NAYARA IZABEL VIANA Correlação entre polimorfismos genéticos relacionados à hereditariedade, fatores hormonais e o câncer de próstata São Paulo 2017 Tese apresentada à Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo para obtenção do título de Doutora em Ciências Programa de Urologia Orientador: Prof. Dr. Alberto Azoubel Antunes Coorientadora: Profª. Drª. Sabrina Thalita dos Reis Faria
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Correlação entre polimorfismos genéticos relacionados à hereditariedade… · 2018. 2. 16. · NAYARA IZABEL VIANA Correlação entre polimorfismos genéticos relacionados à
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Transcript
NAYARA IZABEL VIANA
Correlação entre polimorfismos genéticos relacionados à
hereditariedade, fatores hormonais e o câncer de próstata
São Paulo
2017
Tese apresentada à Faculdade de Medicina
da Universidade de São Paulo para obtenção
do título de Doutora em Ciências
Programa de Urologia
Orientador: Prof. Dr. Alberto Azoubel Antunes
Coorientadora: Profª. Drª. Sabrina Thalita dos
Reis Faria
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)
Preparada pela Biblioteca daFaculdade de Medicina da Universidade de São Paulo
Viana, Nayara Izabel Correlação entre polimorfismos genéticosrelacionados à hereditariedade, fatores hormonais eo câncer de próstata / Nayara Izabel Viana. -- SãoPaulo, 2017. Tese(doutorado)--Faculdade de Medicina daUniversidade de São Paulo. Programa de Urologia. Orientador: Alberto Azoubel Antunes. Coorientador: Sabrina Thalita dos Reis Faria.
Descritores: 1.Neoplasias da próstata2.Hereditariedade 3.Polimorfismo de nucleotídeoúnico 4.Androgênios 5.Estrogênio 6.Prognóstico
USP/FM/DBD-413/17
Dedicatória
Aos meus pais Antônio e Rozilane, com
todo meu amor e gratidão, pelo amor
incondicional e por tudo que fazem
para a realização dos meus sonhos.
Agradecimentos
Agradeço primeiramente a Deus e Nossa Senhora Aparecida, pela proteção e
pelas bênçãos que me concedem todos os dias.
Ao Prof. Dr. Alberto Azoubel Antunes, meu orientador, por ter me aceitado mais
uma vez como sua aluna, assim como no mestrado. Agradeço por toda ajuda na
realização deste trabalho, por todo empenho em sempre me ajudar durante
esses anos de pós-graduação e por contribuir para o meu crescimento.
À Profª. Drª. Sabrina T. Reis, minha coorientadora, minha amiga e minha irmã.
Agradeço por ter sido a primeira mão estendida para que eu pudesse trilhar esse
caminho e realizar tantos sonhos. Obrigada pela amizade que construímos, por
ter se tornado minha irmã e por me ajudar em tudo e em todos os momentos.
Obrigada por ser meu exemplo profissional e pessoal e por me ensinar muito
mais que você imagina.
À Profª. Drª. Katia Ramos Moreira Leite, pela oportunidade única de trabalhar ao
seu lado. Agradeço por todos os momentos de aprendizado e principalmente
pelo seu carinho em nos incentivar a fazermos mais e melhor do que nós
mesmos achamos que somos capazes.
Ao Prof. Dr. Miguel Srougi, por sempre incentivar e apoiar o trabalho realizado
no LIM55. Agradeço pela oportunidade de aprender lições reais de humildade e
amor ao próximo.
A todos os funcionários da Urologia, especialmente à secretária da pós-
graduação, Elisa Cruz, pela imensa ajuda durante todo o período de doutorado
e também às secretárias Inisabete, Tereza e Aparecida, sempre dispostas e
ajudar.
Ao Iran Amorim Silva, querido amigo do laboratório, sempre disposto a ajudar e
ensinar tudo que sabe. Agradeço pelo companheirismo, pela convivência
maravilhosa e pela ajuda em tudo que preciso. É uma honra trabalhar ao seu
lado.
À Vanessa Guimarães e ao Ruan Pimenta, meus amigos queridos, com quem
posso contar em todos os momentos. Agradeço por vocês serem tão especiais,
companheiros e por sermos tão unidos. Vocês são verdadeiros presentes de
Deus na minha vida.
Aos meus amigos Me. Denis Reis Morais e Dr. Caio Moura, por serem meus
companheiros desde o início do mestrado, pelo apoio e pela ajuda durante todo
o caminho.
Aos meus queridos companheiros do LIM55: Dr. Nelson Dip, Drª. Isis Paloppi,
Dr. José Pontes Junior, Dr. Renato Fidelis, Dr. Rubens Park, Dr. Alexandre
Iscaife, Me. Juliana Camargo, Dr. Saulo Recuero. Agradeço pela amizade, pela
ajuda e por fazerem do nosso laboratório um lugar tão iluminado e especial.
À toda equipe do consultório do Prof. Miguel que se empenhou para auxiliar na
coleta das amostras dos pacientes: Prof. Dr. Alberto Antunes, Prof. Dr. Carlo
Passerotti, Dr. Adriano Nesrallah e à enfermeira Mary Elen Salles. Ao Dr. Erico
Diógenes, Dr. Renato Oyama e Daniela Janolli, também pela ajuda na coleta das
amostras.
