cultivo celular se emplearon los siguientes reactivos: medio mínimo
esencial de Eagle (MEM) y glutamina de la firma comercial GibcoBRL, suero fetal de ternera recién nacida (NBCS), suero fetal bovino (FBS) y suero fetal bovino dializado (FBS dializado) de SIGMA. Los antibióticos fueron suministrados por Antibióticos
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S.A. La tripsina y los medios de comprobación se obtuvieron de Difco Laboratorios y la biotina de Sigma.
Promega e Invitrogen proporcionaron los productos necesarios para la purificación de RNA total. La purificación de productos de PCR y de DNA plasmídico a baja y alta escala se llevó a cabo con los productos de las casas comerciales Promega, Quiagen y Mbiotech. Las firmas comerciales GENTRA Systems, Promega, Invitrogen proporcionaron los productos necesarios para la extracción de DNA genómico.
Los reactivos y enzimas empleados en las reacciones de PCR, RT‐PCR, RT‐PCR tiempo real y mutagénesis dirigida fueron obtenidos de las firmas comerciales Perkin‐Elmer, Applied Biosystem, Invitrogen, Roche y Stratagene.
Las reacciones de secuenciación cíclica directa se llevaron a cabo con productos de Promega y Applied Biosystems. Los oligonucleótidos sintéticos proceden de la firma comercial Isogen y los oligonucleótidos antisentido tipo morfolinos fueron suministrados por la casa comercial GeneTools.
Las enzimas de restricción fueron proporcionadas por Roche Diagnostics, New England Biolabs y Promega. Los reactivos de purificación de proteínas y los utilizados para Western Blot son de las casas comerciales: Amersham Pharmacia Biotech, Millipore, New England Biolabs, Nordic Inmunology, Perkin Elmer, Pierce, Sigma y Stratagene. 3.1.2 Material biológico Pacientes
Se han incluido en el estudio 31 pacientes fenilcetonúricos españoles que han sido sometidos a pruebas de sobrecarga con BH4 en un estudio en colaboración con la Dra. Martínez‐Pardo (Hospital Ramón y Cajal).
El estudio del efecto de compuestos moduladores de splicing incluyó 3
pacientes diagnosticados de acidemia propiónica y correspondientes al grupo de complementación PCCA, los tres de origen turco enviados por los Drs. Adrian C. Sewell, T. Parlowsky y Art. Warman, al laboratorio para su diagnóstico genético.
El estudio del efecto de la terapia con oligonucleótidos antisentido incluyó 2 pacientes diagnosticados de acidemia propiónica, uno correspondiente al grupo de complementación PCCA y el otro correspondiente al grupo de complementación PCCB, ambos de origen turco enviados por el Dr. Gülden Gokcay al laboratorio para su diagnóstico genético.
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Las muestras de los pacientes utilizados incluyen fibroblastos de piel, sangre
total periférica y/o muestras de sangre impregnada en papel. Líneas celulares establecidas
La línea celular de hepatoma utilizado para este estudio fue Hep 3B, cedida por el Dr. S. R. de Córdoba. La línea celular de linfoblastos utilizada fue MCR de European Collection of Cell Cultures (ECACC). Cepas bacterianas Las estirpes de E. coli utilizadas en este estudio fueron las siguientes: XL1‐Blue, DH5α, JM109, TB1 y BL21 StarTM (DE3) One Shot Cell (Invitrogen) Vectores plasmídicos
Los plásmidos utilizados en este estudio fueron: pMALc2‐PAH wt (De Lucca
et al. 1998), R68S (Zekanowski et al. 2000) ,V388M (Gamez et al. 2000), F39L, E178G, A300S, A313T, A373T y Y414C (enviados por el Dr.R.C.Stevens), pFLAG‐CMV (Sigma), pET 41a‐hATR (enviado por la Dr. R. Banerjee), pGL3‐ luciferasa y pCMV PRC β‐galactosidasa. 3.2 MÉTODOS 3.2.1 Tratamiento de ácidos nucleicos Para la purificación de DNA plasmídico se empleó el sistema comercial de extracción de DNA plasmídico Wizard®Plus SV Minipreps DNA Purification system de Promega. En las purificaciones a gran escala se empleó el sistema de extracción QUIAGEN® Plasmid Maxi kit de Quiagen.
Para la purificación de RNA celular se emplearon los sistemas comerciales de extracción de RNA Promega® SV total RNA Isolation System y Invitrogen “TriPure Isolation Reagent”.
El proceso de retotranscripción (RT) se llevó a cabo a partir de 1 μg de RNA
total, utilizando los reactivos suministrados por Invitrogen (SuperScriptTM First‐Strand Síntesis System for RT‐PCR) y siguiendo las recomendaciones del proveedor.
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Para la amplificación de DNA genómico y de cDNA obtenido tras RT, mediante el proceso de PCR se utilizaron los reactivos y las instrucciones descritas por las firmas comerciales Perkin Elmer (AmpliTaq® DNA polimerasa) e Invitrogen (Platinum® Taq DNA polimerasa). En las amplificaciones realizadas con los productos de Perkin Elmer, se añadió la enzima tras incubar la mezcla de amplificación durante 15 minutos a 95ºC (hot start). Las reacciones de amplificación se llevaron a cabo en un volumen final de 100 μl ó 50 μl, con una concentración de MgCl2 de 1,5 mM, 100 pmoles de cada oligonucleótido, 2,5 U Taq polimerasa y entre 0,5‐1 μg de DNA genómico o 200‐500 ng de cDNA obtenido tras RT. La temperatura de hibridación osciló entre 48‐55 °C según fuera la temperatura de fusión o melting del par de oligonucleótidos empleados en cada caso.
Las amplificaciones se llevaron a cabo en un termociclador Peltier Thermal Cycler PTC‐200 (MJ Research).
Los fragmentos exónicos que comprenden toda la región codificante más las
regiones intrónicas adyacentes a cada exón (secuencias consenso donadoras y aceptoras implicadas en el procesamiento del premRNA o splicing) y los fragmentos de cDNA de los distintos genes estudiados fueron amplificadas usando los oligonucleótidos descritos previamente en el laboratorio (Gravel et al. 1994; Ohura et al. 1993; Pérez et al. 1994; Richard et al. 1999). Para algunos fragmentos del cDNA del gen PAH se diseñaron nuevos oligonucleótidos (Tabla 6).
Tabla 6: Oligonucleótidos utilizados en la amplificación del cDNA de PAH
Nombre del oligo Secuencia 5´ 3´
PCR ( pb)
cDNA PAHa ENSG00000171759
PAH 10 PAH 13
GGTGCTGGGCTCCTGTCATC CTCCATCAACAGATTCACAGCT
377 1029‐1048 1384‐1405
a Se muestra la localización de cada oligonucleótido en la secuencia del cDNA PAH, siendo el nucleótido +1 la adenosina del ATG iniciador de la traducción.
Para la purificación de los fragmentos obtenidos tras la amplificación se utilizó el kit SpinCleanTM PCR Purification (Mbiotech), en el caso de que la purificación se realizara a partir de los fragmentos en geles de agarosa se utilizó PCR Preps DNA Purificación Resin (promega) y QIAEX II Gel Extraction Kit (Qiagen).
La secuenciación cíclica directa se realizó empleando el producto Big DyeTM Terminador v3.1 Cycle Sequencing kit (Applied Biosystem) junto con oligonucleótidos sintéticos y los productos de secuenciación se analizaron en el secuenciador capilar ABI Prism ®3700 Genetic Analyzer (Applied Biosystems).
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En las reacciones de secuenciación de productos amplificados por PCR se emplearon 300 ng de DNA. La secuenciación de productos amplificados por PCR se llevó a cabo con oligonucleótidos de igual secuencia a los empleados en las reacciones de amplificación.
Para la qRT‐PCR del mRNA de la PAH y de PCCA se utilizaron las sondas Taqman Hs00609359 y Hs01120554‐ml respectivamente suministradas por Applied Biosystems (Taqman Gene Expresión Assays, http://myscience.appliedbisyntesis.com ), para los mRNAs de PCCA, PCCB, MCCA, MCCB y HCS se utilizaron sondas Universal Probe y oligonucleótidos específicos diseñadas usando el probeFinder Software (Universal Probe Library) de Roche Applied Science. La retrotranscripción se llevó a cabo con el Archive kit de Applied Biosystems a una concentración de síntesis 10 ng de RNA/μl y siguiendo las recomendaciones del proveedor. Para la PCR se utilizó la TaqMan 2X Universal PCR Master Mix No Amperese ONG (Applied Biosystems).
La amplificación y análisis se realizó en un aparato ABIPRISM 7900 HT y utilizando el programa SPS2.1 o SDS software de Applied Biosystems.
La eficiencia de la amplificación fue estandarizada mediante la retrotranscripción y posterior amplificación en paralelo del mRNA de los genes constitutivos GAPDH o 18s rRNA.
Para llevar a cabo la cuantificación, una vez obtenidos los datos de crossing point (Cp) o cycle threshold (Ct) de la PCR a tiempo real tanto para el gen de interés como para los constitutivos se llevó a cabo el tratamiento matemático para obtener finalmente el parámetro (RQ) relative quantity que nos permite comparar de forma cuantitativa las cantidades de mRNA en los distintos extractos celulares, siendo calculado según la siguiente fórmula:
RQ = 2‐ ΔΔCt ; ΔΔCt = (ΔCt de una muestra ‐ ΔCt la muestra de referencia) ΔCt = (Ct del gen de estudio ‐ Ct del gen constitutivo [GAPDH o 18s rRNA])
Para la mutagénesis dirigida mediante el proceso de PCR se utilizó el kit
QuickChangeTMSite Directed Mutagenesis de Stratagene. La mutación PAH A309V fue introducida en el vector pFLAG‐CMV que porta
la secuencia del cDNA PAH con primers existentes previamente en el laboratorio. Las mutaciones ATR I96T y R195H fueron obtenidas por mutagénesis dirigida
a partir del cDNA wt de la hATR en el plásmido pET 41a utilizando los oligonucleótidos que se detallan en la tabla siguiente.
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Tabla 7: Oligonucleótidos sintéticos diseñados para la mutagénesis dirigida del cDNA MMAB clonado en el vector pET 41a
a La base que introduce la mutación en la reacción de mutagénesis dirigida se muestra en negrita. b Se muestra la localización de cada oligonucleótido en la secuencia del cDNA, siendo el nucleótido +1 la adenosina del ATG iniciador de la traducción.
Para el clonaje del cDNA de la PAH en el vector pFLAG‐CMV y de las regiones reguladoras de transcripción y traducción de la PAH en el vector pGL3 las dianas escogidas fueron NotI y SalI en el primer caso y SacI y HindIII en el segundo. Estas dianas fueron creadas mediante PCR a partir de DNA genómico o cDNA de la PAH clonado en el plásmido pMALc2‐PAH utilizando oligos que contenían la secuencia de corte para cada enzima y cuya secuencia se describe en la Tabla 8. De esta manera se obtuvieron los mutantes para PAH Y414C y V388M en el vector pFLAG‐CMV y la construcción pGL3‐PrUTRPAH en el vector pGL3.
Tabla 8: Oligonucleótidos sintéticos diseñados para el clonaje de la región codificante del cDNA de la PAH y las regiones reguladoras de transcripción y traducción de la PAH.
a Se muestra la localización de cada oligonucleótido en la secuencia del cDNA PAH, siendo el nucleótido ‐1 el primer nucleótido previo a la adenosina del ATG iniciador de la traducción y +1 el nucleótido A del ATG iniciador de la traducción.
3.2.2 Electroforesis en geles con gradiente de desnaturalización (DGGE) El rastreo inicial de mutaciones en el gen de la PAH se realizó mediante la
técnica de electroforesis con gradiente de desnaturalización (DGGE) según se describe en (Pérez et al. 1997). Esta técnica está basada en las propiedades de desnaturalización del DNA, determinadas por su secuencia, que permiten separar moléculas de DNA que difieren en una sola base nucleotídica debido a su diferente migración electroforética en geles con gradiente de desnaturalización (Lerman and Silverstein 1987).
La amplificación se llevó a cabo utilizando primers con colas GC en su extremo 5’ ó 3’ terminal previamente descritos y la electroforesis se desarrolló en geles de poliacrilamida al 6 % con un gradiente de desnaturalización del 0 % al 80 % de urea‐formamida, en los que el 100 % corresponde a una concentración de urea 7 M y 40 % de formamida. La electroforesis se realizó a 150 V durante 5 h en TAE (0,04 M Tris‐acetato, 1 mM EDTA, pH 8) a una temperatura constante de 60 °C en un aparato de la casa CBS Scientific CO.
La presencia de varias bandas debidas a la formación de heteroduplex indica la presencia de mutaciones que fueron posteriormente identificadas por secuenciación. 3.2.3 Expresión y purificación de proteínas en E. coli Expresión y purificación de la proteína de fusión MBP‐PAH
La expresión y purificación de la proteína de fusión MBP‐PAH se llevó a cabo esencialmente siguiendo el protocolo descrito por (Martínez et al. 1995). A lo largo de todo el proceso de purificación se empleó un tampón Hepes 20 mM NaCl 200 mM pH 7.0 (Na‐Hepes).
El cultivo de las cepas de E. coli transformadas con los plásmidos pMALc2‐PAH normal y mutantes se realizó en medio LB en presencia de ampicilina (0,1 mg/ml). Cuando estos cultivos alcanzaron una A600nm≈ 0.6, se indujo la expresión de las proteínas MBP‐PAH normal y mutantes, mediante la adición de IPTG 1 mM, adicionándose también 0,2 mM de sulfato amónico ferroso (FAS) como fuente del cofactor metálico necesario para la actividad PAH. Tras ser incubados los cultivos a 37ºC durante 16‐21 h, las células fueron sedimentadas por centrifugación, resuspendidas en tampón Na‐Hepes en presencia de 0,2 mM Pefabloc® (como inhibidor de proteasas) y posteriormente lisadas por sonicación. El extracto proteico soluble fue obtenido tras centrifugación. Las proteínas de fusión totales (MBP‐PAH) normal y mutantes fueron purificadas mediante cromatografía de afinidad en columnas de amilosa (New England Biolabs), equilibradas en tampón Na‐Hepes. La elución se realizó empleando una disolución 10 mM de maltosa en Na‐Hepes. Las proteínas de fusión totales así obtenidas se
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mantuvieron a 4ºC hasta su utilización o fueron congeladas inmediatamente después de la purificación en N2 líquido y almacenadas a ‐80ºC. La separación de las distintas formas oligoméricas para obtener la forma tetramérica presente en la proteína de fusión total (MBP‐PAH) purificada de E. coli fue realizada mediante cromatografía de exclusión molecular a 4ºC usando la plataforma integrada AKTA®PRIME (Amersham Pharmacia Biotech) para desarrollar y monitorizar la separación cromatográfica. El desarrollo cromatográfico se realizó a 4ºC, empleando como fase móvil tampón Na‐Hepes previamente desgasificado, usando un flujo de 0,38 ml/min, el volumen de muestra aplicado fue de 2 ml, tomándose fracciones del eluido cada 5 min (≈ 1,9 ml/fracción). La detección se realizó espectrofotométricamente a 280 nm usando una célula de flujo continuo. Una vez eluida la forma tetramérica, las fracciones correspondientes (según indicó la señal espectrofotométrica registrada) fueron concentradas usando tubos CENTRIPLUS YM‐50 (Amicon) y congeladas en N2 líquido, almacenándose posteriormente a ‐80ºC hasta su utilización.
La concentración de proteína total de las proteínas de fusión totales purificadas se determinó siguiendo el método de Bradford (Bradford 1976) empleando el reactivo Bio‐Rad Protein Assay (Bio‐Rad). En el caso de las formas tetraméricas purificadas de la proteína de fusión (MBP‐PAHtet), la concentración de proteína se determinó espectrofotométricamente a 280 nm empleando ε =1,6 (ml.mg‐1.cm‐1) para la MBP‐PAHtet. Para la cuantificación de concentraciones en mol/l, se empleó como peso molecular 92,3 kDa para la subunidad de MBP‐PAHtet. Expresión y purificación de la proteína hATR.
La expresión y purificación de la proteína ATR se llevó a cabo esencialmente siguiendo el protocolo descrito por (Leal et al. 2004).
La proteína hATR se expresó en la cepa de E. coli BL21 StarTM (DE3) One Shot Cell (Invitrogen) a partir del plásmido pET 41a que tiene el cDNA de la ATR sin el péptido mitocondrial. La cepa E. coli fue crecida en LB suplementado con 30‐60 mg/L de kanamicina a 37ºC y con agitación a 275 rpm. Cuando el cultivo alcanzó A600nm≈ 0,6 se indujo la expresión de la proteína mediante la adición 1mM de IPTG a una temperatura de 25ºC o 37ºC durante 3‐5 horas. Una vez transcurridas las 3‐5 horas las células fueron recogidas por centrifugación a 6000 K durante 10 minutos, pesadas y guardadas a ‐70ºC durante al menos 12 horas.
El pellet celular congelado se resuspendió a una concentración 0,25 mg/ml en buffer 50 mM fosfato de potasio (KPB) (pH: 8), 100‐300 mM NaCl, 1 mM DTT, 1 mM PSMF, 1 mM EDTA, 0,05 mg/ml DNAse I, 0,3 mg/ml lisozima durante 1 hora a 4ºC
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con agitación. El homogenado obtenido fue sonicado durante 10 minutos con la secuencia 10´´ sonicación (p=5) y 20´´ descanso. El extracto celular crudo fue centrifugado a 18000 K durante 1 hora, el sobrenadante obtenido tras la centrifugación se diluyó en buffer 50 mM fosfato de potasio (pH=8), 1 mM DTT y 300 mM KCl. Se determinó la cantidad de proteína siguiendo el método de Bradford.
