UNIVERSIDADE DO EXTREMO SUL CATARINENSE UNIDADE ACADÊMICA DE CIÊNCIAS DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE DAIANE BIFF CORRELAÇÃO DOS MARCADORES INFLAMATÓRIOS DE FASE AGUDA COM A ALTERAÇÃO COGNITIVA A LONGO PRAZO CRICIÚMA, FEVEREIRO DE 2010
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UNIVERSIDADE DO EXTREMO SUL CATARINENSE
UNIDADE ACADÊMICA DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
DAIANE BIFF
CORRELAÇÃO DOS MARCADORES INFLAMATÓRIOS DE FASE
AGUDA COM A ALTERAÇÃO COGNITIVA A LONGO PRAZO
CRICIÚMA, FEVEREIRO DE 2010
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DAIANE BIFF
CORRELAÇÃO DOS MARCADORES INFLAMATÓRIOS DE FASE
AGUDA COM A ALTERAÇÃO COGNITIVA A LONGO PRAZO
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde para obtenção do título de Mestre em Ciências da Saúde.
Orientador: Prof. Dr. Felipe Dal Pizzol
CRICIÚMA, FEVEREIRO DE 2010.
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus por ter me dado forças para superar os desafios que encontrei e
chegar até aqui.
Agradeço aos meus pais pelo incentivo, carinho e por acreditar sempre que eu
conseguiria. Obrigada pelas noites sem dormir, pelos “extras” no orçamento, pela
força e reconhecimento.
Agradeço ao meu companheiro que esteve do meu lado, com apoio e força que
sempre precisei, nunca me deixando desamparada nos momentos mais difíceis.
Obrigada pela alegria, palavras de conforto e ânimo e, principalmente, por todo amor
dedicado.
Agradeço aos meus irmãos pelo incentivo e apoio de sempre, em quaisquer
situações.
Agradeço de coração ao meu orientador Professor Dr Felipe Dal Pizzol que me
ajudou muito com a bolsa de estudos da CAPES /PROCAD, sem ela eu não
conseguiria concluir o mestrado. Agradeço ainda pela amizade, pelos sustos e pelas
pesquisas que tanto me acrescentaram no âmbito pessoal e profissional.
Agradeço ao laboratório de Fisiopatologia, onde passei boa parte dos meus dias
estudando, trabalhando. Obrigada às pessoas que nele se encontram, pelos braços
sempre abertos a me receber com carinho.
Agradeço aos meus amigos e colegas de mestrado, pude conhecer pessoas que
mostraram o verdadeiro valor da palavra amizade.
Agradeço à minha amiga Giselli Scaini que sempre esteve do meu lado me ajudando
com os compromissos do mestrado e, principalmente foi meu ombro direito na fase
final desta dissertação.
Dedico esta dissertação aos meus pais e
meu noivo pela paciência e incentivo de
sempre. Sem o apoio deles eu não teria
conseguido.
RESUMO
A sepse é uma síndrome complexa caracterizada por um desequilíbrio entre a resposta pró-inflamatória e anti-inflamatória ao patógeno. Ela deve ser entendida como um processo, já que ela pode derivar de múltiplas causas e envolvem múltiplos processos. A ocorrência e a evolução da clínica estão diretamente ligadas à resposta imune. A inflamação é uma resposta tecidual à agressão a despeito da natureza do agente causador. Inicia de maneira localizada, desencadeada por uma série de processos inflamatórios considerados fisiológicos, ou seja, uma resposta tecidual protetora do organismo ao agente agressor. Nesta cascata, as moléculas desencadeantes estimulam a liberação de mediadores primários como o TNF-α (fator de necrose tumoral alfa) e interleucina-1 (IL-1). Nos doentes sépticos, encontram-se com frequência níveis elevados de mediadores pró-inflamatórios como o TNF-α e a IL-1, assim como níveis elevados de citocinas essencialmente anti-inflamatórias, como a Interleucina 10. Esses biomarcadores podem se tornar aliados como indicadores de processos biológicos normais, processo patogênico, ou resposta farmacológica a uma intervenção terapêutica. Além deles, os níveis de estresse oxidativo tem importantes mecanismos envolvidos na fisiopatologia da sepse. A geração maciça de espécies reativas de oxigênio (ROS) durante a sepse compromete funções como a sobrevivência da célula. Todos esses mecanismos estão envolvidos na fisiopatologia da encefalopatia séptica que parece ser multifatorial, como sugerido por alguns estudos. Estas pesquisas propõem que os organismos infectantes ou suas toxinas não são os responsáveis diretos pela encefalopatia, mas sim a inflamação sistêmica resultante da infecção. Vários estudos têm demonstrado que os sobreviventes de sepse apresentam comprometimento cognitivo a longo prazo, incluindo as alterações de memória, atenção, concentração e/ou perda da função cognitiva global. Desse modo, verificamos neste trabalho a correlação dos marcadores inflamatórios de fase aguda e de estresse oxidativo, como o TNF-α e a Interleucina 1 e 10 com os níveis de espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), respectivamente, com a memória a longo prazo. Nossos resultados comprovaram o dano cognitivo a longo prazo em ratos com indução de sepse. Também demonstraram que os níveis de TNF-α e TBARS elevaram-se consideravelmente nos ratos que tiveram a indução de sepse, quando comparados ao controle. Demonstraram dentro do grupo CLP, que os ratos que tiveram melhor desempenho no teste de esquiva inibitória tiveram alta concentração de TNF-α e TBARS logo nas 6 horas após a indução. Puderam mostrar que os ratos que tiveram maior inflamação e maior índice de estresse oxidativo obtiveram melhor desempenho de memória a longo prazo. Desse modo, pode-se entender que o estresse e a inflamação aumentada fisiologicamente na sepse significa um sinal de preparo do organismo para combater com mais eficiência o patógeno, levando a uma melhor adaptação celular.
