et discipline ou spécialité Jury : Toulouse 3 Paul Sabatier (UT3 Paul Sabatier) Laborel-Préneron di 1er juillet 2015 des sécrétomes de Staphylococcus aureus et Staphylococcus epidermidis du microbiote cutané d'enfants atopiques sur la réponse immunitaire T CD4 BSB : Immunologie INSERM UMR 1043 / CNRS UMR 5282 / Université Toulouse 3 Jean-Philippe Lacour, rapporteur Pr. Jean-François Nicolas, rapporteur Dr. Julien Seneschal, rapporteur Pr. Franck Boralevi, examinateur Pr. Denis Hudrisier, examinateur Pr. Gérard Lina, examinateur Christian Davrinche
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et discipline ou spécialité
Jury :
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♠✏✑✚✑✏di 1er juillet 2015
✛✜✜✢✣✤ des sécrétomes de Staphylococcus aureus et Staphylococcus epidermidis
du microbiote cutané d'enfants atopiques sur la réponse immunitaire T CD4
✥✦ BSB : Immunologie
❈✧★✧✩ INSERM UMR 1043 / CNRS UMR 5282 / Université Toulouse 3
J✑✪ Jean-Philippe Lacour, rapporteur
Pr. Jean-François Nicolas, rapporteur
Dr. Julien Seneschal, rapporteur
Pr. Franck Boralevi, examinateur
Pr. Denis Hudrisier, examinateur
Pr. Gérard Lina, examinateur
❉✑✪ Christian Davrinche
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Table des matières Abstract ................................................................................................................................. 5
Atopic dermatitis (AD) is an inflammatory and pruritic skin disease frequently affecting children. Its prevalence is increasing in industrialized countries. Its complex pathophysiology involves a skin barrier dysfunction and/or genetic abnormalities leading to sensitivity to environmental allergens such as house dust mites. Interactions between the immune system and skin bacteria, pathogens and commensals, appeared to be important in the disease. To study the influence of skin microbiota in the CD4+ T cell response, we designed a cohort of young AD children sensitized to house dust mite allergens (Der p) and their counterparts (controls). Analysis of skin microbiota (MALDI-TOF), transcripts profiling and quantification of anti-Der p CD4+ T cells showed that the presence of S. aureus on inflamed skin of AD subjects was associated with high IgE levels, Th2/Th22 transcripts and peripheral Th2 anti-Der p response. Monocyte-derived dendritic cells (moDC) were exposed to secretomes produced by S. aureus and S. epidermidis strains isolated from patients and released IFN-γ
and IL-10 respectively. Proliferation of CD4+ T cells induced by allogeneic moDC exposed to S. aureus secretome was blunted by concurrent exposure of moDC to S. epidermidis secretome. Regulatory T cells (Treg) lost their activity against conventional CD4+ T cells under the direct effect of S. aureus secretome. Overall, these results allow us to think that S.
aureus is an important factor of the AD inflammation by inducing Th2 activation and silencing resident Treg. Commensals such as S. epidermidis could be used to counteract these effects by inducing IL-10 production by skin DC.
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Résumé
La dermatite atopique (DA) est une maladie inflammatoire et prurigineuse de la peau, très fréquente chez les enfants et dont la prévalence augmente dans les pays industrialisés. La physiopathologie complexe de cette maladie met en jeu un défaut de la barrière cutanée et/ou des défauts génétiques résultant en une hypersensibilité aux allergènes de l’environnement tels que ceux issus d’acariens. Récemment, des études sur les interactions
entre le système immunitaire et les bactéries commensales et pathogènes de la peau ont révélé leur importance dans cette maladie. Pour étudier le rôle du microbiote cutané dans la réponse T CD4+, des cohortes de jeunes enfants, atteints de DA et sensibilisés aux allergènes d’acariens (Der p) ou non DA (population contrôle), ont été recrutées. L’analyse
du microbiote (MALDI-TOF) et du profil transcriptomique cutanés, ainsi que la quantification des T CD4+ anti-Derp (ELISpot) ont montré que la présence de S. aureus sur la peau inflammatoire des sujets AD était associée à des taux élevés d’IgE, des transcrits
caractéristiques d’une orientation Th2/Th22 et à une réponse périphérique Th2. Des cellules dendritiques dérivées de monocytes (moDC) de donneurs sains produisent respectivement de l’IFN-γ et de l’IL-10 en présence de sécrétomes issus de souches de S. aureus et S.
epidermidis provenant de patients. La prolifération de lymphocytes T CD4+ stimulés avec des moDC allogéniques traitées avec le sécrétome de S. aureus est atténuée par le traitement simultané des moDC avec le sécrétome de S. epidermidis. Les sécrétomes de S. aureus sont capables d’inhiber directement l’activité suppressive de lymphocytes T régulateurs en l’absence de cellule présentatrice d’antigène. L’ensemble de nos résultats nous permet de
penser que S. aureus est un facteur pro-inflammatoire de la DA en exacerbant la prolifération de lymphocytes Th2 résidents et en inhibant la fonction des lymphocytes T régulateurs. Favoriser les effets anti-inflammatoires des bactéries commensales telles que S.
epidermidis liés à l’induction d’une sécrétion d’IL-10 par les cellules dendritiques de la peau pourrait bénéficier aux patients atteints de DA.
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Liste des abréviations
agr : accessory gene regulator
AIP : auto-inducing peptide
AMP : peptide antimicrobien
APC : cellule présentatrice d’antigène
AUC : aire sous la courbe
BCM : milieu conditionné bactérien
CCR : récepteur de chimiokine CC
CD : cluster de différenciation
CLA : antigène des lymphocytes cutanés
CLR : récepteur lectine de type C
CMH : complexe majeur d’histocompatibilité
CTLA4 : cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4
monocyte-derived dendritic cells (moDC) exposed for 24 hours to S. aureus (S.a, red), S. epidermidis
(S.e, blue) secretomes or medium (NT, black) or LPS (green) in (a) and corresponding secreted IFN-γ
and IL-10 (pg/ml) in (b). p*** <0.001, N=14 independent experiments. (B) Either moDC as indicated or
monocyte (day 0 of differentiation) as denoted by mo(S.e)DC and mo(S.a)DC were treated with (S.e)
and (S.a). (C) Cells as indicated were co-cultured with CFSE-labeled allogeneic naïve CD4+T cells for
5 days at 1:10 stimulator to T cell. The percentage of proliferating cells was determined by flow
cytometry. Mean+/-SEM, N=4, 1-way ANOVA p=0.0009.
moDC stimulated with S. epidermidis releases IL-10 that impairs their maturation and reduces
S. aureus effect
Stimulation of moDC with (S.e) in the presence of anti-IL-10 antibodies increased expression of CD86,
CD83 and HLA-DR (Figure 4Aa) and production of TNF-a (10 fold) and IL-6 (5 fold, not shown),
demonstrating that IL-10 exerts a strong anti-inflammatory effect. Addition of conditioned medium
prepared from (S.e)-treated moDC to allogeneic (S.a)-treated moDC down-regulated the expression of
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HLA-DR, CD86 and CD83 (Figure 4Ab), an observation consistent with amounts of IL-10 found in the
medium. Moreover, phenotypic changes observed in figure 4Aa,b are supported by the relative
amounts of IFN-g and IL-10 quantified in the matched cell culture medium (Figure 4Ac). To assess the
functional consequences of coexisting S. aureus and S. epidermidis secretome on T cell proliferation,
moDC were pulsed with mixtures of (S.e) and (S.a) at various ratios and co-cultured with CFSE-
labeled allogeneic CD4+T cells. Addition of increasing amounts of (S.e) to a given quantity of (S.a)
significantly decreased proliferation of T cells (Figure 4B) suggesting that commensals such as S.
epidermidis may have a prominent role in controlling inflammatory effects of cutaneous S. aureus.