Aos pacientes que aceitaram participar deste trabalho e gentilmente cederem
uma amostra de sangue.
Aos meus queridos pais, Antônio Viana e Rozilane Viana, agradeço por serem
tão maravilhosos e especiais. Agradeço pelo amor incondicional que nos une,
por serem meu porto seguro, por tudo que me ensinaram e ensinam, e por não
medirem esforços pela minha felicidade. Deus não poderia ter sido mais
generoso ao me abençoar como filha de vocês. Amo muito vocês.
Ao meu marido Carlos Eduardo Moura, meu grande amor e companheiro de
todos os momentos. Agradeço por incentivar todos os meus sonhos com tanta
generosidade e dedicação. Agradeço pelo amor e carinho em todos esses anos,
pela paciência, compreensão e por se empenhar pela nossa felicidade. Te amo
muito.
Ao meu querido avô José Malta de Oliveira, que torce e se alegra pelas minhas
conquistas. Aos meus avós que já não estão mais entre nós, José Afonso Viana,
Izabel Delfina Viana e Ceci Aparecida. Agradeço por todo amor que me
dedicaram e por tudo que fizeram por mim.
Aos meus tios, Paulo, João Pedro, Antônio e Roberval e às minhas tias Vera,
Maria José, Rosângela, Silvania e Luciana, por todo amor, carinho e orações.
Vocês são pessoas muito especiais na minha vida, com as quais sei que posso
contar em todos os momentos.
Aos meus primos e primas, Paula, Marcos, Otávio e Carolyna, por serem meus
irmãos de coração e pelo amor que nos une. À nossa pequena Isabella, minha
sobrinha de coração, uma princesinha que Deus nos enviou para trazer mais
amor para nossa família. Vocês são muito especiais e eu os amo muito.
Às minhas amadas amigas, Valéria, Luz Maria, Nyara, Tatiane, Karen, Taíla e
Nayara, pelo incentivo, pela torcida e pelo carinho de se fazerem sempre
presentes, apesar da distância. Vocês são essenciais na minha vida.
Ao meu afilhado Lucas Reis Faria, que amei desde o momento em que soube
da sua existência. Agradeço por você ser essa criança tão especial, que trouxe
tanto amor para nossa vida. Amo você, meu pequeno príncipe.
Ao amigo Leandro Faria, por toda ajuda durante todos esses anos. Agradeço por
termos você e a Sabrina como nossa família e por compartilharmos tantos
momentos juntos. À pequena Laura, que mesmo antes de nascer já preenche
nossa vida com mais amor e alegria. Ao Sr. Geraldo e Neuza Reis pelo carinho
de sempre comigo e com minha família.
Aos meus primos Maria da Anunciação e Irineu Bagnariolli, pela ajuda e carinho
que sempre têm conosco.
À FAPESP, pelo apoio concedido para realização deste trabalho (2012/19258-
5).
Esta dissertação ou tese está de acordo com as seguintes normas, em vigor no momento desta publicação:
Referências: adaptado de International Committee of Medical Journals Editors (Vancouver).
Universidade de São Paulo. Faculdade de Medicina. Divisão de Biblioteca e Documentação. Guia de apresentação de dissertações, teses e monografias. Elaborado por Anneliese Carneiro da Cunha, Maria Julia de A. L. Freddi, Maria F. Crestana, Marinalva de Souza Aragão, Suely Campos Cardoso, Valéria Vilhena. 3a ed. São Paulo: Divisão de Biblioteca e Documentação; 2011.
Abreviaturas dos títulos dos periódicos de acordo com List of Journals Indexed in Index Medicus.
Tabela 2 - Características clínico-patológicas dos pacientes com
CaP e dos indivíduos do grupo controle.............................. 23
Tabela 3 - Características clínico-patológicas dos pacientes com
CaP esporádico e familiar................................................... 23
Tabela 4 - Polimorfismos selecionados para análise........................... 25
Tabela 5 - Distribuição dos genótipos de 13 polimorfismos nos
pacientes diagnosticados com CaP e nos indivíduos do
grupo controle.................................................................... 32
Tabela 6 - Distribuição dos alelos dos 13 polimorfismos entre
pacientes com CaP e grupo controle.................................. 34
Tabela 7 - Distribuição dos genótipos de 13 polimorfismos nos
pacientes disgnosticados com CaP com histórico familiar
e esporádico....................................................................... 35
Tabela 8 - Distribuição dos genótipos de 13 polimorfismos em
relação ao nível de PSA pré-operatório.............................. 37
Tabela 9 - Distribuição dos genótipos de 13 polimorfismos em
relação ao escore de Gleason na peça............................... 39
Tabela 10 - Distribuição dos genótipos de 13 polimorfismos em
relação ao escore de Gleason na peça (3 parâmetros) ...... 41
Tabela 11 - Distribuição dos genótipos de 13 polimorfismos em
relação à recidiva bioquímica............................................. 43
Lista de Figuras
Figura 1 - Esquematização da nova graduação proposta pela ISUP
para o CP e as curvas de sobrevida livre de recidiva de
acordo com a nova graduação.............................................. 5
Figura 2 - Sistema TaqMan®. Identificação da base com uso de
sondas marcadas com fluoróforos......................................... 28
Resumo
Viana NI. Correlação entre polimorfismos genéticos relacionados à hereditariedade, fatores hormonais e o câncer de próstata [Tese]. São Paulo: Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo; 2017.