Sepsis is a complex syndrome characterized by an imbalance between pro-inflammatory and anti-inflammatory responses to the pathogen. It must be understood as a process, since it can derive from multiple causes and involve multiple processes. The clinical occurrence and evolution are directly linked to immune response. Inflammation is a tissue response to aggression, regardless of the nature of the causing agent. It starts in a localized way, triggered by a series of physiological inflammatory processes, i.e., an organism’s protective tissue response to the attacker agent. In this cascade, triggering molecules stimulate the release of primary mediators like TNF-α (tumor necrosis factor alpha) and interleukin-1 (IL-1). In septic patients, high levels of pro-inflammatory mediators such as TNF-α and IL-1 are often found, as well as high levels of essentially anti-inflammatory cytokines, such as interleukin 10. These biomarkers may be used as indicators of normal biological processes, pathogenic processes, or pharmacological response to therapeutic intervention. Besides them, the oxidative stress levels and its mechanisms are involved in the pathophysiology of sepsis. The massive reactive oxygen species’ (ROS) generation during sepsis undertakes functions such as cell survival. All these mechanisms are involved in the pathophysiology of septic encephalopathy, which seems to be multifactorial, as suggested by some studies. These researches propose that the infecting organisms or their toxins are not directly responsible for the encephalopathy, but the inflammation resulting from infection is linked to the disease. Several studies have shown that sepsis’ survivors have long-term cognitive impairment, including memory, attention, and concentration changes; and / or global cognitive function loss. Thus, this study found a correlation between acute phase inflammatory markers, such as TNF-α and Interleukin 1 and 10, and the oxidative stress with the levels of thiobarbituric acid reactive species (TBARS), respectively, with the long-term memory. Our results confirm the long-term cognitive impairment in rats with induced sepsis. They also showed that TNF-α and TBARS levels increased considerably in mice that had the induction of sepsis, when compared to control. In the CLP group, the results demonstrate that mice with a better performance in inhibitory avoidance test had higher concentrations of TNF-α and TBARS in the first 6 hours after induction. This study also shows that mice with greater inflammation and increased oxidative stress levels had a better performance of long-term memory. Therefore, it’s possible to understand that the oxidative stress and the physiologically increased inflammation in sepsis is due to the preparation of the body to effectively combat the pathogen, leading to better cellular adaptation.
resultado de sepse. Assim, a expressão local de IL-10 no timo reduz a apoptose do
tecido local e ativação da caspase-3 e parece atenuar a resposta sistêmica de
citocinas pró-inflamatórias (Tschoeke et al., 2008).
1.7 Sepse e o extresse oxidativo
O estresse oxidativo é um dos vários e mais importantes mecanismos
envolvidos na fisiopatologia da sepse. A geração maciça de ROS durante a sepse
compromete as funções bem como a sobrevivência da célula, especificamente
agindo sobre a mitocôndria e alterando a fosforilação oxidativa por meio da inibição
dos complexos enzimáticos, gerando mais ROS e tendo como desfecho final a
diminuição da produção energética mitocondrial que por fim culmina com morte
celular (Clementi et al., 1998; Siami et al., 2008).
A resposta inflamatória determina a liberação de radicais livres de oxigênio,
os quais mantêm um ciclo vicioso de lesão-inflamação-ativação de fatores
nucleares. Nesse ponto, houveram muitos estudos a respeito do estresse oxidativo
na sepse. A sepse gera um estado de desequilíbrio entre a produção de oxidantes e
antioxidantes, gerando um excesso de radicais livres de oxigênio. Essas moléculas
têm a função de destruir o agente agressor, entretanto não são específicas e
acabam por determinar lesão também no hospedeiro (Macdonald & Webster 2003).
Basicamente o que se observa é um desequilíbrio entre a produção de ROS
(principalmente pelos complexos I e IV) e os agentes contra-reguladores
(antioxidantes fisiológicos), principalmente as enzimas catalase (CAT) e superóxido
dismutase (SOD) (Barichello et al., 2006), nas células de órgãos vitais (Crouser,
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2004). Ritter et al. (2003) demonstraram que a atividade da CAT estava reduzida
durante a sepse, havendo mais acúmulo de ROS e por consequência maior dano. Já
foi demonstrado experimentalmente a existência de dano neuronal em algumas
regiões do cérebro de ratos causados por ROS, após indução de sepse por CLP.
Esses achados são de grande valor, pois ajudam a explicar a alteração da
consciência presente na encefalopatia séptica (Streck et al., 2008).
Estudos têm demonstrado que a disfunção orgânica está associada à hipóxia
citopática, mediada por radicais livres de oxigênio lesando a mitocôndria (Fink,
2002). Sabe-se que o dano orgânico secundário ao choque séptico está associado à
liberação de radicais livres de oxigênio. Mais ainda, o estado redox celular influencia
a ativação do fator nuclear κB (NFκB) que iniciará o processo imunoinflamatório
observado na sepse, com liberação de interleucinas e amplificação da resposta do
hospedeiro (Batra et al., 2000).