Una vez diluido el extracto a una concentración de 1mg/ml se añadió un 22% (p/v) de sulfato de amonio para producir la primera precipitación, se dejó a 4ºC con agitación durante 7‐12 horas, tras este tiempo se centrifugó a 8000K durante una hora, el sobrenadante se recogió y en frío y con agitación se le añadió un 11% (p/v) de sulfato de amonio para producir la segunda precipitación, una vez disuelto el sulfato se quitó la agitación y se mantuvo durante 16 horas a 4º, posteriormente se centrifugó a 8000K durante una hora, el sobrenadante se descartó y el precipitado, donde se encuentra la hATR, se diluyó sin agitación ni pipeteo en 5‐10 ml de Tris 10 mM pH:8, DTT 1 mM.
Una vez resuspendido el segundo precipitado se eliminó el sulfato de amonio mediante diálisis, para ello se utilizó una membrana de diálisis 5,1 ml/cm. en cuyo interior se pusieron las proteínas resuspendidas, la membrana se metió en 5L de Tris 10 mM pH: 8, DTT 1 mM durante 12 horas en agitación y en cámara fría. Al día siguiente se cambiaron los 5L por otros 3L nuevos del mismo buffer, Tris 10 mM pH:8, DTT 1 mM y se volvió a dejar al menos 12 horas en agitación.
Una vez eliminado el sulfato de amonio se filtró la proteína con un filtro 0,45 μM y se introdujo en una columna de sefarosa Q (previamente equilibrada con Tris 10 mM pH: 8) para llevar a cabo una cromatografía de intercambio aniónico.
El desarrollo cromatográfico se realizó a 4ºC, empleando como fase móvil un gradiente Tris 10 mM pH:8, DTT 1 mM KCl 20 mM hasta Tris 10 mM pH: 8, DTT 1 mM KCl 220 mM y tomándose fracciones del eluido de 12 ml con un colector de fracciones.
La concentración de proteína total de las fracciones obtenidas se determinó siguiendo el método de Bradford. Para seleccionar las fracciones en las que se encontraba la ATR se realizó electroforesis SDS‐PAGE con las fracciones con una mayor concentración de proteína.
Posteriormente con las fracciones en las que se detectó la ATR se llevó a cabo cromatografía de exclusión molecular utilizando una columna de hidroxiapatita para obtener una mayor purificación de la proteína. El desarrollo comatográfico se realizó a 4ºC y se utilizó como fase móvil un gradiente desde 10 mM KPB pH: 8, KCl 5 mM
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hasta 400 mM KPB pH: 8., KCl 5 mM Las fracciones obtenidas con un colector automático fueron de 7 ml.
La concentración de proteína total de las fracciones obtenidas tras esta cromatografía también se determinó siguiendo el método de Bradford.
Las fracciones con la hATR se concentraron mediante columnas Amicon para obtener una concentración de 10 μg/μl 3.2.4 Cromatografía en gel
Para estudiar el estado de oligomerización de la hATR wt y mutante se utilizó una columna Superdex 200 (1,2cm x 92cm) con un flujo 2,0 ml/min buffer 50 mM Tris‐HCl pH:8 con 100 mM KCl. Se utilizaron estándares para calcular la masa molecular de la proteína (molecular standard marker (Biorad)). La cantidad de proteína utilizada fue de 100μg.
3.2.5 Electroforesis, transferencia y detección de proteínas Electroforesis, transferencia e inmunodetección de la proteína PAH
La transferencia e inmunodetección de la proteína PAH y de las proteínas FLAG‐PAHwt y mutantes procedentes de hepatoma se realizó sometiendo 50‐300 μg de los extractos proteicos solubles (obtenidos por congelación‐descongelación de los precipitados celulares resuspendidos en el buffer Na‐Hepes 20 mM con Pefabloc 0,2 mM) a electroforesis discontinua en gradiente desnaturalizante (SDS‐PAGE) (Davis 1964; Laemmli 1970; Ornstein 1964)
La proteínas separadas por SDS‐PAGE, fueron transferidas a membranas de nitrocelulosa (Western blot) y detectadas mediante tinción con Rojo Poinceau (Harlow and Lane 1988). La inmunodetección de proteínas se realizó utilizando anticuerpos monoclonales comerciales anti‐tirosina, anti‐triptófano y anti‐fenilalanina hidroxilasa (PH8; Pharmingen) de ratón y para las proteínas de fusión Flag‐PAH se utilizó el anticuerpo primario Antiflag M2 (Sigma), y como anticuerpos secundarios, anticuerpos de cabra anti‐ratón GAM/Ig (Nordic y Santa Cruz) conjugados a peroxidasa, ambos anticuerpos a una dilución 1/5000 (V/V). La visualización de los complejos formados se llevó a cabo mediante el desarrollo de una reacción quimioluminiscente en presencia del reactivo ECL™ (Amersham Pharmacia Biotech) durante 1 min y posterior impresión de una película fotográfica durante 1 min. para las proteínas FLAG‐PAH y entre 15 y 30 min. para la PAH endógena del hepatoma. La cuantificación de los niveles de proteína inmunorreactiva se realizó mediante densitometría láser, utilizando el densitómetro Bio‐Rad GS‐710 Calibrated Imaging Densitometer (Bio‐Rad).
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Electroforesis, transferencia y detección de la proteína α‐PCC mediante marcaje con avidina conjugada a fosfatasa alcalina.
Para la detección de la proteína α‐PCC las mitocondrias de fibroblastos fueron aisladas por homogenización y centrifugación diferencial a 4°C en una solución 25mM sacarosa, 10 mM Tris‐HCl, 2 mM EDTA pH 7,4 y 0,2 mM PMSF, siguiendo el protocolo descrito por (Bergman et al. 1989) y posteriormente resuspendidas en 20‐50 μl de una solución 25 mM sacarosa, 10 mM Tris‐HCl y 2 mM EDTA pH 7,4. La determinación de la concentración de proteínas se llevó a cabo mediante cuantificación por el método de Bradford. La misma cantidad, 25‐100 μg de las fracciones mitocondriales fue sometida a SDS‐PAGE.
Tras la electroforesis, las proteínas procedentes de las fracciones mitocondriales fueron transferidas a membranas de PVDF (Immobilon™‐P, Millipore) según el protocolo descrito por (Baumgartner et al. 2001a). La transferencia se realizó empleando una solución 24 mM Tris base, 192 mM glicina, 20% metanol según el protocolo descrito por (Towbin et al. 1979), en el aparato Mini Trans‐Blot Transfer Cell (Bio‐Rad). Una vez finalizada, la membrana fue sometida a tres lavados de 5‐10 minutos en PBS y bloqueada durante al menos una hora en una solución PBS‐BSA 2% (p/v). Una vez bloqueada la membrana, se incubó durante 1 hora con una solución de PBS/BSA 0,3 % (p/v) a la que se había añadido avidina conjugada con fosfatasa alcalina (Pierce) en una proporción 1:1000. Tras tres lavados sucesivos de 5 min. en PBS, se procedió al revelado de la membrana por adición del sustrato 1‐Step™ NBT/BCIP de la firma comercial Pierce y posterior desarrollo colorimétrico. 3.2.6 Ensayos enzimáticos Actividad fenilalanina hidroxilasa Para determinar la actividad específica PAH en la fracción tetramérica de la proteína de fusión purificada (MBP‐PAHtet) y en extracto celular de hepatoma se cuantificó la L‐Tyr formada a partir de L‐Phe en los ensayos mediante la separación de ambos aminoácidos por cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) y detección fluorimétrica. En los extractos celulares de hepatoma se eliminaron los aminoácidos antes de llevar a cabo el ensayo de actividad utilizando los filtros ULTRAFREE®‐ MC 10,000 NMWL Filter Unit. (Amicon) y la concentración de proteína se determinó siguiendo el método de Bradford.
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La mezcla de reacción, conteniendo 0,15‐1 μg de MBP‐PAH y de MBP‐PAHtet ó 5‐10 μg extracto celular de hepatoma en Na‐Hepes a pH 7.0, en presencia de catalasa (0,04 mg/ml), albúmina de suero bovino (0,5 mg/ml) y L‐Phe 1 mM, fue incubada durante 4 min a 25ºC, adicionándose posteriormente sulfato amónico ferroso 100 μM, y tras 1 min de incubación, se inició la reacción mediante la adición de BH4 75 μM en DTT 5 mM, en un volumen final de 50 μl. La reacción se desarrolló durante 1 min a 25ºC en el caso de MBP‐PAHtet y durante 30 min. en el caso del extracto de hepatoma y se detuvo usando 3 volúmenes de HClO4 12% (V/V) frío (método de (Allen et al. 1999)). La mezcla final se incubó a 0ºC durante al menos una hora y a ‐20ºC durante una noche, después se centrifugó durante 15 minutos en una centrífuga de mesa y el sobrenadante se almacenó a ‐20ºC para ser aplicado posteriormente en el HPLC. En algunos experimentos, en lugar de preincubarse la proteína con L‐Phe 1 mM, ésta se adicionó junto al BH4 al iniciar la reacción. Los blancos de reacción se determinaron adicionando H2O (en lugar de L‐Phe) o DTT 5 mM (en lugar de BH4). Para determinar la velocidad máxima (Vmax) y la afinidad aparente (Km) por BH4, se realizaron los ensayos de actividad en ausencia de preincubación con L‐Phe, iniciándose la reacción con 1 mM L‐Phe y distintas concentraciones de BH4 (2,5‐200 μM), mientras que la Vmax, la afinidad aparente (S0,5) y cooperatividad (índice de Hill, h) por L‐Phe se determinaron en condiciones de preincubación con L‐Phe (5‐4000 μM) e iniciándose la reacción con 75 μM BH4.
Los niveles de L‐Tyr formada durante los ensayos se determinaron mediante
la separación de los aminoácidos por HPLC, según el método descrito por (Allen et al. 1999). Se utilizó una columna de matriz hidrofóbica (Eclipse®XDB 250 x 4.6 mm Zorbax®XDB‐C18 de Agilent Technologies) equilibrada en 5% acetonitrilo (V/V) en H2O y desarrollándose la separación cromatográfica en condiciones isocráticas a 25ºC durante 10 min, siendo los tiempos de retención de ~3,9 min para L‐Tyr y ~6,8 min para L‐Phe. El volumen de muestra aplicado fue de 50 μl. La detección de L‐Phe y L‐Tyr se realizó usando un detector fluorimétrico, con una λexcitación= 274 nm y λemisión=304 nm. La determinación de la concentración de L‐Tyr formada se realizó interpolando las señales obtenidas para las muestras en una recta de calibrado generada usando patrones de L‐Tyr pura (preparada inicialmente en HCl 0.1 N y titulada usando λ275nm= 1400 M‐1 ∙ cm‐1), procesados de idéntica manera a las muestras en cada método. Actividad ATP:cob(I)alamina adenosiltransferasa
Los ensayos enzimáticos para la ATR fueron llevados a cabo siguiendo el protocolo descrito en (Johnson et al. 2001) con algunas modificaciones. La mezcla de reacción utilizada contenía 200 mM Tris (pH:8), 1,6 mM KH2PO4, 2,8 mM MgCl2, 100 mM KCl, 0,4 mM ATP y 80 μM (Cob(II)alamina o OHcobalamina (Sigma)). La mezcla de reacción (800 μl) se introdujo en cubetas de metacrilato y se
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empezó a monitorizar la absorbancia a 388 nm y 37ºC, cuando la línea fue estable se añadieron 10 μl de ácido Ti(III)citrato, una vez estabilizada la línea por ultimo se añadieron 10‐100 μg de proteína y se observó la disminución de la absorbancia. El análisis matemático para el cálculo las actividades a partir de las gráficas obtenidas se llevó a cabo utilizando el programa informático IGOR Pro6 (WaveMetrics Inc.).
Tanto la mezcla de reacción, la proteína y el ácido Ti(III)citrato se prepararon en condiciones anaeróbicas.
Los ensayos enzimáticos de la actividad realizados con el mismo protocolo anteriormente descrito pero utilizando 50 μM Cob(II)alamina y diferentes concentraciones de ATP (entre 0‐0,2 mM) permitió el cálculo de Km y Vmax por ATP. El programa informático con el que se realizaron los análisis matemáticos fue también IGOR Pro6(WaveMetrics Inc.).
Para calcular la Kd para los distintos análogos de Cob(II)alamina se pusieron 3 ml de buffer Tris 50mM pH: 8 en una cubeta de cuarzo y se midió la fluorescencia ( λexcitación= 280 nm y λemisión=340 y un tiempo de integración de 2 min). A continuación se añadieron entre 40‐150 μg proteína y se volvió a medir la fluorescencia, se fueron añadiendo 1‐ 10 μl del análogo (concentración entre 2‐7 mM) midiéndose la fluorescencia tras cada adición. El programa informático con el que se realizaron los análisis matemáticos fue también IGOR Pro6 (WaveMetrics Inc.).
Para calcular la Kd por Cob(II)alamina, se midió en una cámara anaeróbica el
espectro desde 300 nm hasta 750 nm de la proteína ATR a una concentración de 2μM en el buffer Tris 50mM pH: 8, posteriormente se añadió Cob(II)alamina a una concentración final 10μM y se volvió a medir el espectro con el mismo rango de absorción. El experimento se repitió a distintas concentraciones de proteína hasta un máximo de 100 μM. Posteriormente se llevo a acabo el análisis matemático de los espectros con el programa informático IGOR Pro6 (WaveMetrics Inc.). Actividad propionil‐CoA carboxilasa y metilcrotonil‐CoA carboxilasa La medida de la actividad PCC y MCC se realizó en fibroblastos cultivados. Los fibroblastos fueron recogidos por tripsinización y resuspendidos en un buffer Tris‐HCl 20 mM, glutation 0,025 % (p/v). Posteriormente, se sometieron a tres ciclos sucesivos de congelación/descongelación en N2 líquido y a una centrifugación posterior 5 min. a 13000 rpm, para obtener el extracto celular total. La determinación de las actividades enzimáticas PCC y MCC se realizó siguiendo el protocolo descrito por (Suormala et al. 1985). Cada ensayo se llevó a cabo en un volumen final de 200 μl, en la siguiente mezcla de reacción: 20 μmoles Tris‐HCl pH 8.0, 0,15 μmoles DTT, 0,628 μmoles Na2‐ATP.3H2O, 1,2 μmoles MgCl2.6H2O, 20 μmoles KCl, 5% (v/v) Triton X‐100, 0,2 μmoles propionil‐CoA o 0,2
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μmoles 3‐metilcrotonil‐CoA y 8 μmoles NaHCO3. El isótopo radiactivo NaH[14C]O3 (Amersham Pharmacia Biotech) utilizado tenía una actividad de 56 mCi/mmol NaHCO3 y 2 mCi/ml, fue suministrado a la reacción en una proporción de 1, 2 ó 3 μCi/ μmol NaHCO3.
La reacción enzimática comenzó al añadir 20 μl del extracto proteico celular y se llevó a cabo a 30°C durante 20 minutos con agitación. La parada de la reacción enzimática tuvo lugar por la adición de 140 μl de TCA 30% (p/v) y las proteínas precipitadas se separaron por centrifugación a 14000 rpm durante 15 min. El sobrenadante fue transferido a un vial de centelleo y sometido a evaporación a totalidad a temperatura ambiente, siendo posteriormente resuspendido en 500 μl de agua miliQ. Posteriormente se añadieron a cada vial 5 ml de líquido de centelleo Optiphase Hisafe 2 (Perkin Elmer) y se procedió a la determinación de cpm en el contador 1209 Rackbeta Liquid Scintillation Counter (Wallac).
La cuantificación de proteínas totales en los extractos proteicos se llevó a cabo según el método descrito por (Lowry et al. 1951).
Las actividades específicas residuales PCC y MCC se expresaron en unidades de pmoles [14C]O2 incorporado/min/mg proteína total. 3.2.7 Síntesis in vitro y pulso caza de las proteínas PAH La expresión in vitro de las proteínas PAH se realizó empleando el sistema comercial TnT‐T7 Quick Coupled Transcription/Translation System de Promega siguiendo las instrucciones del proveedor. El cDNA de la PAH se amplificó mediante PCR utilizando como molde 100 ng de los plásmidos pRc/CMV‐PAH o pMALc2‐PAH wt y mutantes, empleando para ello el oligonucleótido T7‐PAH que introduce el promotor de la RNA polimerasa T7 y la secuencia consenso Kozak próxima al ATG iniciador (Kozak 1984) y el oligonucleótido 13B, según se describe en (Gamez et al. 2000).
El experimento de pulso‐caza llevado a cabo para estudiar la vida media de la PAH en presencia/ausencia de BH4, se desarrolló en presencia de L‐[35S]‐metionina y L‐[35S]‐cisteína según se describe en (Gamez et al. 2000). La reacción de síntesis se desarrolló a 30ºC durante 35 minutos, tras los cuales el proceso de síntesis se detuvo añadiendo RNAsa A (1 mg/ml) y DNAsa I (1 mg/ml). En este punto se obtuvo la alícuota (10 μl) correspondiente a la síntesis y tiempo cero. El resto de la reacción se incubó a 37 ºC y se tomaron alícuotas (10 μl) cada hora tras la síntesis hasta las 7 horas. Las muestras se congelaron a ‐20ºC hasta su utilización. Para cada proteína PAH se realizaron en paralelo los experimentos en presencia y ausencia de 500 μM
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BH4 en la mezcla de síntesis. Las diferentes alícuotas fueron desnaturalizadas y analizadas posteriormente mediante SDS‐PAGE. Las proteínas marcadas radiactivamente fueron visualizadas por fluorografía y cuantificadas por densitometría láser de las películas fotográficas (Gamez et al. 2000) Los resultados fueron ajustados a una función de decaimiento exponencial.