INTRODUÇÃO: O Câncer de Próstata (CaP) é a sexta neoplasia mais comum
no mundo correspondendo a aproximadamente 10% do total de cânceres. No
Brasil, o CaP é a neoplasia maligna não cutânea mais comum entre os homens.
A hereditariedade é um dos principais fatores de risco do CaP, que se caracteriza
pela herança de mutações em genes de susceptibilidade de alta penetrância que
quando transmitidos aos descendentes aumentam o risco de desenvolvimento
de tumores. Os andrógenos e estrógenos influenciam o desenvolvimento,
maturação e manutenção da próstata, afetando a proliferação e a diferenciação.
Isso tem despertado grande interesse no papel desses hormônios esteroides no
desenvolvimento e manutenção tanto da próstata normal quanto maligna. Os
Polimorfismos de Nucleotídeo Único (SNPs) são variantes de risco genéticos
associados com uma série de doenças, incluindo o câncer. Considerando que a
história familiar e que os componentes hormonais constituem fatores de risco
para o desenvolvimento do CaP, acredita-se que a identificação de
polimorfismos envolvidos nesses processos possa ter um papel relevante para
auxiliar no desenvolvimento de ferramentas alternativas para a detecção precoce
e para a definição do prognóstico desta neoplasia. OBJETIVOS: Analisar
polimorfismos (SNPs) relacionados com histórico familiar e com fatores
hormonais em amostras de sangue de pacientes com CaP e em homens
saudáveis. Além disso, correlacionar os resultados da genotipagem com
parâmetros clínico-patológicos. MÉTODOS: O estudo foi composto por 185
pacientes diagnosticados com CaP, sendo 97 casos esporádicos e 72 com
histórico familiar (dois parentes de primeiro grau). O grupo controle foi composto
por 70 amostras de sangue de indivíduos saudáveis, que comprovadamente não
possuíam CaP e fazem acompanhamento com intuito preventivo. Foram
selecionados 13 polimorfismos para análise: rs10486567, rs10993994,
Viana NI. Correlation between genetic polymorphisms related to heredity, hormonal factors and prostate cancer [thesis]. São Paulo: “Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo”, 2017.
BACKGROUND: Prostate Cancer (PCa) is the sixth most common cancer
worldwide accounting for around 10% of all cancers. In Brazil, the PCa is the
most common non-skin malignancy among men. Heredity is one of the main risk
factors for PCa, which is characterized by mutations of heritage in high-
penetrance susceptibility genes that when transmitted to offspring increase the
risk of tumor development. Androgens and estrogens influence the development,
maturation and maintenance of the prostate, affect proliferation and
differentiation. This has aroused great interest in the role of these steroid
hormones in the development and maintenance of both normal and malignant
prostate. Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) are variants of genetic risk
associated with a number of diseases including cancer. Considering that the
family history and hormonal components are risk factors for the development of
PCa, we believe that the identification of polymorphisms involved in these
processes may have an important role to assist in the development of alternative
tools for early detection and to define the prognosis of this cancer. OBJECTIVES:
To analyze polymorphisms (SNPs) associated with family history and hormonal
factors in patient blood samples with PCa and in healthy men. In addition, to
correlate the results of genotyping with clinical-pathological parameters.
METHODS: The study consisted of 185 patients diagnosed with PCa, divided into
97 sporadic cases and 72 with a family history. The control group consisted of 70
blood samples from healthy individuals who had no proven PCa and do it for
preventive purposes. We selected 13 polymorphisms for analysis: rs10486567,
Considerando o polimorfismo rs4919743, embora o genótipo heterozigoto
tenha sido o mais prevalente nos 2 grupos, sua frequência foi maior nos
pacientes sem recidiva (90,1%) quando comparado aos pacientes com recidiva
(73,5%) (p= 0,04) (OR=0,22; IC: [0,04 – 1,20]) (Tabela 11). Para os genótipos
não foi possível construir curvas de sobrevida devido à baixa frequência do
genótipo homozigoto selvagem.
Na análise de alelos não encontramos nenhuma associação significativa
considerando recidiva bioquímica.