Figure 4. MoDC stimulated with S. epidermidis secretome release IL-10 that impairs their
maturation and reduces the effect of S. aureus secretome. A. (a) activation profile (CD86, CD83,
HLA-DR) of moDC exposed to medium (NT), secretomes of S.aureus (S.a), S.epidermidis (S.e)
supplemented with anti-IL-10 or isotype (iso). (b) moDC incubated with (S.a) alone or supplemented
with conditioned medium (CM) from allogeneic moDC pulsed with (S.e), with anti-IL-10 or matched
isotype. (c) Secreted IFN-g and IL-10 (ng/ml) by moDC presented in (a) and (b). Similar results have
been obtained in 3 independent experiments. (B) moDC exposed to a mixture of (S.a) and (S.e) at
m.o.i of 10 and 20 as indicated and co-cultured with CFSE-labeled allogeneic CD4+T cells.
Proliferation of T cells was quantified by flow cytometry (%). p***<0.001 N=4.
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Exposure of Treg cells to S. aureus secretome impairs their suppressive activity
Treg cells play a key role in controlling skin inflammation and we may ask whether S. aureus
secretome could interfere with their function. To address this question
Foxp3+CD4+CD25+CD127dim/neg Treg were exposed to (S.a) or (S.e) for 24 hours and washed before
mixing with CFSE-labelled conventional CD4+T cell (Tconv). Figure 5 shows that (S.a) dramatically
reduced the suppressive activity of Treg at Tconv to Treg ratio of 1:1 and 2:1. At the opposite (S.e)
was able to improve Treg activity when compared to untreated cells as emphasized at 2:1 cell ratio.
Overall these data show that contrary to that of S. epidermidis, secretome of S. aureus has a direct
inhibitory effect on Treg cells.
Figure 5. S. aureus and S. epidermidis secretomes exert opposite effects on Treg suppressive
function. CFSE-labeled conventional CD4+T cells (Tconv) were cultured in the presence of beads
pre-loaded with anti-CD2, -CD3 and -CD28 and Foxp3+ regulatory CD4+T cells (Treg) pretreated for
24 hours with medium (NT), secretome of S. aureus (S.a) or S. epidermidis (S.e) at Tconv to Treg
ratio of 1:1 (A) and 2:1 (B). Proliferation was assessed by flow cytometry after 5 days and percent of
suppression was calculated as (1- proliferation of Tconv with Treg / proliferation of Tconv without Treg)
X100. p*<0.05, p**<0.01, N=5.
Discussion
Recent studies demonstrated that basis of genesis and pathophysiology of AD could be found at the
intersection of cutaneous microbiota and skin-associated immunity (6). Metagenomic analyses of
microbiome in healthy and atopic skin revealed dominance of the pathogenic bacteria S. aureus as a
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major contributor to pathology of AD (12). At the opposite, commensals such as S. epidermidis could
provide a protective skin signature through interactions with resident DC (18). A goal and challenge of
our study was to provide an overall picture of very young atopic children including composition of skin
microbiota and characterization of inflammation and immune response markers. Culturomic analysis
confirmed the presence of S. aureus exclusively in patients, a unique feature associated with high
levels of blood IgE. Nevertheless, most patients (68%) were not colonized by S. aureus at the time of
skin sampling and had low levels of IgE, suggesting that they could be in a post-flare status of the
disease, as previously described (12). Regarding skin bacterial diversity no significant differences
were observed between the two groups. A metagenomic analysis of inflammatory, xerotic and normal
areas is under investigation to complement the culturomic approach and will be the scope of another
manuscript. This study confirms previous works showing modulation of the best known markers for
barrier damages, inflammation and activated Th2/Th22, (19) and prevalence of IL-4-secreting T cells
of Th2 phenotype in AD patients (20). The absence of IL-12 secretion by moDC (not shown) under
stimulation with LPS, is in line with our previous observation made on monocytes (21). Altogether our
data confirm observations made by us and others regarding the prevalence of cutaneous S.aureus in
AD and the role of superantigens in proliferation and commitment of Th2 cells (22). Exotoxins secreted
by S. aureus take part in mechanisms of escape from the immune system to ensure survival and
spreading within tissues (23) and S. aureus d-toxin promoted IgE and IL-4 production as well as
inflammatory skin disease in a mouse model (24). Therefore we considered that the secretome of S.
aureus could play a crucial role in pathophysiology of AD and that monocytes and DC could be
primary targets exposed to these bacterial products because of their role in monitoring inflammatory
skin. We demonstrated that S. aureus secretome committed monocytes to differentiate in vitro into
semi-mature CD1anegDC. According to previous observations (25) we can suspect that these cells
have lost their ability to ingest bacteria, thus allowing S. aureus to escape host response. Interestingly,
it has been shown that interactions of resident Th2 cells with monocytes could drive their
differentiation into Th2-promoting DC, creating an amplification loop that could worsen the disease
(26). To mimic the effects of cutaneous commensal and pathogenic bacteria on skin CD4+T cells, we
exposed moDC to S. aureus and S. epidermidis secretome. We found that S. aureus promoted IFN-g
secretion by moDC but we can assume that IFN-g-producing Th1 cells could take part in this
amplification process since they have been identified in AD skin although at a lesser extent than
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Th2/Th22 (19). At the opposite, IL-10 secretion by DC exposed to S. epidermidis reflects the capacity
of skin commensals mutualism to counteract harmful effects of pathogens by decreasing production of
inflammatory cytokines, expression of co-stimulatory molecules and of MHCII-superantigen
complexes. Besides these commensal-mediated anti-inflammatory mechanisms, specific subsets of
skin Treg could control proliferation of inflammatory T cells (7, 27) including cytotoxic CD8+T cells that
might induce apoptosis of keratinocytes (28). Nevertheless, in psoriasis lesions these cells could
proliferate but are defective in their capacity to control inflammation (27). In AD skin similar defects
could take place in a cell contact-dependent pathway through the action of S. aureus toxins on
monocytes (29). In addition, stimulation of TLR2 on Treg has been shown to reduce their function (30).
Even though Treg isolated from peripheral blood may not accurately represent skin resident T cells we
may ask whether it could be effective as far as TLR expression is shared by several Treg subsets.
Functional and molecular characterization of mechanisms underlying the inhibitory effect of S. aureus
secretome on Treg suppressive activity are under investigation. Moreover the ability of S. epidermidis
secretome to enhance Treg activity and to potentially overcome the effect of S. aureus remains to be
further explored. Overall our observations highlight the major role played by the induction of IL-10
secretion by DC in inflamed skin of AD patients where resident Treg could be silenced (Figure S4).
