Caracterización morfológica y evaluación de la resistencia de materiales criollos de aguacate Persea americana Mill. A la pudrición radical del aguacate Phytophthora cinnamomi Rands en el centro de investigación Palmira de CORPOICA. Eberto Rodríguez Henao Universidad Nacional de Colombia Facultad de Ciencias Agropecuarias Palmira, Colombia 2015
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CORPOICA. - bdigital.unal.edu.co · A los investigadores Demian Kondo Ph.D. Entomólogo y Marilyn Manrique Ing. Agrónoma ... algunas accesiones de aguacate, la prueba de separación
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Caracterización morfológica y evaluación de la resistencia de materiales criollos de
aguacate Persea americana Mill. A la pudrición radical del aguacate
Phytophthora cinnamomi Rands en el centro de investigación Palmira de
CORPOICA.
Eberto Rodríguez Henao
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Ciencias Agropecuarias
Palmira, Colombia
2015
Caracterización morfológica y evaluación de la resistencia de materiales criollos de
aguacate Persea americana Mill. A la pudrición radical del aguacate
Phytophthora cinnamomi Rands en el centro de investigación Palmira de
CORPOICA.
Eberto Rodríguez Henao
Trabajo de investigación presentado como requisito parcial para optar al título de:
Expreso mis más sinceros agradecimientos a todas las personas que de una u otra forma hicieron parte y posible la realización de este trabajo. A CORPOICA Centro de Investigación Palmira y en especial al Sistema de Bancos de Germoplasma Vegetal Palmira por permitir realizar el estudio con el germoplasma de aguacate presente en este centro de investigación. A COLCIENCIAS y CORPOICA por financiar económicamente el presente trabajo como joven investigador e innovador Colciencias mediante la convocatoria 566 del 2012. Al Dr. Álvaro Caicedo Investigador de CORPOICA por sus importantes aportes como codirector del presente trabajo de investigación, sin los cuales no hubiese sido posible realizar este trabajo. Al Dr. Jaime Eduardo Muñoz profesor asociado de la Universidad Nacional de Colombia Sede Palmira, director del presente trabajo de investigación por su continua orientación y aportes para el presente trabajo. A la Dra. Elizabeth Álvarez investigadora del CIAT por participar como guía para la selección de la presente investigación como trabajo de tesis. A Hermilzon Escobar Lourido asistente de investigación de CORPOICA por su apoyo en el proceso de inoculación, parte fundamental en este trabajo de investigación. A la Dra. Nubia Murcia y su equipo de apoyo por su colaboración en la parte de trabajo de laboratorio. A los investigadores Demian Kondo Ph.D. Entomólogo y Marilyn Manrique Ing. Agrónoma por sus aportes para mejorar la redacción de este documento.
Resumen y Abstract IX
Resumen
Como aporte a la búsqueda de cultivares de aguacate Persea americana Mill.,
potencialmente resistentes a la enfermedad de pudrición de raíces causada por
Phytophthora cinnamomi Rands, se evaluaron 21 accesiones del banco de germoplasma
de aguacate antillano de CORPOICA, seleccionadas por distanciamiento genético
mediante caracterización morfológica, utilizando dos cepas patogénicas de este oomiceto.
El objetivo fue identificar accesiones con potencial de uso como portainjertos, práctica de
manejo preventivo de esta enfermedad. Se evaluó la infección con micelio del patógeno
mediante la técnica de herida al tallo. Se midió periódicamente el largo y ancho del avance
de síntomas. Con estos registros se estableció el área bajo la curva del progreso de la
enfermedad (ABCPE) en el tejido de la planta. Se utilizó un diseño en bloques completos
al azar con arreglo factorial de 3 x 21 x 8 en parcelas subdivididas (dos cepas del patógeno
y una cepa testigo, 21 accesiones de aguacate y 8 lecturas en el tiempo de avance de la
enfermedad). El análisis estadístico mostró diferencias significativas del ABCPE para
algunas accesiones de aguacate, la prueba de separación de medias de Tukey reveló seis
niveles de respuesta y permitió identificar la cepa Ag A-041 de Tribunas Córcega,
Risaralda como la más patogénica. Se identificó la accesión NATU-001 proveniente de
Tumaco, Nariño, como promisoria por su alta resistencia y la accesión CANO-008 de
Norcasia, Caldas, testigo resistente de acuerdo a estudio realizado por Jaramillo et al.
(2009), el cual presentó el segundo menor valor de ABCPE. Los testigos susceptibles, i.e.,
cultivar Hass y portainjerto Topa-Topa, presentaron muy baja resistencia al patógeno junto
con la accesión QUIQUI-030 de Quimbaya, Quindío.