3.2.8 Cultivo celular. Las células de hepatoma, fibroblastos y LB fueron cultivadas en botellas de 75 cm2 y en placas estandarizadas de 6 pocillos (P6) a 37°C en una atmósfera de humedad relativa del 95% y CO2 5%, utilizando como medio de cultivo MEM suplementado con glutamina 2 mM, suero al 10% (v/v) y una mezcla de antibióticos. Los sueros utilizados fueron suero fetal bovino (FBS), suero fetal bovino dializado y suero de ternera recién nacida (NCBS). Las células fueron recogidas con una solución de tripsina‐EDTA y sedimentadas mediante centrifugación. Se realizaron controles de contaminación de reactivos, medios de cultivo y cultivos celulares de forma sistemática durante todo el estudio. Expresión transitoria en células eucariotas Hep3B
Para el análisis del efecto de la sepiapterina sobre la transcripcion y
traducción de la PAH se sembraron 5x105 células Hep3B por pocillo en placas P6, después de 24 horas se cotransfectaron los plásmidos pGL3UTRPrPAH y pRCCMV‐βgal (como estándar interno para montorizar la eficiencia de la transfección) según el protocolo descrito por la casa comercial para el Jet PEI. 5 horas después de la transfección se cambió el medio por medio control o con sepiapterina 100 μM (filtrada con MILLEX®GS filter 0,22 μm) y 48 horas después se recogieron las células por centrifugación y se resuspendieron en 180 μl de buffer (Reporter lysis buffer del kit luciferase Assay System de Promega®) con 0,2 mM de pefabloc y se sometió a 2 ciclos de congelación/descongelación en N2 líquido. Los extractos proteicos solubles se recuperaron por centrifugación de las células lisadas. A partir de estos extractos proteicos se procedió a la medida de la actividad luciferasa con 20 μl de cada muestra, utilizando para ello un luminómetro Monolight 2010 (Analytical Luminescence Laboratory), siendo la luciferina del kit (luciferase Assay System de Promega®) el sustrato de la reacción.
La medida de la actividad β‐Galactosidasa (Nielsen et al. 1983) sirvió como control de la eficiencia de la transfección
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Para el estudio de expresión transitoria de la proteína FLAG‐PAH wt y mutantes se sembraron de 4‐5x106 células de Hep3B en botellas T75, después de 24 horas se transfectaron según el protocolo descrito por la casa comercial para el Jet PEI, 10 μg de plásmido pFLAG‐CMVPAH normal o mutantes y 20 μl de Jet PEI. A las 5 horas se cambió el medio por medio control o con sepiapterina 100 μM, 48 horas después se recogieron las células y tras su lisis mediante congelación‐descongelación se utilizaron para experimentos de Western blot. Transfección de oligonucleótidos antisentido tipo morfolinos en fibroblastos.
La secuencia de los oligonucleótidos tipo morfolinos (GeneTools) utilizados en la modulación de splicing se muestra en la siguiente tabla. Tabla 9: Oligonucleótidos tipo morfolinos diseñados para la modulación del splicing en los genes PCCA y PCCB. Nombre del
oligo Secuencia 5´ 3´ Gen diana
Ins84PCCA CACAGTGTTGACAAAAACTAGAAAA PCCA
ENSG00000175198
Ins72PCCB TCATGTAATAAAGATATGTACCTCT PCCB
ENSG00000114054
Los fibroblastos del paciente fueron cultivados en placas estandarizadas P6, 5x105 células por pocillo, 24 horas después de la siembra se añadió el oligonucleótido antisentido (AON) a una concentración final en el medio de 10 μM ó 20 μM. Para la transfección del AON se utilizó Endo‐Porter (Gene Tools) a una concentración final de 6 μM. El tiempo de cultivo tras la adición del Endo‐Porter y el AON fue de 48‐72 horas, tras este tiempo se recogieron las células y se guardó el precipitado celular a ‐70º hasta su utilización.
3.2.9 Medida de pterinas
El análisis de pterinas en el extracto celular de hepatoma fue llevado a cabo usando HPLC con columna modelo HP1100 de Agilent technologies y con un detector de fluorescencia. La preparación de las muestras se hizo siguiendo el método de (Fukushima and Nixon 1980) y la monitorización fluorimétrica se realizó usando un detector fluorimétrico, con una λexcitación= 360 nm y λemisión=440 nm.
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3.2.10 Soporte informático Los ajustes a las ecuaciones de Michaelis‐Menten (para determinar Vmax y Km
por BH4) y de Hill (Vmax, S0,5 y h por L‐Phe) se realizaron mediante regresión no‐lineal, usando los programas SPSS 11.0 (SPSS Inc.) y Origin 5.0 (MicroCal Inc.).
El tratamiento de imágenes digitales y densitometría de las mismas se realizó
mediante los programas Kodak Digital Science 1D 2.0.3. (Kodak Scientific Image Systems),y Quantity One 4.3.1 (Bio‐Rad).
El análisis estructural de las mutaciones PAH tuvo lugar a partir del modelo de la PAH full length generado por P. Gómez y E. López de la Unidad de Bioinformática del CBM. El análisis estructural de las mutaciones ATR tuvo lugar a partir del modelo tridimensional descrito en (Schubert and Hill 2006).
La visualización de las estructuras tridimensionales y la localización de los
aminoácidos mutados en las distintas variantes alélicas de los genes PAH y MMAB se realizaron con el soporte informático DS ViewerPro5.0 de Accelrys Inc.
La identificación de las mutaciones detectadas en los genes PCCA y PCCB
como posibles ESEs (exonic splicing enhancers) se llevó a cabo con los programas informáticos ESEfinder versión, Rescue‐ESE (RESCUE‐ESE Web Server), y PESX (PESXs Server).
La identificación de los posibles sitios aceptores y donadores de splicing en una determinada secuencia se realizó con el programa informático Splice Site Prediction de BDGP (http://www.fruitfly.org/seq_tools/splice.html).
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4. RESULTADOS
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4.1 BASES MOLECULARES DE LA RESPUESTA A BH4 EN FENILCETONURIA
En el momento de comenzar este trabajo (año 2003) se había descrito la respuesta positiva a BH4 en pacientes PKU en diversas poblaciones, con frecuencias variables y gran heterogeneidad en las mutaciones asociadas. En la población española no se había analizado aún la respuesta en pacientes PKU, por lo que en colaboración con la Dra Martínez‐Pardo (Hospital Ramón y Cajal, Madrid) se inició un estudio mediante la aplicación de test de sobrecarga de BH4 y el genotipado de los pacientes sometidos al mismo.
Por otra parte, el laboratorio estaba realizando un estudio con el objetivo de
investigar los mecanismos moleculares responsables de la respuesta in vivo a BH4, (en colaboración con los doctores R. Stevens (Scripps Research Institute, La Jolla, USA) y A. Martínez (Univesidad de Bergen, Noruega)), en este sentido nos propusimos la caracterización de la proteína PAH con algunas mutaciones asociadas a respuesta a BH4 en sistemas procariotas, eucariotas y libres de células. 4.1.1 IDENTIFICACIÓN DE MUTACIONES ASOCIADAS A RESPUESTA A BH4 EN PACIENTES FENILCETONÚRICOS ESPAÑOLES
En colaboración con la Dra. Martinez‐Pardo (Hospital Ramón y Cajal) se llevó
a cabo un estudio piloto de sobrecarga con BH4 en 31 pacientes españoles deficientes en el gen PAH. Para el genotipado de todos los pacientes sometidos al test de sobrecarga se analizaron muestras de DNA genómico, obtenidas de sangre total periférica. Las mutaciones de los 31 individuos fueron estudiadas mediante las técnicas de DGGE y secuenciación cíclica directa identificándose un total de 34 mutaciones diferentes, previamente descritas en la base de datos de la PAH (http://www.pahdb.mcgill.ca). Únicamente en dos pacientes sólo se determinó la mutación en uno de los alelos, por lo que el porcentaje de variantes alélicas identificadas en el total de pacientes fue de un 96,7% (Tabla 10). En aquellos casos en los que se tuvo muestra de los padres se confirmó la herencia mendeliana y la presencia de ambas mutaciones en posición trans.
De los 31 pacientes incluidos en este estudio, 11 (5 HFA y 6 PKU leves)
mostraron una respuesta positiva al test de sobrecarga con BH4, considerando como respuesta positiva una disminución igual o mayor a un 30% en los niveles de L‐Phe 8 horas después de la sobrecarga. Adicionalmente 3 pacientes más mostraron una respuesta lenta con una disminución igual o mayor a un 30% en los niveles de L‐Phe entre 12‐16 horas después de la sobrecarga.
El 90% de los HFAs y el 50% de los PKU leves responden positivamente al
test, se observa por lo tanto que los fenotipos más suaves presentan una respuesta
48
favorable en un alto porcentaje mientras que en los pacientes con fenotipos más graves esta respuesta es muy poco frecuente. Tan solo un 20% de los PKUs moderados y un 13% de los clásicos responden de forma lenta.
Todos los individuos estudiados con respuesta favorable son compuestos
heterocigotos con al menos una mutación missense potencialmente asociada a respuesta excepto el paciente 19548 que es homocigoto para la mutación IVS10nt‐3C>T (en cursiva y negrita en la Tabla 10). Las mutaciones missense de los pacientes que se postulan podrían estar implicadas en respuesta serían aquellas que tienen actividad residual por estudios de expresión de mutaciones o que se han descrito asociadas a respuesta a BH4 en pacientes en otros trabajos (Spaapen and Estela Rubio‐Gozalbo 2003) y aparecen subrayadas y en negrita en la Tabla 10.
El paciente 19548 es homocigoto para la mutación IVS10nt‐3C>T, este cambio nucleotídico altera el sitio aceptor de splicing del intrón 10 y como consecuencia se produce la eliminación del exón 11 en la maduración del mensajero (Jaruzelska et al. 1995). La hipótesis para explicar la respuesta a BH4 y el fenotipo HFA en este paciente es la presencia de transcritos normales con el exón 11, para comprobar esto se llevó a cabo el estudio del mRNA de la PAH mediante retrotranscripción y posterior PCR a partir de RNA de linfoblastos del paciente, rescatando la transcripción basal de la PAH en estas células ya que la expresión del gen de la PAH se activa exclusivamente en hígado y riñón.
La amplificación y posterior secuenciación del fragmento del cDNA con los primers PAH10 y PAH13 permitió observar la existencia de mRNA normal (Fig 9) que podría explicar el fenotipo HFA que presenta el paciente y la respuesta a BH4.
Exón 10
Exón 10
Exón 12
Exón 11
MCR 19548
10 11 12
10 12
Figura 9: Análisis por RT‐PCR y posterior secuenciación del cDNA de la PAH utilizando los oligonucleótidos específicos PAH10 ‐ PAH13 a partir del RNA del paciente 19548 y utilizando la línea celular MCR (linfoblastos control).
49
Tabla 10: Fenotipos, genotipos y tipo de respuesta de los pacientes sometidos al test de sobrecarga con BH4.
Genotipo Referencia Fenotipo Mutación 1 Mutación 2
a +, respuesta positiva: disminución igual o mayor a un 30% en los niveles de L‐Phe 8 horas después de la sobrecarga con BH4; ‐ respuesta negativa; +/‐, respuesta lenta: disminución igual o mayor a un 30% en los niveles de L‐Phe entre 12‐16 horas después de la sobrecarga con BH4 . ND, no determinado. En negrita y subrayado, mutaciones missense potencialmente responsables de la respuesta. En negrita y cursiva mutación de splicing asociada a respuesta lenta.
50
4.1.2 EXPRESIÓN DE PROTEÍNAS PAH MUTANTES IMPLICADAS EN LA RESPUESTA A BH4
Las mutaciones analizadas mediante expresión para caracterizar sus parámetros cinéticos y/o su estabilidad han sido F39L, R68S, D129G, H170D, E178G, V190A, A300S, A309V, A313T, A373T, V388M, E390G, P407S, Y414C. La mayoría de las mutaciones estudiadas están presentes en el dominio catalítico y todas ellas han sido descritas en pacientes fenilcetonúricos americanos (Matalon et al. 2004) y españoles que responden a BH4 .
La localización en la estructura monomérica de la PAH de las mutaciones se muestran en la Figura 10. Destaca el hecho de que muchas de ellas no se encuentran ni en la región de unión al cofactor ni en las proximidades, por lo que se postula que es difícil que todas las proteínas mutantes tengan afectada la Km por BH4, por lo que el efecto positivo de un aumento en las concentraciones de BH4 podría estar relacionado con la estabilización de las proteínas mutantes, (que tendrían defectos de plegamiento), actuando la BH4 como una chaperona química.
Figura 10: Estructura en dominios de un monómero de PAH y localización de los residuos implicados en respuesta a BH4, sometidos a estudios cinéticos y/o de estabilidad La BH4 se muestra en rosa y blanco y los residuos implicados en respuesta a BH4 en azul y blanco.
51
Análisis cinéticos
El procedimiento experimental utilizado para caracterizar las diversas propiedades cinéticas de la PAH ha sido la expresión de la proteína de fusión MBP‐PAH en la bacteria E. coli y su utilización para ensayos de actividad enzimática en forma de tetrámero. La fracción tetramérica activa se obtuvo mediante purificación por cromatografía de afinidad y posterior cromatografía de exclusión molecular. En el caso de la mutación D129G se llevaron a cabo los ensayos cinéticos con la proteína total obtenida tras cromatografía de afinidad en paralelo con la proteína normal ensayada en las mismas condiciones
Los ensayos cinéticos en condiciones de estado estacionario han permitido determinar los parámetros cinéticos del enzima tetramérica normal y mutante; actividad específica, afinidad aparente por BH4 (Km), afinidad aparente por L‐Phe (S 0,5), cooperatividad (índice de Hill, h) y activación por L‐Phe.
Para determinar la actividad PAH se cuantificó la L‐Tyr formada durante los ensayos mediante separación cromatográfica de L‐Tyr y L‐Phe en HPLC y detección y cuantificación por fluorimetría tal y como se especifica en materiales y métodos. Los datos se muestran en la Tabla 11.
Se observa que sólo una mutación (P407S) presenta parámetros similares a los de la proteína normal, mientras que las otras cuatro proteínas mutantes presentan alteraciones en algún parámetro cinético, dos (D129G y H170D) tienen una actividad específica preincubando con L‐Phe disminuida, tres (D129G, H170D y V190A) tienen una actividad específica sin preincubar con L‐Phe disminuida y una (E390G) presenta alteraciones en el grado de activación (<2,5). Solo una de ellas (D129G) presenta una cierta disminución de la afinidad por BH4 (Km elevada en un 40%).
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Tabla 11. Parámetros cinéticos obtenidos para las proteínas MBP‐PAHtet y MBP‐PAH normal (wt) y mutantes.
Forma purificada Actividad Específica (μmol L‐Tyr/min.mg) L‐Phe (c) BH4 (d)
a) Actividad específica determinada preincubando con 1 mM L‐Phe durante 5 min. e iniciando el ensayo con 75μM BH4. b) Actividad específica determinada sin preincubar con L‐Phe e iniciando el ensayo con 75 μM BH4 y 1mM de L‐Phe. c) Actividad determinada preincubando con 0‐4 mM L‐Phe durante 5 min. e iniciando el ensayo con 75 μM BH4. d) Actividad determinada iniciando el ensayo con 1mM de L‐Phe y BH4 0‐200 μM. e) Actividad medida en la forma purificada MBP‐PAH tras cromatografía de afinidad. Los parámetros cinéticos para la MBP‐PAHwt en esta forma
purificada son : actividad específica (μmol L‐Tyr/min.mg)+L‐Phe =1,54±0,13 y –L‐Phe = 0,86±0,16, grado de activación = 1,8 y Km por BH4 =26±3. ND: no determinado Todos los datos son la media de al menos dos experimentos independientes por duplicado
53
Análisis del efecto del cofactor BH4 sobre la estabilidad de las proteínas PAH normal y mutantes.
Para el análisis del posible efecto de la BH4 sobre la estabilidad conformacional de las proteínas mutantes se llevaron a cabo experimentos de pulso‐caza mediante transcripción‐traducción acoplada (TNT) en un sistema libre de células en ausencia o presencia de altas concentraciones de BH4 (500μM). Tras el pulso‐caza las proteínas marcadas fueron sometidas a electroforesis, autorradiografía y densitometría.
Estos experimentos permitieron determinar la vida media (t1/2) tanto en presencia como en ausencia de BH4 de la enzima normal (wt) y de las distintas variantes alélicas. Los resultados de t1/2 obtenidos en los experimentos de pulso‐caza de las proteínas mutantes y de la proteína normal se encuentran recogidos en la Tabla 12. En la Figura 11 se muestran experimentos representativos obtenidos para la proteína normal y algunas proteínas mutantes.
Todas las mutaciones estudiadas, excepto R68S y A300S, presentan defectos
de estabilidad probablemente debido a una deficiencia en el plegamiento, con una vida media en ausencia de BH4 inferior a la vida media de la proteína normal, son por lo tanto proteolíticamente degradadas más rápidamente que la salvaje.
Para la mayoría de las variantes alélicas estudiadas la presencia de una mayor concentración de BH4 o no produce ningún efecto positivo en la estabilidad de la proteína o si existe un aumento en la vida media es muy leve. Sin embargo para tres de ellas (A309V, V388M, Y414C) la presencia de altas concentraciones de BH4 implica un aumento significativo de la vida media, llegando a alcanzar valores de t1/2 similares a los de la proteína PAH salvaje.
Figura 11: Análisis mediante SDS‐PAGE y posterior autorradiografía de la estabilidad de la proteína PAH normal y algunas mutantes en presencia/ausencia de BH4.
Tabla 12: Vida media (t1/2) de las proteínas PAH normal y mutante en presencia/ausencia de BH4 en el sistema TNT.