Our findings provide additional arguments for topical therapeutic approaches against AD by supplying
suitable conditions to favor anti-inflammatory properties of skin commensals such as S. epidermidis,
as examplified in (31).
Acknowledgments. We thank the physicians who helped to recruit the patients and the nurses of the
out patients’ dermatology clinics in Bordeaux for their help. Fatima-Ezzahra L’faqihi is acknowledged
for technical advices in cytofluorometric analyses and Hélène Martin in cell culture. We thank M.Bes
and A.Tristan for their technical help and J.Theunis for the management of clinical records. This work
was supported by Pierre Fabre Dermo-cosmétique (Toulouse) and institutional grants from INSERM.
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Author contributions
E.L-P, P.B, F.B, P.L, A-M.S, D.R, C.C, C.D conceived the study and designed the research project.
E.L-P, P.B, P.L, F.F, M.S, Y.S, C.B, G.L performed experiments. F.B, F.M-P recruited the patients and
managed clinical records. E.L-P and CD wrote the manuscript.
Conflict of Interest
The authors state no conflict of interest.
99
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101
Supplemental Data
Supplementary Methods
Study participants and sample collection
This study was carried out from March 2012 to June 2013 in the Pediatric Dermatology Unit at the
children hospital in Bordeaux (France). The investigators are experienced dermatologists, who
recruited children from among the patients they usually followed up for enrolment in the study. This
study was conducted according to the principles of the Declaration of Helsinki and its subsequent
amendments, the guidelines for Good Clinical Practices (CPMP/ICH/135/95) and French regulations.
The protocol was approved by the Ethics Committee South-West and Overseas III in Bordeaux,
France (N°CPP 2011/102) and by the French Agency for the Safety of Health Products (AFSSAPS)
(Ref B111515-30). Patients were included after their parents or guardians had signed a written
informed consent form. Subjects included in this study involved a group of 22 children, aged from 12 to
36 months old (mean age = 22.86 months), suffering from AD according to the UK Working Party
criteria with a SCORAD index from 20 to 33, who were sensitized to D. pteronyssinus, as defined by
positive skin prick test response (wheal diameter > 3mm) or positive atopy patch test or previous
positive RAST and a second group of 17 age-matched healthy children (mean age = 24.94 months)
with no personal or familial history of AD in the first-degree relatives, no food allergy other than cow
milk allergy, no asthma and no skin disease related to a defect of skin barrier function and/or an
abnormality of skin microbiota and/or an inflammatory syndrome. For all the children included,
applications of topical corticosteroid, antiseptic, immunosuppressive, antifungal and antibiotic
treatments were not allowed within 7 days prior to inclusion. Systemic immunosuppressive,
immunomodulator, antifungal or antibiotics treatments were also forbidden within 15 days prior to
inclusion. The children were also not included if they had applied any skin care product or topical
treatment after the last toilet, the day before the inclusion visit except on the nappy area. Blood
samples were collected at time of skin sampling and IgE quantification was done by the Immunology
laboratory of Bordeaux CHU Pellegrin. Bacterial composition of skin was determined from swabs
sampling whose relevance for identification of skin bacterial populations had been demonstrated (1).
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Real Time RT-PCR analysis on skin scratching
Skin samples were taken by scratching the skin surface (5 times back and forth) with a sterile micro-
abrasive tool (Vitry, Paris, France). Cell aggregates were transferred from the tool to a microtube
containing 500 μL of RNAprotect Cell Reagent (QIAGEN, Courtaboeuf, France) and placed at -80°C.
Total RNA was isolated using the RNeasy mini QIAcube kit (QIAGEN, Courtaboeuf, France) according
to the manufacturer’s directions, including DNase I digestion. RNA was eluted in 30 μL of sterile,
RNase-free water. Ten μL of RNA was reverse transcribed to single-stranded cDNA by the High
Capacity cDNA kit (Life Technologies, Saint Aubin, France), using random hexamer, in a final volume
of 20 μL according to the manufacturer’s instructions. Amplification of skin samples was performed as
described in (2).
Results are expressed as fold change 2(-deltadeltaCt), where deltaCt corresponds to the Ct of target
gene minus the Ct of endogenous control (RLPL0) and deltadeltaCt correspond to deltaCt of the
sample minus the deltaCt of the calibrator (healthy children).
Primers and probes used were designed by Life Technologies: HBD3-Hs00218678_m1, HBD2-
assay® (Cambrex-BioWhittaker, Walkersville, USA) showed that the endotoxin content of the
recombinant SE solutions was less than 0.005 units/ml. Superantigenic activities of toxins were
assessed by measuring CD69 surface expression by T cells.
Generation and culture of cells
Monocytes and monocyte-derived dendritic cells (moDC)
Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were isolated from buffy coats (blood donors from EFS,
Toulouse) or from patients/controls blood by Ficoll separation (PAA). Monocytes were isolated from
PBMC with the use of CD14 microbeads and a magnetic bead separation system (Miltenyi).
Monocytes were maintained for 5 days in RPMI medium supplemented with 10% FCS, 1% penicillin-
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streptomycin, 20 ng/ml recombinant GM-CSF (Miltenyi) and 50 ng/ml IL-13 (donated by Sanofi-
Aventis). On day 5, non-adherent monocytes-derived dendritic cells (moDC) were recovered and
stimulated for 24 hours with either S. aureus and S. epidermidis BCM at a multiplicity of infection
(MOI) of 20 or 5% (v/v), unless otherwise stated, or purified toxins at 100 ng/ml, LPS at 100 ng/ml,
with or without anti-IL-10 antibody or matched isotype (eBioscience, 16-7108 and 16-4301) at 10
μg/ml. In experiments with highly purified cells, moDC were generated as described, stained on day 5
with anti CD1a PE antibody and sorted by flow cytometry (Cell sorter FACS ARIA-SORP).
Alternatively, monocytes were stimulated on day 0, supplemented with GM-CSF and IL-13, maintained
for 5 days in differentiation medium and then treated/used as described above for moDC. Cells were
stained and submitted to flow cytometry analysis on a FACSCalibur cytometer (BD Biosciences) as
detailed in the Flow cytometry analysis section.
T cell ELISpot assays
For ELISpot assays, monocytes and autologous CD4+ T cells were isolated from patients/controls
blood within 24h after sampling. CD4+ T cells were kept at -80°C in FCS 10%DMSO over the course
of moDC generation. On day 5, moDC were harvested, washed and stimulated with either crude
extracts of D. pteronyssinus (Der p) at 500 ng/ml (LTN-DPE-4, Indoor Biotechnologies), or
recombinant allergen Der p1 at 100 ng/ml (RP-DP1D-1, Indoor Biotechnologies). Alternatively purified
S. aureus enterotoxin SEB was used at 100 ng/ml. T cells and autologous moDC were co-cultured for
20 hours in ELISpot plates (Diaclone) coated with anti-IFN-γ or -IL-4 capture antibodies. After cell
removal by washing, biotinylated detection antibodies, enzyme-conjugated streptavidin and substrate
are successively added according to manufacturer’s instructions. Plates were read using the C.T.L.
analyzer and the Immunospot software. Results were expressed as numbers of spots per 106 T cells.