Tabela 11 - Distribuição dos genótipos de 13 polimorfismos em relação à recidiva
bioquímica
Alteração (ensaio)
Genótipo
Sem recidiva
bioquímica (n)
Com recidiva
bioquímica (n)
Odds Ratio p
rs10486567
AA* 10,7% (13) 5,9% (2) 1 0,42
AG 30,6% (37) 41,2% (14) 2,45 [0,49 – 12,31]
GG 58,7% (71) 52,9% (18) 1,64 [0,34 – 796]
rs7501939
TT* 15,7% (19) 9,1% (3) 1 0,04
TC 39,7% (48) 63,6% (21) 2,77 [0,73 – 10,38]
CC 44,6% (54) 27,3% (9) 1,05 [0,25 – 4,31]
rs4430796
AA* 24,8% (30) 14,7% (5) 1 0,06
AG 51,2% (62) 73,5% (25) 2,41 [0,84 – 6,94]
GG 24% (29) 11,8% (4) 0,82 [0,20 – 3,39]
rs10993994
CC* 19% (23) 32,4% (11) 1 0,24
44
CT 47,9% (58) 41,2% (14) 0,50 [0,50 – 1,27]
TT 33,1% (40) 26,5% (9) 0,47 [0,17 – 1,30]
rs2735839
GG* 5,8% (7) 0% (0) 1 0,15
GA 94,2% (114) 100% (34) 4,81 [-]
AA 0% (0) 0% (0) -
rs5945572
GG* 30,6% (37) 38,2% (13) 1 0,06
GA 27,3% (33) 41,2% (14) 1,20 [0,49 – 2,93]
AA 42,1% (51) 20,6% (7) 0,39 [0,14 – 1,07]
rs9364554
CC* 61,2% (74) 70,6% (24) 1 0,49
CT 31,4% (38) 26,5% (9) 0,73 [0,30 – 1,72]
TT 7,4% (9) 2,9% (1) 0,34 [0,41 – 2,84]
rs138213197
CC* 58,7% (71) 55,9% (19) 1 0,77
CT 41,3% (50) 44,1% (15) 1,12 [0,52 – 2,41]
TT 0% (0) 0% (0) -
rs1271572
AA* 37,2% (45) 32,4% (11) 1 0,30
AC 42,1% (51) 55,9% (19) 0,42 [0,13 – 1,39]
CC 20,7% (25) 11,8% (4) 0,65 [0,28 – 1,52]
rs2987983
AA* 9,1% (11) 5,9% (2) 1 0,38
AG 86,8% (105) 94,1% (32) 1,67 [0,35 – 7,95]
GG 4,1% (5) 0% (0) -
rs8072254
AA* 26,4% (32) 26,5% (9) 1 0,92
AG 43,8% (53) 47,1% (16) 1,07 [0,42 – 2,71]
GG 29,8% (36) 26,5% (9) 0,88 [0,31 – 2,51]
rs4919743
AA* 2,5% (3) 8,8% (3) 1 0,04
AG 90,1% (109) 73,5% (25) 0,22 [0,04 – 1,20]
GG 7,4% (9) 17,6% (6) 0,66 [0,09 – 4,47]
rs3808330
CC* 6,6% (8) 5,9% (2) 1 0,20
CT 20,7% (25) 35,3% (12) 1,92 [0,35 – 10,46]
TT 72,7% (88) 58,8% (20) 0,90 [0,17 – 4,61]
*Genótipo homozigoto selvagem
45
5. DISCUSSÃO
46
Considerando que o CaP é a segunda principal causa de morte por câncer
na população masculina, é fundamental que os esforços se concentrem em
descobrir indivíduos propensos a desenvolver a doença. Do ponto de vista de
saúde pública, a capacidade de identificar a predisposição genética para o CaP
poderia ser uma abordagem de rastreio para a população masculina. A
identificação de indivíduos com alto risco de aparecimento precoce e agressivo
do CaP, seria ainda mais valiosa.
Neste trabalho, investigamos a frequência de 13 SNPs presentes em
genes que já foram associados ao desenvolvimento do CaP esporádico ou
familiar e também em receptores hormonais, e tentamos estabelecer uma
correlação entre estes SNPs e o desenvolvimento do CaP e também a sua
progressão. Quando comparamos a frequência dos genótipos dos SNPs
estudados entre pacientes diagnosticados com CaP e o grupo controle,
encontramos diferenças estatísticas relacionadas a 3 SNPs. O primeiro deles é
o SNP rs10486567, que está localizado no cromossomo 7, no segundo íntron do
gene JAZF1 e codifica três proteínas C2-H2 do tipo zinc finger. Em nosso
estudo, a presença do genótipo homozigoto polimórfico aumentou em três vezes
o risco de desenvolvimento do CaP. Considerando apenas a presença ou
ausência dos alelos polimórficos, este SNP manteve o resultado encontrado nas
análises de frequência dos genótipos. A presença do alelo polimórfico aumentou
a predisposição ao CaP em 2 vezes. Através da meta-análise realizada por Liu
et al. (88) este SNP emergiu como um foco de interesse para o CaP e após
análises mais detalhadas continuou apresentando associação com o risco para
a neoplasia (89), incluindo a forma familiar(90).
47
Embora a importância funcional do SNP rs10486567 ainda tenha que ser
identificada, JAZF1 é reconhecido por codificar uma proteína zinc finger
denominada cisteína 2 histidina 2 (Cys2-His2), um tipo estrutural de zinc finger
que interage com alguns metais pesados como cádmio e chumbo (91, 92).
Interações de proteínas zinc fingers com metais pesados é um dos mecanismos
propostos para a carcinogênese por metal (93-95). Proteínas zinc finger estão
envolvidas no reparo do DNA, na transcrição e na supressão de tumores. Alguns
metais pesados já foram identificados como modificadores da estrutura e função
de algumas proteínas zinc finger chaves envolvidas na carcinogênese, tais como
o supressor de tumor p53 (96) e na inibição da cadeia de reparo do DNA (97).
As proteínas codificadas por este gene são também repressoras
transcripcionais de NR2C2, que se trata de um receptor nuclear altamente
expresso no tecido da próstata e que interage com o receptor de andrógeno.