T1/2 (horas) Proteína
Sin BH4 Con BH4
wt‐PAH 8.7 7.9
Mutaciones
F39L 5.6 6.5
R68S 8.2 8.6
E178G 5.5 5.8
V190A 5.7 5.2
A300S 8.9 8.8
A309V 3.5 8.5
A313T 4.9 4.9
A373T 6.1 7.1
V388M 5.5 7.0
E390G 5.6 6.4
Y414C 5.8 8.8
Una vez observado que un aumento en los niveles de BH4 en el sistema TNT producía un efecto estabilizador en algunas de las proteínas mutantes, analizamos si este efecto era reproducido en un modelo celular de hepatoma. Para ello en primer lugar se midieron los niveles intracelulares de BH4 en el hepatoma y se alteraron estos niveles con distintos compuestos. Para disminuir los niveles celulares de tetrahidrobiopterina se utilizaron varios inhibidores de la vía de síntesis intracelular del cofactor, en concreto se usaron dicumarol que es inhibidor de la sepiapterina reductasa y DAHP (2,4‐Diamino‐6‐hidroxipirimidina) que inhibe la GTPCH (GTP ciclohidrolasa I) (Fig 3). Para aumentar los niveles de tetrahidrobiopterina se utilizó un precursor de la BH4 que es la sepiapterina.
55
Se comprobó en primer lugar cual era la alteración en los niveles de pterinas
intracelulares al cultivar el hepatoma durante 24 ó 48 horas en presencia de los distintos compuestos a una concentración final de 100 μM para el dicumarol y la sepiapterina y de 10 mM para el DAHP. Los metabolitos marcadores utilizados para determinar el efecto de estos compuestos fueron la biopterina (BH4+BH2+BH2 oxidada) como medida de la cantidad de BH4 y neopterina como medida de la interrupción de la vía de síntesis de novo de la BH4.
Se obtuvo a ambos tiempos en presencia de sepiapterina, un aumento en la
concentración de biopterina, siendo a 48 horas más de trescientas veces respecto al control y disminuía a cero en presencia de los dos inhibidores. Los datos para 48 horas se muestran en la Tabla 13. Tabla 13: Niveles de biopterina y neopterina (pmol/mg proteína) en extracto celular de hepatoma cultivado durante 48 horas en presencia de dicumarol, sepiapterina o DAHP. Control Dicumarol 100μM DAHP 10mM Sepiapterina 100μM
Todos los datos son la media de dos experimentos independientes. a (BH4+BH2+BH2 oxidada). ND: no determinado
Una vez comprobado que los niveles intracelulares del cofactor eran alterados, según lo esperado, seleccionamos tres mutaciones (A309V, V388M y Y414C) para el estudio de su estabilidad, estas mutaciones fueron seleccionas por su presencia en el genotipo de individuos respondedores in vivo y por presentar una corrección en su defecto estructural en el sistema TNT en presencia de BH4.
Para analizar el efecto de niveles elevados de BH4 sobre las proteínas PAH
mutantes seleccionadas, se clonaron los cDNA de la proteína PAH normal y mutantes en el vector pFLAG‐CMV como proteínas de fusión al péptido FLAG, este sistema nos permitió la detección de manera específica de dichas proteínas en hepatoma mediante el uso de un anticuerpo antiFLAG, evitando la detección de la PAH endógena.
En primer lugar se calculó la vida media de la proteína de fusión normal, para ello se transfectó el hepatoma humano con el plásmido pFLAG‐CMVPAHwt y se paró la síntesis proteica a las 48 horas con puromicina (inhibidor de la traducción) a una concentración final de 10 μg/ml. La proteína recogida a tiempo 0, 4, 8 y 10 horas tras la parada de la traducción se sometió a Western Blot y los datos resultantes se analizaron para determinar la vida media de la proteína. La proteína
56
de fusión FLAG‐PAHwt presentaba una vida media de 9,4 horas (Fig 12), siendo del mismo orden que la vida media calculada en el sistema TNT.
0
20
40
60
80
100
120
0 2 4 6 8 10
tiempo(horas)
% P
AH
resi
dual
Fig 12: Representación semilogarítmica de la degradación de la proteína FLAG‐PAHwt en función del tiempo. Todos los puntos de la gráfica son la media de tres experimentos independientes.
Posteriormente comprobamos si la cantidad de proteína de fusión FLAG‐PAHwt aumentaba en presencia de sepiapterina, y al igual que ocurre en el sistema TNT, el cultivo en presencia de niveles elevados de BH4 no aumenta la cantidad de proteína. Cuando trasfectábamos las proteínas mutantes observábamos que dos de las mutantes (A309V y V388M) cuando se cultivaban en ausencia de sepiapterina y en comparación con la FLAG‐PAHwt se acumulaban en menor cantidad y que para las tres mutantes, el cultivo en presencia de sepiapterina durante 48 horas, llevaba a una mayor cantidad de proteína detectada. Este aumento era más importante (2,5 veces) para la mutación A309V (Tabla 14). Tabla 14: Cantidad relativa de proteína FLAG‐PAH wt y mutantes en hepatoma en presencia o ausencia de sepiapterina 100 μM durante 48 horas..
Todos los datos son la media de tres experimentos independientes y referidos a la cantidad obtenida con la proteína FLAG‐PAHwt.
Tiempo (horas) % FLAG-PAHwt
0 100 4 77±9 6 73,±13 8 50±6
57
4.1.3 EFECTO DE LA BH4 SOBRE LA TRANSCRIPCIÓN Y TRADUCCIÓN DEL GEN PAH
Con el objeto de analizar otro de los mecanismos moleculares propuestos implicados en la respuesta a BH4 se estudió el efecto de una variación en los niveles intracelulares de la BH4 en el modelo celular Hep3B sobre la expresión del gen PAH.
En primer lugar tras cultivar las células Hep3B durante 24 y 48 horas en
presencia de los distintos compuestos descritos previamente para alterar los niveles de BH4 intracelular (DAHP, dicumarol y sepiapterina) se midió la actividad de la fenilalanina hidroxilasa endógena en el extracto celular. El ensayo enzimático se llevó a cabo preincubando entre 5‐20 μg de proteína total del extracto celular durante 5 minutos con L‐Phe (1mM) y disparando la reacción con BH4 75μM, el tiempo total de reacción fue de 30 minutos. Tabla 15: Actividad específica de la PAH del extracto celular de hepatoma control o cultivado en presencia de dicumarol, DAHP o sepiapterina.
Actividad PAH en extracto de hepatoma (nmol L‐Tyr/min.mg prot) Tiempo Control Dicumarol 100μM DAHP 10mM Sepiapterina 100μM 24 horas 0,16±0,09 0,03±0,01 ND 0,27±0,09 48 horas 0,16±0,09 0,011±0,01 0,52±0,18 0,65±0,09
Todos los datos son la media de al menos tres experimentos independientes por duplicado. ND: no determinado
Tanto a 24 como a 48 horas la actividad de la PAH del extracto celular de hepatoma cultivado con dicumarol disminuía drásticamente mientras que cultivado con sepiapterina aumentaba 2 y 4 veces respectivamente. Con el DAHP, a 48 horas, la actividad fue más de tres veces la del control (Tabla 15).
En paralelo a los estudios de actividad se llevaron a cabo experimentos
mediante Western Blot (Fig 13) con anticuerpos monoclonales antiPAH para medir la cantidad de proteína. Los resultados obtenidos mostraron un paralelismo con los obtenidos para la actividad, en el caso de extractos procedentes de cultivo en presencia de dicumarol la cantidad de proteína PAH disminuía drásticamente tanto a 24 como a 48 horas, siendo 6 veces menos que en el control a ambos tiempos. El extracto procedente del cultivo con sepiapterina alcanzaba hasta 4,5 veces más respecto al control a las 48 horas de tratamiento y para el cultivo con DAHP el aumento observado en el extracto, a 48 horas, era de casi tres veces.
.
58
Figura 13: Análisis por Western Blot de la proteína PAH normal del extracto de cultivo control, cultivo en presencia de dicumarol 100 μM y cultivo en presencia de sepiapterina 100 μM a las 24 horas.
De manera análoga a los experimentos realizados con la proteína FLAG‐PAHwt se midió la vida media de la proteína PAH endógena del hepatoma en las distintas condiciones. Se cultivó el hepatoma humano en presencia de sepiapterina 100 μM, en presencia de DAHP 10 mM y en condiciones control y se paró la síntesis proteica a las 48 horas con puromicina a una concentración final de 10 μg/ml. La proteína recogida a tiempo 0, 4, 8 y 10 horas tras la parada de la traducción se sometió a Western Blot y los datos resultantes se analizaron para determinar la vida media de la proteína (Tabla 16 y Figura 14)
Tabla 16: Datos de vida media (t1/2) de la proteína PAH en el extracto control, con sepiapterina 100 μM y con DAHP 10 mM.
t1/2(horas) Control DAHP 10mM Sepiapterina 100µM
9,4 10 26
Figura 14: Representación semilogarítmica de la degradación de la PAH de las células Hep3B en función del tiempo. Todos los puntos de la gráfica son la media de dos experimentos independientes.
Los resultados obtenidos permiten afirmar que la presencia de mayores
cantidades de tetrahidrobiopterina en cultivo celular hepático humano lleva a una
Hep 3B Hígado Control Dicumarol 100 μM Sepiapterina 100μM
PAH
Proteína PAH
10
100
0 2 4 6 8 10 12
Tiempo (horas)
+ sepiapterina 100 μM
control
+ DAHP 10 mM
% PAH residual
59
mayor estabilidad de la proteína PAH endógena, sin embargo el cultivo en presencia del inhibidor DAHP no altera la vida media de la PAH.
Aunque la superior estabilidad de la enzima por aumento de la concentración
de BH4 ya nos permitiría justificar la mayor actividad obtenida en los experimentos, comprobamos si también había una aportación al efecto observado por un aumento de la transcripción del gen PAH o por un aumento en la estabilidad del mensajero.
Para el análisis del posible efecto de la BH4 sobre los niveles del mRNA se utilizó como método experimental la qRT‐PCR a partir del RNA de las células obtenidas tras cultivo de Hep3B control o en presencia de dicumarol 100 μM, de sepiapterina 100 μM o de DAHP 10 mM. Una vez obtenido el RNA total, se utilizaron entre 500‐1000 ng del mismo para llevar a cabo una qRT‐PCR a tiempo real con sondas Taq man específicas para el cDNA de la PAH. Para la cuantificación de la PCR se utilizaron como estándares internos dos genes con expresión constitutiva, el gen de la gliceraldehido fosfato deshidrogenasa (GAPDH) y el gen del rRNA 18S. Tabla 17: Cantidad relativa del mRNA de la PAH en células Hep3B cultivadas durante 48 horas con sepiapterina 100 μM, dicumarol 100 μM y DAHP 10 mM.
Todos los datos son la media de tres experimentos independientes por triplicado En los resultados obtenidos observamos que no existe diferencia entre la
expresión del gen PAH en hepatoma control y en hepatoma cultivado en presencia de sepiapterina 100 μM o DAHP 10 mM durante 48 horas. Por el contrario las cantidades de mRNA de la PAH en hepatoma cultivado en presencia de dicumarol 100 μM eran significativamente inferiores (30%) (Tabla 17).
La estabilidad del mRNA de la PAH en las distintas condiciones se realizó tras el cultivo del hepatoma, durante 48 horas, con dicumarol o con sepiapterina (siempre con un hepatoma control de referencia) y parada de la transcripción con actinomicina (10 μg/ml). El mRNA se analizó a tiempos 0, 4, 6, 8 y 10 horas tras parada de la transcripción mediante PCR a tiempo real con sondas Taq Man y posterior tratamiento matemático de los datos. El resultado obtenido (datos no mostrados) fue que no existe una estabilización del mRNA de la PAH cuando el
% mRNA Control 100 DAHP 97±12
Dicumarol 32±14 Sepiapterina 84±28
60
hepatoma se cultiva en presencia de sepiapterina mientras que con el dicumarol la estabilidad con respecto al control es significativamente menor.
Por último se analizó el efecto de la BH4 sobre la expresión del gen reporter (luciferasa) clonado bajo regiones reguladoras de la PAH, para ello se clonó en el vector pGL3 un fragmento de 500 pares de bases de la región promotora del gen PAH más la región 5´UTR (pGL3PrUTRPAH). Este vector se cotransfectó en células Hep3B junto al vector pCMV PRCβ‐galalactosidasa (para normalizar la transfección), se cultivó durante 48 horas en presencia o ausencia de sepiapterina 100 μM y se midió en los extractos celulares la actividad luciferasa y la actividad β‐galactosidasa. Los resultados obtenidos muestran que no existe un aumento de la actividad luciferasa cuando se cultivan las células en presencia de niveles elevados de BH4 (Fig 15)
Actividad luc/b-gal
-1
1
3
5
7
9
B-gal B-gal + pGL3 B-gal +pGL3PrUTRPAH
Act
ivid
ad lu
c /B
-gal
Uni
dade
s ar
bitr
aria
s en
mill
ones
- sepiapterina+ sepiapterina
Figura 15: Actividad luciferasa normalizada con actividad ß‐galactosidasa en extracto celular de hepatoma cotransfectado el plásmido pCMVPRC‐β‐galactosidasa y el plásmido pGL3 o el pGL3PrUTRPAH en presencia o ausencia de sepiapterina 100μM. Todos los datos son la media de dos experimentos independientes por duplicado.
61
4.2 BASES MOLECULARES DE LA RESPUESTA A COBALAMINA (VIT B12) EN ACIDEMIA METILMALÓNICA AISLADA
Aproximadamente un 40% de los pacientes del grupo de complementación cblB (defecto en el gen MMAB) manifiestan un efecto positivo in vivo en respuesta a suplementación con cobalamina (en forma de OH‐Cbl) (Matsui et al. 1983). Este porcentaje es similar cuando se llevan a cabo estudios in vitro mediante suplementación con OH‐Cbl en fibroblastos de pacientes y medida de la incorporación de propionato.
En estudios previos en el laboratorio se han descrito varios pacientes que pertenecen al grupo cblB con respuesta in vitro a OHcobalamina, entre ellos se encuentra el paciente con el genotipo (I96T y P173fs (c.584G>A)) en el gen MMAB (datos del laboratorio) El cambio nucleótidico c584G>A se encuentra en el último nucleótido del exón siete afectando al splicing, como consecuencia se genera o un mRNA sin el exón siete o si existe splicing correcto, con el exón siete pero con la mutación R195H (datos del laboratorio).
4.2.1 EXPRESIÓN DE PROTEÍNAS MUTANTES IMPLICADAS EN RESPUESTA IN VITRO A B12; Análisis cinéticos
Para poder entender cuales son los mecanismos moleculares que determinan la respuesta in vivo e in vitro (datos del laboratorio) en acidemia metilmalónica aislada tipo cblB se llevaron a cabo análisis cinéticos y estructurales de la ATP:cob(I)alamina adenosiltransferasa humana (hATR) normal y con las mutaciones puntuales (I96T y R195H) mediante expresión en un sistema procariota. Estos estudios se realizaron en el laboratorio de la doctora Ruma Banerjee (Centro Redox de Biología, Departamento de Bioquímica, Universidad de Nebraska, Lincoln, Nebraska,USA).
La hATR es un trímero constituido por 3 monómeros cada uno de ellos organizado en 5 hélices α y dos laminas ß (Schubert and Hill 2006). La mutación I96T se encuentra localizada en la hélice α1 (Fig 16). Esta estructura secundaria es muy importante ya que el sitio de unión a ATP se forma entre las hélices α1, α2 de un monómero y el loop α3 ‐α4 y las hélices α4, α5 del monómero adyacente. La unión de ATP a su sitio activo produce un cambio conformacional en el trímero que contribuye a la formación del sitio de unión a cobalamina. Una de las hipótesis de partida es que el cambio de la isoleucina por la treonina en el aminoácido 96 podría producir un alteración en el sitio de unión a ATP y disminuir la afinidad de la hATR por este sustrato, esto podría producir a su vez una alteración en el cambio conformacional de la proteína para formar el sitio de unión a cobalamina y por lo tanto también podría verse alterada la afinidad por este sustrato. Otra hipótesis es
62
que este cambio nucleotídico I96T puede afectar a la estructura final del trímero produciendo una menor estabilidad del mismo.
Figura 16: Visualización parcial de la estructura cristalizada de la ATR humana. La figura muestra uno de los monómeros (amarillo) con sus cinco hélices α. El aminoácido I96 (en gris) se encuentra en la hélice α1 y el ATP en el espacio entre dos de los monómeros (amarillo y azul) de la proteína,
La mutación R195H se encuentra localizada en la hélice α4 (Fig. 17). Esta
estructura secundaria junto con la hélice α1 están implicadas en la interacción entre los tres monómeros y formación del oligómero. Existen dos pares arginina glutámico (Glu84/Arg195 y Glu91/Arg191) esenciales en la formación del trímero.
Figura 17: Visualización de la estructura trimérica cristalizada de la ATR humana. La figura muestra los tres monómeros (amarillo, verde y azul) con sus cinco hélices α. El aminoácido R195 (morado) se encuentra en la hélice α4 en el espacio de interacción entre los tres monómeros.
I96
ATP
hélice α 4
R195hélice α 1
63
Con objeto de determinar las características cinéticas y estructurales de las hATR I96T y R195H que nos permitirían determinar la base molecular de la respuesta a cobalamina, se expresaron las proteínas normal y mutantes en la cepa bacteriana BL21 StarTM (DE3) One Shot Cell (Invitrogen) utilizando el vector pET 41a con el cDNA de la ATR humana clonado por la Dra Ruma Banerjee. Las dos mutaciones I96T y R195H se introdujeron mediante mutagénesis dirigida.