Statistical Analysis
Statistical analysis were performed using SASÒ software, release 9.3. All quantitative variables were
expressed as sample size, mean, standard deviation (SD), median and range values. Intergroup
comparison of clinical and gene expression were performed with Student’s t-test, Mann-Whitney’s test
or Wilcoxon’s test, depending on the normality of distributions as specified in the tables. Correlations
between clinical parameters and qPCR-quantified genes with a differential expression fold change
105
(FC) >2 and a correlation coefficient >│0.6│ (i.e. meaning a strong correlation according to JD Evans’
guide) were selected and analysed using Pearson’s or Spearman’s correlation test (r). All statistical
tests were performed at a significance level of 0.05.
References
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106
Table S1. Trancriptome analysis of gene expressed in inflamed areas of AD patients relative to
their non-AD counterparts. Skin samples were taken by scratching the skin surface and reverse-transcribed RNA submitted to PCR with primers for genes as indicated. Results are expressed as Fold Change (FC) in AD (N=21) vs non-AD samples (N=14). Associated p values are shown according to methods described in statistical section.
Gene p value FC
FLG <.0001 -33,4620368
LOR <.0001 -37,8871287
S100A7 0.0018 6,69256792
S100A8 0.0002 28,2174085
S100A9 0.0002 21,1013902
NLRP3 0.0003 280,416897
CASP1 0.0612 -6,59843344
IL1b 0.0412 10,8693377
LL37 0.0044 119,54566
HBD2 0.0037 6,6670778
HBD3 0.0029 11,8114083
RNASE7 0.0008 -6,07797538
CCL3 0.0306 12,5081269
CCL17 0.0181 10,2317651
IL-8 0.0009 32,1584301
IL-13 0.0009 643,855732
IL-22 0.0019 693,153442
107
IL-6
(NT)
(S.a
)
Mix
SA
g
0200400600800
100010000
30000
50000
70000
Co
ncen
tra
tio
n (
pg
/ml)
IFN-g
(NT)
(S.a
)
Mix
SA
g
0200400600800
10005000
10000
15000
20000
Con
cen
trati
on
(p
g/m
l)
Figure S1. IFN-g and IL-4 ELISPot assays. Spot forming units/106 T cells were quantified on
peripheral blood from AD and non-AD children in response to crude extract (CE) of Der p. In AD
patients (N=17), counts (CFU/ml) of skin S. aureus are associated with ratio of IL4 to IFN-g spots.
Spearman’s correlation, r=0.63, p=0.0062.
Figure S2. Activation profile of moDC exposed to a mix of recombinant S. aureus toxins. (A)
Activation phenotype (CD86, CD83, HLA-DR) of moDC exposed to medium (NT), S. aureus
secretome (S.a) or a mix of recombinant S. aureus toxins SEC, SEG, SEI, SElM, SElN, SElO (Mix) at
100 ng/ml each for 24 hours. (B) Quantification (pg/ml) of IL-6 and IFN-g secreted by cells in (A). N=3
independent experiments.
10 1 10 2 10 3 10 4 10 5 10 6 10 7
0.01
0.1
1
10
100
1000
S.aureus (CFU/ml)
Sp
ots
rati
o I
L-4
/IF
N- g
moDC
CD86 CD83 HLA-DR
NT
S.a
Mix
A B
108
Figure S3. Production of cytokines by highly purified moDC. moDC have been sorted on the
basis of CD1a expression (A) and exposed to S.aureus (S.a) and S. epidermidis (S.e) secretome for
24 hours. IFN-g and IL-10 secreted by purified cells has been quantified (pg/ml) by cytometry bead
assay (B). The presented experiment (A) is representative of three independent ones.
FSC CD1a PE
Count
Count
SS
C
SS
C
A IL-10
S.e S.a
0
200
400
600
800
Con
cen
trati
on
(p
g/m
l)
IFN-g
S.e S.a
0
1000
2000
3000
4000
Con
cen
trati
on
(p
g/m
l)
B
109
Figure S4
Schematic representation of hypothetical S. aureus and S. epidermidis secretome effects on
activation of skin resident TCD4 cells. Induction of IFN-g secretion by dendritic cells exposed to S.
aureus secretome including superantigen toxins (SAg) promotes expansion of Th2 cells. Secretion of
IL-4 and IL-13 could support production of IgE, barrier dysfunction (FLG) and inhibition of antimicrobial
peptides supply (AMP). Harmful effects of S. aureus secretome could be amplified by direct inhibition
of regulatory T cells (Treg) activity. Overall, these deleterious effects could be counteracted by IL-10
secreted by dendritic cells exposed to skin commensals such as S. epidermidis.
S.
aureus
S.
epidermidis
IL-10
MHC II MHC II
Secretome
MHC II MHTCR Treg
Th2
Treg
Th2 IL-4
AMP FLG
IgE
TCT
h2 MHC II
IL-13
CD83, 86
Th
2
IFN-g
2
SAg CD83, 86
Secretome
Dendritic cell
Peptide (allergen...)
110
111
Suite du projet, perspectives et discussion
Au cours de ce projet, nous avons étudié l’influence de deux bactéries sur la réponse
immunitaire : S. aureus, une bactérie qui peut être pathogène et associée à la DA, et S.
epidermidis, une bactérie commensale présente sur la peau des enfants atopiques et non
atopiques.
Identification des facteurs produits par S. epidermidis induisant la production d’IL-10
Dans notre modèle in vitro, nous avons fait le choix d’utiliser des milieux conditionnés,
contenant des facteurs qui, dans la DA, peuvent franchir la barrière cutanée plus facilement
que des bactéries entières. Cependant, il a été montré que les bactéries vivantes avaient
des effets différents, notamment sur la production d’AMP par les kératinocytes (Wanke et al.,
2011). Dans la DA, la peau est lésée au niveau des zones inflammatoires et cela facilite
probablement le passage des facteurs produits et sécrétés par les bactéries ou même des
bactéries vivantes.
Afin d’étudier les effets de ces sécrétomes sur les LT CD4+, nous nous sommes d’abord
intéressés à leur influence sur des cellules dendritiques. Dans notre modèle in vitro, nous
avons utilisé des DC dérivées de monocytes de donneurs sains, qui correspondent aux
IDEC (Segura et al., 2013), des cellules présentes au niveau des lésions de la DA, et qui
présentent les antigènes aux LT.
Nous avons pu mettre en évidence certaines capacités régulatrices de S. epidermidis. En
effet, son sécrétome induit la production d’IL-10 par les moDC et atténue la prolifération des
LT CD4+ induite par le sécrétome de S. aureus. Il serait intéressant de déterminer quels
facteurs libérés par S. epidermidis et contenus dans son sécrétome en sont responsables. Il
a déjà été montré que S. epidermidis possède des propriétés anti-inflammatoires, anti-
microbiennes et de soutien de l’immunité innée de l’hôte qui impliquent des ligands de TLR2.