Palabras clave: Phytophthora cinnamomi Rands, Persea americana Mill., banco de
3. Marco teórico y estado del arte ............................................................................. 11 3.1 Taxonomía del aguacate ............................................................................... 11
3.1.1 Sinonimia ............................................................................................ 11 3.2 Centro de origen del aguacate ....................................................................... 12 3.3 Importancia económica del aguacate ............................................................. 12 3.4 Caracterización morfológica........................................................................... 14 3.5 Importancia económica de Phytophthora cinnamomi ..................................... 15 3.6 Taxonomía de Phytophthora cinnamomi Rands............................................. 16 3.7 Características morfológicas de Phytophtora cinnamomi ............................... 17 3.8 Ciclo biológico de Phytophthora cinnamomi ................................................... 18 3.9 Sintomatología ............................................................................................... 20 3.10 Portainjertos de aguacate resistentes a Phytophthora cinnamomi ................. 21 3.11 Métodos de evaluación de la resistencia a Phytophthora cinnamomi en Persea americana ................................................................................................................ 22
4. Materiales y métodos ............................................................................................. 27 4.1 Localización ................................................................................................... 27 4.2 Caracterización morfológica del Banco de Germoplasma de Aguacate de CORPOICA C.I. Palmira ........................................................................................... 27 4.3 Selección del material vegetal ....................................................................... 29 4.4 Selección de cepas de Phytophthora cinnamomi ........................................... 29 4.5 Producción del material vegetal ..................................................................... 30
4.5.1 Manejo agronómico ............................................................................. 30 4.6 Clonación del material vegetal ....................................................................... 32
XII
4.7 Clonación del material vegetal ....................................................................... 34 4.8 Monitoreo climatológico ................................................................................. 35 4.9 Diseño experimental ...................................................................................... 36 4.10 Variable de respuesta.................................................................................... 36 4.11 Inoculación .................................................................................................... 36
5. Resultados y discusión ......................................................................................... 39 5.1 Caracterización morfológica del banco de germoplasma de aguacate del C.I. Palmira .................................................................................................................... 39 5.2 Selección del material vegetal ....................................................................... 42 5.3 Monitoreo climatológico en el área de estudio ............................................... 43 5.4 Síntomas y niveles de expresión de la enfermedad por cepa evaluada ......... 45 5.5 Síntomas de la enfermedad en las plantas inoculadas .................................. 50 5.6 Análisis de varianza (ANDEVA) para la interacción cultivar criollo vs. Cepa de P. cinnamomi Rands ................................................................................................ 51 5.7 Respuesta de las accesiones criollas de aguacate a las cepas de P. cinnamomi ............................................................................................................... 53
12 Caracterización morfológica y evaluación de la resistencia de materiales criollos de aguacate Persea americana Mill. A la pudrición radical del aguacate Phytophthora cinnamomi Rands en el centro de investigación Palmira de CORPOICA.
3.2 Centro de origen del aguacate
El centro de origen del aguacate es América. Su nombre etimológico deriva del náhuatl
Ahuaca Cuahuitl: ahuacatl (testículo) y cuahuitl (árbol) “árbol de testículos”; Su nombre en
inglés, avocado, deriva de la palabra en español abogado, una adaptación de la palabra
azteca ahuacatl, que se convirtió en avocat en francés y advokaat en holandés. El nombre
Inca de Palta aún se utiliza en Perú, Ecuador y Chile (Bernal et al., 2008). Se considera
que la especie que dio origen al aguacate proviene de la zona montañosa del occidente
de México y Guatemala. Se distribuye naturalmente desde México hasta Perú, pasando
por Centro América, Colombia, Venezuela y Ecuador. Se dice que varios cientos de años
antes que los conquistadores europeos llegaran a México ya este frutal había sido
domesticado según registro de fósiles encontrados que datan de hace más de 8.000 años.
De acuerdo a pruebas arqueológicas encontradas en Puebla, México de hace 12.000 años
se determinó que esta región es el centro de origen del aguacate (Bernal et al., 2008;
Sánchez, 1999).
El aguacate se dispersó desde México hasta Perú en el periodo precolombino y fue
domesticado por los Aztecas, en Sur América solo se conocía en la región oriental de la
Sierra Nevada de Santa Marta hasta el Norte de Chile. Ya en el periodo colonial fue llevado
a las Antillas, Brasil y al Sur de Europa entre los siglos XVI y XVII; a Hawái, La Florida y
California. Fue introducida en el siglo XIX en Suráfrica, Argentina e Israel, se iniciaron
cultivos comerciales en la primera mitad del siglo XX (Bernal et al., 2008).
3.3 Importancia económica del aguacate
El aguacate es la quinta fruta tropical más importante en el mundo, por volumen y área
cultivada (Yabrudy, 2012). Se produce en casi todos los países de clima cálido y templado,
aunque sus mayores cultivos se encuentran en países latinoamericanos, dentro de los que
se destaca México como principal productor a nivel mundial, República Dominicana,
Colombia, Perú, Chile, y Brasil, según cifras estadísticas de la FAO del 2015. La superficie
mundial sembrada con aguacate se estima en 516.485 ha (FAOSTAT, 2015) que se
distribuyen en más de 50 países, el 90% del área sembrada con aguacate se encuentra
en América y el 10% restante en los demás continentes (Alcántar, 2008). Se cultiva en
Marco teórico y estado del arte 13
Nueva Zelanda, Australia, Filipinas, Costa de Marfil, Kenia, Suráfrica, Marruecos, Israel,
Italia y España (las Islas Canarias y en el territorio continental), Estados Unidos (California
y La Florida), entre otros. A nivel mundial, los países que reportan mayores niveles de
importación de este frutal en orden de cantidad son: Inglaterra, Francia, Alemania, Italia,
Bélgica, Países Bajos, Dinamarca, Suecia, Japón y Noruega (Bernal et al., 2008). El
consumo mundial de aguacate entre 2001 y 2011, pasó de 482 a 675 gramos por
habitante/año, lo que significó un crecimiento del 39,9%, convirtiéndolo en uno de los
mercados del sector de alimentos con mayor dinámica (Yabrudy, 2012).
