Ronéo n°7 – UE6 – Cours n°7 Page 1 sur 16 UE6 – Physiopathologie du système immunitaire et immunothérapie Pr Monteiro Le 05/03/20 de 13h30 à 15h30 Ronéotypeur : Maëlys ROBERT/Charlotte ROZENBERG Ronéoficheur : Maëlys ROBERT/Charlotte ROZENBERG Cours 7 : Anticorps monoclonaux et protéines de fusion thérapeutiques
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Cours 7 : Anticorps monoclonaux et protéines de fusion ... · Anticorps monoclonaux et protéines de fusion thérapeutiques. Ronéo n°7 – UE6 – Cours n°7 Page 2 sur 16 I. Introduction
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Ronéo n°7 – UE6 – Cours n°7 Page 1 sur 16
UE6 – Physiopathologie du système immunitaire et immunothérapie
Pr Monteiro
Le 05/03/20 de 13h30 à 15h30
Ronéotypeur : Maëlys ROBERT/Charlotte ROZENBERG
Ronéoficheur : Maëlys ROBERT/Charlotte ROZENBERG
Cours 7 :
Anticorps monoclonaux et protéines de fusion
thérapeutiques
Ronéo n°7 – UE6 – Cours n°7 Page 2 sur 16
I. Introduction – Définitions
II. Domaines d’application
III. Production des Ac monoclonaux murins AcM
IV. Limites des AcM en thérapeutique
V. Humanisation des AcM murins
A. AcM chimériques
B. AcM humanisés
C. AcM complètement humains
VI. Nouvelles technologies
A. Ac bispécifiques
B. CAR-T cells
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I. Introduction - Définitions
Ce cours traite des Ac monoclonaux et des protéines de
fusion thérapeutiques.
La définition d’un AcM est simple : population
homogène d’Ac issus d’un seul et unique clone de
cellules B. Un AcM présente plusieurs avantages :
Grande spécificité vis-à-vis de l’antigène
Forte affinité (en raison des immunisations
successives)
Production massive et constante in vitro via les
hybridomes
Une cellule souche donne des cellules filles qui se
différencient dans la lignée B.
Principe de clonalité : un clone, lorsqu’il passe à la phase
adaptative, réagit contre le « non-self », c'est-à-dire contre les Ag de l’extérieur. 1 clone = 1 Ac = 1 réponse
Réponse polyclonale (cf schéma) : on obtient plusieurs clones (ici, Anti-3, anti-4, anti-7) contre les Ag
Réponse monoclonale : on sépare 1 clone qui donne 1 seul AcM
Différence
sérum
polyclonal/AcM
Prenons l’exemple du lapin. On le saigne après
immunisation : on obtient dans le sérum des Ac
polyclonaux (c'est-à-dire différents : sur le schéma,
certains ont une partie courte, d’autres une partie
longue, d’autres sont en Y) dirigés contre un Ag qui
présente plusieurs épitopes.
Puis on prend une souris, on lui administre le même
Ag présentant plusieurs épitopes que le lapin. Puis on
extrait les lymphocytes produits par les organes
lymphoïdes secondaires (ganglions, rate) de cette
souris. On les fusionne avec un partenaire de fusion :
une cellule cancéreuse, qui est par nature immortelle
(alors que les cellules de la souris vont mourir au bout
de 7-10 jours, car elles sont différenciées et mortelles). On obtient ainsi un hybride qui produit
plusieurs types de clones (chaque clone = 1 Ac).
Découverte des
AcM
On doit la découverte des AcM à deux génies : G. Köhler et C. Milstein , prix Nobel de
médecine en 1984 avec N.K. Jernes « for thepries concerning the specificity in developement
and control of the immune system and the discovery of the principle for production of
monoclonal antibodies ».
1975 : 1e article décrivant la génération d’un AcM ayant une spécificité définie
Ils ont découvert chez les souris un myélome qui ne sécrétait pas d’Ac.
Ils ont développé la technique des hybridomes.
Leur découverte a été fondamentale pour l’immunologie : elle a définit les CD (clusters de
différenciation), établissant ainsi une nomenclature internationale utilisée pour l’identification et
l’immunophénotypage des cellules du système immunitaire par CMF. Un CD désigne les
molécules de la surface cellulaire reconnues par des Ac spécifiques.