JAZF1 é também um gene que frequentemente se funde com SUZ12 em
tumores de endométrio (98). Além disso, nesses tumores ocorrem frequentes
translocações que levam a expressão quimérica de JAZF1 e JJAZ1. O
mecanismo que conduz a esse rearranjo é desconhecido mas sabe-se que isso
não ocorre em concentrações elevadas de estrógeno e progesterona, sugerindo
que esse tipo de fusão pode ocorrer de maneira hormônio dependente (99). No
entanto, um estudo recente mostrou que na presença do polimorfismo
rs10486567, a sensibilidade de JAZF1 ao andrógeno é reduzida em 56%,
sugerindo que este SNP parece ser a variante funcional mais significativa deste
locus (100).
48
Em conformidade com nossos resultados outros trabalhos também
encontraram associação entre o SNP rs10486567 e o CaP (89, 101-103). Além disso,
em um desses estudos que avaliou 1.827 homens brancos com diagnóstico de
adenocarcinoma de próstata, esse SNP também mostrou associação com
pacientes que possuíam escore de Gleason de alto grau (≥8) (101). Em outro
estudo que investigou a possível utilização de alguns loci de risco como
marcadores de mortalidade para o CaP, este SNP esteve entre os que
mostraram associação positiva para essa finalidade. No entanto neste mesmo
trabalho, esse SNP mostrou associação com casos de CaP não fatais (104). O
alelo polimórfico deste SNP também foi associado com uma diminuição
significativa do risco de recorrência bioquímica, surgimento de metástase (105) e
início precoce da neoplasia (106). Outro estudo mostrou que este polimorfismo em
combinação com outras alterações pode ter um efeito cumulativo associado com
características mais agressivas do CaP (107). Assim como encontrado em nossos
resultados, é incontestável a participação deste SNP no desenvolvimento do
CaP e na aquisição de algumas características, principalmente com relação a
agressividade da doença. Em face dessas importantes associações este SNP
merece ser alvo de investigações mais profundas em trabalhos posteriores.
Ainda comparando a frequência dos genótipos entre pacientes com CaP
e o grupo controle, o polimorfismo rs9364554 também mostrou uma possível
associação com o desenvolvimento da doença, onde a presença do genótipo
homozigoto polimórfico representa um risco três vezes maior de
desenvolvimento da neoplasia. Na análise considerando apenas a presença ou
ausência do alelo polimórfico, encontramos que o alelo variante do SNP
rs9364554 foi estatisticamente associado a presença do CaP. A presença deste
49
alelo aumenta a predisposição a esta neoplasia em 2 vezes. Este SNP está
localizado no íntron 5 do gene SLC22A3 que atua na eliminação de algumas
drogas e toxinas ambientais. Grisanzio et al. (108), mostraram que a supressão
deste gene foi capaz de alterar algumas características fenotípicas associadas
ao CaP em linhagens celulares. Essas características dizem respeito
principalmente aos eventos associados à proliferação e viabilidade celular
mostrando, portanto, que este gene provavelmente está associado à iniciação
tumoral. Este fato é corroborado pela constatação de que a expressão de
SLC22A3 é inversamente correlacionada à progressão do CaP, visto que há uma
redução da expressão deste gene à medida que a doença avança (109). Variantes
em SLC22A3 também estão associadas com câncer colo retal (110) e com
mieloma múltiplo (111).
O SNP rs9364554 está associado à diminuição da transcrição de
SLC22A3 (108) e também já mostrou associação com a progressão do CaP (112).
Na população chinesa, não houve associação entre este polimorfismo e o CaP
(113). Não existem muitos trabalhos avaliando esta alteração no CaP, e, portanto,
consideramos relevante esse dado encontrado na população brasileira, visto que
tanto a presença do genótipo homozigoto polimórfico quanto do alelo polimórfico,
podem ser suficientes para elevar a predisposição à doença.
Também encontramos uma correlação significativa na comparação dos
grupos com o polimorfismo rs8072254, neste caso a presença do genótipo
homozigoto polimórfico foi mais frequente em pacientes do grupo controle, o que
nos faz supor que em condição de homozigose esse polimorfismo pode ser
considerado um SNP protetor, entretanto a distribuição do alelo polimórfico deste
SNP foi muito semelhante entre casos e controles. O SNP rs8072254 está
50
mapeado na terceira posição no elemento de resposta a andrógenos (ARE), que
são sítios de DNA reconhecidos pelo receptor de andrógeno (AR) (114, 115).
Estudos revelaram que o alelo variante (A) deste SNP é mais permissivo à
ligação com AR quando comparado com o alelo selvagem (G). Estes resultados
também foram encontrados em estudos in vitro, utilizando luciferase, onde foi
relatado que tanto a presença do alelo variante (A) quanto a presença do alelo
selvagem (G) são permissivos à ligação com AR, no entanto a ligação com o
alelo A é significativamente mais elevada do que com o alelo selvagem G. Isso
sugere que possa existir uma maior expressão de AR em CaP, devido à ligação
com o alelo variante A do SNP rs8072254.
Quando comparamos a distribuição dos polimorfismos com os pacientes
que possuíam CaP esporádico e CaP familiar, encontramos uma associação
significativa em relação ao SNP rs1271572, que está localizado na região
promotora do receptor de estrógeno beta ou ESR2. O genótipo polimórfico desta
alteração foi quase 3x mais presente nos pacientes que possuíam CaP
esporádico quando comparado aos indivíduos com CaP com história familiar da
doença (p=0,03). Em um estudo realizado na população chinesa, a frequência
deste polimorfismo foi significativamente menor nos casos de CaP que no grupo
controle (116). Existem poucos trabalhos na literatura relacionados a este SNP e
este trabalho realizado na população chinesa parece ser o único a associar esta
alteração específica ao CaP.