A resposta inflamatória gerada na sepse é mediada por fatores de transcrição
nuclear, destacando-se o NFκB. A ativação desse fator pode ocorrer via
reconhecimento de patógeno pelos receptores Toll-like na membrana celular ou por
alterações no estado redox celular. Tais flutuações no estado redox teriam a
capacidade de deflagrar uma resposta inflamatória no hospedeiro, via ativação de
fatores de transcrição nuclear. Nesse ponto, então, se tem uma situação na qual a
resposta determina liberação de radicais livres que continuará ativando fatores
nucleares e amplificará a resposta inflamatória (Vistos & Rocha Fuente, 2004).
1.8 Sepse e Sistema Nervoso Central
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Vários estudos têm demonstrado que os sobreviventes da UTI apresentam
comprometimento de funções cognitivas em longo prazo, incluindo alterações de
memória, atenção, concentração e/ou perda da função cognitiva global (Angus et al.,
2001; Gordon et al., 2004; Granja et al., 2005). Estudos envolvendo modelos
animais de sepse em modelos murinos de ligação e perfuração cecal (CLP) são
clinicamente relevantes, uma vez que induzem uma sepse polimicrobiana que imita
a sepse humana (Ritter et al., 2004).
O termo dano cognitivo, tal como definido aqui se refere a anormalidades
clinicamente significativas em um ou mais funções do cérebro incluindo memória,
atenção, velocidade de processamento mental, função executiva, habilidades visuo-
espaciais e função intelectual. O prejuízo cognitivo pode ser leve, moderado ou
grave e pode limitar a capacidade do indivíduo de pensar, raciocinar e executar as
tarefas diárias (Streck et al., 2008).
Recíprocas interações entre o sistema imunológico e sistema nervoso central
(SNC) são considerados os principais componentes da resposta do hospedeiro em
estado de choque séptico. O cérebro é muitas vezes considerado um órgão
privilegiado, pois é anatomicamente isolado do sistema imunológico pela barreira
hemato-encefálica (BBB), carente de um sistema linfático e com baixa expressão de
antígenos do complexo histocompatibilidade em seu parênquima celular (Sharshar
et al., 2003).
O SNC controla uma grande variedade de funções fisiológicas que são
cruciais para manter a homeostase da resposta do hospedeiro em níveis
comportamentais, neuroendócrinos e níveis autonômicos. Alterações em qualquer
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uma dessas funções adaptativas podem influenciar o curso de choque séptico.
(Sharshar et al., 2003).
Os efeitos biológicos causados pela liberação de citocinas se refletem no
SNC, como: febre, anorexia (Maier et al., 1998), e ativação do eixo hipotálamo-
pituitária-adrenal, tendo por resultado o aumento da produção dos corticóides
adrenais (Licínio & Wong, 1997). As interações recíprocas entre o sistema nervoso
central e o sistema imunológico são considerados como os componentes principais
da resposta inflamatória a sepse, o que acaba causando alterações nos sistemas
neuroendócrino, autonômico (Chrousos, 1995), comportamental (Gordon et al.,
2004) e distúrbios em quaisquer funções adaptáveis como as respostas
inflamatórias e hemodinâmicas no SNC (Saper & Breder, 1994; Sharshar et al.,
2003; Sharshar et al., 2004).
A fisiopatologia da encefalopatia séptica parece ser multifatorial, pois estudos
sugerem que os organismos infectantes ou as toxinas produzidas por eles não são
os responsáveis diretos pela encefalopatia, mas sim a inflamação sistêmica
resultante da infecção. A sequência de eventos que leva à inflamação sistêmica
inclui a ativação de leucócitos e liberação de mediadores inflamatórios. O cérebro
comporta-se de maneira diferente, pois a presença da barreira hemato-encefálica e
a diminuição da expressão de moléculas de adesão (VCAM-1 e ICAM-1) nesse
tecido impedem o acúmulo de leucócitos no mesmo. Apesar desse acúmulo não
ocorrer no cérebro, sabe-se que mediadores inflamatórios passam pela barreira
hemato-encefálica e provocam efeitos importantes nesse tecido. Estudos sugerem
que esses mediadores provocam alterações significativas nas células endoteliais
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cerebrais, responsáveis pela integridade da barreira hemato-encefálica e pela
proteção e isolamento do cérebro (Papadopoulos et al., 2000).
Portanto, a inflamação sistêmica decorrente de um foco infeccioso ou outras
causas, parece ser a causa mais plausível da encefalopatia séptica (Deitch, 1998).
Endotoxinas ou outros produtos bacterianos ativam macrófagos e linfócitos, os quais
geram dano neuronal (Bardenheuer et al., 1999; Weigand et al., 1999; Bauer et al.,
2000). A ocorrência do dano oxidativo e produção aumentada de citocinas (IL-1; IL-
2; TNF-α) parecem ter sinaptotoxidade causando morte neuronal (Papadopoulos et
al., 2000).