Tras la inducción con IPTG las proteínas normal y mutantes se purificaron
secuencialmente mediante precipitación con sulfato de amonio seguida de cromatografía de intercambio aniónico mediante columna de sefarosa Q y finalmente cromatografía de exclusión molecular utilizando una columna de hidroxiapatita. La purificación obtenida para I96T fue de más del 95% después de la primera cromatografía y casi del 99% tras la segunda. (Fig 18). Para R195H tras la primera cromatografía (con columna de sefarosa Q) se obtuvo una purificación del 95% (dato no mostrado) que fue suficiente para llevar a cabo el resto de los ensayos a partir de las fracciones de esta cromatografía.
Figura 18: Electroforesis SDS PAGE de los extractos y fracciones de los diferentes pasos de purificación de la proteína hATR I96T. a) Extracto celular inducido a 25ºC con 1mM de IPTG (1) y sin inducir (2), b) Fracciones conteniendo la proteína hATR I96T tras cromatografía de intercambio aniónico con columna de sefarosa Q (carriles 2, 3 y 4). El carril 1 corresponde a la hATR wt purificada, c) Fracciones conteniendo la proteína hATR I96T tras cromatografía de exclusión molecular con columna hidroxiapatita (carriles 1, 2, 3 y 4).
Las fracciones de las proteínas purificadas en los distintos pasos cromatográficos se concentraron para obtener una solución con una cantidad mínima de proteína de 1mg/ml que fue utilizada para ensayos enzimáticos y análisis estructurales.
La medida de actividad para la proteína hART normal y las dos mutantes se
realizó siguiendo el protocolo descrito en métodos y los resultados se muestran en la Tabla 18 y en la Figura 19 se muestra un experimento representativo. Los datos obtenidos muestran que la proteína R195H tiene la misma actividad que la wt mientras que la I96T alcanza el 60% de la actividad salvaje.
1 2 3 4
hATR hATR hATR
1 2 1 2 3 4 Kda 36 27
18
a) c) b)
64
Tabla 18: Actividad específica para las proteínas hATR wt, I96T y R195H.
Todos los datos son la media de dos experimentos independientes por triplicado.
1.5
1.0
0.5
0.0
543210 Figura 19: Experimento representativo de la actividad de la proteína hATR I96T como medida de la disminución en la absorbancia a 388 nm con respecto al tiempo debido a la formación de AdoCbl desde cob(I)alamina. La cantidad de proteína utilizada en el ensayo fue de 10 μl a una concentración 11 μg/μl. 1‐Adición de 10 μL de ácido Ti(III)citrato. 2‐ Adición de 10μL de proteína hATR I96T.
La caracterización cinética de las proteínas mutantes se completó con la realización de ensayos que nos permitieron calcular las Kds para Cob(II)alamina y diversos análogos y la Km y Vmax por ATP (Tablas 19 y 20).
Tanto las Kd para la Cob(II)alamina como para los análogos no mostraron diferencias significativas, excepto para la CNCbl, con los descritos para la wt en ninguna de las dos mutaciones. La Km por ATP para la proteína hATR I96T muestra que no existe alteración en la afinidad por el ATP para la proteína mutante I96T aunque si se observa una disminución de un 30% en la Vmax.
Tabla 19: Km y Vmax para ATP para la proteína hATR wt y I96T. Km (μM) Vmax (nmol min–1 mg–1) Wt 6,2 ± 1,3 170 ± 9 I96T 7,8 ± 1.9 125 ± 8
1
2
Tiempo (minutos)
Absorbancia
65
Tabla 20: Constante de disociación para la Cob(II)alamina y para los diversos análogos para la proteína wt, I96T y R195H. Wt I96T R195H Kd (μM) Kd (μM) Kd (μM) AdoCbla 1,7 ± 0,4 2,58 ± 0,62 ND OHCblb 8,5 ± 1,1 7,8 ±1,55 11,38 ± 2,4 CNCblb 7,8 ± 0,5 13,28 ± 0,28 14,16 ± 4,7 Cob(II)alaminaa 3,6± 1,6 1,37± 0,33 ND a Los datos son la media de dos experimentos independientes por duplicado. b Los datos son la media de un experimento por triplicado.
Por último analizamos el efecto de los cambios nucleotídicos en la distribución oligomérica de la proteína. Para el caso de la proteína con la mutación R195H era especialmente interesante este estudio ya que el aminoácido mutado se encuentra implicado directamente en la formación del trímero. Mediante cromatografía en gel a 4 ºC en condiciones nativas y obtención del peso molecular por comparación con patrones se determinó el estado de oligomerización de las tres proteínas observándose que la wt se presentaba como un trímero y la I96T mayoritariamente también, aunque una pequeña proporción de la proteína aparecía como monómero. El estado de oligomerización de la proteína R195H correspondía mayoritariamente a la mezcla de trímeros y monómeros (Fig 20).
Figura 20: Perfil de elusión de las proteínas I96T y R195H tras cromatografía en gel. El estado de oligomerización se dedujo a partir de la obtención del peso molecular por comparación con los patrones.
44 KDa.
Trímero + monómero
R195H
Trímero hATR (72KDa.)
I96T
Monómero hATR (24 KDa.)
I96T
670 KDa. 158 KDa. 17 KDa.
1,35 KDa.
Trímero hATR (72KDa.)
I96T
66
4.3 BASES MOLECULARES DE LA RESPUESTA A BIOTINA EN ACIDEMIA PROPIÓNICA Y METILCROTONILGLICINURIA.
Los estudios desde hace 36 años han presentado evidencias que indican la implicación de la biotina en el control de la expresión génica en animales de laboratorio y células en cultivo. La lista de proteínas cuya expresión es afectada por la biotina incluye enzimas implicadas en el metabolismo de la glucosa, enzimas asociadas a la homeostasis de la biotina, transportadores de vitaminas, factores de transcripción, citokinas y sus receptores y oncogenes (Baur et al. 2002; De La Vega and Stockert 2000; Pacheco‐Alvarez et al. 2002).
Con objeto de esclarecer el posible efecto de la biotina sobre la expresión génica de carboxilasas dependientes de biotina, acerca de lo cual no hay consenso en la literatura, y que permitiría sentar las bases para una posible terapia de suplementación con esta vitamina, nos centramos en el estudio de dos enzimas, PCC y MCC, cuyo defecto causa acidemia propiónica y metilcrotonilglicinuria, respectivamente. Para analizar el posible efecto de una suplementación con biotina sobre la expresión de PCC y MCC utilizamos dos modelos celulares, hepatoma (Hep3B) y linfoblastos (MCR), que cultivamos durante periodos largos de tiempo (14‐16 días) en presencia de diferentes niveles de biotina.
Para alterar los niveles de la biotina se prepararon medios de cultivo con un 10% de tres sueros comerciales diferentes con concentraciones de biotina ya definidas en la literatura; FBS (biotina 100‐200 nM), NBCS (biotina <1nM ) y FBS dializado (biotina <1nM) (Collins et al. 1988; Suormala et al. 2002). La concentración de biotina en suero humano en condiciones fisiológicas es de 2,5 nM (Mock et al. 1995) por lo que cuando el suero utilizado era FBS dializado o suero NBCS la concentración final de biotina en el medio era de 0,1 nM correspondiendo a una situación de deficiencia en biotina y cuando el suero utilizado era el FBS los niveles finales de biotina en el medio eran de 10‐20 nM correspondiendo a una situación farmacológica.
En primer lugar comprobamos si existía algún efecto de las variaciones de biotina sobre las actividades enzimáticas PCC y MCC, para ello llevamos a cabo estudios cinéticos con células de hepatoma cultivadas en presencia de concentraciones deficientes (0,1nM) y farmacológicas (10nM) de biotina.
67
0
25
50
75
100
125
150
175
% a
ctiv
idad
car
boxi
lasa
[Biotina] 14 dias 10 nM 0.1 nMa a
Actividad carboxilasa
Actividad MCC
Actividad PCC
Figura 21: Actividad relativa PCC y MCC en extracto celular tras cultivo de hepatoma con distintas concentraciones de biotina durante 14 días. Los datos son la media de al menos dos experimentos independientes por duplicado
Mediante estos estudios, se observa que para ambas enzimas hay una mayor
actividad al cultivar el hepatoma en presencia de niveles farmacológicos. Este aumento fue de 4 veces más para la propionil‐CoA carboxilasa y de 6 veces más para la metilcrotonil‐CoA carboxilasa (Fig.21) respecto a la actividad obtenida en cultivo con niveles deficientes de biotina.
Las diferencias en las actividades no eran debidas a la utilización de sueros diferentes sino a la diferencia de concentración de biotina entre ellos, este resultado se obtuvo al medir las actividades carboxilasas en células de hepatoma cultivado en presencia del suero NBCS (con niveles de 0,1 nM) durante 14 dias y hepatoma cultivado en las mismas condiciones y suplementado con biotina 10 μM durante 24 horas. El aumento de actividad al adicionar la biotina es igual al obtenido cultivando las células con suero FBS.
El aumento de actividad podría deberese a un aumento paralelo de la
cantidad de proteína unida a biotina (forma activa de las enzimas). Para comprobar esta hipótesis se realizó el estudio en las células de hepatoma en presencia de los dos niveles de biotina y se utilizó la técnica de transferencia y detección de proteínas mediante marcaje con avidina conjugada a fosfatasa alcalina a partir de 25‐100 μg de proteínas de fracciones mitocondriales de las células. Se observó un aumento en ambas proteínas cuando los niveles de biotina en el cultivo eran farmacológicas. Como ocurría con la actividad, las variaciones en las cantidades de proteína eran más marcadas para la subunidad alfa de la metilcrotonil‐CoA carboxilasa (6 veces más) que para la subunidad alfa de la propionil‐CoA carboxilasa (2 veces más) (Fig. 22)
68
Figura 22: Experimento representativo de la detección de las proteínas biotiniladas (subunidades α de PCC y de MCC) en extractos mitocondriales de células Hep3B cultivadas en presencia de diferentes concentraciones de biotina en el medio. PC: Piruvato carboxilasa.
Cuando aumentamos más la cantidad de biotina alcanzando niveles de 10 μM
en el medio de cultivo no se observa un aumento en la cantidad de proteína biotinilada ni para MCCA ni para PCCA en comparación con niveles 10 nM (datos no mostrados).
Para el análisis del posible efecto de la biotina sobre los niveles de mRNA se utilizó como método experimental la qRT‐PCR a partir de RNA de las células cultivadas en presencia de ambos niveles de biotina. Una vez obtenido el RNA total, se utilizaron entre 500‐1000 ng del mismo para llevar a cabo qRT‐PCR a tiempo real con sondas específicas (sondas Universal Probe Library o sonda TaqMan) de mRNA de PCCA y MCCA. Para normalizar los datos se utilizó como estándar interno el gen de expresión constitutiva rRNA 18S.
También se cuantificaron en las mismas condiciones otros dos genes
relacionados con la biotina: MCCB (gen de la subunidad no biotinilada de la metilcrotonil‐Coa carboxilasa) y HLCS (gen de la holocarboxilasa sintetasa) (Fig. 23).
Los resultados obtenidos permiten afirmar que el aumento en los niveles de
biotina no produce variación en la cantidad de los mRNA de ninguno de los genes estudiados, descartando así un efecto de la biotina sobre la transcripción y sobre la estabilidad de dichos mRNAs.
PC
MCCAPCCA
10 nM 0.1 nM[Biotina]
69
Figura 23: Cantidad relativa de mRNA PCCA, MCCA, MCCB y HLCS en hepatoma cultivado con distintas concentraciones de biotina. Para PCCA y MCCA los datos son la media de al menos dos experimentos independientes por triplicado, para MCCB y HLCS los datos son la media de un experimento por triplicado.
Está descrito en la literatura que el efecto de la biotina sobre la expresión génica de las enzimas difiere según el tipo celular, por ello utilizamos otro modelo celular, la línea celular de linfoblastos (MCR) para estudiar los niveles de mRNA PCCA y MCCA asociado a distintas concentraciones de biotina. El tiempo de cultivo fue de 14 días y los sueros utilizados fueron FBS para niveles 10 nM y suero FBS dializado para niveles 0,1 nM. Los resultados obtenidos en linfoblastos fueron iguales que los obtenidos en hepatoma e indican que la cantidad de mRNA PCCA y MCCA es independiente de los niveles de biotina (Fig. 24).
Figura 24: Cantidad relativa de mRNA PCCA, MCCA en linfoblasto cultivados con distintas concentraciones de biotina. Todos los datos son la media de un experimento por triplicado.
El aumento de la traducción de los mensajeros PCCA y MCCA también
podría explicar la elevación en las cantidades y actividades de las enzimas estudiadas. Para comprobar si los niveles elevados de biotina producían algún efecto sobre la traducción o sobre la estabilidad de las carboxilasas se cultivaron células de hepatoma en presencia de niveles deficientes (0,1 nM) de biotina durante 14 ‐16 días y se añadió entonces biotina 10 μM durante 30 min. u 8 horas. De forma paralela se
020406080
100120
% mRNA
PCCA MCCA
10 nM0.1 nM
0
50
100
150
200
250
PCCA MCCA MCCB HLCS
10 nM
0.1 nM
0
50
100
150
200
250
PCCA MCCA MCCB HLCS
10 nM
0.1 nM
0
50
100
150
200
250
PCCA MCCA MCCB HLCS
10 nM
0.1 nM
% mRNA
70
añadió biotina 10 μM simultáneamente con puromicina 10 μg/ml (inhibidor de la traducción) durante 8 horas. Se midió la actividad en las diferentes condiciones.
Se observa que la recuperación de la actividad es prácticamente igual en
presencia y ausencia de puromicina, por lo que podemos descartar un efecto significativo de la biotina sobre la traducción (Fig. 25). También se observa que la actividad PCC alcanza la mitad de los niveles control a los 30 minutos de cultivo en presencia de 10μM de biotina y recupera totalmente los niveles de actividad a las 8 horas. Para la actividad MCC la recuperación era total a las 8 horas mientras que a los 30 minutos era de un 25%.
0
25
50
75
100
125
150
175
Figura 25: Porcentaje de actividad PCC y MCC en extracto celular tras cultivo de hepatoma con distintas concentraciones de biotina y puromicina en el medio, considerando 100% la actividad obtenida cultivando a 10nM de biotina durante 14 días. Los datos son la media de al menos dos experimentos independientes por duplicado. a Datos de un experimento por duplicado.
10 nM 0.1 nM0.1 nM 0.1 nM 10 μM biotin+ + ‐ ‐
‐ ‐ ‐ + 10 μg/ml puromicina
0.1 nM+ ‐
30 min 8 horas 8 horas
a [Biotina] 14 días
% Actividad carboxilasa Actividad PCC
Actividad MCC
71
4.4 TERAPIAS MODULADORAS DE MUTACIONES DE SPLICING EN ACIDEMIA PROPIÓNICA
Una fracción significativa de mutaciones causantes de EMH afectan al proceso de splicing, estas mutaciones han sido encontradas tanto en los sitios canónicos de splicing como en regiones reguladoras intrónicas o exónicas (Cartegni et al. 2002). Las dos consecuencias más comunes de las mutaciones de splicing son el skipping exónico (eliminación de un exón que no se incluye en el mRNA maduro) y la activación de sitios crípticos cuya consecuencia es la inclusión de secuencias aberrantes o la eliminación de secuencias codificantes.
El conocimiento de las consecuencias que cada mutación produce en
términos de su mecanismo de acción a nivel de DNA y mRNA ha abierto nuevas y prometedoras vías terapéuticas genéticas en estas alteraciones del splicing. La modulación del splicing, mediante sobreexpresión de factores de splicing, uso de drogas (butirato sódico, kinetina, valproico, aclarubicina, benzamidas etc…)(Andreassi et al. 2001; Hims et al. 2007; Nissim‐Rafinia et al. 2004) uso de oligonucleótidos antisentido (Takeshima et al. 2006) etc. permitirá modificar los transcritos incorrectamente procesados y por lo tanto alterar la expresión fenotípica.
4.4.1 ANÁLISIS DEL EFECTO DE DROGAS SOBRE MUTACIONES DE SPLICING QUE PRODUCEN NIVELES DETECTABLES DE TRANSCRITOS NORMALES
Ocasionalmente mutaciones de splicing pueden resultar en niveles detectables de mRNAs correctamente procesados generando ciertos niveles de proteína normal, tales mutaciones por lo tanto producen a partir del mismo alelo transcritos mutantes y normales, los niveles de ambos transcritos varían dependiendo de la mutación, el tejido y el individuo, pero en todos los casos existe una correlación entre la severidad fenotípica y los niveles de transcrito aberrante. Se ha demostrado en diversos trabajos que la sobreexpresión de factores de splicing y diversas drogas incrementan los niveles de mRNA correctamente procesado(Nissim‐Rafinia et al. 2004).
En el presente estudio se han seleccionado tres pacientes diagnosticados de acidemia propiónica y que genéticamente presentaban en homocigosis mutaciones que alteraban el splicing generando mayoritariamente transcritos aberrantes (con perdida de un exón) pero que presentaban ciertos niveles de mRNA procesado correctamente (Tabla 21) para evaluar el efecto de diversas drogas sobre el patrón de splicing.