A importância dos estrógenos no desenvolvimento do trato reprodutivo
masculino tem sido cada vez mais reconhecida. Os estrógenos atuam através
dos receptores de estrógenos nucleares específicos (ESRs). O receptor de
51
estrógeno β (ERβ) ou ESR2 é altamente expresso no epitélio da próstata
sugerindo um efeito direto dos estrógenos nesse órgão (117, 118). A supressão do
ESR2 em animais leva a hiperplasia ventral da próstata, indicando que esta
molécula pode desempenhar um papel antiproliferativo nesse tecido (119, 120).
Alguns estudos confirmaram os sinais antiproliferativos deste gene no CaP, onde
observaram inibição da invasão e do crescimento do tumor bem como regulação
da apoptose (121, 122). Através da regulação da apoptose, ocorre a inibição da
proliferação de células cancerosas induzidas por 17 β-estradiol (estrógeno) e da
5α-diidrotestosterona em células de CaP sensíveis a andrógeno (LNCaP) (123).
Como dito anteriormente, ESR2 e AR são localizados e amplamente expressos
no epitélio da próstata (124). A redução da expressão de ESR2 em tumores
recorrentes privados de andrógeno ou após castração reflete a dependência de
andrógenos pela expressão de ESR2 no CaP humano (125, 126).
Foram realizados alguns estudos sobre o padrão de expressão de ESR2
em tecidos da próstata normal e maligno. Na maioria dos estudos, a expressão
de ESR2 diminui à medida que aumenta a graduação de Gleason, mas a
expressão deste gene se eleva novamente em lesões metastáticas (127-129).
Essas variações na expressão de ESR2 sugerem que este gene pode regular a
carcinogênese da próstata através de genes relacionados à proliferação celular
e apoptose, levantando a possibilidade de que as variantes de ESR2 podem
alterar o risco de CaP.
Aqui, não encontramos associação entre este polimorfismo e o
desenvolvimento do CaP ou a seus fatores prognósticos, entretanto
curiosamente, encontramos associação entre este SNP e os casos de CaP
52
esporádico. Nossos resultados são inéditos na literatura, uma vez que este
polimorfismo no gene ESR2 ainda não havia sido associado ao CaP
considerando o histórico familiar e a população brasileira. São necessárias
análises genéticas adicionais para melhor caracterização desta região para de
fato garantir a funcionalidade desta alteração.
Considerando os fatores prognósticos clássicos do CaP, para os valores
de PSA pré-operatório, encontramos significância estatística apenas para o SNP
rs3808330. Encontramos maior frequência do genótipo homozigoto polimórfico
no grupo de pacientes com PSA <10ng/ml. Este SNP está localizado no gene
EN2 e nosso trabalho é o primeiro a analisar esta mutação no CaP.
Os genes Engrailed (EN) são membros de uma família de fatores de
transcrição que contém um homeodomínio e apresentam um alto grau de
conservação funcional durante o desenvolvimento embrionário e na regulação
da tradução (74). EN foi primeiramente descrito como uma mutação em
Drosophila que resultou numa falha do desenvolvimento da extremidade que
divide a asa em compartimentos anterior e posterior. Genes homólogos de EN
estão presentes em vários grupos de animais. Os vertebrados têm dois genes
engrailed, o EN1 e EN2 que são mais ou menos equivalentes funcionalmente
(130, 131).
Estudos recentes têm mostrado que EN2 pode ser clinicamente útil como
um marcador de diagnóstico específico de CaP. Atualmente os testes usados na
prática clínica para detecção do CaP, incluem a dosagem do PSA, o exame de
toque digital e a realização de biópsias, e cada um destes testes apresentam
limitações significativas (132-134). Existe uma necessidade urgente de novos
53
biomarcadores para superar as limitações para detecção do CaP. Em 2011,
Morgan et al. (78) avaliaram o papel de EN2 no diagnóstico de CaP. Foi
demonstrado que EN2 é secretado na urina por células de CaP mas não por
tecido prostático normal. A expressão de EN2 foi confirmada nas linhagens
celulares PC3, DU145 e LNCaP e em tecidos de biópsias com CaP confirmado,
pela técnica de PCR em tempo real. Por imunohistoquímica também foi
confirmada a alta expressão da proteína EN2 nos tecidos de CaP e não nos
tecidos prostáticos normais ou na neoplasia intraepitelial prostática de alto grau
(135). Os níveis de EN2 foram medidos por ELISA em amostras de urina da manhã
e neste trabalho a presença de EN2 foi associada ao CaP, com uma
sensibilidade de 66% e uma especificidade de 88,2% sem necessidade de toque
digital retal (136).
Em face das potenciais utilidades clínicas do EN2 resolvemos investigar
se polimorfismos nesse importante marcador poderia estar associado a alguma
característica do CaP. Interessantemente, o SNP rs3808330 que avaliamos se
mostrou mais presente em pacientes que possuíam níveis menores de PSA.
Como ainda não existe nenhum trabalho avaliando essa alteração associada ao
CaP, não conseguimos definir precisamente o significado desta correlação, mas
podemos postular que por esta alteração ser na região promotora talvez ela
possa estar associada com uma baixa expressão do EN2, entretanto este fato
abre perspectivas para outras investigações.