Applications
des AcM
Immunologie fondamentale
Etude des lignées cellulaires (CD)
Etude des cellules pathologiques
Protéomique (séquençage, spectrométrie de masse), drug discovery, car un Ac isole une
protéine
Diagnostic
Cytométrie en flux, immunohistochimie, immunofluorescence
Imagerie médicale
Thérapie
Traitement des rejets de greffe (1e AcM murin mis sur le marché en 1986 : anti-CD3
humain Muromomab, depuis les AcM ont été humanisés)
Traitement de certains cancers
Traitement de maladies auto-immunes
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Immuno-
thérapie passive
par les AcM
Le prof a lu la
diapo
-fixation par la partie Fab et inhibition de l’interaction récepteur/ligand
-sérum immun dans la prévention/traitement de maladies infectieuses (sérum anti-diphtérique
début 20e siècle)
-Avantages des AcM :
Plus efficaces
Reproductibles (congélation en azote des clones pour utilisation ultérieure)
Absence de contaminants
-exemples :
Mab anti cytomégalovirus (agent pathogène responsable de la pneumonie)
Mab anti synticial virus (bronchiolite)
Mab anti rhésus (prophylaxie de l’allo-immunisation foeto-maternelle)
Immuno-
thérapie active
par les AcM
Fab (fragment antigen
binding) : partie de l’Ac chargé
de la liaison à l’Ag, situé dans
les domaines variables VH et
VL
Fc (fragment cristallisable) :
partie de l’Ac qui interagit
avec les cellules et les
molécules effectrices (FcR),
situé dans les domaines
constants CH2 et CH3 des
chaines lourdes
Cette partie effectrice de
l’Ac lui permet de tuer sa cible
II. Production des Ac monoclonaux murins AcM
Etapes de
production des
AcM
Long discours du prof sur les
interactions entre recherche et
associations protectrices des animaux
qui, selon lui, peuvent ralentir la
recherche et entravent le progrès (« la
règlementation excessive tue la
science »).
1. On commence par immuniser la
souris.
2. Phase d’hybridation : on sélectionne
un clone et on le fusionne avec le
myélome. On obtient plusieurs types de clones après la pousse : cellules normales B de la souris,
cellules du myélome, cellules hybrides
3. Clonage : 1 cellule par puits
4. Criblage de chaque puits
5. Sous-clonage : s’assurer que le clone est spécifique
6. Production de l’AcM : un hybridome produit un Ac contre un CD
La production prend généralement 3 mois, mais peut aller jusqu’à 8 mois.
Animaux
utilisés
-L’animal le plus utilisé est la souris.
-A Bichat, on utilise la souris BALB/c qui possède un partenaire de fusion
Etape 1 Immunisation
Le prof a lu la
diapo
-Pour l’immunisation de la souris, on utilise un Ag qui présente plusieurs épitopes
-Sources d’Ag :
Degré de pureté : élimination des contaminants
Haptènes, protéines porteuses
-Immunisation de l’animal :
Dose et forme de l’Ag
Adjuvants
Voies (sous-cutané, dans la patte très douloureuse mais meilleure façon d’immuniser
la souris débat avec les associations protectrices des animaux) et nombre d’injections
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Question d’un étudiant : pourquoi l’injection dans la patte est-elle la meilleure façon
d’immuniser un animal ?
L’adjuvant, quand il est injecté dans la patte, forme une petite boule, un granulome, qui
concentre et stimule les cellules du système immunitaire la cellule dendritique fait son activité
de CPA dans ce granulome.
Les adjuvants sont responsables du débat sur les vaccins : ils permettent d’améliorer la réponse
immunitaire mais ils peuvent être à l’origine des douleurs occasionnées par le vaccin.
Adjuvants
-Augmentation de l’intensité de la réponse immunitaire
-Accroissement de l’effet mémoire
-Stimulants non spécifiques de la réponse immunitaire
-3 composantes principales :
Huile minérale/eau : protection de l’Ag, transport de l’Ag
Particules : agrégation de l’Ag, dépôt antigénique
Parois des bactéries : réaction inflammatoire
Adjuvant complet de Freund FCA
-composition :
Mélange d’huile non métabolisable (l’émulsion permet une grande répartition de l’Ag ,
effet de dépôt)
Surfactant : Arlacel A
Mycobactéries : M. tuberculosis, M. butyricum immuno-stimulation non spécifique
importante
-considéré comme le plus efficace
-cause des inflammations chroniques, abcès, ulcérations, nécroses
Autres adjuvants
-Adjuvant incomplet de Freund FIA
Idem FCA, sans les parois bactériennes
Utilisé dans les 2e injections
-Montanide ® ISA (SEPPIC)
Mélange de surfactants (manide oléate) et d’huile non métabolisable
Aussi efficace que FCA
Beaucoup moins toxique que FCA
Emulsions eau/huile, huile/eau, eau/huile/eau
Technique
d’hybridation
cellulaire ou
hybridome
On fusionne une cellule B
(possible assi avec les cellules T,
mais ce n’est pas l’objet du
cours) avec une cellule
cancéreuse B d’un myélome non
sécrétant (qui ne produit pas
d’Ac), à l’aide de polyethylene
glycol PEG (sorte de super glue).