72
Tabla 21 : Mutaciones y efectos sobre el mRNA de los tres pacientes analizados. Gen /Paciente Mutación Efecto en el mRNA % Transcritos normales
PCCA/17475 IVS22nt‐2A>G Skipping exón 23 6‐16%(Clavero et al. 2004)
PCCA/20743 IVS13nt+3A>G Skipping exón 13 2‐3 %(Desviat et al. 2006)
PCCA/19802 IVS13nt+3A>G Skipping exón 13 2‐3 %(Desviat et al. 2006)
La presencia de transcritos normales en estos pacientes abría la posibilidad de utilizar compuestos como el valproico, el butirato sódico y la kinetina cuyo efecto sobre la restauración del splicing normal había sido descrito en otros trabajos. Para analizar este posible efecto se cultivaron fibroblastos de los tres pacientes en presencia de valproico o butirato sódico a una concentración final de 500 μM durante 24 horas o con kinetina 100 μM durante 72 horas, después se recogió el precipitado celular mediante centrifugación y posteriormente se cuantificó el mRNA correctamente procesado llevando a cabo una qRT‐PCR utilizando sondas específicas para los exones delecionados que nos permitían rescatar sólo los transcritos normales. No se observó variación significativa en los niveles de mRNA correctamente procesado para las tres líneas de fibroblastos con ninguno de los compuestos utilizados. Para el paciente 17475 se llevaron a cabo además experimentos de medida de actividad PCC y tampoco se observó un aumento en presencia de los diversos compuestos (Fig 26)
0
20
40
60
80
100
120
16440(control)
17475 17475Valproíco500μM 24 horas
17475NaBu
500μM 24 horas
17475Kinetina100μM 72 horas
Figura 26: Porcentaje de mRNA con el exón 23 y actividad de fibroblastos control y del paciente 17475 tras cultivo en presencia de diversos compuestos. Los datos son la media de al menos dos experimentos independientes por duplicado.
RNA Actividad
Cantidad relativa (%)
73
4.4.2 ANÁLISIS DEL EFECTO DE OLIGONUCLEÓTIDOS ANTISENTIDO SOBRE LA INCLUSIÓN ABERRANTE DE PSEUDOEXONES.
Los pacientes 22742 y 23660 fueron diagnosticados de acidemia propiónica en base a sus niveles de metabolitos marcadores en sangre y orina y ensayos enzimáticos en fibroblastos y fueron referidos al laboratorio para su estudio genético.
En el cDNA del paciente 22742 se observó una inserción entre los exones 14 y
15 de 84 pares de bases correspondientes a una región del intrón 14 del gen PCCA. Esta secuencia intrónica ya había sido descrita (Campeau et al. 1999) como transcrito minoritario en individuos normales, pero en el paciente el transcrito con la inserción era prácticamente exclusivo. Los análisis en el gDNA del paciente 22742 revelaron el cambio nucleotídico IVS14‐1416A>G en el interior de las 84 pb. El análisis mediante programas de predicción de secuencias auxiliares de splicing, en concreto el uso de ESEfinder ha identificado que este cambio nucleotídico en el paciente PCCA elimina un sitio de unión para SRp55 y crea una nueva secuencia de unión a SRp40 (Fig. 27), por lo tanto este cambio generaría una secuencia reconocida con gran afinidad por la maquinaria de splicing que llevaría a cabo la inclusión en el mRNA maduro de las 84 pb como si fueran un exón (pseudoexón).
Figura 27: Análisis in silico con el programa ESEfinder del pseudoexón para PCCA en cuyo interior se encuentra la base que aparece mutada en el paciente (rosa). Se muestran el cambio en el patrón de unión a los factores de splicing Srp55 y Srp40 dependiendo si la base es la A ( nucleótido wt) o la G (nucleótido mutante)
De manera análoga, para el paciente 23660 se identificó una inserción en el cDNA de PCCB de 72 pares de bases entre los exones 6 y 7 correspondientes a una región del intrón 6. El cambio nucleotídico encontrado en gDNA es IVS6+462A>G, este cambio se encuentra en la posición +5 relativa al GT de la secuencia insertada incrementando el sitio 5´críptico donador de splicing aumentando el score de 0,93 a 1
SF2/ASF
ag//…………TGAATTTCATA/GGAACATCAGTTT…………..//gt
SC35 SRp40 SRp55
A G
74
aumentando la afinidad de la secuencia consenso de reconocimiento de U1snRNA (Fig. 28). Análisis adicionales in silico utilizando el ESEfinder predicen la creación de un sitio para SRp55. Como ocurre para el paciente 22742 parece probable que ese cambio genere un reconocimiento por parte de la maquinaria de splicing de una región en el intrón 6 que se introducirá en el mRNA maduro como un exón generando un mensajero aberrante cuya traducción queda interrumpida de manera prematura.
Figura 28: Alineamiento entre la secuencia consenso para U1snRNA y la región donadora de splicing del pseudoexón, se observa que el cambio de una A por una G en el nucleótido + 5 (en rojo) del pseudoexón aumenta la complementariedad entre ambas secuencias.
A partir de estos datos previos, nos planteamos como hipótesis que la eliminación de estas inserciones produciría la recuperación del mRNA normal, la obtención de proteína normal y como consecuencia la recuperación de la actividad.
Para la eliminación del pseudoexón se utilizaron oligonucleótidos antisentido
tipo morfolinos (diseñados, sintetizados y purificados por la casa comercial Gene Tools) que se unirían a la región 3´ ó 5´ del pseudoexón e impedirían su reconocimiento por parte de la maquinaria de splicing y su inclusión en el mRNA final (Fig 29).
c.1209ins84 (IVS14-1416A>G)
Exon 14 ag
10.92
0.92
Exon 15ag gt
0.98
A >G
gt
Exon 14 Exon 1584 bp
a)
c.654ins72 (IVS6+462A>G)
A >G
Exon 6 ag
0.98
Exon 7ag gt
0.93
Exon 6 Exon 7
gt
0.87
72 bp
b)
1
Figura 29: Esquema de la incorporación a) del fragmento de 84 pares de bases en el mRNA de PCCA entre los exones 14 y 15 y b) del fragmento de 72 pares de bases en el mRNA de PCCB entre los exones 6 y 7. En verde se muestra el cambio nucleotídico presente en cada paciente y en azul el oligo antisentido que se une a la región 5´ o 3´del pseudoexón. También se indica encima de las diferentes secuencias el valor de splicing según (Shapiro et al 1987).
U1 snRNA UCCAUUCAUA
Paciente PCCB AGGTACATAT
G
75
El cultivo de los fibroblastos de los dos pacientes en presencia de los oligonucleótidos antisentido (AON) en las condiciones que se describen en materiales y métodos permitió la recuperación total del transcrito normal (sin la inserción) tanto a las 48 horas como a las 72 horas de tratamiento con el AON tanto a 10μM como a 20 μM (Fig. 30). La identidad de las bandas se comprobó mediante secuenciación.
Exon 14 Exon 15
Exon 14 Exon 15
Exon 14 Exon 15
Exon 14 Exon 15
1 2 3 4Exon 6 Exon 7
Exon 6 Exon 7
1 2 3 4Exon 6 Exon 7
Exon 6 Exon 7
Figura 30: RT‐PCR a partir de mRNA obtenido de fibroblastos control y de los pacientes 22742 y 23660 sin transfectar o 72 horas tras la transfección con 10 μM ó 20 μM de AON. a) carril 1: fibroblastos control, carril 2: 22742, carril 3: 22742 + 10 μM AON, carril 4: 22742 + 20 μM AON. b) carril 1: fibroblastos control, carril 2: 23660, carril 3: 23660 + 10 μM AON, carril 4: 23660 + 20 μM AON
Por otra parte se llevo a cabo la medida de la actividad PCC en los fibroblastos de los pacientes transfectados con los AONs, para comprobar si 72 horas tras la transfección la recuperación del transcrito normal era paralela a una recuperación de la actividad. Los resultados indican que la actividad se recupera totalmente alcanzando niveles control en ambas líneas celulares (Fig. 31).
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
0 0 10 20 0 10 20
Act
ivid
ad P
CC
(pm
ol/m
in/m
g)
22742 23660 Línea celularControl
[ AONs ] µM
Figura 31: Medida de la actividad carboxilasa en fibroblastos control y de los pacientes 22742 y 23660 72 horas tras la transfección con distintas concentraciones de AONs. Todos los datos son la media de tres experimentos independientes por duplicado.
1 2 3 4
a) b)
76
Asimismo, en el caso del defecto en el gen PCCA, analizamos la cantidad de proteína PCCA biotinilada en los fibroblastos del paciente 22742 transfectados o no con 20 μM de AONs durante 72 horas, observándose que en presencia de AONs se recupera la proteína PCCA (Fig 32).
Figura 32: Detección de las proteínas biotiniladas PCCA y MCCA en extractos celulares de fibroblastos del paciente 22742 sin transfectar con AON o 72 horas tras la transfección con 20µM del AONs. Se utilizaron mitrocondrias de hepatoma como control.
Para comprobar que el efecto de los oligonucleótidos antisentido sobre los fibroblastos de los pacientes era específico de secuencia se hicieron una serie de experimentos utilizando diferentes AONs y diferentes líneas celulares. En primer lugar se cultivaron los fibroblastos del paciente 22742 con un oligo antisentido específico de otro gen diferente a PCCA y se midió la actividad en el extracto celular tras transfección durante 72 horas con 20 μM de este AON, el resultado obtenido fue que la línea celular 22742 no presentaba aumento de actividad con respecto al cultivo sin transfectar, lo mismo ocurría para la línea celular 23660, cuando se transfectaba durante 72 horas con 20 μM de un AON no específico para el gen PCCB.
La secuencia intrónica que se incorpora en el mRNA de PCCA del
paciente 22742 ya había sido descrita (Campeau et al. 1999) como transcrito minoritario en individuos normales y también es detectada en pacientes con mutaciones de frameshift o mutaciones nonsense que producen mRNA con un codón de parada prematuro (PTC). Se eligió un paciente (21398) con una mutación nonsense en homocigosis y que presentaba la inserción para comprobar si la eliminación de la inserción utilizando el AONs revertía el fenotipo deficiente. El resultado fue que no se recuperó la actividad en este paciente, siendo por lo tanto el efecto observado para el AONs, específico de la mutación del paciente 22742.
Hep 3B - AON
MCCA PCCA
20 µM AON
77
5. DISCUSIÓN
78
5.1 RESPUESTA A COFACTORES EN EMH 5.1.1 Respuesta a tetrahidrobiopterina en fenilcetonuria.
El genotipado de pacientes PKU sometidos a sobrecarga con BH4 intenta establecer las relaciones entre el fenotipo y el genotipo de los fenilcetonúricos que responden a BH4 para intentar predecir en base al genotipo que pacientes, a priori, son susceptibles de ser respondedores. La expresión y caracterización de las mutaciones asociadas a respuesta a BH4 intenta esclarecer cuales con los mecanismos moleculares subyacentes a la respuesta.
Un alto porcentaje de los pacientes del presente trabajo con una respuesta favorable al test de sobrecarga presentaban fenotipos suaves (HFAs y PKU leves). Actualmente se cree que el número de pacientes que se pueden beneficiar de este tratamiento podría representar el 60‐80 % PKU leves o moderados y un 40% de la población total PKU (Blau and Erlandsen 2004; Zurfluh et al. 2008).
En general la diversidad alélica en los pacientes que responden es grande y
casi el 90% de ellos son compuestos heterocigotos, por lo tanto es importante el estudio de los genotipos asociados a respuesta en cada población para determinar su prevalencia.
La mayoría de las variantes alélicas missense que portaban los pacientes que
respondían (Tabla10) habían sido previamente descritas en pacientes respondedores, excepto la R176L, S87R, P275R y L348V. De estas cuatro mutaciones las dos primeras se encontraban presentes en pacientes hemicigotos (en combinación con una mutación funcionalmente nula) permitiendo determinar su relación directa con la respuesta a BH4, las otras dos mutaciones aparecen combinadas en un paciente y se desconoce cual de las dos o si la combinación de ambas es responsable del efecto positivo frente a BH4, ya que L348V aparece junto a Y414C en un PKU leve que responde pero también en un paciente que presenta una mutación de splicing y que es no respondedor.
Otras dos mutaciones interesantes son D415N y E390G, que han sido previamente descritas como posiblemente asociadas a respuesta pero que en este estudio se encontraban combinadas en algún paciente con mutaciones nulas por lo que se demuestra su implicación directa en la respuesta.
Todas las mutaciones missense asociadas a respuesta en este trabajo (excepto P275R) han sido analizadas cinéticamente en diversos trabajos y presentan actividad residual (Pey et al. 2003), de ellas el 70% se localizan en el dominio catalítico, el 15%
79
en el dominio regulador y el otro 15% en la región de tetramerización, coincidiendo esta distribución con la descrita en otros estudios (Zurfluh et al. 2008)
La única mutación no missense que está asociada a respuesta es IVS10‐3ntC>T, esta aparece en homocigosis en un paciente HFA (19548) que presenta una respuesta lenta. Esta mutación produce un skipping del exón 11 en el mRNA. Los estudios de splicing en este trabajo (Fig. 12) y en otros anteriores (Jaruzelska et al. 1995) han demostrado que existen transcritos normales, y por lo tanto proteína normal, lo cual explicaría el fenotipo suave del paciente. Este caso es el primero en el que se asocia una mutación de splicing a una respuesta a BH4 (recientemente se ha descrito otra mutaciones de splicing (IVS4 ‐5C>G) que ha sido asociada claramente a respuesta a BH4 (Zurfluh et al. 2008)). La estabilización, al actuar la BH4 como chaperona química, de los niveles reducidos de proteína PAH normal en este paciente, produciría un aumento en la cantidad y actividad PAH y justificaría la respuesta. Esta hipótesis se correlaciona con resultados en hepatoma que se discuten en el siguiente apartado. Otra hipótesis que explicaría la respuesta en este paciente sería que los niveles elevados de BH4 produjeran la activación de la transcripción del mRNA de la PAH o la activación de factores de splicing que aumentarían el porcentaje de transcrito correctamente procesado con el exón 11.
En este trabajo ciertas mutaciones (I65T, R261Q, L348V,) aparecen tanto en individuos que responden como en aquellos que no y se han descrito en otros trabajos inconsistencias en la respuesta en pacientes con el mismo genotipo, particularmente en pacientes que portan las mutaciones L48S, I65T, R158Q, R261Q e Y414C (Desviat et al. 2004; Fiori et al. 2005; Leuzzi et al. 2006; Yildirim et al. 2007) esto hace que todavía sea desconocida, para algunas mutaciones, cual es su implicación en la respuesta, desconociéndose por el momento hasta que punto la combinación de distintas mutaciones y las características fisiológicas de cada individuo determinan la respuesta. A pesar del número de trabajos realizados y del elevado número de pacientes descritos con una repuesta positiva, la diversidad en los protocolos utilizados no permite comparar todos los casos de forma cuantitativa.
La presencia de algunas mutaciones de forma persistente (I65T aparece en 4 de los 11 respondedores de este trabajo y D129G aparece en 3 pacientes descritos en varios trabajos (Baldellou et al. 2006; Hennermann et al. 2005) y la existencia de individuos homocigotos (IVS10‐3 C>T) o hemicigotos (D415N, E390G...) que responden, permite pensar que determinadas mutaciones o combinados genotípicos están asociados directamente a la respuesta.
Los casos reportados de monoterapia con BH4 a largo plazo parecen prometedores ya que algunos pacientes mantienen en su sangre niveles de fenilalanina dentro de los rangos terapéuticos (Belanger‐Quintana et al. 2005; Cerone et al. 2004; Hennermann et al. 2005; Lambruschini et al. 2005; Trefz et al. 2005) por lo
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que esta terapia se muestra como una alternativa real a la dieta y hace muy interesante la posibilidad de poder predecir en muchos casos ,en base al genotipo, qué individuos fenilcetonúricos tienen altas probabilidades de beneficiarse del tratamiento oral con BH4. Recientemente se ha descrito la eficacia del tratamiento con una forma sintética biológicamente activa de la BH4, la dihidroclorido sapropterina (comercialmente llamado KuvanTM) y que se encuentra en fase clínica III(Burton et al. 2007; Levy et al. 2007)
Con el objetivo de entender los mecanismos que subyacen a la respuesta positiva a BH4 se han llevado a cabo diversos estudios de expresión para caracterizar cinética y estructuralmente la PAH normal y varias proteínas mutantes presentes en pacientes que responden.
Por estudios estructurales previos se conoce que las mutaciones asociadas a
respuesta no sólo afectan a las regiones de unión al BH4 o a regiones próximas a esta zona sino que se encuentran distribuidas por los tres dominios de la PAH por lo se han propuesto varias hipótesis para explicar el efecto de la BH4 sobre la PAH:1) efecto catalítico (compensación de Km elevadas), 2) efecto estabilizador sobre la proteína (chaperona química), 3) efecto sobre la expresión génica de la PAH, aumentando la transcripción o estabilizando el mRNA , 4) efecto por compensación de concentraciones subsaturantes de cofactor en hígado y 5) efecto protector de la BH4 frente a la inactivación Mediante el análisis cinético llevado a cabo en cinco proteínas mutantes (D129G,
H170D, V190D, E390G, P407S) como proteínas de fusión a MBP, se ha observado que cuatro de las cinco presentan defectos en alguna de las propiedades catalíticas y/o reguladoras, con pérdida de función, pero manteniendo actividad residual.
La Km por BH4 sólo está elevada en la proteína mutante D129G, por lo que
para las otras cuatro variantes analizadas cinéticamente en este trabajo, la hipótesis catalítica no es la que subyace a la respuesta positiva. Respecto a la mutante D129G analizando la estructura de la proteína PAH se observa que el Asp 129 se encuentra localizado en el dominio catalítico y forma un puente de hidrógeno con la Ala132 y con la Arg 234. El cambio del aspártico 129 por una glicina altera las interacciones con estos dos aminoácidos produciendo una desestabilización de la parte inicial de la región catalítica, este cambio estructural podría propagarse al centro activo pudiendo afectar a la afinidad por BH4 y resultando en un incremento de la Km (Fig. 33).
Se han identificado más mutantes de Km en estudios previos en el laboratorio (F39L, I65T, P244L, L308F y A309V), pero además de representar un número reducido dentro de las mutaciones asociadas a respuesta, los incrementos de Km detectados en ellas son leves, por lo que se piensa que este no es el mecanismo más
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importante implicado en la respuesta. Se ha descrito que en PKU solo un tercio de las proteínas mutantes asociadas a respuesta a BH4 presentan una afinidad reducida por este cofactor (Pérez et al. 2005).