Além disso, as células gliais, células com função de suporte e homeostase no
SNC e cuja ativação/desregulação pode levar à lesão e morte neuronal por diversos
mecanismos, parecem participar efetivamente do dano cerebral na sepse. Estudos
mostram que alterações nas funções dos astrócitos podem induzir morte neuronal
por diminuição da regulação de fluxo cerebral local, redução da atividade sináptica
causada por menor aporte de nutrientes aos neurônios e aumento da
permeabilidade da barreira hemato-encefálica (Papadopoulos et al., 2000).
1.9 Modelo animal de sepse
Realizar pesquisas experimentais de sepse em humanos são difíceis devido à
severidade da doença, a necessidade de intervenções terapêuticas imediatas e a
heterogeneidade dos pacientes. Devido a isso, modelos animais tornam-se opções
de estudos para explorar a patogênese e determinar dados pré-clínicos capazes de
propor intervenções terapêuticas corretas. Para estas propostas, deve-se utilizar um
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modelo animal que reproduza as características da sepse: vasodilatação,
hipotensão, aumento do débito cardíaco, resposta ao tratamento e mortalidade
vistos em pacientes sépticos.
Alguns modelos animais de indução de sepse são muito utilizados, como a
sepse induzida pelo LPS ou por TNF-α que reproduz exemplo de sepse abdominal e
sepse cutânea. Desse modo, também os modelos que induzem peritonite são
bastante aceitos e utilizados.
Entretanto, o modelo mais aceito, conhecido hoje, e que parece reproduzir
mais adequadamente o quadro clínico de sepse, é o chamado CLP (cecal ligation
and perforation). O modelo de CLP tem contribuído para elucidar a patogênese e
determinar novas terapias em sepse (Ritter et al., 2004). Também tem sido
amplamente utilizados para explicar o comprometimento cognitivo dos sobreviventes
da sepse (Ritter et al., 2004). Este modelo refere-se a ligação do ceco logo abaixo
da válvula ileocecal (desta forma não obstruindo todo o trânsito intestinal) e
perfuração do ceco com agulha de tamanho padronizado e a liberação de conteúdo
fecal para a cavidade peritoneal, conforme classicamente descrito por Wichterman e
coleboradores em 1980.
Com isso, além de induzir a peritonite ocasiona uma isquemia mesentérica
simulando melhor as grandes síndromes clínicas de sepse abdominal.
Recentemente este modelo foi modificado para melhor simular as características
clínicas dos pacientes com sepse abdominal, incluindo desta maneira a
ressuscitação volêmica e o emprego de antibióticos de amplo espectro (Hollenberg
et al., 2001).
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2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Avaliar a correlação entre os marcadores inflamatórios de fase aguda e a
alteração cognitiva a longo prazo.
2.2 Objetivos Específicos
Avaliar os efeitos da sepse sobre os níveis de TNF-α, interleucinas 1 e 10 em
líquor na fase aguda da inflamação.
Correlacionar os resultados dos testes de memória à longo prazo com os
níveis de marcadores inflamatórios de fase aguda.
Avaliar os efeitos da sepse sobre os níveis de TBARS.
Correlacionar os resultados dos testes de memória à longo prazo com os
níveis de TBARS na fase aguda.
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3 METODOLOGIA
Os experimentos foram feitos na Universidade do Extremo Sul Catarinense –
UNESC – nos laboratórios de Neurociências e de Fisiopatologia Experimental.
Todos os procedimentos experimentais foram realizados de acordo com as
recomendações internacionais para o cuidado e o uso de animais de laboratório,
além das recomendações para o uso de animais da Sociedade Brasileira de
Neurociências e Comportamento (SBNeC).
3.1 Animais experimentais
Foram utilizados 80 ratos Wistar machos (60 dias) procedentes do Biotério da
UNESC. Os animais foram acondicionados em 5 animais por caixa, com ciclo claro -
escuro de 12 horas (07:00h às 19:00h) e comida e água ad libitum. O ambiente será
mantido a temperatura de 23 + 1º C. Todos os animais (ratos Wistar, adultos,
machos) randomizados participarão dos experimentos.
Os animais foram mortos por decapitação (guilhotina) e o descarte dos
mesmos será o acondicionamento em saco branco leitoso e, em seguida, serão
encaminhados para freezer (conservação) na universidade e após foram coletados e
transportados por empresa terceirizada.
3.2 Modelo Animal de CLP
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Primeiramente os ratos foram divididos em dois grupos. O grupo Sham
(controle) e grupo Sepse. Todos os ratos foram anestesiados com Cetamina
(50mg/kg) injetados na parte intraperitoneal. Os animais foram submetidos a CLP
como previamente descritos (Fink & Heard, 1990) (figura 1). Primeiramente os ratos
foram submetidos a laparotomia abdominal (passo1). Os ratos tiveram o ceco
exposto (passo 2) e firmemente amarrados (não ocluindo totalmente a luz de
passagem da parede intestinal) com sutura de fio seda de 3.0mm, debaixo da
válvula de ileocecal (passo 3). O grupo sham terá o ceco apenas exposto e colocado
novamente dentro da cavidade peritoneal. O grupo sepse, antes de recolocado o
ceco de volta à cavidade peritoneal teve o ceco perfurado uma vez com uma agulha
de 14mm (passo 4). O ceco foi apertado suavemente para expulsar uma quantia
pequena de conteúdo fecal do local de perfuração e então devolvido na cavidade
peritoneal (passo 5), em seguida foi realizado o fechamento da incisão peritoneal
com fio de suturas de seda de 4.0.