Actualmente Colombia se ubica como el tercer país productor de aguacate a nivel mundial,
donde se cultiva desde el nivel el mar hasta los 2.500 .m.s.n.m., en el cual se produce en
los departamentos de: Antioquia, Bolívar, Caldas, Cesar, Cundinamarca, La Guajira, Meta,
Quindío, Risaralda, Santander, Sucre, Tolima, Valle del Cauca entre otros, con un área de
32.066 hectáreas, siendo los de mayor producción: Tolima, Antioquia, Bolívar, Caldas y
Santander (AGRONET, 2015). La diversidad en pisos térmicos presentes en el territorio
colombiano, condicionada por la franja altitudinal con que se cuenta, permite una amplia
adaptación de las tres variedades botánicas o razas, la raza antillana es usada
principalmente como portainjerto para las razas mexicana, guatemalteca e híbridos de
mexicanas por guatemaltecas e híbridos de guatemaltecas por antillanas, siendo estas
últimas las variedades comerciales de mayor siembra en Colombia (Bernal et al., 2008).
El consumo del fruto de aguacate ha aumentado a nivel mundial especialmente en Estados
Unidos, Francia, Alemania y España, lo cual ha incidido en el incremento de las áreas
cultivadas y por ende la producción. Su alta demanda se debe a las cualidades de sabor,
nutritivas y amplios usos que se le puede dar a esta fruta como las culinarias, industriales,
farmacéuticas y cosméticas. A pesar del gran potencial que tiene el aguacate como
producto exportable en Colombia, el país no ha podido consolidarse como un exportador
neto, debido a la alta demanda interna que obliga a la importación en ciertas temporadas
del año, especialmente desde Ecuador y Venezuela, también se debe a la falta de prácticas
agrícolas apropiadas que dificultan el acceso a los mercados internacionales, en especial
de Estados Unidos y los países de la Unión Europea, que son los mayores demandantes
en el mercado mundial (Yabrudy, 2012).
14 Caracterización morfológica y evaluación de la resistencia de materiales criollos de aguacate Persea americana Mill. A la pudrición radical del aguacate Phytophthora cinnamomi Rands en el centro de investigación Palmira de CORPOICA.
El aguacate colombiano cada vez gana más terreno en los consumidores de la Unión
Europea y Estados Unidos, siendo el cultivar Hass de origen mexicano 10% y
guatemalteco 90% (Bernal et al., 2009), una de las frutas reconocida por expertos como
una de las más exóticas, nutritivas y de buen sabor que se producen en Colombia, lo cual
hace de este frutal un exquisito manjar para los europeos y los norteamericanos quienes
son los mayores consumidores de aguacate en el mundo y por lo tanto es el cultivar que
más se exporta por su alto contenido vitamínico ya que posee 11 de las 13 vitaminas
conocidas, 8 minerales y factores Omega 3 y 6 (Anacafé, 2004).
El cultivo del aguacate es una excelente opción de empleo porque se utiliza mucha mano
de obra y da una rentabilidad excelente que se estabiliza en el sexto año de producción y
puede continuar produciendo hasta por 30 años si se da un buen manejo agronómico
(Guarín, 2011). De acuerdo con Rodríguez et al. (2009) en el año 2008 se generaron
54.925 empleos directos e indirectos, con una tasa interna de retorno (TIR) del 36% con
un área familiar mínima rentable de 1,26 ha, un producto interno bruto (PIB) de 93.355
millones de pesos anuales que produjeron un flujo de caja permanente y beneficio a 26.048
productores que tienen 7.077 m2 cada uno.
3.4 Caracterización morfológica
La totalidad de las variantes que presenta una misma especie se conoce como variabilidad
genética, la cual puede expresarse fenotípicamente (visiblemente) y características
genotípicas (no visibles) (Franco e Hidalgo, 2003), variabilidad genética originada por la
continua interacción dinámica de adaptación con los factores bióticos y abióticos en los
que crece cada individuo. Esta interacción adaptativa genera diversidad en la información
genética de los individuos de una determinada población o especie, la cual se va
trasmitiendo a las generaciones futuras a través del tiempo (Hernandez Villarreal, 2013).
Los descriptores de caracterización permiten una discriminación fácil y rápida entre
fenotipos. Generalmente son caracteres altamente heredables, que pueden ser fácilmente
detectados a simple vista y se expresan igualmente en todos los ambientes. Además,
pueden incluir un número limitado de caracteres adicionales que son deseables según el
consenso de los usuarios de un cultivo en particular (IPGRI, 1995). Permiten identificar la
Marco teórico y estado del arte 15
variabilidad genética de una población y determinar los mejores descriptores
(discriminantes) para evaluar las plantas (Hernandez Villarreal, 2013).