Le LTA agit sur les kératinocytes pour inhiber l’inflammation induite par le TLR3 (Lai et al.,
2009). Le lipopeptide LP01 favorise l’expression d’AMP par les kératinocytes (Lai et al.,
2010; Li et al., 2013). Le PGN ou des molécules incorporées dans le PGN de S. aureus peut
inhiber la réponse IL-2 induite par les SAg en favorisant la production d’IL-10 par des APC
(monocytes, macrophages dérivés de monocytes) et leur apoptose. (Chau et al., 2009;
Frodermann et al., 2011)
112
Pour tenter de répondre à cette question, à partir du sécrétome de S. epidermidis, nous
avons séparé et isolé les fractions de poids moléculaire supérieur et inférieur à 10 kDa afin
de stimuler des moDC. Lors d’un premier test, la fraction inférieure à 10 kDa a été la seule à
ne pas faire augmenter HLA-DR et CD83 et à faire diminuer CD86 (figure 1A). Cependant, la
fraction supérieure à 10 kDa est celle qui induisait la plus importante production d’IL-10.
C’est dans la fraction inférieure à 10 kDa que LP01 a été découvert (Li et al., 2013). Nous
avons aussi réalisé un test en stimulant les moDC avec LP01 synthétisé (EMC
Microcollections, Tübingen, Allemagne) ainsi qu’un peptide « scrambled », seul ou avec le
sécrétome de S.aureus. Comparé au sécrétome de S. aureus seul, l’ajout de LP01 diminue
l’expression de CD86 induite par le sécrétome. Cependant le peptide « scrambled » avait un
effet encore plus important sur la diminution d’expression de CD86 et CD83 (Figure 1B). Il
serait intéressant de renouveler ces expériences afin de confirmer ou d’infirmer ces résultats
et de doser l’IL-10 dans le surnageant des moDC stimulées.
Figure 1 Expression des marqueurs CD86, CD83 et HLA-DR sur des moDC stimulées 24h avec un sécrétome de S. epidermidis (BCM Se) total, ou les frations de poids moléculaire supérieur ou inférieur à 10 kDa (A) ou sur des moDC non traitées (NT), stimulées 24h avec un sécrétome de S. aureus (BCM Sa) seul ou en présence du lipopeptide LP01 ou du peptide contrôle « scrambled ».
Diminution ou augmentation de HLA-DR sur les moDC en réponse au sécrétome
La diminution de HLA-DR peut-être induite par deux mécanismes différents : soit par la
réduction transcriptionnelle du transactivateur de classe II, CIITA, qui régule l’expression de
HLA-DR, soit par l’endocytose et la séquestration dans le cytoplasme des molécules de
HLA-DR à la surface de la cellule comme c’est le cas dans les travaux de Wang (Wang et
113
al., 2012a). Ce processus d’internalisation de HLA-DR dépend de MARCH I (membrane-
associated RING-CH I). L’expression de MARCH I diminue généralement en fin de
maturation des DC ce qui permet la stabilisation de HLA-DR chargé du peptide à la surface
de la cellule (De Gassart et al., 2008).
D’autre part il a été montré qu’un traitement de monocytes avec S. aureus inactivé diminue
l’expression de HLA-DR et CD86 mais induit l’expression de CD40, CD80, CD83 et CCR7.
Avec ce traitement, les monocytes produisent aussi de grandes quantités d’IL-10 et de TNF-
α et pas d’IL-12. Cet effet dépend du LTA de S. aureus et est reproduit par le LTA d’une
autre bactérie à Gram positif, Streptococcus faecalis (Wang et al., 2012a). Ce résultat
pourrait donc laisser penser que l’IL-10 produit par les moDC en présence de S. epidermidis
est peut-être dû aux petites quantités de LTA présentes dans le sécrétome. Ils ont aussi
montré l’augmentation de l’expression de PD-L1, qui a des propriétés immunosuppressives,
sur les monocytes traités mais cette expression ne dépend pas de l’IL-10. L’expression d’IL-
10 et de PD-L1 par les monocytes traités avec S. aureus inactivé induit une inhibition de la
réponse T et constitue un mécanisme de tolérance de la bactérie par le système
immunitaire.
Le sécrétome de S. aureus que nous utilisons ne fait produire que de faibles quantités d’IL-
10 aux moDC mais leur fait produire de l’IFN-γ. Ce résultat est certainement dû aux SAg
présents dans le sécrétome puisqu’une stimulation avec un mélange de SAg induit aussi la
production d’IFN-γ. Les travaux de Wang ont aussi montré qu’un prétraitement des
monocytes à l’IFN-y induit la production d’IL-12, de TNF et diminue la production d’IL-10
(Wang et al., 2012a). Ainsi on pourrait supposer que les SAg qui induisent directement la
production d’IFN-y sont l’équivalent d’un prétraitement à l’IFN-γ et induisent donc la
diminution d’IL-10. Dans notre cas, une contamination par des LT peut contribuer à la
production d’IFN-γ mais nous avons montré en triant les moDC par cytométrie en flux qu’ils
en produisent aussi. Même si la production d’IFN-γ par des moDC est inhabituelle, elle a
déjà été montrée dans le cas d’une stimulation avec Mycobacterium bovis et passerait par le
TLR2 (Fricke et al., 2006). Des marquages en immunofluorescence (DC-SIGN et IFN-γ) sur
des moDC sont en cours de mise au point au laboratoire pour apporter des arguments
supplémentaires.
114
La différenciation des monocytes en DC est déviée par le sécrétome de S. aureus
Ces expériences de Wang (Wang et al., 2012a) montrant l’induction de la production d’IL-10
par S. aureus inactivé ont été réalisées sur des monocytes alors que notre étude est réalisée
sur des moDC.
Figure 2 Production de cytokines sur 24h par des moDC à J6 non traitées (NT), stimulées à l’état de monocytes en début de différenciation (J0) ou à l’état de moDC (J5) par des sécrétomes de S. aureus (Sa) ou S. epidermidis (Se). Moyenne de 3 expériences indépendantes.
Nous avons montré que la présence du sécrétome de S. aureus dès le début de la
différenciation des monocytes en DC impactait celle-ci. En effet, après 5 jours en présence
d’IL-4, de GM-CSF, les moDC ont une morphologie dendritique et expriment fortement le
CD1a mais cette expression est inhibée par le sécrétome de S. aureus. Nous n’observons
cependant pas de différence significative dans la production d’IL-10 lorsque nous stimulons
les monocytes avec le sécrétome de S. aureus avant la différenciation (J0 Sa) ou après la
différenciation en moDC (J5 Sa) (Figure 2). Nous avons aussi constaté la production de forts
niveaux d’IFN-γ dans le milieu de culture lorsque les monocytes sont stimulés au cours de
leur différenciation en moDC. Or, il a été décrit que l’IFN-γ, ajouté au GM-CSF et à l’IL-4 sur
des monocytes, pouvait faire dévier leur différenciation en DC vers une différenciation en
macrophages. En effet, l’IFN-γ induit la production d’IL-6 et de M-CSF par les monocytes en
cours de différenciation, ces cytokines étant des facteurs promouvant la différenciation en
macrophages. Cet effet de l’IFN-γ est limité aux stades précoces de la différenciation. Ainsi,
des DC immatures ne peuvent pas être converties en macrophages par l’ajout d’IFN-γ
(Delneste et al., 2003).