Ainda nas comparações com fatores prognósticos do CaP, encontramos
associações para o SNP rs7501939. Este polimorfismo apresentou maior
frequência do genótipo homozigoto polimórfico em pacientes que apresentaram
54
menor escore Gleason e em pacientes que não apresentaram recorrência da
doença. Este polimorfismo está localizado no cromossomo 17q12 no segundo
íntron do gene HNF1β que é um fator de transcrição. HNF1β codifica três
isoformas em seres humanos. As isoformas HNF1β (A) e HNF1β (B) parecem
ser ativadores da transcrição, ao passo que a isoforma HNF1β (C) é um
repressor de transcrição (137). Existem diferenças na expressão das isoformas de
HNF1β entre tecidos normais e malignos da próstata, onde tumores de próstata
exibem maior expressão de HNF1β isoforma (B) do que o tecido normal (138). É
possível que variantes em HNF1β contribuam para a alteração da expressão
desta isoforma no CaP. Estudos de expressão gênica embrionária, mostram que
a expressão de HNF1β ocorre durante o desenvolvimento inicial do trato
urogenital humano (139). Embora o mecanismo biológico pelo qual HNF1β pode
afetar o risco de CaP ainda não tenha sido elucidado, a expressão diferencial
deste gene tem sido associada à recorrência do CaP (140).
Polimorfismos nesse gene, foram incialmente relatados como sendo
relacionados com o CaP em um estudo de associação do genoma (GWAS) na
Islândia (141) e posteriormente foi replicado em dois estudos adicionais no Reino
Unido (142) e nos Estados Unidos (143). Além disso essas alterações estão
associadas também a infertilidade masculina (144).
Em recente trabalho de Nikolic et al. (145) realizado na população sérvia, o
alelo polimórfico do SNP rs7501939 mostrou associação com o risco de CaP e
também com hiperplasia prostática benigna, porém não foi associado com os
parâmetros de progressão do CaP. Curiosamente, no estudo de Chornokur et al.
(98), este polimorfismo também foi associado ao risco de CaP, porém
55
exclusivamente em pacientes obesos. Em outro estudo, avaliando os
polimorfismos de HNF1β no CaP e em outras malignidades tais como colo retal,
pulmão, mama, melanoma e pâncreas, o SNP rs7501939 mostrou associação
somente com o risco de CaP (146). Este polimorfismo também já apresentou
associação com o CaP hereditário e com pacientes que tiveram diagnóstico
precoce da doença (147).
Como podemos perceber muitos trabalhos associaram este polimorfismo
ao desenvolvimento do CaP, mas não aos fatores prognósticos. Aqui em nosso
trabalho não encontramos associação com o desenvolvimento desta neoplasia
mas encontramos uma associação entre este polimorfismo e ausência de
recidiva bioquímica e com escore de Gleason mais baixo.
Ainda na comparação com o escore de Gleason, encontramos que o
genótipo homozigoto polimórfico do SNP rs5945572 foi mais frequente nos
pacientes com Gleason de baixo grau. O SNP rs5945572 está localizado no gene
NUDT11 (cromossomo X) que codifica isoformas de diphosphoinositol, que
determina a taxa de fosforilação no reparo do DNA, resposta ao stress e
apoptose (148). A inibição da expressão de NUDT11 influencia fenótipos celulares
associados a propriedades relacionadas a tumores em células de CaP. Na
linhagem celular LNCaP a supressão de NUDT11 inibiu a proliferação e a
formação de colônias bem como diminuiu a viabilidade celular (108).
Em um grande estudo genome-wide envolvendo as populações islandesa,
europeia e americana, o SNP rs5945572 apresentou forte associação com o CaP
(149). Este estudo foi replicado na população africana e a mesma associação foi
encontrada (102). Esta alteração também já foi associada com o risco de CaP em
56
famílias com membros acometidos (150). Este polimorfismo, porém, não
demonstrou associação com o CaP quando avaliado na população asiática. No
entanto, em outro estudo na população americana, este SNP não só foi
associado ao risco de CaP, (149) como também com pacientes que apresentaram
recidiva bioquímica (112). Em homens com ancestralidade europeia esta alteração
apresentou associação com o aumento do risco de CaP e com a gravidade dos
sintomas do trato urinário inferior (151).
De uma forma geral encontramos que alguns polimorfismos parecem ter
um papel relevante no desenvolvimento do CaP, na transmissão familiar e com
alguns fatores prognósticos. Estes importantes polimorfismos, ainda não haviam
sido estudados na população brasileira e em vários pontos, nosso trabalho
identificou correlações ainda não demonstradas na literatura. Acreditamos que o
valor da associação entre esses SNPs e o CaP em estudos posteriores poderá
auxiliar no desenvolvimento de ferramentas alternativas que possam auxiliar na
detecção precoce e na definição do prognóstico desta neoplasia.