Figura 33: Visualización parcial de la estructura cristalizada de la PAH humana. La figura muestra la Asp129 (verde), los aminoácidos con los que interaccionan, la Arg 243 y la Ala132. Se muestra la BH4 (rojo) localizada en el sitio activo.
Para analizar el efecto de la BH4 sobre la estabilidad de las proteínas mutantes se han analizado once proteínas mutantes (F39L, R68S, E178G, V190A, A300S, A309V, A313T, A373T, V388M, E390G, Y414C) en el sistema de expresión TNT libre de células, la mayoría de ellas tienen vidas medias disminuidas en ausencia de BH4 y con respecto a la salvaje, confirmándose un defecto estructural que originaría una degradación acelerada. En tres de ellas (A309V, V388M y Y414C) este defecto es corregido al aumentar los niveles de BH4. Este resultado avala la hipótesis de que la BH4 ejerce un efecto protector sobre algunas mutaciones frente a la degradación proteolítica. En la PAH recombinante se ha demostrado que la unión a BH4 resulta en una reducción en la proteólisis por tripsina (Solstad and Flatmark 2000).
La utilización de un modelo celular de hepatoma para estudiar el efecto de distintos niveles de BH4 sobre la PAH endógena y sobre proteínas de fusión PAHwt y mutantes transfectadas permite estudiar la relación entre BH4 y la PAH en un entorno más fisiológico. Cuando el hepatoma se cultiva en presencia de niveles elevados de BH4 se observa una mayor cantidad de proteína y una mayor estabilidad de la PAH endógena, este efecto ha sido observado también utilizando como modelo el ratón wt y el ratón deficiente en el gen PTS (Scavelli et al. 2005; Thony et al. 2004). Este efecto estabilizador sobre la PAH endógena justifica la respuesta a BH4 que existe en el paciente 19548 (Tabla 10). Este paciente es homocigoto para la mutación de splicing IVS10nt‐3 C>T, este cambio nucleotídico altera el sitio aceptor de splicing del intrón 10 y como consecuencia se produce la eliminación del exón 11 en la maduración del mensajero aunque esto no ocurre en todos los transcritos, sino que se ha comprobado (Fig. 12) (Jaruzelska et al. 1995) que existen niveles reducidos de mRNA PAH normal. Esto haría que en el paciente se
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sintetizara una cantidad reducida de PAH normal que sería estabilizada por la sobrecarga a BH4, aumentando la cantidad relativa de la enzima y produciendo la respuesta.
Las tres proteínas expresadas como proteínas de fusión al péptido FLAG en
células Hep3B (A309V, V388M y Y414C) fueron seleccionadas por presentar una corrección en su defecto estructural en el sistema TNT en presencia de BH4. Cuando transfectamos estas proteínas mutantes en el sistema de hepatoma observamos que dos de las tres se acumulan en menor cantidad que la proteína wt, esto coincide con la menor cantidad de estas proteínas detectadas en el modelo TnT y como proteínas MBP‐PAH expresadas en E coli. También se observa que al cultivar el hepatoma con niveles elevados de BH4 las tres proteínas mutantes transfectadas aumentan su cantidad relativa entre 1,5 ‐ 2,5 veces alcanzando y superando en algunos casos los niveles de la proteína FLAG‐PAHwt, coincidiendo también con los resultados obtenidos en el modelo TNT.
Todos estos resultados obtenidos en diversos trabajos y con diversas metodologías permiten afirmar que el efecto estabilizador de la BH4 como chaperona química sobre la PAH previniendo su degradación es un mecanismo relevante en la respuesta.
Existen varios trabajos en la literatura sobre el efecto a nivel de regulación de la expresión génica de la BH4. Para la proteína oxido nítrico sintasa, de la que la BH4 es también cofactor, se ha descrito que un aumento en los niveles de BH4 producen un aumento en los niveles de mRNA de esta enzima (Linscheid et al. 1998; Saura et al. 1996) y para un ratón transgénico con defecto en la GTP ciclohidrolasa, se ha descrito un aumento de actividad, niveles de proteína y mRNA para la PAH en hígado tras administración oral de cofactor (Hyland and Munk‐Martin 2001).
En el presente estudio se analizó el posible efecto de la BH4 sobre transcripción y estabilidad del mRNA de la PAH en hepatoma. Para ello se midió el efecto de niveles elevados de BH4 sobre el mRNA PAH endógeno y sobre la expresión de genes reporter clonados bajo el promotor de la PAH. Los niveles elevados de BH4 no ejercen ningún efecto ni en la mayor expresión del gen PAH, ni en la mayor estabilidad del mRNA. Esto concuerda con otro estudio utilizando un modelo experimental de ratón con defecto en la ruta de biosíntesis del cofactor (en concreto el gen PTS) en el cual se observó que mientras la actividad y la cantidad de enzima disminuyen (al estar disminuidas las concentraciones de BH4) las cantidades de mRNA son similares para los ratones control que para los defectivos (ratón k.o. para PTPS)(Thony et al. 2004).
En los estudios con hepatoma se observa un efecto del dicumarol, este disminuye la cantidad de mRNA de la PAH. El hecho de que el dicumarol no sólo sea un inhibidor de la sepiapterina reductasa y por lo tanto de la biosíntesis de BH4,
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sino que también inhibe otros procesos celulares sugiere que la inestabilidad y disminución del mensajero de la PAH quizá no sea específico de la bajada del BH4 sino secundario a otros efectos del dicumarol, esto coincide con que al utilizar otro inhibidor de la vía de síntesis del cofactor (DAHP) no se observa disminución en los niveles de mRNA. De manera inesperada la inhibición de la enzima GTP ciclohidrolasa con DAHP produce un aumento en la cantidad y por lo tanto en la actividad de la PAH que podría explicarse por un posible efecto inespecífico del DAHP sobre la traducción que justificaría este resultado.
Existen otras hipótesis asociadas al efecto de la BH4 que han sido analizadas en otros estudios y que podrían contribuir a la respuesta, una de ellas se basa en que las concentraciones fisiológicas de BH4 en el hígado son subsaturantes, concentraciones inferiores a la Km por BH4 de la PAH, produciendo una actividad submáxima de la PAH. La sobrecarga con BH4 produciría un aumento en las concentraciones del cofactor en el hígado aumentando la actividad fenilalanina hidroxilasa (Kure et al. 2004).
También en trabajos previos en el laboratorio se ha postulado que la BH4 ejerce un efecto protector frente a la inactivación por un fenómeno de tipo oxidativo. Este efecto protector de la BH4 frente a la inactivación oxidativa puede deberse al cambio conformacional que el cofactor parece inducir sobre la proteína, que causa la oclusión del centro activo por una secuencia autorreguladora presente en el dominio N‐terminal, pudiendo proteger de este modo a los residuos esenciales para la catálisis. La BH4 también podría actuar directamente como antioxidante (Kohnen et al. 2001; Kuzkaya et al. 2003) ya sea libre en disolución o unido al centro activo de la PAH.
Los distintos datos existentes en la literatura y los obtenidos en este estudio permiten afirmar que aunque los mecanismos moleculares que subyacen a la respuesta positiva a BH4 todavía no han sido totalmente dilucidados, se confirma que posiblemente sea un efecto multifactorial y dependiente del tipo de mutación, apuntando a un efecto estabilizante de la BH4 que actuaría como chaperona química como mecanismo mayoritario.
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5.1.2 Respuesta a cobalamina en acidemia metilmalónica aislada Para conocer los mecanismos moleculares responsables de la respuesta a
cobalamina in vivo e in vitro que se ha descrito en diversos pacientes con acidemia metilmalónica aislada perteneciente al grupo de complementación cblB (mutante MMAB) se ha utilizado un sistema de expresión procariota para expresar y analizar cinética y estructuralmente la enzima codificada por el gen MMAB, la ATP:cob(I)alamina adenosiltransferasa humana (hATR) con varias mutaciones (I96T y R195H) asociadas a esta respuesta.
La primera mutación I96T es una mutación missense localizada en el exón 3 y
la segunda mutación aparece en el último nucleótido del exón 7 y afecta al correcto procesamiento del mRNA produciendo la deleción del exón 7 y como consecuencia una mutación de parada prematura p.S174fs. Existe la posibilidad de que haya transcritos con el exón 7 pero con la mutación R195H, aunque datos del laboratorio indican que dichos transcritos serán muy minoritarios por lo que la respuesta a cobalamina será responsabilidad fundamentalmente de las características cinéticas y conformacionales de la proteína mutante I96T.
La mutación I96T aparece en otro paciente con respuesta positiva in vitro a
cobalamina en combinación con la mutación R191W, localizada en la región de trimerización (Fig. 34) La mutación R191W ha sido expresada como proteína de fusión a GST y presenta una disminución de su afinidad por los sustratos ATP y cob(I)alamina (Zhang et al. 2006). Para este paciente la respuesta a cobalamina por lo tanto será debida a un efecto a varios niveles debido a las características cinéticas y estructurales tanto de la mutante R191W como de la mutante I96T.
Figura 34: Visualización parcial de la estructura trimérica cristalizada de la ATR humana. La figura muestra la región de interacción entre los tres monómeros con los pares implicados en trimerización Glu84(gris) /Arg195(azul oscuro) y Glu91(verde oscuro) / Arg191 (rosa) y los puentes de hidrógeno que establecen entre ellos en verde punteado. En azul claro se muestra la I96.
Mediante el análisis cinético se ha observado que la proteína con la mutación
I96T tiene un 60% de actividad con respecto a proteína la wt, pero esta disminución
I96
R191
R195
E91
E84
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de la actividad no es debida a una disminución de la afinidad por los sustratos ATP o Cob(II)alamina cuyas Km y Kd se ha comprobado que son normales. Esta menor actividad tampoco parece ser debida a una distribución oligomérica incorrecta ya que por cromatografía en gel se ha observado una composición mayoritariamente trimérica muy similar a la obtenida para la proteína salvaje por lo que es posible que la menor actividad de la proteína sea debida a una menor estabilidad de la misma.
El análisis cinético para la mutación R195H revela unos niveles de actividad
iguales a los de la proteína wt. Sin embargo la distribución de los oligómeros esta alterada apareciendo una proporción de monómeros mayor. Parece, por tanto una mutación estructural, este resultado sería coherente con la posición que ocupa el aminoácido alterado, la arginina 195. El aminoácido R195 es esencial en la región de trimerización junto con Glu 84, Glu 91 y Arg 191 (Fig 34), la alteración en cualquiera de estos aminoácidos podría alterar de forma significativa la formación y estabilidad del oligómero. La proteína ATR con la mutación R195H presenta una proporción de trímeros disminuida pero una actividad similar a la wt, este resultado podría deberse a que el ensayo de actividad se llevó a cabo inmediatamente después de la purificación de la proteína mientras que la cromatografía se realizó tras almacenar la proteína durante 48 horas a 4ºC.
Sería necesario llevar a cabo experimentos para calcular la vida media de las dos proteínas mutantes para poder determinar la existencia de un defecto estructural.
En el caso más probable de que la mayoría de los trímeros que forma la hATR en el paciente portaran la mutación I96T y teniendo en cuenta los resultados obtenidos en los estudio cinéticos y de estructura, la respuesta a cobalamina no es debida a una compensación por alteraciones en las constantes de afinidad por los sustratos sino que parece más probable que la hidroxicobalamina ejerza otros efectos entre los que estaría un efecto estabilizante. Sería necesario analizar el efecto de la cobalamina sobre la estabilidad de las proteínas mutantes de manera similar a como se ha hecho para PAH y BH4.
La ATR no sólo cataliza la transferencia de un grupo adenosilo desde el ATP
a la cobalamina para generar la adenosilcobalamina, sino que es la responsable de transferir esta AdoCbl a la enzima de la que es cofactor, la metilmalonil‐CoA mutasa (MCM), en este proceso está implicada además la proteína MMAA (que tiene actividad GTPasa) aunque todavía se desconoce que papel exacto ejerce en la transferencia (Banerjee 2006). Se postula que las tres proteínas interaccionarían por lo que mutaciones en cualquiera de las tres proteínas pueden alterar estas interacciones y producir como resultado un defecto en la actividad MCM. Sería interesante conocer como afectan las mutaciones de la proteína ATR en la interacción con las otras dos proteínas y si niveles elevados de cobalamina estabilizan esta unión.
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5.1.3 Respuesta a biotina en acidemia propiónica y en metilcrotonilglicinuria
En este estudio hemos utilizado dos líneas celulares, linfoblastos (MCR) y
hepatoma 3B (Hep3B), para determinar el efecto de diferentes niveles de biotina en el medio de cultivo de las células sobre la expresión de varios genes, entre ellos, los genes que codifican para la subunidad que une biotina en dos carboxilasas celulares (PCC y MCC), defectivas en acidemia propiónica y metilcrotonilglicinuria, respectivamente
No se han obtenido evidencias de que exista modulación a nivel
transcripcional por parte de la biotina de los genes MCCA y PCCA en estos dos tipos celulares. Estos datos coinciden con los resultados obtenidos en estudios con células Jurkat (Manthey et al. 2002; Rodriguez‐Melendez et al. 2001) y en células de rata de diversos tejidos (Rodriguez‐Melendez et al. 2001; Rodriguez‐Melendez et al. 1999) pero son contrarios a los obtenidos en HepG2 (Pacheco‐Alvarez et al. 2004; Solorzano‐Vargas et al. 2002) donde se muestra una regulación dependiente de biotina de los niveles de mRNA de las carboxilasas. También se observó que no existía efecto de la biotina sobre la transcripción del gen HLCS que codifica para la enzima holocarboxilasa sintetasa responsable de la biotinilización de la apocarboxilasas. Para este gen también ha sido documentado una regulación de la expresión génica por parte de la biotina (Solorzano‐Vargas et al. 2002). La diferencia de resultados en los distintos estudios puede ser atribuida a las diferencias en las técnicas experimentales utilizadas y/o a efectos de factores biológicos aun no identificados.
Aunque no existía un efecto de la biotina sobre la transcripción de ninguno de los genes más relevantes para las carboxilasas en nuestro modelo celular, esto no descartaba la posibilidad de un efecto a otros niveles. El estudio de los niveles de actividades carboxilasas y proteínas biotiniladas llevado a cabo en células Hep3B permitió observar que existía una correlación directa entre los niveles de biotina, las actividades PCC y MCC y la cantidad de proteína biotinilada, también se observó que la proteína MCC es más sensible a la disminución de los niveles de biotina que la PCC, este efecto coincide con otros trabajos (Suormala et al. 2002).
Los estudios de reactivación de las carboxilasas con biotina a distintos
tiempos y en presencia o ausencia de puromicina permitieron determinar que la síntesis de proteína no es requerida para la recuperación de la actividad. Sí parece que podría existir un cierto efecto estabilizador de la biotina ya que la recuperación de la actividad en ausencia de puromicina y añadiendo biotina 10 μM no es total a los 30 minutos (la PCC alcanza un 55% de actividad con respecto a la wt y la MCC tan solo recupera un 20% de actividad), aunque tras ocho horas ambas actividades alcanzan los niveles control. En cualquier caso no es descartable un cierto efecto
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estabilizante de la biotina sobre las carboxilasas aunque parece que el mecanismo mayoritariamente responsable de la reactivación es el paso de apocarboxilasa a holocarboxilasa.
In vivo la terapia con biotina produce respuesta positiva en pacientes con
deficiencia en los defectos de biotinidasa y en los defectos en HCS, en este último caso la base molecular mayoritariamente responsable de esta respuesta es la compensación en el defecto de afinidad (Km elevada) por biotina que existe en muchas de las proteínas HCS mutantes (Sakamoto et al. 1999; Suzuki et al. 1996)} aunque también han sido reportados casos en los que la respuesta esta asociada a mutaciones de splicing (Sakamoto et al. 2000; Santer et al. 2003), lo que indicaría que puede haber otros mecanismos implicados en al respuesta. Sin embargo en acidemia propiónica (AP) no ha sido reportado ningún caso de respuesta a biotina y en metilcrotonilglicinuria (MCG) sólo se ha descrito un paciente (Baumgartner et al. 2004).
Aunque por los estudios existentes hasta ahora no parece haber una respuesta
significativa, desde el punto de vista bioquímico, a la administración de biotina en pacientes con acidemia propiónica, se recomienda la administración de biotina continuada a dosis de 5‐10 mg/día, que podría ser útil para mantener la enzima con actividad residual plenamente activa en los momentos de stress metabólico, además son necesarios más estudios que permitan entender las diferencias en los resultados obtenidos en distintos tipos celulares y la no respuesta in vivo.
Los resultados hasta ahora indican que la respuesta a biotina en acidemia propiónica y metilcrotonilglicinuria es un evento poco común, por lo que no parece que pueda llegar a ser una terapia relevante en estas enfermedades.
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5.2 TERAPIAS MODULADORAS DE MUTACIONES DE SPLICING EN ACIDEMIA PROPIÓNICA 5.2.1 Efecto de drogas sobre mutaciones de splicing que producen niveles detectables de transcritos normales.
Se ha descrito que el uso de compuestos como valproico, butirato sódico y kinetina aumenta los niveles de transcritos correctamente procesados en genes con mutaciones de splicing responsables de algunas enfermedades como atrofia muscular espinal, fibrosis cística, disautonomía familiar (Andreassi et al. 2001; Hims et al. 2007; Nissim‐Rafinia et al. 2004).