L’équipe a montré dans un autre contexte, que la voie du GM-CSF pouvait être altérée par la
production d’IL-6. Ainsi, la différenciation de monocytes infectés par le cytomégalovirus
humain était modifiée et les DC obtenues avaient un phénotype CD1a négatif similaire à
celui que nous obtenons avec des monocytes en présence de S. aureus. Cette voie du GM-
CSF altérée diminuait l’activité phagocytique des moDC (Carlier et al., 2011). Nous avons
115
donc voulu regarder la phosphorylation de STAT5 dans nos conditions car le GM-CSF
signale par STAT5. Nous avons réalisé des western-blot sur des lysats de moDC stimulées à
J0 ou J5 par les sécrétomes de S. epidermidis ou S. aureus. D’après la première expérience,
il semble que la phosphorylation de STAT5 est réduite lorsque les monocytes sont stimulés
par le sécrétome de S. aureus en début de différenciation (J0) comparé à une stimulation sur
des moDC (Figure 3). Cependant, nous n’avons pas reproduit ce résultat à l’expérience
suivante. Nous avons eu des difficultés de standardisation étant donné que la taille et le type
cellulaire diffèrent suivant les conditions de traitement. Il serait intéressant de reproduire ces
expériences afin de déterminer s’il s’agit d’un mécanisme d’échappement à la phagocytose
pour S. aureus.
Figure 3 Western blot réalisé sur des lysats de moDC à J6 non traitées (NT), stimulées à l’état de monocytes en début de différenciation (J0) ou à l’état de moDC (J5) par des sécrétomes de S. aureus (Sa) ou S. epidermidis (Se). Les blots ont été incubés avec des anticorps (BD Biosciences) contre STAT5 total et STAT5 phosphorylé (pStat5). La quantification a été réalisée avec le logiciel ImageLab (Bio-Rad). Les rapports des quantités de pStat5 sur Stat5 rapportées à l’actine sont présentés ici.
D’autre part, la présence de SAg au cours de la différenciation des moDC a aussi un impact
sur leur capacité à polariser des LT CD4+. Nous avons observé que la présence de SEB au
cours de la différenciation de monocytes en DC induit davantage de lymphocytes
producteurs d’IL-4 par rapport à une stimulation avec du SEB sur des moDC déjà
différenciés. (Figure 4)
0
1
2
3
4
NT J0 Sa J5 Sa J0 Se J5 Se
pS
tat5
/Sta
t5
116
Figure 4 Polarisation de LT CD4+ naïfs cultivés 7 jours en présence de moDC non traitées ou stimulées 24hà J5 avec du LPS (100ng/ml) ou du SEB (100ng/ml) ou stimulées à l’état de monocyte à J0 pendant leur différenciation (mo(SEB)DC). Les cellules sont perméabilisées, marquées avec des anticorps anti- IL-4 et anti- IFN-γ (BD Biosciences) et analysées en cytométrie en flux.
La fonction des Treg est altérée par le sécrétome de S. aureus
Nos travaux montrent que S. epidermidis peut atténuer la prolifération de T CD4+ induite par
S. aureus. Nous avons aussi montré la capacité de S. aureus à bloquer l’activité suppressive
de Treg CD4+CD127lowCD25+ issus du sang de donneurs sains. A l’inverse, S. epidermidis
améliore l’activité suppressive des Treg au ratio 2 Tresp : 1 Treg. Nous traiterons donc des
Treg avec des mélanges, simultanés ou décalés, de sécrétomes des deux bactéries afin de
déterminer si S. epidermidis est capable d’inhiber l’action de S. aureus. Il a été observé,
chez des patients atteints de DA, un nombre élevé de Treg dans le sang avec une activité
immunosuppressive normale. Cependant une stimulation de ces Treg avec du SEB diminue
leur capacité suppressive (Ou et al., 2004). Ce groupe a par la suite décrit un mécanisme où
le contact avec des APC est requis. En effet, SEB induit l’expression de GITR-L par les
monocytes et inhibe la capacité des Treg à supprimer la prolifération de T effecteurs.
(Cardona et al., 2006)
Il a aussi été montré qu’une stimulation par Pam3CSK4, une lipoprotéine synthétique
semblable aux lipoprotéines bactériennes et agoniste de TLR2, accompagnée d’une
activation du TCR sur des Treg murins induit leur prolifération ainsi qu’une perte temporaire
de leur phénotype suppressif (Liu et al., 2006; Sutmuller et al., 2006). Un prétraitement de
Treg humaines avec un mélange de ligands de TLR2 réduit leur capacité à supprimer la
prolifération de LT répondeurs. Cette inhibition de la fonction suppressive des Treg ne
s’accompagne pas d’une diminution de l’expression de Foxp3 (Oberg et al., 2010). Notre
équipe a montré que SEB pouvait directement induire un signal par le TLR2 (Mandron et al.,
2006) mais un mécanisme indépendant des SAg pourrait donc aussi être impliqué dans
l’inhibition de l’activité suppressive que nous observons. Afin d’apporter des réponses sur le
117
mécanisme d’action des sécrétomes bactériens sur l’activité des Treg, nous doserons leur
production de cytokines (IL-10, TGF-β) et de granzymes. Nous pourrons aussi nous
intéresser aux interactions entre d’autres superantigènes (SEC, SEA…) et le TLR2.
Analyse métagénomique du microbiote
Un second article est en cours de préparation en collaboration avec Jean-Philippe Rasigade
et Gérard Lina (INSERM U1111, Université Lyon I, Hospices Civils de Lyon) et se focalisera
sur les analyses du microbiote. En effet dans le premier article nous ne nous intéressons
qu’à l’analyse en MALDI-TOF sur les zones inflammatoires, ce qui est très restreint comparé
à l’ensemble des données obtenues à partir des prélèvements cutanés (analyses en MALDI-
TOF et métagénomique du microbiote sur les zones inflammatoires, xérotiques, saines et
creux poplité).
En métagénomique, par le séquençage des ARN 16S, la diversité du microbiote est plus
importante qu’avec une analyse par MALDI-TOF (128 genres contre 21). Cette différence est
due à l’étape de culture des souches avant l’analyse en MALDI-TOF qui ne permet pas de
faire pousser toutes les souches. Cependant, le nombre d’espèces identifiées est plus faible
en séquençage car l’analyse n’atteint pas le niveau d’identification de l’espèce pour toutes
les souches. Le séquençage permet d’obtenir le genre pour toutes les souches alors qu’en
MALDI-TOF l’identification arrive jusqu’au niveau de l’espèce pour quasiment toutes les
souches. (Tableau 1)
Pyroséquençage MALDI-TOF
Espèces identifiées 55 72
Genres identifiés 128 21
Tableau 1 Nombre d'espèces et de genres identifiés par les techniques du pyroséquençage et du MALDI-TOF.
Dans la suite de ce paragraphe, nous nous focaliserons sur l’analyse métagénomique et
donc sur les genres bactériens. La proportion du genre Staphylococcus est significativement
plus importante sur la zone inflammatoire (ZI) des sujets DA que sur la zone appariée des
sujets non DA (Figure 5 A). Cette différence entre les deux groupes n’est pas observée sur
les autres zones. Nous constatons aussi que plus la proportion de Staphylococcus spp. est
importante, plus la diversité microbienne est faible (Figure 5 B). Ces résultats concordent
avec l’étude de Kong (Kong et al., 2012) qui a montré que la prépondérance de S. aureus en
phase de poussée était liée à une diminution de la diversité du microbiote.