Il y un échange de composants
entre la cellule normale et la
cellule cancéreuse (random
exchange), avec une certaine
perte.
On obtient un hybridome qui
contient :
- Des cellules hybrides qui ont la moitié du chromosome de la cellule normale, et la moitié
du chromosome de la cellule cancéreuse
- Des cellules B normales ce sont les cellules du début qui n’ont pas fusionné, car la
- Des cellules cancéreuses super glue ne marche pas à chaque fois.
La cellule hybridome B sécrète des AcM.
Si on avait fait cette technique d’hybridation avec une cellule T, on aurait eu un hybridome T qui
sécrète des IL-2.
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La découverte de la déficience en enzyme HGPRT
des cellules de myélome a permis de les utiliser
pour la technique d’hybridation.
Sélection des hybridomes sur
milieu sélectif HAT
Si on met une cellule de myélome
déficiente en HGPRT dans un
milieu HAT, elle meurt.
Le milieu HAT permet ainsi de
sélectionner les cellules hybrides
HGPRT+.
Un LB non fusionné ne va pas
survivre à la culture car il n’est pas
immortel, par nature.
La cellule hybride HGPRT+ survit
car elle a acquis la partie
immortelle de la cellule cancéreuse et la partie HGPRT+ de la cellule normale.
Le plasmocyte non fusionné HGPRT- ne survit pas en milieu HAT.
La seule cellule capable de survivre en milieu HAT est donc l’hybride HGPRT+.
Sélection/criblage des hybridomes
sécrétant
On utilise le protocole ELISA.
L’Ag est au fond de la plaque. On ajoute un
surnageant hybridome couplé à l’Ac.
Les puits contenenant l’Ag seront positifs.
Résumé de la technique des
hybridomes On a plusieurs épitopes. On
immunise la souris. Elle
produit beaucoup d’Ac
contre différents épitopes.
On récupère les LB avec
BCR (attention erreur sur la
diapo, uniquement les LB,
pas les plasmocytes) dans la
rate ou les ganglions de la
souris.
On fusionne ces LB avec les
cellules de myélome. On
obtient ainsi des hybridomes.
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On sélectionne (ELISA, CMF) et clone les hybridomes qui vont sécréter chacun un AcM contre
les différentes parties de l’Ag .
Production des
AcM in vivo en
ascite
-cette technique n’est plus vraiment utilisée
-hybridomes cultivés in vivo
-injection des hybridomes dans le péritoine des souris
-développement d’une tumeur liquide : ascite
-prélèvement des Ac par ponction de liquide d’ascite
-purification du liquide d’ascite nécessaire
-rendement élévé : 20 g/L
-possibilité de congélation en azote pour conservation
Là aussi, débat avec les associations protectrices des animaux qui « empêchent la recherche »
car l’ascite est douloureuse pour la souris.
Production des
AcM in vitro
Le prof est
passé très
rapidement sur
ces diapos
-production en batch
Flacons ou plaques de cultures cellulaires
40 à 100 mL
Rendement faible de l’ordre de 1µg/mL
Production relativement pure
Contaminsation par les composants du milieu de culture
-techniques de microencapsulation
Capture des hybridomes dans des billes d’alginate
Pas de contamination
Purification simplifiée
Meilleur rendement de l’ordre de 100 µg/mL
-production en bioréacteurs
Basé sur la technologie des fibres creuses (dialyse)
Diminution des coûts, du temps
Augmentation de la production (3 à 5 g/L) et de la pureté
Pas ou peu de contaminant
Production in
vivo
Avantages Inconvénients
-concentration élevée en AcM
-pas d’intermédiaire industriel
-utilisation de l’animal
-présence de protéines murines
-contaminants
-stress de la souris
Production in
vitro
Avantages Inconvénients
Pas d’utilisation d’animal
Production de grandes quantités
d’Ac
Pas de contraintes légales à
l’utilisation d’animaux
Pas de personnel d’animalerie
Pas de contaminant
Tous les hybridomes ne prolifèrent pas en réacteur
Nécessite l’utilisation de sérum de veau fœtal
Productions moins concentrées
Contamination par les hybridomes morts
Mab de + faible affinité
Plus chère pour de petites productions
Purification
des liquides
contenant
les AcM
Chromatographie d’affinité : l’Ag se lie au site et les impuretés
passent. On peut récupérer l’Ac qui s’est fixé. Un peu + de
contaminant qu’avec l’autre méthode
Spécifique du Fc (protéine A, protéine G) pour les IgG
Spécifique de l’Ag
Chromatographie échangeuse d’ions : traitement acide pour
éliminer les impuretés Choc pour les Ac (car pH3)
Pour les IgM
Critères de
qualité pour
un AcM
Spécificité :
Reconnaissance d’1 seul motif antigénique
Réactions croisées, non spécifiques
Maintien de l’activité après modification chimique (couplage à des fluorochromes, enzymes)
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Affinité :
Elevée Constante et contrôlée
Avantages de ce type de production :
Constante Reproductible
III. Domaines d’application
Les AcM murins en thérapeutique :
Il y a très peu d’AcM murins thérapeutiques sur le marché actuellement
Un des plus connus : Rituximab. Il s’agit d’un Ac monoclonal chimérique dirigé contre le CD20
Anti-huCD20 (Ibritumomab) marqué à l’yttrium-90 (lymphomes B)
Anti-huCD3 (OKT®, Muromomab) : Ac de souris
Cible les LT
Indication : prévention du rejet aigu d’allogreffes rénales, hépatiques et
cardiaques
OKT3 : un des 1ers Ac utilisés chez l’H
OKT3 peut être utilisé comme dose d’attaque dans le rejet de greffe aigu.
