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CRISPRi:ゲノムワイドCRISPR干渉による転写抑制スクリーニングCarlos le Sage & Benedict CS CrossHorizon Discovery, 8100 Cambridge Research Park, Waterbeach, Cambridge, CB25 9TL, United Kingdom
Horizon Discoveryは以前に強力なCRISPR-Cas9ノックアウトプラットフォームを開発し、tracrRNA配列に小さな重要な変更を加えることでスクリーニング品質の向上を実証しました(Cross et al, 2016)。ここでは、新しいオールインワンのヒト全ゲノムCRISPRiプラットフォームを紹介し、BRAF阻害剤であるベムラフェニブに対する耐性および感受性遺伝子の同定によってその有効性を実証します。転写を数桁レベルで負に制御する機能は新しい手法であり、ポジティブおよびネガティブ選択スクリーニング(dCas9は変異原性ではない)の両方で新規ヒットを同定する機会を研究者に提供します。
プラットフォーム設計CRISPRiスクリーニングのために、dCas9-KRAB融合遺伝子とU6プロモーター駆動のガイドRNAカセットを含むカスタムオールインワンレンチウイルスベクターシステムを作成しました。単一のレンチウイルスインサートからのdCas9-KRABとCRISPRの同時発現は、プール化機能ゲノミクススクリーニングに必要な非常に効率的なターゲティング戦略を提供します。パフォーマンスをさらに向上させるために、プール化CRISPR-Cas9ドロップアウトスクリーニングの堅牢性を向上させることが以前に実証されている、改変したtracrRNAを使用しました(Cross et al, 2016)。最後に、ローカルヌクレオソームから離れたゲノムDNAの場所に結合するガイドRNAのパフォーマンスが大幅に向上したことを実証したHorlbeckら(2016)による最新のガイドRNA設計に基づいて、ヒト全ゲノムガイドRNAライブラリーを構築しました。この第2世代のCRISPRiライブラリーには、遺伝子あたり5つのガイドRNAが含まれ、合計19,050の遺伝子をターゲットとしています。
CRISPRiスクリーニングプラットフォームの検証16日間のベムラフェニブ処理後、スクリーニング完了後のペレットを採取し、各ガイドRNAの相対量を次世代シーケンシングによって測定しました。その後、MAGeCKワークフロー(Li et al, 2014)の改変バージョンを備えたCRISPR-Cas9スクリーニング分析プラットフォームでNGSデータを実行することにより、ガイドRNAと遺伝子ヒットレベルのランキングを評価しました。発現抑制されたときに細胞集団から主要な必須遺伝子がドロップアウトすることをCRISPRiのQCの指標にしていますが、本検証では全体的に優れたQCパフォーマンスを観察しました。
次に、各遺伝子をターゲットとするそれぞれのガイドからの同化スコアを使用して、遺伝子レベルのヒット同定が行われました。最高ランクの遺伝子には、MED12、NF1、CUL3、TADA1、NF2、およびTADA2Bがあり、これらの遺伝子の喪失によりベムラフェニブに対する耐性が付与されることが知られています(Huang et al, 2012; Whittaker et al, 2013; Shalem et al, 2014)。さらに、メディエーター(MED15、MED16、MED23、MED24)またはSAGA(TAF5LおよびTAF6L)複合体に属するメンバーがさらに見つかります。
興味深いことに、スクリーニングはベムラフェニブ耐性因子を特定するために特別に設計されましたが、その抑制が化合物に対する感受性を増加させる遺伝子には、EGFRとITGB5が含まれていました。これは、CRISPRaテクノロジーによって、発現が増強されたときにベムラフェニブ耐性を助けると既に報告されている2つの遺伝子です(Konermann et al, 2015)。
ReferencesCross, B. C. S. et al., Sci. Rep. 2016; 6(31782) Davies et al., Nature. 2002 Jun 27;417(6892):949-54 Flaherty et al., N. Engl. J. Med. 2010 Aug 26;363(9):809-19 Horlbeck, M. A. et al., eLife. 2016; 5 Huang et al., Cell. 2012 Nov 21;151(5):937-50 Konermann, S. et al., Nature. 2015;517(7536):583-8 Li et al., Genome Biol. 2014;15(12):554 Shalem et al., Science. 2014 Jan 3;343(6166):84-7 Whittaker et al., Cancer Discov. 2013 Mar;3(3):350-62