Os animais foram hidratados com solução salina (50 mL/kg subcutâneo)
imediatamente e 12 h após realização de CLP (passo 6). Todos os animais foram
devolvidos às suas gaiolas com acesso livre para comida e água. O grupo sepse
recebereu a cada 6 horas durante 3 dias, antibioticoterapia com 30 mg/kg
ceftriaxone e 25 mg/kg clindamicina. O grupo sham recebereu solução salina
correspondente à quantidade de administração da antibioticoterapia.
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Figura 1: Modelo animal de sepse.
3.3 Teste de esquiva inibitória
Este teste consegue avaliar a memória a longo prazo do animal. Ele foi
realizado 2 vezes, 30 dias após indução de sepse. Primeiramente como pré-teste e
24 horas após, realizado o teste.
O equipamento consiste em uma caixa de acrílico (50 x 25 x 25 cm) na qual o
piso é formado por barras paralelas de metal (1 mm de diâmetro). Os espaços entre
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as barras medem 1 cm. Uma plataforma com 7 cm de largura e 2,5 cm de altura é
colocada junto à parede esquerda do aparelho (Quevedo et al., 1997; Roesler et al.,
2003; 2004).
Na sessão de treino os animais foram colocados sobre a plataforma e
determinou-se o tempo que o animal levava para descer com as quatro patas da
plataforma. Esse tempo é denominado latência. Imediatamente após descer da
plataforma (com as 4 patas), o animal recebeu um choque de 0,4 µA durante 2
segundos.
Na sessão de teste, o animal foi novamente colocado na plataforma e
determinou-se o tempo que o mesmo levava para descer da plataforma (latência),
porém não foi administrado choque. Sendo que após 180 segundos de latência os
ratos seriam retirados da caixa.
A latência é um parâmetro clássico de retenção de memória. Os intervalos
entre o treino e o teste foi de 24 horas para memória de longa duração (Izquierdo et
al., 1998; Quevedo et al., 1997; Roesler et al., 2003; 2004).
Figura 2: Plataforma teste de esquiva inibitória.
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3.4 Determinação de citocinas (IL-1 e IL-10) e TNF-α no líquor
As concentrações de IL-1, IL-10 e TNF-α foram avaliadas 6 horas após a
indução da sepse. No tempo inicial (6 horas) o sangue foi coletado através de
punção da veia ocular. IL-1, IL-10 e TNF-α foram determinados pelo método imuno-
enzimático: Standard Sandwich Enzymelinked Immunosoberbent Assay (ELISA),
empregando kits comercias (R & D Systems, Minneapolis, MN).
3.5 Medida de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS)
Como indício de peroxidação lipídica e avaliação de dano oxidativo será
medida a concentração de TBARS tecidual durante uma reação ácida aquecida
como previamente descrito (Draper, 1990). Brevemente, as amostras obtidas (líquor)
serão misturadas com 1mL de ácido tricloroacético 10% e 1mL de ácido
tiobarbitúrico, fervidas por 15 minutos, e após a quantidade de TBARS será
determinada pela absorbância em 532 nm por espectrofotometria.
3.6 Análise Estatística
A análise estatística foi realizada utilizando o programa SPSS (Statistical
Package for the Social Sciences) versão 17.0. Os dados serão expressos em forma
de média e desvio padrão e analisados pelo teste T Student com P<0,05
considerado estatisticamente significativo.
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4 RESULTADOS
No presente estudo realizamos as dosagens de TNF-α, interleucinas 1 e 10 e
TBARS 6 horas após a realização de CLP como marcadores de inflamação e de
lipoperoxidação, relacionando tais concentrações com o cognição a longo prazo.
A avaliação de memória dos grupos, através do teste de esquiva inibitória,
comprova que há realmente déficit neurológico, como mostrado na figura 3. O grupo
Sham (controle) teve seu tempo de latência estatisticamente maior que os ratos
submetidos a CLP.
Figura 3: Tempo de latência do teste de esquiva inibitória em ratos submetidos ao modelo animal de sepse. Os valores são apresentados em média ± DP e os resultados foram expressos em segundos, analisados pelo Teste T Studant considerado significante * p <0,05. N= .
Foram avaliadas as concentrações de IL-1 e IL-10 em animais submetidos ao
modelo animal de sepse por CLP, as avaliações foram realizadas 6 horas após a
indução. Os animais do grupo CLP apresentaram um aumento significativo nos
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níveis de IL-1 no líquor em comparação com o grupo sham (figuras 4 e 5,
respectivamente). Entretanto não foram encontradas diferenças significativas nos
níveis da IL-10 quando comparada ao grupo sham.
Figura 4: Concentração de IL-1 em líquor de ratos submetidos ao modelo animal de sepse (6 horas após). Com N=80. Os valores são apresentados em média ± DP e os resultados foram expressos em pg/mL, analisados pelo Teste T Studant considerado significante * p <0,05 (em relação ao grupo SHAM).
Figura 5: Concentração de IL-10 em líquor de ratos submetidos ao modelo animal de sepse (6 horas após). Com N = 80. Os valores são apresentados em média ± DP e os resultados foram expressos em pg/mL, analisados pelo Teste T Studant considerado significante * p <0,05 (em relação ao grupo SHAM).
