Cours Spectrométrie de Masse L’ionisation par électropray : l’ESI Cours ESBS Oct 2010 Sarah CIANFERANI Institut Pluridisciplinaire Hubert Curien (IPHC) Laboratoire de Spectrométrie de Masse BioOrganique Dir : Alain Van Dorsselaer UMR 7178 CNRS - Université de Strasbourg Tel: 03 68 85 26 79 [email protected]
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Cours Spectrométrie de Masse Lionisation par électropray : lESI Cours ESBS Oct 2010 Sarah CIANFERANI Institut Pluridisciplinaire Hubert Curien (IPHC) Laboratoire.
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Cours Spectrométrie de Masse
L’ionisation par électropray : l’ESI
Cours ESBS
Oct 2010
Sarah CIANFERANI
Institut Pluridisciplinaire Hubert Curien (IPHC)Laboratoire de Spectrométrie de Masse BioOrganique
Dir : Alain Van DorsselaerUMR 7178 CNRS - Université de Strasbourg
Ionisation par bombardement d’ions ou d’atomes rapides(LSIMS ou FAB)
Petites molécules volatiles et thermostables
molécules < 6000 Da
Biomolécules (1 300 kDa) et complexes non-covalents, protéomique
Ionisation par électronébullisation (électrospray ES ou ESI)
Désorption/Ionisation Laser assistée par Matrice (MALDI)
DURES
DOUCES
ASSEZ DOUCES
Deux méthodes d’ionisation des biomolécules particulièrement efficaces et sensibles ont été inventées dans les années 90 et constamment améliorées : le MALDI et l’ESI (ElectroSpray Ionisation).
L’ESI a les caractéristiques suivantes :- nécessite une introduction de l’échantillon en solution- génère des ions multichargés (analyse de protéines)- fonctionne à pression atmosphérique- souvent associée à un analyseur quadrupolaire, à temps de
vol ou à trappe d’ions.
L’ionisation par électropray : l’ESI
La source ES : historique
- jusqu’en 1987 : limite de poids moléculaire des composés analysables par MS : 35000 Da dans les cas les plus favorables- depuis 1988-89 : apparition de la technique d’ionisation par électronébulisation (electrospray) et possibilité d’analyser des composés de plusieurs centaines a plusieurs millions de Da) - 2002 :John. B. FENN : Prix Nobel pour le développement de la technique d’ionisation pour l’analyse des biomolécules
(1) Electrospray interface for liquid chromatographs and mass spectrometers
Whitehouse C.M., Dreyer R.N. Yamashita M. and Fenn J.B.
Anal. Chem. 57, 675-679 (1985)
2) Interpreting mass spectra of multiple charged ions
Mann M., Meng C.K. and Fenn J.B. Anal. Chem. 61, 1702-1708, (1989)
Principe de l’ionisation Electrospray (ES)
L’ionisation ES repose sur l’introduction d’une solution aqueuse du composé à analyser par un capillaire métallique très fin porté à un haut potentiel
Cette tension crée des charges dans la solution
A la sortie du capillaire, on a un « nébulisat » (spray) de gouttelettes (1 m) favorisé par une assistance pneumatique
L’ionisation par électrospray: ESI- génère des ions multichargés- souvent associée à un analyseur quadrupolaire, à temps de vol ou à trappe d’ions.