3.5 Importancia económica de Phytophthora cinnamomi
Phytophthora cinnamomi Rands está distribuido globalmente y puede infectar cerca de
3.000 especies vegetales, causando un grave problema en la agricultura (Hardham, 2005),
este oomiceto es el agente causal de la enfermedad conocida como pudrición radical de
raíces en el cultivo del aguacate Persea americana Mill. y es la enfermedad más grave de
este cultivo a nivel mundial (Zenmyer, 1980) se considera el principal factor limitante en la
producción de países como: Australia, México, Sudáfrica y los Estados Unidos, además de
otros setenta países (Sánchez, 2001). Esta enfermedad ha causado la muerte de muchas
explotaciones comerciales en zonas de América Latina y es el mayor limitante de la
producción de aguacate en Australia, Sur África y California (Ploetz et al., 2002). En
California la pudrición radical por Phytophthora ha generado pérdidas del 60 a 75% de los
cultivos de aguacate, un estimado en pérdidas de 40 millones de dólares anuales (Coffey,
1987; Gabor et al., 1990) y 44 millones en 1989 (REDFRUT, 2000). Las mayores pérdidas
en plantaciones de aguacate se presentan en zonas con suelos mal drenados y con
problemas de inundaciones prolongadas (Ploetz y Schaffer, 1989). En California ha
afectado un estimado de 2.428 ha (Zentmyer y Ohr, 1981 apud, Kurtz, 1988). Vidales y
Alcantar (1999) reportan 1.300 ha afectadas en California y daños del 20% en los árboles
de aguacate de Sudáfrica.
En México en el estado de Puebla se han observado incidencias del 75% de los árboles.
En Querétaro ocasionó la desaparición del cultivo. En Michoacan en 1979 se encontraron
trece mil árboles afectados, 13 años después en 1994 se encontraron cien mil árboles
afectados, posteriormente en 1999 la severidad subió a 550 mil árboles afectados,
causando una pérdida de 640 millones de pesos mexicanos (40 millones de dólares
americanos) evidenciando un creciente incremento de la enfermedad (Vidales y Alcantar,
1999).
La pudrición radical por Phytophthora también ha diezmado de manera significativa
importantes repositorios de germoplasma en la región, tales como los de la USDA-ARS
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estación de Isabella, Puerto Rico, y en la escuela Panamericana de Agricultura en
Zamorano, Honduras (Violi et al., 2006).
En Colombia, la especie P. cinnamomi ha sido claramente identificada como la causante
de pudrición de raíces del aguacate en las zonas productoras de este frutal, causando
pérdidas que oscilan entre un 30 y un 50% de los árboles en la etapa de vivero y durante
los dos primeros años de establecimiento del cultivo (Tamayo, 2007).
3.6 Taxonomía de Phytophthora cinnamomi Rands
Según el Departamento de Conservación y Manejo de la Tierra de Australia (2003), P.
cinnamomi y otros miembros del grupo del genero Phytophthora no son parte del reino de
los hongos, pertenecen a los mohos acuáticos u Oomycota (Clase Oomycetes), ubicados
en el reino Chromista o Stramenopila. P. cinnamomi tiene un parecido superficial con los
hongos, pero son diferentes en sus paredes celulares, las cuales están formadas por
celulosa en vez de quitina como los hongos. Este patógeno consume la planta huésped
causando áreas con apariencia de podredumbre, esto debilita la planta al reducir el
movimiento de agua y nutrientes dentro de la planta. Una vez atacados huéspedes
susceptibles raramente logran recuperarse.
El reino Stramenopila está formado por los Phylum: Oomycota, Hyphochytridiomicota y
Labyrinthulomycota. Constituye un grupo muy variable, el cual incluye microorganismos
que no forman zoosporas como algas de color café. Según la última reclasificación
taxonómica P. cinnamomi quedo ubicada de la siguiente manera (Hardham, 2005,
Alexopoulos et al., 1996).
Dominio: Eukaryota
Reino: Stramenopila
Phyllum: Oomycota
Clase: Oomycetes
Orden: Pythiales
Familia: Pythiacea
Género: Phytophthora
Marco teórico y estado del arte 17
3.7 Características morfológicas de Phytophtora cinnamomi
El micelio de P. cinnamomi es cenocítico (sin septos) con hifas moderadamente
ramificadas y con hinchamientos vesiculares, el diámetro de las hifas varia de 8 a 25
micras. El aspecto de la colonia en medio de cultivo es tipo roseta o camelia debido al
crecimiento deprimido y algodonoso del micelio que tiene lugar a intervalos irregulares. Los
esporangioforos son simples y sobre ellos se forman esporangios ovales u oval alargados,
grandes con medidas de 23 y 63 micras de largo por 15 a 30 micras de ancho sin papila.
Forma abundantes clamidosporas esféricas, terminales e intercalares. Las esporas son
heterotálicas (Coria, 2009).
La principal característica que existe para diferenciar P. cinnamomi de otras especies de
Phytophthora es el hinchamiento que presentan las hifas, las cuales adquieren un aspecto
coraliforme y son formadas más profusamente que en la mayoría de las otras especies
(Erwin y Ribeiro, 1996 apud, Acosta, 2008).