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Dentre o grupo CLP, selecionamos os 50% e 25% dos ratos que tiveram
melhor desempenho no teste de esquiva inibitória e correlacionamos com os níveis
de IL-1 e IL-10 (figuras 6, 7, 8 e 9, respectivamente). Não encontramos diferença
estatística nessas correlações.
Figura 6: Correlação dos níveis de IL-1 com o desempenho do teste de esquiva inibitória submetidos ao modelo animal de sepse (6 horas após) Percentil 50. Com N=. Os valores são apresentados em média ± DP e os resultados foram expressos em pg/mL, analisados pelo Teste T Studant considerado significante * p <0,05 (Apenas no grupo CLP).
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Figura 7: Correlação dos níveis de IL-1 com o desempenho do teste de esquiva inibitória submetidos ao modelo animal de sepse (6 horas após) Percentil 75. Com N=. Os valores são apresentados em média ± DP e os resultados foram expressos em pg/mL, analisados pelo Teste T Studant considerado significante * p <0,05 (Apenas no grupo CLP).
Figura 8: Correlação dos níveis de IL-10 com o desempenho do teste de esquiva inibitória submetidos ao modelo animal de sepse (6 horas após) Percentil 50. Com N=. Os valores são apresentados em média ± DP e os resultados foram expressos em pg/mL, analisados pelo Teste T Studant considerado significante * p <0,05 (Apenas no grupo CLP).
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Figura 9: Correlação dos níveis de IL-10 com o desempenho do teste de esquiva inibitória submetidos ao modelo animal de sepse (6 horas após) Percentil 75. Com N=. Os valores são apresentados em média ± DP e os resultados foram expressos em pg/mL, analisados pelo Teste T Studant considerado significante * p <0,05 (Apenas no grupo CLP).
Os níveis de TNF-α após em 6 horas da indução da sepse aumentaram
consideravelmente nos ratos submetidos a CLP quando comparados com o grupo
sham (figura 10).
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Figura 10: Concentração de TNF-α em líquor de ratos submetidos ao modelo animal de sepse (6 horas após). Com N=80. Os valores são apresentados em média ± DP e os resultados foram expressos em pg/mL, analisados pelo Teste T Studant considerado significante * p <0,05 (em relação ao grupo SHAM).
Não encontramos correlação estatisticamente significativa ao compararmos
os níveis de TNF-α e TBARS com o desfecho dos animais submetidos a CLP
(figuras 11 e 12, respectivamente).
Figura 11: Correlação dos níveis de TNF-α em líquor 6 horas após indução modelo animal de sepse em ratos com o desfecho. * Com N=36. Os valores são apresentados em média ± DP e os resultados foram expressos em pg/mL x10-3, analisados pelo Teste T Studant considerado significante * p <0,05 (em relação ao grupo SHAM).
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Figura 12: Correlação dos níveis de TBARS em líquor 6 horas após indução modelo animal de sepse em ratos com o desfecho. * Com N=36. Os valores são apresentados em média ± DP e os resultados foram expressos em pg/mL x10-3, analisados pelo Teste T Studant considerado significante * p <0,05 (em relação ao grupo SHAM)
Ao analisarmos os 50% dos ratos que tiveram melhor desempenho no teste
de esquiva inibitória e correlacionamos com os níveis de TNF-α coletados 6 horas
após indução de CLP, encontramos significativo aumento de TNF-α nos animais que
apresentaram melhor desempenho (figura 13).
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Figura 13: Correlação dos níveis de TNF-α submetidos ao modelo animal de sepse (6 horas após) Percentil 50. * Com N=13. Os valores são apresentados em média ± DP e os resultados foram expressos em pg/mL x10-3, analisados pelo Teste T Studant considerado significante * p <0,05 (Apenas grupo CLP).
Verificou-se na figura 14 um aumento considerável nos níveis de TBARS nos
ratos submetidos ao modelo animal de sepse quando comparados ao grupo sham.
Figura 14: Lipoperoxidação em líquor de ratos submetidos ao modelo animal de sepse (6 horas após). Os valores são apresentados em média ± DP e os resultados foram expressos em nmol de TBARS/mg de proteínas. * p < 0,05 (em relação ao grupo SHAM).
40
Observa-se que os níveis de TBARS dosados nos grupos com melhor e pior
desempenho no teste de esquiva inibitória estão aumentados nos ratos que
apresentaram um melhor desempenho quanto ao tempo de latência. Dentre os ratos
que apresentaram melhor desempenho do grupo sepse, selecionamos 25% dos
ratos que tiveram melhor desempenho, sendo que nestas avaliações observou-se
que os níveis de TBARS estão aumentados nos ratos que apresentaram um melhor
desempenho quanto ao tempo de latência (figura 15).
Figura 15: Lipoperoxidação em líquor de ratos submetidos ao modelo animal de sepse (6 horas após) Percentil 75. Os valores são apresentados em média ± DP e os resultados foram expressos em nmol de TBARS/mg de proteínas. * p < 0,05.
41
5 DISCUSSÃO
As incapacidades observadas neste estudo, como as alterações cognitivas,
são verificadas em sobreviventes de sepse, principalmente a incapacidade na
memória. Desta forma, o modelo de CLP pode ajudar a investigar os mecanismos
biológicos que estão associados com a incapacidade cognitiva, determinando
possíveis ações terapêuticas para esta situação. Estudos prévios em pacientes em
Unidade de Terapia Intensiva que apresentaram sepse constataram que estes
pacientes apresentam alguma incapacidade cognitiva na alta hospitalar (Hopkins et
al., 1999; Granja et. al, 2004). Apesar disso, os mecanismos envolvidos na
incapacidade cognitiva ainda não estão bem elucidados.