Structure d’une source d’ionisation Electrospray (ES)
Une source d’ionisation par ES est composée : - d’un capillaire dans lequel est injecté l’échantillon à analyser en solution- d’un ensemble de lentilles électrostatiques permettant de transférer les ions de la zone à
pression atmosphérique vers la zone dans laquelle règne un vide poussé
V = 3000V
3 à 5 l/min
cap. métal (75 m)+ +
+ ++
+ ++
+ ++
+ ++ TOF D
Electrospray:Formation de gouttelettes chargéescontenant la protéine
Zone de désolvatation
Zone de focalisation des ions
Analyse des produits en fonction de leur rapport m/z
L’ionisation ES est un processus qui a lieu : - à température ambiante- à pression atmosphérique (ambiante)- sous l’action d’un champ électrique
L’ionisation ES génère des ions multichargés
Elle est basée sur un processus électrolytique de : H2O H+ + OH-
Elle se fait à pression atmosphérique, à température ambiante
L’ionisation par électronébulisation (electrospray): ES+
Solution
Capillaire métallique(appauvri en électrons)
++++
++++++
++
++++++
++ ++ -------- -- -- -- --
--++
++++++ ++
Générateur de
haute tension
++ --
-- +++
+++ ++
e-
D
Contre électrode
SM
Cône
Cône de Taylor
Certains OH - sont attirés, puis neutralisés par le capillaire métallique: OH - OH.
Avec un voltage positif sur le capillaire on génère donc des gouttelettes chargées positivement à cause d’un excès de protons qui se fixent les sites protonables.
L’ionisation électrospray : principe de la production du spray
Débit imposé
par une pompe
Tube capillaire
0 volt
+ 2000 volts
+ 3000 volts
…………
Emission d’un spray visible à la loupe. Ces gouttelettes sont expulsées, sèchent, entament des fissions, et génèrent des ions désolvatés.
Le volume électronébulisé doit être égal au volume apporté par la pompe.
Effet de pointe qui entraîne
la déformation du liquide
en gouttelettes chargées
Champ électrique qui agit sur le liquide chargé
Electrospray: Formation de gouttelettes chargées
sous l’effet d’un champ électrique
L’ionisation électrospray : mécanisme de formation des ions
Émission d’un spray visible à la loupe.
Ces gouttelettes sont expulsées,
sèchent, entament des fissions,
et génèrent des ions désolvatés
L’ionisation / désorption par ESI génère des ions en phase gazeuse en 3 étapes:
1- production de gouttelettes chargées à partir de l’électrolyte en solution
2- fissions des gouttelettes chargées en gouttelettes plus petites
3- « transfert » des ions en phase gazeuse
Réduction de taille, mais nombre
de charges électriques constant
(explosions coulombiennes)
…………
+ +
+ ++ ++ +
++++
Evaporation du solvant
+
L’ionisation électrospray : mécanisme
Au cours du trajet des ions dans le spectromètre de masse, il y a évaporation du solvant des gouttelettes.
- diminution de la taille de la gouttelette- et augmentation parallèle de la densité de charges au sein de la gouttelette
Il y a un équilibre entre tension de surface de la gouttelette et forces de répulsions coulombiennes. Plus le solvant s’évapore, plus les forces de répulsion coulombiennes sont importantes.
lorsque forces de répulsion coulombiennes > tension superficielle il y a explosion de la gouttelette en une gouttelette plus petite
Au delà d’un certaine limite appelée limite/diamètre de Rayleigh, on observe une fission des gouttelettes en gouttelettes de plus petites taille.
Après plusieurs étapes de fissions/explosions, la densité de charge dans la gouttelette devient telle que le champ électrique local très intense conduit à le désorption des ions par effet de champ.
Il se forme alors des ions solvatés constitués de l’ion analyte entouré de molécules de solvant et de nombreuses charges. L’évaporation des dernières molécules de solvant permet d’obtenir un ion désolvaté contenant n charges, i.e. nH+ : on parle d’ions multichargés
L’ionisation électrospray : importance du débit pour la sensibilité
…………Débit de la pompeDébit du spray
•Le débit auquel un électrospray fonctionne a une importance capitale pour la sensibilité.
•L’intensité du courant d’ions produit dépend de la concentration de la solution et non pas du débit auquel la solution est injectée
•Il vaut donc mieux injecter une solution concentrée au débit le plus faible possible
L’électrospray est concentration – dépendant
L’ionisation électrospray : débit élevés et débits faibles
…………Débit de la pompeDébit du spray
• DEBITS ELEVES (1 - 200 microlitres par minute)
En « électrospray pur », il est difficile de dépasser débit de plus de 1 microlitre par minute. Pour des débits supérieurs, il faut une assistance pneumatique à la nébulisation.