118
Figure 5 (A) Proportion du genre Staphylococcus en ARN 16S sur la zone inflammatoire du groupe DA (case) et la zone appariée du groupe non DA (control). (B) Cette proportion de Staphylococcus est inversement correlée à l’indice de Simpson représentant la diversité des genres.
Une analyse en composantes principales (PCA) suggère des différences de microbiote entre
les deux groupes sur la peau xérotique et à moindre niveau dans les creux poplités, alors
qu’au niveau de la peau inflammatoire le microbiote ne permet pas de discriminer
correctement les deux groupes. La capacité d’un modèle à prédire le caractère DA ou non-
DA d’un patient à partir du microbiote d’une zone cutanée donnée a été estimée par analyse
ROC ; la moyenne de l’aire sous la courbe ROC (ROC/AUC, qui mesure le pouvoir
discriminant d’un modèle), calculée à partir de 100 réplicats de validation croisée (100x10-
fold cross-validation), était de 0.77 ± 0.02 pour le microbiote de la peau xérotique. Cette
valeur très significativement supérieure à 0.5 (AUC sous l’hypothèse nulle d’absence de
pouvoir discriminant) confirme que le microbiote de la peau xérotique présente des
caractéristiques permettant de prédire l’appartenance d’un patient à la cohorte DA.
Dans le modèle prédictif utilisé (analyse discriminante basée sur les composants principaux,
DAPC, (Jombart et al., 2010)) chaque genre bactérien a un poids, qui reflète son importance
dans la fonction discriminante. Ainsi, au niveau de la peau xérotique, Prevotella,
Fusobacterium et Porphyromonas sont les trois genres les plus discriminants, ceux qui
permettent de prédire avec le moins d’erreur le caractère DA d’un sujet (figure 6). Il est
intéressant de noter que ces 3 genres sont anaérobies et n’ont pas été identifiés lors de
l’analyse en MALDI-TOF. Cette absence de détection en culturomique peut être liée aux
conditions de prélèvement/transport que ces souches n’auraient pas supporté, ou aux
conditions de culture avant le passage en MALDI-TOF.
p<.05
119
Figure 6 Contribution à la discrimination des groupes DA et non DA des différents genres bactériens : en rouge, genres plus représentés dans le groupe DA et en bleu, genre plus représenté dans le groupe non DA.
Ces résultats originaux nous invitent à nous intéresser davantage aux zones xérotiques chez
les sujets DA. En effet, une peau xérotique est un « terrain » propice au développement de
lésions de DA et pourrait être considérée comme une peau en amont des poussées, avec un
microbiote similaire à ce qui se passe avant le déclenchement de la DA. Il faudrait
déterminer si ce qui a été vu sur la peau xérotique des sujets DA pourrait être un facteur
prédictif. On peut ainsi imaginer un outil pronostic se basant sur le microbiote pour anticiper
le déclenchement de la DA chez des enfants à peau sèche. Cependant nous ne savons pas
si la zone chez les sujets non DA appariée à la zone xérotique des sujets DA est elle aussi
xérotique ou non. En effet si celle-ci n’est pas xérotique, notre modèle prédit davantage le
caractère xérotique sur la base du microbiote que le caractère DA.
Age des sujets
Le jeune âge des sujets récrutés constituait un des intérêts de l’étude mais aussi une
difficulté. En effet, le recrutement était compliqué, les volumes de sang étaient faibles et ne
permettaient pas toujours de réaliser les expériences que nous souhaitions. En revanche,
notre étude a l’originalité de s’intéresser au microbiote de jeunes enfants dans le contexte de
la DA et d’utiliser des souches bactériennes issues de patients pour nos expériences in vitro.
L’étude sur la diversité du microbiote dans la DA menée par Kong. (Kong et al., 2012)
s’intéresse à une tranche d’âge plus large, de 2 à 15 ans alors que le microbiote évolue dans
la petite enfance puis à la puberté.
120
Certains sujets DA de l’étude n’avaient pas ou très peu d’IgE anti Derp1 et/ou totaux au
moment du prélèvement alors qu’ils étaient sélectionnés sur leur sensibilité aux acariens.
Cette absence d’IgE pourrait être liée à leur jeune âge, ou à une phase post-poussée de la
DA. Il serait intéressant d’analyser le microbiote et les niveaux d’IgE de sujets susceptibles
de développer une DA au cours du temps. Une telle étude permettrait de confirmer ou
d’infirmer le modèle discriminant basé sur le microbiote de la peau xérotique développé
grâce à l’analyse génomique.
121
Conclusion
La peau est l’interface entre l’hôte et son environnement. Colonisée par une multitude de
micro-organismes, le dialogue entre ce microbiote et les cellules immunitaires de la peau est
important pour le maintien de l’homéostasie et de la fonction barrière de la peau face aux
stress et invasions de pathogènes. Les dysbioses au sein de ces communautés sont
souvent associées à des maladies comme la dermatite atopique.
Nous avons confirmé au cours de notre étude la prépondérance du pathogène
Staphylococcus aureus et une diminution de la diversité microbienne sur les zones
inflammatoires d’enfants atteints de DA. L’étude de ce microbiote chez des enfants très
jeunes a une importance toute particulière dans la compréhension de la maladie puisque
celle-ci se développe souvent au cours de la petite enfance. Une analyse poussée de
l’évolution de ce microbiote permettrait peut-être de développer des outils de diagnostic non
invasifs basés sur la présence de certaines souches microbiennes.
Les cellules dendritiques sont les premiers senseurs des produits bactériens qui peuvent
traverser la peau lésée. Nous avons montré que leur phénotype et leur production de
cytokines étaient affectés différemment par le pathogène S. aureus et le commensal S.
epidermidis, présent chez tous les enfants de nos cohortes. Alors que S. aureus renforce
l’inflammation en induisant la prolifération de LT par le biais de ses superantigènes, les
facteurs libérés par S. epidermidis permettent la production d’IL-10 et limitent l’effet de S.
aureus sur la prolifération des LT. Ce phénomène apparaît comme un moyen de
contrecarrer l’effet de S. aureus, qui de plus, inhibe directement l’activité suppressive de
Treg.
Nos résultats ouvrent de nouvelles pistes concernant l’implication des bactéries cutanées
dans la DA. Poursuivre des études sur la compréhension du rôle de ces bactéries
commensales permettrait d’ouvrir la voie à de nouvelles approches préventives. Il serait
bénéfique d’imaginer une crème ou un traitement à appliquer chez des enfants susceptibles
de développer une DA pour favoriser la croissance de bactéries mutualistes de la peau
comme S. epidermidis, qui aurait un effet protecteur à plusieurs niveaux : limiter la
colonisation par S. aureus et limiter l’inflammation cutanée.
122
Représentation schématique des effets hypothétiques des sécrétomes de S. aureus and S.
epidermidis sur l’activation des lymphocytes T CD4+ de la peau.
123
Remerciements
Ecrire les remerciements d’une thèse n’est pas une mince affaire. C’est surtout une histoire
de timing : alors que l’on croit que tout est fini il faut replonger dans les (presque) quatre
années qui se sont écoulées et se remémorer les bons et les mauvais souvenirs, les gens
qui étaient là, pour m’aider ou pour assister aux échecs et aux succès, aux éclats de joie et
aux colères.