El valproico y el butirato sódico son inhibidores de las histonas deacetilasas
(HDAC) y actúan como activadores transcripcionales de genes entre ellos genes que codifican para algunos factores de splicing como Htra2‐β1 y SC35 (Brichta et al. 2003; Chang et al. 2001), estos factores a su vez facilitan el correcto splicing del mRNA, esto ocurre para el caso del splicing del gen SMN2 asociado a atrofia muscular espinal (Britchta L et al 2003). La kinetina por su parte favorece el splicing correcto en la disautonomía familiar y se postula que influye en la activación o la localización celular de proteínas específicas de splicing (Hims et al; 2007). Debido a .que los factores de splicing aumentados mediante la utilización de los diversos compuestos son generales, su efecto podría ser efectivo para muchos genes con mutaciones que alteran el splicing pero que presentan ciertos niveles de transcrito normal, siendo interesante llevar a cabo experimentos en los diversos pacientes con enfermedades metabólicas hereditarias que cumplen estas características.
En los estudios realizados en este trabajo con pacientes que portaban mutaciones de splicing responsables de skiping exónico en PCCA no se ha observado este efecto positivo, no se ha incrementado el nivel de transcritos correctamente procesados. El splicing es regulado por la interacción de un complejo repertorio de factores de splicing con diferentes secuencias reguladoras por lo que serían necesarios estudios sobre que factores y en que nivel están implicados en el procesamiento del mRNA para el gen PCCA, de esta manera podríamos comprender porque no ocurre un efecto favorable de los compuestos utilizados.
Para algunos compuestos como la kinetina se ha demostrado que se requieren
determinados elementos en las proximidades de las secuencias canónicas de los exones diana (un elemento CAA cerca del extremo 5´ del exón) (Hims et al. 2007) que no están presentes en los exones del gen PCCA.
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Los niveles de transcrito normal PCCA en los pacientes estudiados eran aproximadamente entre un 5‐15 % mientras que en los estudios en la literatura el porcentaje de mRNA normal del gen correspondiente nunca es menor del 20%, quizá sea necesario un nivel mínimo de reconocimiento de la maquinaria de splicing sobre las secuencias mutantes para que pueda existir un efecto positivo significativo de las drogas en el proceso de splicing. 5.2.2 Efecto de la terapia con oligonucleótidos antisentido sobre mutaciones de splicing que producen inclusión de pseudoexones.
La modulación del splicing mediante el uso de oligonucleótidos antisentidos (AONs) ha sido usada en fibrosis cística y en la distrofia muscular de Duchene (Takeshima et al. 2006) para interferir el proceso de splicing y originar proteína funcional. La existencia de pacientes con acidemia propiónica cuyas características genéticas permitían postular una posibilidad de beneficio tras aplicación de esta terapia fue el motor que impulsó los ensayos realizados en el presente trabajo.
En los intrones existen secuencias correspondientes a sitios potenciales de splicing 3´y 5´de manera muy abundante, sin embargo, no se incluyen estas regiones como exones de manera frecuente en el mRNA maduro y esto es debido a que, a pesar de tener unos buenos valores de splicing, estas regiones presentan otros defectos importantes, además de un enriquecimiento de regiones silenciadoras (Buratti et al. 2006) que impiden su reconocimiento como exones verdaderos.
Estudios genéticos previos en el laboratorio en dos pacientes con acidemia propiónica permitieron observar que estos pacientes presentaban una inserción de una región intrónica (pseudoexones) en el mensajero maduro y un cambio nucleotídico en el gDNA en homocigosis. (Tabla 22). Tabla 22: Secuencia intrónica insertada y variaciones intrónicas genómicas.
Gen /Paciente Origen de la secuencia insertada
Cambio en el mRNA
Cambio en el gDNA
PCCA/22742 Intrón 14 r.1284ins84 A→G en el medio del pseudoexón
(IVS14‐1416A→G)
PCCB/23660 Intrón 6 r.654ins72 A→G en posición +5 del sitio 5´
donador del pseudoexón (IVS6+462 A→G)
Los estudios in silico de las regiones 3´y 5´de los pseudoexones incorporados en estos pacientes predicen scores de splicing elevados. Esto sugiere que tales secuencias deben ser incluidas en el mRNA maduro generando un mRNA con un
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codón de parada prematuro (PTC), que probablemente será diana del sistema NMD que lo degradará, el mensajero que no es degradado predeciblemente generará una proteína no funcional.
Para el caso del pseudoexón del gen PCCA (inserción de 84 pares de bases) la
inserción es detectada en células control en niveles muy bajos y en pacientes con mutaciones de frameshift o mutaciones nonsense que producen mRNA con PTC. Es posible que estos transcritos con la inserción de pseudoexones formen parte del mecanismo de control del splicing en el cual eventos alternativos de splicing pueden regular la expresión génica por inclusión de pseudoexones y activación de NMD, como se ha descrito para el gen de la tropomiosina (Grellscheid and Smith 2006). Para el caso del pseudoexón del gen PCCB la inserción no ha sido descrita ni en otros pacientes ni en individuos control por lo que es un evento específico del genotipo de este paciente.
La hipótesis en los dos pacientes es que el cambio nucleotídico en el gDNA
activa la inserción del pseudoexón. Para el caso de PCCA el cambio identificado se encuentra en medio del pseudoexón y es una A por una G. El análisis mediante programas de predicción de enhancers de splicing, en concreto el uso de ESEfinder ha mostrado que este cambio nucleótidico elimina un sitio de unión para SRp55 y crea una nueva secuencia de unión a SRp40. Serían necesarios estudios con RNAi contra el gen SRp40 para demostrar la implicación de este factor en el reconocimiento del pseudoexón promovido por la mutación.
Para el paciente 23660 la inserción en el cDNA de PCCB es de 72 pares de
bases entre los exones 6 y 7. El cambio nucleotídico en gDNA es IVS6+462A>G y se encuentra en la posición +5 relativa al gt de la secuencia insertada, incrementando el sitio 5´críptico donador de splicing aumentando el score de 0,93 a 1 y aumentando la afinidad de la secuencia consenso de reconocimiento de U1snRNA (Fig. 31). Análisis adicionales in silico utilizando el ESEfinder predicen la creación de un sitio para SRp55.
El uso de oligos antisentido tipo morfolinos en fibroblastos de estos pacientes PCCA y PCCB ha permitido recuperar la actividad normal, revirtiendo así el fenotipo mutante en ambos pacientes. La recuperación de la actividad al impedir la incorporación del pseudoexón en los mRNA, demuestra que estas inserciones son la causa de la enfermedad en estos pacientes
Cuando se llevó a cabo la RT‐PCR, tras el tratamiento con AONs, se observó
un 100% de transcritos normales, probablemente los transcritos aberrantes sean inestables debido a la presencia de PTC, por lo que el mRNA normal será amplificado de manera preferente. Aunque no se puede afirmar que en la población de células tratadas, solo exista mRNA correctamente procesado, la cantidad de este
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mRNA correctamente procesado es suficiente para corregir el defecto enzimático. La recuperación de la actividad permite deducir que el mRNA es procesado correctamente y traducido en proteínas activas, la detección de proteína biotinilada en el paciente PCCA tras el cultivo en presencia de AONs confirma esta teoría.
Los experimentos con oligonucleótidos diseñados contra otros genes no producen ningún efecto, por lo que el efecto de los AONs es específico de secuencia, además no se ha observado un efecto citotóxico de estos oligonucleótidos sobre ninguna de las líneas celulares utilizadas.
Tampoco existe un efecto de los oligonucleótidos antisentido diseñados
específicamente contra las inserciones en pacientes con las inserciones no activadas, este hecho junto a los experimentos llevados a cabo en el laboratorio con minigenes demuestran que los cambios nucleotídicos detectados en gDNA activan la exonización de las secuencias.
Una gran ventaja de estos oligonucleótidos antisentido tipo morfolinos es que
tienen una gran estabilidad, son muy resistentes a nucleasas y a la degradación por RNAsaH cuando forman híbridos con RNA.
Las mayores dificultades para la utilización in vivo de estos AONs es su
vehiculización para que puedan llegar a los tejidos de interés y la determinación de la dosis óptima que permita obtener de forma simultánea la recuperación de los transcritos de interés sin una toxicidad elevada. Otra desventaja de esta terapia es su elevada especificidad de mutación, son efectivas únicamente para un genotipo concreto, por lo que su aplicación es limitada.
Un ejemplo de utilización in vivo de este tipo de terapia es la distrofia
muscular de Duchene en la que los oligonucleótidos antisentido han sido utilizados en pacientes de forma intramuscular y se ha restaurado parcialmente la distrofina (Aartsma‐Rus et al. 2007). Todos estos datos sugieren que el uso terapéutico de oligonucleótidos antisentidos puede ser clínicamente prometedor para acidemias orgánicas.
En las enfermedades metabólicas hereditarias el porcentaje de variantes
alélicas identificadas, analizando los fragmentos exónicos que comprenden toda la región codificante más las regiones intrónicas adyacentes a cada exón, está entre el 95‐98 % de los alelos, para el 2‐5% restante se postula que las mutaciones podrían encontrarse en regiones promotoras, regiones de poliadenilación o podrían producir inserciones de pseudoexones que generarían un mRNA aberrante, que sería diana del sistema NMD siendo degradado de manera acelerada y no siendo detectado por los sistemas tradicionales de detección de mutación. En el caso de los pacientes descritos en este trabajo, al ser homocigotos, la detección de los transcritos con la
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inserción fue inmediata. Para otros casos, utilizando compuestos (emetina o puromicina) que inhiben este sistema NMD, se podrían rescatar transcritos con pseudoexones, por lo que potencialmente podría haber un mayor número de pacientes que los identificados actualmente que serían susceptibles de ser tratados con terapia antisentido.
Las terapias basadas en el RNA, dentro de las cuales se encuentra la terapia
con AONs presentan toda una serie de ventajas con respecto a las terapias convencionales de reemplazamiento génico ya que no presentan peligro de integración en el genoma huésped y permiten modificar la expresión génica sin alterar la regulación normal del gen a nivel de gDNA (Wood et al. 2007). Es esencial, para el conocimiento completo de los mecanismos moleculares de las enfermedades, no sólo identificar las mutaciones a nivel de gDNA sino también conocer que alteraciones a nivel de mRNA están asociadas a esas mutaciones, ya que se está comprobando que la modulación de este mRNA es una estrategia terapéutica eficiente y prometedora.
93
6. CONCLUSIONES
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1. La respuesta a BH4 en los pacientes fenilcetonúricos españoles se asocia
mayoritariamente a fenotipos leves o moderados siendo un fenómeno menos frecuente en aquellos fenotipos más severos.
2. En general se puede afirmar que aquellos pacientes con fenotipos suaves y
con mutaciones missense que mantienen una actividad residual presentan altas probabilidades de responder de forma favorable al tratamiento oral con BH4.
3. La base molecular de la respuesta a tetrahidrobiopterina en fenilcetonuria es
multifactorial y dependiente del tipo de mutación, apuntando a un efecto estabilizante, como chaperona química de la BH4, como mecanismo mayoritario y descartando un efecto de la BH4 sobre la expresión del gen PAH.
4. En algunos casos, la respuesta a cobalamina en acidemia metilmalónica por
defecto en la enzima ATR, puede deberse a un efecto estabilizante de la coenzima, ya que mutaciones asociadas a la respuesta no alteran la afinidad del enzima por sus sustratos, ATP y cobalamina.
5. La biotina no afecta a la expresión génica de dos carboxilasas celulares PCC y
MCC, en los modelos celulares de hepatoma (Hep3B) y linfoblastos (MCR), pero sí favorece su activación de apocarboxilasas a holocarboxilasas.
6. El uso de diversas drogas moduladoras de splicing no ha resultado una
terapia efectiva en fibroblastos de tres pacientes con acidemia propiónica que portan mutaciones de splicing con niveles detectables de mRNA correctamente procesado.
7. El uso de oligonucleótidos antisentido en fibroblastos de dos pacientes con
acidemia propiónica ha demostrado que las inserciones presentes en estos pacientes son la causa de la enfermedad y que la terapia antisentido es altamente efectiva para mutaciones que generan la inserción de pseudoexones.
8. Los estudios presentados en este trabajo sobre las bases moleculares
responsables del efecto de las diferentes variantes alélicas permiten aportar una base científica para la aplicación de terapias específicas de mutación.
95
7. BIBILIOGRAFÍA
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8. PUBLICACIONES
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Parte de este trabajo se encuentra descrito en las siguientes publicaciones: Aguado C, Perez B, Garcia MJ, Belanger‐Quintana A, Martinez‐Pardo M, Ugarte M,
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111
INTRODUCCIÓN................................................................................................................. 1 ENFERMEDADES METABÓLICAS HEREDITARIAS (EMH)................................... 2 RESPUESTA A COFACTORES EN EMH ........................................................................ 5 FENILCETONURIA Y RESPUESTA A TETRAHIDROBIOPTERINA (BH4) .......... 7 Estructura y función de la fenilalanina hidroxilasa ..................................................... 10 El cofactor tetrahidrobioterina.......................................................................................... 12 ACIDEMIA METILMALÓNICA AISLADA Y RESPUESTA A COBALAMINA.. 14 Estructura y función de la ATP:cob(I)alamina adenosiltransferasa (ATR).............. 15 ACIDEMIA PROPIÓNICA Y METILCROTONILGLICINURIA Y RESPUESTA A BIOTINA........................................................................................................................... 18
Estructura y función de la propionil‐coA carboxilasa y metilcrotonil‐coA carboxilasa ........................................................................................................................ 21
La coenzima biotina ............................................................................................................ 21 SPLICING Y ENFERMEDADES GENÉTICAS ............................................................. 24 OBJETIVOS.......................................................................................................................... 26 MATERIALES Y MÉTODOS............................................................................................ 28 MATERIALES...................................................................................................................... 29 Reactivos y aparatos............................................................................................................ 29 Material biológico ............................................................................................................... 30 Pacientes................................................................................................................................ 30 Líneas celulares establecidas ............................................................................................ 31 Cepas bacterianas ................................................................................................................ 31 Vectores plasmídicos .......................................................................................................... 31 MÉTODOS ........................................................................................................................... 31 Tratamiento de ácidos nucleicos ...................................................................................... 31 Electroforesis en geles con gradiente de desnaturalización (DGGE) ....................... 35 Expresión y purificación de proteínas en E. coli ........................................................... 35 Expresión y purificación de la proteína de fusión MBP‐PAH.................................... 35 Expresión y purificación de la proteína hATR.............................................................. 36 Cromatografía en gel .......................................................................................................... 38 Electroforesis, transferencia y detección de proteínas ................................................ 38 Electroforesis, transferencia e inmunodetección de la proteína
112
PAH ........................................................................................................................................ 38 Electroforesis, transferencia y detección de la proteína α‐PCC mediante marcaje con avidina conjugada a fosfatasa alcalina ................................................................ 39
Ensayos enzimáticos ........................................................................................................... 39 Actividad fenilalanina hidroxilasa .................................................................................. 39 Actividad ATP:cob(I)alamina adenosiltransferasa....................................................... 40 Actividad propionil‐CoA carboxilasa y metilcrotonil‐CoA carboxilasa ............................................................................................................................ 41 Síntesis in vitro y pulso caza de las proteínas PAH .................................................... 42 Cultivo celular...................................................................................................................... 43 Expresión transitoria en células eucariotas Hep3B....................................................... 43 Transfección de oligonucleótidos antisentido tipo morfolinos en fibroblastos..... 44 Medida de pterinas ............................................................................................................. 44 Soporte informático ............................................................................................................ 45 RESULTADOS..................................................................................................................... 46 BASES MOLECULARES DE LA RESPUESTA A BH4 EN FENILCETONURIA ... 47 Identificación de mutaciones asociadas a respuesta a BH4 en pacientes fenilcetonúricos españoles .............................................................................. 47 Expresión de proteínas PAH mutantes implicadas en la respuesta a BH4...................................................................................................................................... 50 Análisis cinéticos................................................................................................................. 51 Análisis del efecto del cofactor BH4 sobre la estabilidad de las proteínas PAH normal y mutantes........................................................................................................... 53
Efecto de la BH4 sobre la transcripción y traducción del gen PAH........................... 57 BASES MOLECULARES DE LA RESPUESTA A COBALAMINA (VIT B12) EN ACIDEMIA METILMALÓNICA AISLADA............................................................. 61
Expresión de proteínas mutantes implicadas en respuesta in vitro a B12; Análisis cinéticos ..................................................................................................... 61 BASES MOLECULARES DE LA RESPUESTA A BIOTINA EN ACIDEMIA PROPIÓNICA Y METILCROTONILGLICINURIA ................................................ 66
TERAPIAS MODULADORAS DE MUTACIONES DE SPLICING EN ACIDEMIA PROPIÓNICA........................................................................................... 71
Análisis del efecto de drogas sobre mutaciones de splicing que producen niveles detectables de transcritos normales........................................ 71 Análisis del efecto de oligonucleótidos antisentido sobre la inclusión aberrante de pseudoexones. ............................................................................ 73 DISCUSIÓN......................................................................................................................... 77
113
RESPUESTA COFACTORES Y COENZIMAS EN EMH............................................ 78 Respuesta a tetrahidrobioterina en fenilcetonuria ....................................................... 78
114
Respuesta a cobalamina en acidemia metilmalónica aislada ..................................... 84 Respuesta a biotina en acidemia propiónica y en metilcrotonilglicinuria ....................................................................................................... 85 TERAPIAS MODULADORAS DE MUTACIONES DE SPLICING EN ACIDEMIA PROPIÓNICA.................................................................................................................. 88
Efecto de la terapia con oligonucleótidos sobre mutaciones de splicing que producen inclusión de pseudoexones...................................................... 88 Efecto de drogas sobre mutaciones de splicing que producen niveles detectables de transcritos normales. .................................................................. 89 CONCLUSIONES ............................................................................................................... 93 BIBLIOGRAFÍA................................................................................................................... 96 PUBLICACIONES............................................................................................................. 109
115
(Aguado et al. 2007; Aguado et al. 2006; Desviat et al. 2004; Erlandsen et al. 2004; Pey et al. 2004; Ugarte et al. 2007)
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