P. cinnamomi es un oomiceto heterotálico con dos tipos de apareamiento, A1 y A2 donde
cada tipo corresponde a una cepa de apareamiento, la cual produce células sexuales
masculinas o femeninas (Oogonio o anteridio) (Ko, 1978), el tipo de apareamiento
predominante a nivel mundial es el tipo A2 (Ribeiro et al., 1975), lo cual indica que hay una
limitada reproducción sexual dentro de esta especie (Pagliaccia et al., 2013), pero algunos
aislados de aguacate han demostrado que bajo ciertas condiciones (especialmente en
ambientes de laboratorio) puede ser homotálico (la misma cepa produce oogonios y
anteridios) y producir diversidad genética dentro de la especie (Zentmyer, 1952 apud,
Pagliaccia et al., 2013).
El estado sexual de P. cinnamomi se forma cuando los tipos de compatibilidad A1 y A2 se
presentan, los cuales se aparean para generar diversidad genética dentro de la especie,
donde cada tipo corresponde a una cepa diferente, cada cepa de apareamiento presenta
una condición de producción de células sexuales diferentes a la otra, así la cepa con
anteridios se une a la cepa con oogonios y se forma la oosfera. Los oogonios miden en
promedio 40 μm de diámetro, con anteridios anfígenos (18 μm de ancho a 20 μm de largo),
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algunos anteridios pueden ser bicelulares, y muchas de las oosporas son pleróticas (llena
la cavidad del oogonio) de 35 μm (Andrade-Hoyos, 2012).
P. cinnamomi se distingue por su micelio tipo coraloide con abundantes hifas hinchadas.
Vesículas hinchadas sésiles terminales o laterales, protuberancias producidas en forma
simple o en racimo. P. cinnamomi forma tres tipos de esporas diferentes, los esporangios
y clamidosporas que dan origen a la reproducción vegetativa o asexual sin variación
genética las oosporas dan origen a la reproducción sexual. Los esporangios germinan
directamente a través de tubos germinales o indirectamente produciendo zoosporas
móviles biflageladas, generalmente son elipsoides u ovoides, sin papilas y persistentes,
redondeadas en la base y terminales
3.8 Ciclo biológico de Phytophthora cinnamomi
P. cinnamomi tiene reproducción sexual y asexual, en la Figura 1 (Lemus, 2009) se
observan los procesos que presenta este oomiceto en su ciclo biológico de infección, tiene
la capacidad de sobrevivir por mucho tiempo, incluso años sobre el tejido de las raíces en
la rizosfera del cultivo en forma de clamidosporas, aun en ausencia de plantas que
hospeden la enfermedad. Cuando las condiciones son óptimas para la infección, las
clamidosporas reinfectan la planta. Estas condiciones se presentan con excesiva humedad
en el suelo por efecto de abundantes lluvias o suelos con mal drenaje y temperaturas
ideales para la manifestación de la enfermedad, las cuales se encuentran en un rango de
24 a 28°C, ya que se presenta mayor producción de esporangios y mejores condiciones
para la liberación y movimiento de las zoosporas hacia las raíces de las plantas. Las
clamidosporas germinan y dan origen al micelio el cual reinicia el ciclo de la infección. El
micelio pude formar clamidosporas como estructuras de resistencia y también esporangios
donde se encuentran las zoosporas biflageladas que dan inicio a la infección (Andrade-
Hoyos, 2012). Este patógeno puede afectar plantas de aguacate sin importar la variedad
ni estado de desarrollo de las plantas (Ramírez, 2013).
Marco teórico y estado del arte 19
Figura: 1 Ciclo de infección de Phytophthora cinnamomi Rands. Tomado de Lemus, 2009)
Las
zoosporas alcanzan y se adhieren a la raíz del hospedero en las cuales se enquistan y
germinan sobre ellas. Al enquistarse las zoosporas pierden los flagelos. Pasados 20 a 30
minutos del enquistamiento los tubos germinativos inician su crecimiento durante una hora
aproximadamente e inician la penetración de las células radicales. La penetración ocurre
dentro de las 24 horas después de la infección y pasadas seis horas de la penetración el
tejido de la raíz alimentadora muere y sobre este tejido necrótico el oomiceto crece por
algunos días (Ramírez, 2013). Las zoosporas son atraídas por los exudados de las raíces,
los cuales están constituidos por los aminoácidos asparagina y glutamina (Pegg et al.,
2002).