Le plus simple est de commencer par remercier mes rapporteurs et membres du jury qui ont
bien voulu évaluer mon travail de thèse : Julien Seneschal, Jean-François Nicolas, Jean-
Philippe Lacour, Denis Hudrisier, Gérard Lina et Franck Boralevi.
Je remercie surtout très sincèrement Christian, mon directeur de thèse, pour m’avoir
accueillie et permis de réaliser cette thèse. Je souhaite vous remercier pour votre
gentillesse, votre confiance et votre calme, mais aussi pour m’avoir aidée à rattraper mon
« retard » en immunologie.
Ce projet collaboratif n’aurait pas existé sans l’équipe de Pierre Fabre Dermo-Cosmétique
qui a financé l’étude et ma thèse sous l’impulsion d’Anne-Marie Schmitt. Je remercie
particulièrement Christiane Casas, Pascale Bianchi et Daniel Redoulès pour leur
disponibilité, leur enthousiasme et leur contribution au projet.
Je souhaite également remercier tous les autres collaborateurs du projet et notamment à
Bordeaux Franck Boralevi et Fanny Morice-Picard qui ont recruté les enfants de l’étude ainsi
que Philippe Lehours pour l’identification microbienne. A Lyon, merci à Gérard Lina et Jean-
Philippe Rasigade pour leur investissement de dernière minute concernant le microbiote.
Je ne peux conclure ces remerciements pour les personnes ayant participé au projet sans
remercier Frédérique, qui a parcouru un bout du chemin avec moi. Merci de m’avoir permis
d’apprendre à encadrer, je n’aurais pu rêver d’une meilleure stagiaire, appliquée et motivée,
et l’expérience a été concluante puisque tu as ensuite continué à m’apporter ton aide
précieuse jusqu’à la fin de ma thèse. Merci pour ton soutien indéfectible : avoir partagé les
victoires (les Treg, entre autres!) et m’avoir remonté le moral dans les moments de lassitude.
Surtout, merci pour cette formidable leçon de vie : ta bonne humeur malgré tout et ta
gentillesse m’ont reboostée pour la deuxième partie de thèse!
Au sein de l’équipe qui a représenté mon quotidien pendant ces années, j’aimerais remercier
les jeunes : thésards, ex-thésards ou non-thésards. Jérôme pour m’avoir montré les secrets
des DC à mes débuts au CPTP. Charline pour ta gentillesse et ton soutien, heureusement
124
que tu étais là ! Morgane pour les pauses chocolat. Johan pour les discussions de fin de
journée dans le B420. Maude pour l’honorable mission que tu t’es fixée : recenser les
blagues, gaffes, et autres boulettes de tous les membres de l’équipe dans le fameux carnet
vert. Rémi pour ton calme emblématique. Manutea, Jordi et Hugo pour avoir rétabli cette
année la parité parmi les thésards de l’équipe.
Parmi les moins jeunes (mais toujours dans le bureau des jeunes !), merci Hélène pour avoir
été mon repère dans ce nouvel univers quand je suis arrivée puis d’avoir toujours continué à
répondre à mes questions pratiques. A Éric, El Mostapha, Faouzi, Nabila et Stéphane, merci
pour votre bienveillance et vos conseils.
Ailleurs dans le centre, je souhaite remercier toutes les personnes avec qui j’ai interagi,
discuté science ou non. Il y avait donc : Loïc Dupré mon parrain de thèse, Fatima et Anne-
Laure du plateau de cytométrie pour leurs bons conseils, les participants au trafic organisé
de PBMC, Danièle pour la gestion, mais aussi Karim, Lilian, Emilie... Et bien sûr merci à
Aline pour les nombreuses petites attentions, sourires, bonbons, fleurs et discussions qui
améliorent tellement une journée !
Enfin, je souhaite remercier ceux qui n’étaient pas au labo mais qui me supportaient et me
permettaient de me changer les idées, d’apprendre à expliquer naturellement ce que je
faisais dans l’univers mystérieux du labo, de me ravitailler pendant les soirées de manip, de
partir en week-end ou en vacances ! Je pense bien sûr à ma famille : mes parents, mes
sœurs, mon beau-frère et enfin Paolo et Hanaé, 6 ans, qui m’a collée 2 jours avant la
soutenance, « Emeline, c’est quoi le stress ? ». Et il y avait aussi mes amis, avec ou sans
connaissance de la vie de labo, qui finalement vivaient toutes ces aventures avec moi :
Oriane, Tony, Emma, Sophie, Nga…
MERCI
125
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Auteur : Emeline Laborel-Préneron
Titre : Effets des sécrétomes de Staphylococcus aureus et Staphylococcus epidermidis du microbiote cutané d’enfants atopiques sur la réponse immunitaire T CD4
Directeur de thèse : Christian Davrinche
Lieu et date de soutenance : le 1er juillet 2015 à Toulouse
Résumé
La dermatite atopique (DA) est une maladie inflammatoire et prurigineuse de la peau, très fréquente chez les enfants et dont la prévalence augmente dans les pays industrialisés. La physiopathologie complexe de cette maladie met en jeu un défaut de la barrière cutanée et/ou des défauts génétiques résultant en une hypersensibilité aux allergènes de l’environnement
tels que ceux issus d’acariens. Récemment, des études sur les interactions entre le système immunitaire et les bactéries commensales et pathogènes de la peau ont révélé leur importance dans cette maladie. Pour étudier le rôle du microbiote cutané dans la réponse T CD4+, des cohortes de jeunes enfants, atteints de DA et sensibilisés aux allergènes d’acariens (Der p)
ou non DA (population contrôle), ont été recrutées. L’analyse du microbiote (MALDI-TOF) et du profil transcriptomique cutanés, ainsi que la quantification des T CD4+ anti-Derp (ELISpot) ont montré que la présence de S. aureus sur la peau inflammatoire des sujets AD était associée à des taux élevés d’IgE, des transcrits caractéristiques d’une orientation Th2/Th22
et à une réponse périphérique Th2. Des cellules dendritiques dérivées de monocytes (moDC) de donneurs sains produisent respectivement de l’IFN-γ et de l’IL-10 en présence de sécrétomes issus de souches de S. aureus et S. epidermidis provenant de patients. La prolifération de lymphocytes T CD4+ stimulés avec des moDC allogéniques traitées avec le sécrétome de S. aureus est atténuée par le traitement simultané des moDC avec le sécrétome de S. epidermidis. Les sécrétomes de S. aureus sont capables d’inhiber directement l’activité
suppressive de lymphocytes T régulateurs en l’absence de cellule présentatrice d’antigène.
L’ensemble de nos résultats nous permet de penser que S. aureus est un facteur pro-inflammatoire de la DA en exacerbant la prolifération de lymphocytes Th2 résidents et en inhibant la fonction des lymphocytes T régulateurs. Favoriser les effets anti-inflammatoires des bactéries commensales telles que S. epidermidis liés à l’induction d’une sécrétion d’IL-10 par les cellules dendritiques de la peau pourrait bénéficier aux patients atteints de DA.
Mots clés : microbiote cutané, dermatite atopique, réponse T CD4
Discipline : Immunologie
Laboratoire : Centre de Physiopathologie de Toulouse Purpan NSERM UMR 1043 / CNRS UMR 5282 / Université Toulouse 3 CHU Purpan BP 3028 31024 Toulouse CEDEX 03