Lors de la 1ère injection, OKT3 entraîne l’apoptose des LT dirigés contre le
greffon et survit pendant 3 semaines, puis disparaît. Mais cette 1ère injection
créer des Ac anti-OKT3 (même principe que la vaccination) non utilisable sur le long terme
IV. Limites des AcM murins en thérapeutique
La souris ne reconnaît pas tous les motifs antigéniques répertoire immunologique limité
Immunogénicité : l’injection d’AcM de souris chez l’Homme entraîne la création d’Ac humains anti-Ac de
souris (HAMA). Conséquences :
Réactions allergiques Neutralisation et clairance accélérée de
l’AcM
Chute de l’efficacité
AcM murins ne stimulent pas, de façon optimale, les fonctions effectrices de l’immunité chez l’Homme. En
effet, la liaison entre le Fc de souris et le récepteur de macrophage humain est moins bonne. Conséquences :
Faible activation du complément
Mauvais recrutement des récepteurs pour la région Fc : faible cytotoxicité à médiation cellulaire dépendante
des Ac (ADCC)
V. Humanisation des AcM murins
Vers
l’obtention
d’AcM
humains
Difficultés pour obtenir des AcM humains :
Immortalisation des cellules B humaine : très difficile, car il n’existe pas de myélome
humain partenaire de fusion avec LB murins
Volet éthique de la manipulation des cellules humaine
Solution : supprimer les parties immunogènes murines, qui ne participent pas à la
reconnaissance de l’Ag, et de le remplacer par des séquences humaines par CDR-grafting :
Greffe de régions CDR (= régions variables) : lorsqu’on clone un Ac de souris régions 1, 2,
3 humaines (partie constante) + conservation de la région variable de souris : création d’un
Ac chimérique (chimérisation)
Ex : Rituximab région hypervariable murine + région constante humaine
A l’inverse, on peut humaniser un Ac : les acides aminés de la région variable de la souris
sont remplacés par des séquences humaines
Production, de façon recombinante, dans des lignées cellulaires de mammifères, bactéries ou
champignons : plus besoin de modèles animaux
Les
moyens
actuels
Immunologie fondamentale : connaissance du génome des immunoglobulines
Génie génétique, clonage, systèmes d’expression :
E. Coli : sécrétions périplasmiques
Levure Pichia pastoris
Cellules d’insectes
Création de banques de données de gènes d’immunoglobulines :
Phage display Librabry : possibilité de créer des Ac monoclonaux Immunisation d’un
animal et récupération du sang, afin de créer une banque d’ADN
Développement de techniques d’identification performantes
Industries pharmaceutiques et sociétés biotechnologiques Sanofi Adventis, Genovac, GenmAb, etc.
FDA (Food and Drug Administration : administration américaine des denrées alimentaires et
médicaments), AFSSAPS (ancien nom de l’ANSM)
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Gènes des
immunoglobulines
Domaine :
C : constant
J : jonction
D : diversité
V : variable (partie qui reconnaît et lie l’Ag)
Ex du Rituximab : plasmide avec le V (partie variable) murin + C/J/D (partie cste) humain
Cible (entourée en rouge) : région charnière :
Est +/- longue selon l’isotype (la + longue : IgA1, la – longue : IgG, IgM…)
Confère sa flexibilité à l’Ac
A. AcM chimériques
Humanisation partielle : 65% de régions humaines
Régions constantes humaines
Régions variables murines (souris)
Risque d’immunisation réduit
Quelques AcM chimériques approuvés : Infliximab (anti-TNFα),