Nossos estudos demonstram que os animais sépticos submetidos ao teste de
esquiva inibitória apresentaram um tempo de latência menor quando comparados ao
controle. O teste de esquiva inibitória envolve vários estímulos, incluindo percepção
espacial e visual, sensibilidade a dor, acompanhados de um componente emocional
amplamente controlados por hormônios relacionados ao estresse (Gold, 1986).
Estes resultados indicam que o déficit de memória persiste após 30 dias da indução
de sepse. Essa persistência reforça a idéia que este modelo poderia ser uma
ferramenta importante no estudo das sequelas cognitivas em sobreviventes à sepse.
Barrichello e colaboradores (2006) demonstraram que 10 dias após a indução
de sepse por CLP, os ratos apresentaram diminuição da capacidade de memória
aversiva, mostrando que o grupo sepse necessita aproximadamente duas vezes
mais estímulos para alcançar o critério de aquisição de memória, quando comparado
com o grupo sham, comprovando, assim, a dificuldade na aprendizagem.
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Semmler e colaboradores (2007) mostraram que ratos submetidos à sepse
pelo modelo LPS (injeções de lipopolissacarídeos) apresentaram após 3 meses,
alterações comportamentais, dano neuronal em sub-regiões hipocampais e redução
da inervação colinérgica em áreas corticais.
Em um modelo animal de sepse induzido por LPS, foram encontrados
mecanismos conhecidos de apoptose no hipocampo 24 horas após a indução,
sendo assim o mais severamente afetado de sepse (Semmler et al., 2005). As
incapacidades cognitivas parecem estar relacionadas diretamente aos processos
dependentes do hipocampo, danificando a memória (Squire e Zola-Morgan, 1991)
Similarmente, como indicou Semmler e colaboladores (2007) em estudo,
caracterizado por uma redução significativa na densidade dos neurônios na região
CA1/CA2 do hipocampo.
Como clinicamente quase nenhuma manifestação pode ser considerada
exclusiva da sepse, a utilização de outros marcadores inflamatórios torna-se
essencial. Muitas pesquisas sobre marcadores precoces de sepse vem acontecendo
há alguns anos e a utilização das interleucinas parece ser promissora.
Dentre os mediadores endógenos, liberados, primeiramente, pelas células
residentes e, posteriormente, pelas células recrutadas para o foco infeccioso, as
citocinas desempenham um papel primordial na resposta do hospedeiro. Citocinas
como a interleucina-1 (IL-1), o fator de necrose tumoral (TNF-α) e as demais
quimiocinas promovem o recrutamento de leucócitos para o sítio inflamatório, bem
como sua ativação com consequente aumento da atividade microbicida, sendo a
resposta local fundamental para o controle da infecção (Reyes et al., 2003).
43
A evolução de uma infecção localizada para um quadro sistêmico caracteriza-
se pela presença de citocinas pró-inflamatórias na circulação e ativação das células
circulantes, podendo, também, haver a presença de bactérias, endotoxinas ou
exotoxinas (Wei & Li & Li, 1995). Esse fato é responsável pela maioria das
alterações fisiopatológicas, observadas em um quadro clínico de sepse e em
modelos experimentais (Van Der Poll & Sauerwein, 1993).
Como demonstrado em nosso estudo, os níveis de TNF-α e IL-1 elevam-se
significativamente logo nas primeiras horas após a indução de sepse por CLP,
sugerindo que a resposta inflamatória ao agente infeccioso inicia-se imediatamente
após indução de sepse.
Esse aumento de dos níveis de TNF-α e IL-1 corroboram com achados de
outros autores (Girardin et al., 1993; Kilpatrick & Harris, 1998; Dollner et al., 2001;
Reyes et al., 2003).
Além desses dados, quando comparamos os níveis de TNF-α com o teste de
memória a longo prazo em ratos sobreviventes de sepse, podemos encontrar que
25% dos ratos que tiveram melhor desempenho, ou seja, maior tempo de latência,
tiveram seus níveis aumentados. Isto pode mostrar que os animais que tiveram
melhor desempenho a longo prazo, consequentemente, menos dano, foram aqueles
que tiveram maior inflamação inicial. Esta inflamação inicial (antes da sepse
realmente acontecer) funcionaria como uma organização antecipada do sistema
imunológico do organismo do animal. Assim, no momento da agressão pelo
patógeno, seu sistema imunológico estaria mais resistente ou mais preparado,
acarretando em uma defesa inicial importante na prevenção da lesão celular, o que
levaria a tornar-se um mecanismo de proteção celular.
44
Com aumento da inflamação logo no inicio da indução acontece então o
aumento da defesa imunológica de primeiro impacto do animal, ou seja, a
inflamação aumentada é importante apenas na fase inicial da sepse, pois na fase
tardia, o aumento significativo da inflamação acaba sendo outro problema no animal.
Diferentes mediadores da resposta inflamatória da sepse podem levar a
disfunção mitocondrial e esta, a liberação de espécies reativas de oxigênio. Foi
demonstrado que, o dano oxidativo avaliado pela técnica de TBARS ocorrem
precocemente no desenvolvimento do curso da sepse. Os níveis de TBARS foram
significativamente elevados no grupo CLP em relação ao grupo sham.