Utilidades clínicas e avanços no futuro
O CaP representa uma condição fenotípica com relações multigênicas. O
valor preditivo de um determinado alelo é resultado de uma combinação entre o
odds radio e a frequência do alelo na população. O odds ratio de qualquer alelo
envolvido na promoção do CaP em uma determinada população, geralmente é
muito baixo, provavelmente devido aos vários caminhos genéticos possíveis que
podem estar relacionados ao desenvolvimento da doença. Embora o risco de
57
desenvolvimento do CaP em uma população associada com qualquer mutação
alélica seja baixo, quando se trata de uma mutação conhecida, o risco pode ser
bastante elevado para os indivíduos que possuem a alteração. Devemos
considerar a possibilidade de que, mesmo em famílias com uma forte história de
CaP, o desenvolvimento da doença pode não ser devido a uma única mutação,
mas sim a uma combinação poligênica de alelos de predisposição.
Devido à heterogeneidade do CaP no geral, os testes genéticos
representam um grande desafio técnico. Ainda assim, os avanços tecnológicos
da atualidade permitem testar a presença de muito mais loci que no passado. O
sequenciamento completo do genoma é hoje uma realidade e está se tornando
cada vez mais viável comercialmente. Embora a tecnologia de sequenciamento
ainda não tenha atingido a confiabilidade nem a capacidade de interpretação
necessária para ser usada na triagem em massa, as técnicas estão melhorando
rapidamente. No momento, o PSA continua a ser a principal ferramenta para
avaliar o risco de CaP. No entanto, é provável que no futuro, os testes genômicos
irão melhorar a estratégia de diagnóstico do teste do PSA.
Diversos estudos já mostraram avanços que podem ser aliados a práticas
já estabelecidas. Em um estudo GWAS realizado na Islândia, alelos localizados
nos cromossomos 10q26, 12q24 e 19q13.33 foram associados com altos níveis
de PSA e com biópsias prostáticas negativas (152). Um outro estudo com 505
homens mostrou que diversos SNPs nos cromossomos 10 e 19 modificaram
significativamente o risk ratio para CaP e não mostraram qualquer relação com
os níveis de PSA (153). Uma avaliação similar de um painel com alguns desses
58
alelos em diferentes populações mostrou redução na necessidade de biópsias
(154).
Modelos de risco futuros úteis no ambiente clínico provavelmente irão
incorporar vários loci de risco ao invés de variantes individuais e podem ser
dependentes da origem étnica de cada paciente. A combinação entre
ferramentas genéticas e informações clínicas conduziram a geração de um novo
foco na medicina: o tratamento do câncer personalizado. Esta nova meta não
envolve somente ferramentas para a detecção do câncer com novos
biomarcadores, mas também a melhoria na eficácia das ferramentas genéticas
e nas tecnologias de sequenciamento de nova geração para pacientes com
câncer e seus familiares. Estas novas abordagens irão oferecer a possibilidade
de detecção mais precoce da patologia e um tratamento diferente ou específico,
dependendo do genótipo do indivíduo. Isso permitirá a criação de diferentes
protocolos para o tratamento de cânceres mais agressivos e a possibilidade de
realizar controles preliminares em famílias consideradas de risco. Embora muitos
passos significativos no tratamento do CaP tenham sido dados no que diz
respeito a assuntos clínicos e informações genéticas, ainda há um longo
caminho a ser percorrido.
Limitações do estudo
Nosso trabalho envolveu a análise de 13 polimorfismos associados a
fatores de risco para o desenvolvimento do CaP em 185 indivíduos
diagnosticados com a neoplasia e 70 indivíduos saudáveis. Como fatores
59
limitantes do nosso estudo destacamos o relativo pequeno número de pacientes
incluídos no trabalho, embora o mesmo tenha se baseado em outros estudos da
literatura sabemos que estudos de polimorfismos genéticos podem ter uma
amostra muito grande normalmente até captada em diversos centros.
60
6. CONCLUSÕES
61
Através das análises realizadas concluímos que os SNPs rs10486567
(JAZF1) e rs9364554 (SLC22A3) estão associados ao CaP e que seus alelos
polimórficos aumentam em 2 vezes a predisposição para esta neoplasia. O
polimorfismo rs8072254 (AR) parece exercer um efeito protetor para o CaP e o
SNP rs1271572 (ESR2) foi mais frequente no grupo de pacientes com CaP
esporádico.
Considerando os fatores prognósticos do CaP concluímos que o SNP
rs3808330 (EN2) está associado com menores níveis de PSA. O polimorfismo
rs7501939 (HNF1β) está associado a menor escore de Gleason e a ausência de
recidiva bioquímica. O SNP rs5945572 (NUDT10/11) apresentou associação
com menor escore de Gleason.
62
7. ANEXOS
63
Anexo 1. Questionário aplicado aos pacientes com CaP
Questionário
Nome: Idade:
Parentes de 1º grau com CP? ( ) sim ( ) não
Quantos?
Qual a idade aproximada que tinham quando o câncer foi descoberto?
São pacientes do Dr. Miguel Srougi? ( ) sim ( ) não
Se sim, qual o nome?
Caso possua parentes de 1º grau com CP, tem algum irmão com mais de 55 anos sem CP? ( ) sim ( ) não
Se sim, e ele também for paciente do Dr. Miguel, gostaríamos que ele participasse do estudo. Você poderia nos fornecer nome e telefone?
Atualização de endereço:
E-mail:
Fez uso de hormônios?
Fez radioterapia?
Fez uso de outros medicamentos para próstata?
Existem outros tipos de tumores na família?
64
8. REFERÊNCIAS
65
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