Las temperaturas óptimas para la infección de P. cinnamomi fluctúan entre 21 y 30°C,
mientras que hay poca o nula infección a temperaturas mayores de 33°C, o entre 9 y 12°C,
estas temperaturas coinciden con la curva de crecimiento del patogeno. La respuesta de
crecimiento de plántulas de aguacate a temperaturas de suelo, es casi similar a aquellas
del desarrollo y crecimiento de la enfermedad, con la excepción de los cultivares de
aguacate que crecen bien a 33°C. La humedad es un factor ambiental primario que influye
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en el desarrollo de la pudrición de raíces causada por P. cinnamomi, en cuanto a:
crecimiento, esporulación y proceso de infección resultante. La alta humedad (mayor a
90%) aumenta la infección, principalmente, debido al incremento de la formación de
esporangios y las condiciones apropiadas para la liberación de zoosporas, movilidad y
movimiento al sitio de infección (Zentmyer, Menge y Ohr, 1994 apud, Rojas, 2004)
3.9 Sintomatología
El daño causado por P. cinnamomi en el aguacate se inicia en las raíces absorbentes de
la planta, las cuales se necrosan y mueren por la colonización del patógeno. Normalmente
en árboles con un estado avanzado de la enfermedad las raíces absorbentes desaparecen
por la degradación causada por el patógeno, por lo cual en estos árboles se incrementa la
cantidad de agua en el suelo por la incapacidad de absorberla. Debido a la relación
negativa que se presenta entre el agua transpirada y la absorbida por las raíces, la planta
manifiesta síntomas de marchitamiento en las hojas, razón por la cual en algunos sitios del
mundo se le denomina a esta enfermedad tristeza del aguacatero. El escaso contenido de
agua en la planta hace que esta no logre formar la suficiente clorofila, lo que confiere el
color verde a las hojas, y por ende la planta empieza a tornarse de color amarillo o clorótico
(Pegg et al., 2007). Cuando la enfermedad es muy severa, el patógeno se disemina a la
base del tronco de la planta, causando una podredumbre en forma de manchas oscuras
con exudaciones azucaradas y apariencia blanquecina (Mora et al., 2007 apud, Lemus,
2009).
Los síntomas incluyen la muerte progresiva de las ramas de los árboles en diferentes
etapas de desarrollo, marchitez y amarillamiento de las hojas hasta llegar a una defoliación
completa. Las hojas muertas quedan adheridas durante algunos días al tronco del árbol.
Los síntomas presentados en las ramas y hojas son evidencia de que las raíces
alimentadoras fueron atacadas y destruidas por P. cinnamomi, frecuentemente los árboles
afectados producen cosechas incipientes con frutos de baja calidad y tamaño (Faber y
Marais, 2010).
Marco teórico y estado del arte 21
3.10 Portainjertos de aguacate resistentes a Phytophthora cinnamomi
Una de las opciones más viables para el control del problema de pudrición radical causada
por P. cinnamomi es el uso de portainjerto resistentes a este patógeno (Coffey, 1987;
Ploetz et al., 2002; Gallo-Llobet et al., 1999). Con el objetivo de encontrar estos materiales
en la década de 1950 se inició el programa de búsqueda de portainjertos en California,
Estados Unidos por parte del Dr. George Zentmyer de la Universidad de Riverside de
California, tras el descubrimiento de P. cinnamomi como causante de este desorden
fisiológico en la década de 1940. Durante la búsqueda el Dr. Zentmyer encontró resistencia
moderada en el cultivar mexicano Duke en 1951 mediante el uso de estacas sobre suelo
infestado (Zentmyer, 1963), el cual fue introducido como semilla a California, Estados
Unidos, en 1912 (Andrade-Hoyos, 2012). Hasta el momento se han logrado identificar
diferentes materiales de P. americana con resistencia parcial a P. cinnamomi como
Thomas, Martin grande (llamado también G755), Barr Duke, Duke 7 y D9 (Gabor et al.,
1990), G6 (Zentmyer, 1987), recientemente tres selecciones de Martin grande (G755 a, b
y c) de la raza guatemalteca (Coffey, 1987). Durante muchos años el material Duke 7 ha
sido usado como portainjerto para la producción de aguacate en muchos países del
mundo, en Sudáfrica se utilizó desde 1970 hasta 2002 cuando se lanzó el portainjerto Dusa
por parte de Westfalia Servicios Tecnológicos, el cual brindo a los productores de aguacate
mayor resistencia a P. cinnamomi pero también mejores rendimientos de fruta (Mahomed
y Van den Berg, 2011). En evaluación reportada por Smith et al. (2011) se encontraron los
materiales SHSR-02 y SHSR-04 con alta resistencia a P. cinnamomi, mayor a la de Duke
7, de origen Guatemalteco y Mexicano. Los genotipos Duke 6, Duke 7 y G6 presentan
resistencia intermedia a P. cinnamomi, mientras que los cultivares D9, Thomas, Martin
grande y Toro Canyon presentan alta resistencia (Cortéz et al., 2010).
Otros materiales obtenidos por selección y mejoramiento por resistencia a P. cinnamomi
han sido P1, Toro Canyon, G61, P, P3, P6, G 1008, Duke S, Duke Grace, G22 y Parida
(Téliz et al., 2007 apud, Andrade-Hoyos, 2012).
Douhan (2011) de la Universidad de California Riverside reporta nuevos materiales
seleccionados por resistencia probada en invernadero para hacer posteriores evaluaciones
22 Caracterización morfológica y evaluación de la resistencia de materiales criollos de aguacate Persea americana Mill. A la pudrición radical del aguacate Phytophthora cinnamomi Rands en el centro de investigación Palmira de CORPOICA.
en campo, las cuales incluyen los materiales codificados PP29, PP36, PP40, PP52, PP57,
PP80, PP81, VC7, VC66, VC256 y VC801.