Em contraste, quando correlacionados apenas dentro do grupo CLP,
encontramos aumento dos níveis de TBARS nos animais que tiveram melhor
desempenho no teste de esquiva inibitória. Ou seja, os ratos sépticos que tiveram
maior tempo de latência no teste de memória a longo prazo, apresentaram maior
concentração de TBARS nas primeiras 6 horas após a indução de CLP.
Logo, o maior tempo de permanência dos ratos que tiveram indução de sepse
na plataforma relacionou-se ao acentuado nível do dano, o que pode levar a
explicação de que os ratos que apresentaram maior dano obtiveram maior
adaptação e melhor desempenho cognitivo.
Talvez esse mecanismo que envolva a proteção celular, não bem
compreendido ainda, seja o fator principal que leve esses ratos a terem um melhor
desempenho no teste de memória.
O que poderia explicar muitos desses acontecimentos seria a indução de
proteínas existentes no interior das células que são induzidas por tipos específicos
de estresse. Como por exemplo, as proteínas de choque térmico (HSP), também
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chamadas de proteínas de estresse. Estas são induzidas por tipos específicos de
estresse como o calor. Um fato importante que explicaria o provável efeito de quanto
maior a inflamação no animal, melhor seu desempenho no teste de cognição é que
ao interagir com um intervalo de HSPs, a proteína é induzida a regular seu
funcionamento. Além disso, membros da família HSP tem sido reconhecidos por
terem efeitos citoprotetor (Weiss et al., 2002).
Dentro da família das HSP, existem algumas proteínas específicas que
desempenham um papel importante como citoprotetora, antiapoptótica, imunológica
e com efeitos de regulação, e é de longe a melhor estudada. O aumento da
expressão de HSP72 em modelos experimentais de acidente vascular cerebral,
sepse, síndrome do desconforto respiratório agudo, insuficiência renal e isquemia
miocárdica foi mostrado para reduzir lesões de órgãos e, em alguns casos, e
melhorar a sobrevida. O aparecimento do gene HSP está associado com melhores
resultados em ratos (Singleton & Wischmeyer, 2006).
Assim, aumento dos níveis de HSP pode indicar não só danos nos tecidos,
mas podem indicar também o sucesso de montagem de uma resposta ao estresse
que se correlaciona com proteção de tecido e melhor desfecho (Ganter et al., 2006).
As HSP foram mostradas para fornecer neuroproteção da isquemia cerebral
em animais com cultura celular em modelos de choque (Giffard & Yenari, 2004).
Também, trabalhos recentes tem demonstrado que elas também podem interferir
diretamente com a vias da morte celular, como apoptose e necrose e pode modular
a inflamação (Jaattela, 1999).
A morte celular programada ocorre por múltiplos caminhos (Leist & Jaattela,
2001). A apoptose ocorre principalmente por um da via intrínseca que responde ao
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estresse e alterações intracelulares, esta se baseia sobre a liberação de moléculas
pró-apoptóticas mitocondriais, a abertura da permeabilidade mitocondrial dos poros
de transição, e ativação de caspases (Gogvadze & Orrenius, 2006).
O segundo bem descrito caminho é a via extrínseca, que é desencadeada
pela ativação de receptores de membrana plasmática que libera sinal através de
domínios de sua morte. Esta sinalização ativa a caspase-8 e pode prosseguir,
independentemente da via intrínseca, mas também pode levar a ativação da via
intrínsica (Kroemer & Martin, 2005).
Apesar de nossos estudos não terem sido correlacionados com os níveis
dessa proteína citoprotetora, ela pode ser a explicação de porque as altas
concentrações dos indicadores de inflamação e de dano oxidativo tiveram direta
relação com o melhor desempenho dos ratos no teste de esquiva inibitória. Talvez
em estudos futuros, seja necessário verificar a correlação desses níveis que se
apresentaram significantes com os níveis iniciais e tardios dessa proteína que
parece ser tão importante nesses animais.
Muitos estudos mostraram fenômenos neurobiológicos envolvidos no dano
cognitivo em sobreviventes da sepse, contudo falta um aprofundamento do
entendimento da fisiopatologia dessa doença e da relação dela com o déficit
cognitivo a curto e longo prazo.
Pode-se afirmar com clareza que os níveis inflamatórios e de danos
oxidativos iniciais nos ratos submetidos à sepse por CLP apresentam ótimos
resultados. Confirmando a teoria de que o organismo que mais concentradamente
responder (em fase inicial) ao agente agressor tem melhor adaptação e,
consequentemente, melhor resultado prognóstico.
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Neste contexto, os resultados deste estudo sugerem uma incapacidade
cognitiva a longo prazo como alterações de memória. É difícil afirmar claramente
com os dados que encontramos o exato mecanismo que leva esse estresse celular a
relacionar-se com a melhoria da capacidade cognitiva dos animais submetidos a
CLP. Verificar a relação desses estudos com níveis de mediadores induzidos pelo
estresse poderia ser uma importante explicação de como exatamente os animais
conseguem apresentar melhor desempenho com maiores níveis de dano e de
expression in the brain during systemic inflammation. Nature Medicine. 2: 581–
584, 1996.
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