• DEBITS FAIBLES (moins de 1 microlitre par minute)
Plus l’orifice qui émet le spray est petit, plus le débit du spray est faible.
Aux très faibles débits (moins de 200 nanolitres par minute), il n’est même plus nécessaire de pousser avec une pompe; l’aspiration électrostatique suffit à assurer le débit (nano spray)
Pour avoir un spray stable, le volume électronébulisé doit être égal ou volume de solution apporté par la pompe.
L’ionisation électrospray : pour les débits de spray élevés, il faut une assistance à la
nébulisation (1 à 200 microlitres /min.)
Pour dépasser un débit de 1 microlitre par minute, il faut une assistance pneumatique à la nébulisation.
L’ionisation par électrospray permet la mesure de masse de molécules très grosses.
• Mesurer des masses moléculaires très élevées est possible grâce à une caractéristique unique de l'ESI : ce mode d'ionisation génère des ions multichargés.
• Pour mesurer des masses moléculaires élevées, il n'est donc pas nécessaire de disposer d'un analyseur à gamme de balayage m/z élevée.
• La résolution de l'analyseur sera une caractéristique importante pour la mesure, soit des masses moyennes (chimiques) soit des masses monoisotopiques.
m/z
500.5
501.5
502.5
m/z=1
La différence de masse apportée par la présence d’1 isotope est de 1 Da
donc le rapport m/z varie de 1/z
Si z=1 m/z=1
z=2 m/z=0.5
z=3 m/z=0.33 etc
m/z0
100
%
z charges
Comment déterminer l’état de charge du composé étudié à partir du spectre de masse ES
On se sert des profils isotopiques
m/z
500.5
501.5
502.5
m/z=1
Si z=1 alors au niveau du profil isotopique m/z=1/1 = 1
z=2 m/z=1/2 = 0.5
z=3 m/z=1/3 = 0.33 etc …..
Comment déterminer l’état de charge du composé étudié à partir du spectre de masse ES
Entre 2 isotopes, m/z = 1
12C1H16O14N35Cl79Br
13C15N
18O37Cl81Br
m/z
500.0
501.0
502.0
m/z=1
Ici m/z= 1 : on en déduit que ce pic est 1x chargé (monochargé)
Comment déterminer l’état de charge du composé étudié à partir du spectre de masse ES
On en déduit la masse monoisotopique du composé
M= (500.0x1) – 1 = 499 Da
m/z
500.0
500.5
501.0
m/z=0.5
Ici m/z= 0.5 : on en déduit que ce pic est 2x chargé (dichargé)
Comment déterminer l’état de charge du composé étudié à partir du spectre de masse ES
Calcul de la masse moléculaire de la myoglobineà partir de la série d’ions multichargés du spectre ESI
Une fois que les valeurs de z sont déterminées (en résolvant le système d’équation à 2 inconnues M et z), la masse moléculaire de la protéine est recalculée à partir de chaque pic.
La moyenne des valeurs trouvées pour la masse moléculaire est calculée avec une déviation standard.
Plus il y a d’ions multichargés, plus la masse pourra être mesurée avec précision
Les masses calculées sont des masses chimiques et non pas des masses monoisotopiques car la résolution n'est pas suffisante pour séparer les pics isotopiques
L’ionisation ESI est compatible avec une introduction directe ou par chromatographie de l’échantillon
Source Interface Analyseur
Introduction de l ’échantillon:- direct (infusion)- couplage LC
Obtention d ’ions en phase gazeuse
Focalisation et transmission des ions
Séparation des ions en fonction du rapport m/z
Le couplage LC-MS : avec ou sans split
HPLC
rp
DiviseurSM
Détecteur UVCollecte des pics Edman
Mesure de la masse moléculaire
de chaque pic élué10.00 20.00 30.00 40.00 50.00 60.00 70.00