En la última década en Colombia se inició la clonación de Duke 7 como portainjerto
ofertado para el país como material con fuente de resistencia genética a la enfermedad de
la pudrición radical en el vivero Profrutales Ltda (Profrutales, 2013).
3.11 Métodos de evaluación de la resistencia a Phytophthora cinnamomi en Persea americana
En la búsqueda de resistencia a P. cinnamomi en el cultivo de aguacate se han probado
diferentes métodos de evaluación directos e indirectos, probados con los cultivares más
conocidos dentro del germoplasma que presenta resistencia a este oomyceto. Los
métodos empleados para determinar la resistencia de portainjertos de P. americana a P.
cinnamomi se han venido desarrollando desde la década de 1950 con las investigaciones
del Dr. Zentmyer y su grupo de trabajo en la Universidad de California Riverside, con
materiales colectadas en diferentes países de América Latina, entre estos Argentina,
Brasil, Chile, Colombia, Costa Rica, Cuba, Ecuador, El Salvador, Guatemala, Haití,
Honduras, Jamaica, México, Perú, Puerto Rico, St. Croix (Islas Vírgenes), Trinidad y
Venezuela (Zentmyer y Schieber, 1987, 1992).
La resistencia de diferentes colecciones de germoplasma de aguacate a P. cinnamomi ha
sido determinada mediante el uso de diferentes métodos entre los cuales se encuentran el
uso de soluciones nutritivas con material de infección, igualmente en macetas, camas
germinadoras con suelo infestado del patógeno, callos de tejido inoculado y en
plantaciones infestadas en campo (Salgado y Fucikovsky, 1996).
Una de las evaluaciones indirectas realizadas se conoce como el método de la raíz
individual descrito por Dolan y Coffey en 1986, replicado por Zilberstein y Pinkas en 1987
y modificado por Botha et al. en 1989, el cual consiste en inocular trozos de raíz en
laboratorio, sumergidas en suspensión de micelio del patógeno durante tres días y
posterior medición del avance de la enfermedad (Van der Merwe et al., 1992). Otro método
indirecto fue evaluado por los Drs. Dollan y Coffey (1986) mediante la inoculación en tallo
Marco teórico y estado del arte 23
de cuatro portainjertos con zoosporas a nivel de laboratorio, en explantes de tallos de 15
cm de longitud provenientes de clonación mediante la técnica de etiolación como
procedimiento recomendado para una evaluación rápida y sencilla de gran cantidad de
materiales de aguacate.
Otro método usado para la evaluación de la resistencia de diferentes materiales de
aguacate a P. cinnamomi fue descrito por Zentmyer y Mircetich (1965) mediante el cual se
evalúan muchas plantas sumergiendo el sistema radical en una solución nutritiva inoculada
con el patógeno (Salgado y Fucikovsky, 1996).
Otro método de evaluación fue trabajado por Zilberstein y Pinkas (1987) en el cual se
determinó el nivel de resistencia en arboles de aguacate mediante la medición de la
perdida de electrolitos de las raíces, método rápido y no destructivo de las plantas.
La inoculación del patógeno sobre hojas y raíces también ha sido usada para la detección
de la resistencia de P. americana al oomyceto, tal como lo demuestra el trabajo realizado
por Botha et al. (1989), en el cual posterior a la inoculación de zoosporas en raíces y hojas
jóvenes separadas de la planta madre midieron el desarrollo de la lesión, encontrando
similar respuesta en las partes evaluadas de la planta. Esta técnica se presenta como
prometedora según los autores del trabajo ya que es fácil y rápida para el cribado de
árboles en campo no injertados así como para la evaluación de plantas de semilleros de
multiplicación vegetativa, sin realizar intervención de raíces.
El método de la raíz individual de Dolan y Coffey (1986) fue modificado usando esquejes
de diferentes materiales de aguacate enraizados con la técnica de etiolación de Frolich y
Platt (1971) inoculando micelio de P. cinnamomi por Van der Merwe et al. (1992), Van der
Merwe (1992b) en el cual se logró verificar que el uso de micelio como inoculo del patógeno
es muy eficiente para la detección de portainjertos con resistencia a la enfermedad de la
pudrición radical por Phytophthora, tanto como la realizada con zoosporas.
Ruiz-Rosado et al. (1992) evaluaron la respuesta de los materiales Duke 7 y Semil 34 a P.
cinnamomi midiendo el crecimiento de micelio sobre callos de cada material, presentando
Semill 34 una colonización completa por parte del micelio y efectos inhibitorios de
crecimiento en el material Duke 7,corroborando su resistencia al patógeno. López et al.
24 Caracterización morfológica y evaluación de la resistencia de materiales criollos de aguacate Persea americana Mill. A la pudrición radical del aguacate Phytophthora cinnamomi Rands en el centro de investigación Palmira de CORPOICA.
(2007) evaluaron la resistencia a P. cinnamomi en germoplasma de aguacate inoculando
micelio en plantas in vitro como método efectivo para generar la infección y para determinar
niveles de resistencia al patógeno.
Inoculación directamente en tallos jóvenes de aguacate fue realizada por Dolan y Coffey
(1986) usando fragmentos de tallos etiolados, a nivel de laboratorio en cajas Petri con
zoosporas como fuente de inoculo. Los resultados presentados muestran el potencial de
la técnica para evaluar la resistencia a la pudrición radical en germoplasma de aguacate
en futuras selecciones de portanjertos.
Gabor y Coffey (1991) realizaron la comparación de diferentes métodos de inoculación
para la determinación rápida de resistencia a P. cinnamomi en portainjertos de aguacate,
en la cual se encontró que la inoculación en brotes etiolados a nivel de laboratorio en cajas
Petri y la inoculación en sistema radicular intacto es similar para portainjertos de Persea
schiedeana y portainjertos híbridos de P. schiedeana con Persea americana como es el
caso de Martin Grande, UCR 2022 y UCR 2023. Según los autores del trabajo, la
inoculación indirecta (inoculación de tejido diferente a la raíz) puede proporcionar un
método de detección conveniente y rápido para la detección de resistencia a P. cinnamomi
en germoplasma de P. schiedeana e híbridos de P. schiedeana con P. americana. En el
mismo trabajo se encontró que germoplasma de P. americana conocido por tener un
moderado nivel de resistencia como Thomas, Barr Duke y Duke 7 presentaron
susceptibilidad mediante el método de inoculación en tallo, lo cual permite indicar que este
método es más riguroso y preciso para evaluar la resistencia a P. cinnamomi en
germoplasma de P. americana.
La técnica de inoculación por herida al tallo ha sido probada como método alternativo para
la evaluación de resistencia a P. cinnamomi, Dixon et al, (1984) evaluaron la relación entre
la respuesta presentada en Banksia spp. a P. cinnamomi mediante la inoculación directa
a la raíz y la inoculación por herida al tallo y encontraron que es directamente proporcional,
por lo cual fue presentada como una técnica con alto potencial para determinar la
resistencia a P. cinnamomi. Además, esta técnica es presentada como una de las opciones
existentes para realizar pruebas de inoculación de plantas con especies de Phytophthora
Marco teórico y estado del arte 25
(Drenth y Sendal, 2001) por el Centro de Investigación Cooperativa para la Protección de
las Plantas Tropicales de Brisbane, Australia. Entre las técnicas propuestas se encuentran:
1. Inoculación de esporangios en tejido de la hoja o fruta.
2. Inserción de micelio en los tallos de las plántulas jóvenes.
3. La inserción de piezas de agar con micelio en agujeros en el tallo adulto (leñoso) de las
plantas.
4. La inoculación de suelo y siembra de plantas jóvenes en esta tierra infectada.
Según Robin y Desprez (1998) la técnica de inoculación en tallo permite evaluar la
virulencia de muchos aislamientos de P. cinnamomi ya que permite discriminar de forma
estable y consistente los aislamientos del patógeno, además de ser una técnica más
conveniente de realizar que las técnica de inoculación en el suelo.
4. Materiales y métodos
4.1 Localización
El trabajo de investigación se desarrolló en el Centro de Investigación Palmira de
CORPOICA ubicado en Palmira, Valle del Cauca, Colombia, en las coordenadas
03°30’43,6’’N, 76°18’53,5’’O a una altura de 1.001 m.s.n.m. temperatura promedio anual
de 23°C, precipitación promedio anual de 1.100 mm y humedad relativa promedio anual
del 75% (CVC, 2007). Se seleccionó y adecuó un invernadero el cual cumplía con las
condiciones ambientales de temperatura y humedad relativa adecuadas para el desarrollo
de las plantas de aguacate, que deben estar comprendidas entre 18 y 26ºC (Bernal et al.,
2008) y entre 75 y 80% de humedad relativa (Bartoli, 2008). De acuerdo con Medina,
(2000), las condiciones adecuadas para el desarrollo de la enfermedad pudrición radical
del aguacate reporta ambientes similares al del cultivo de aguacate y afecta con mayor
intensidad en ambientes con alta humedad relativa.
4.2 Caracterización morfológica del Banco de Germoplasma de Aguacate de CORPOICA C.I. Palmira
Para realizar la caracterización morfológica del germoplasma de aguacate presente en
CORPOICA Centro de Investigación Palmira conformado por 187 accesiones, se tomó
como referente los descriptores del International Plant Genetic Resources Institute (IPGRI,
1995). Se seleccionaron variables que describen caracteres contrastantes y de alta
heredabilidad (caracteres cualitativos). De 112 descriptores que componen el descriptor
del IPGRI, para aguacate P. americana se seleccionaron para la caracterización los 15
descriptores contrastantes que permitieron ser evaluados para las condiciones de
conservación del germoplasma (materas) del C.I. Palmira. Variables morfológicas
vegetativas, principalmente, fueron evaluadas debido a que las condiciones de
28 Caracterización morfológica y evaluación de la resistencia de materiales criollos de aguacate Persea americana Mill. A la pudrición radical del aguacate Phytophthora cinnamomi Rands en el centro de investigación Palmira de CORPOICA.
conservación en materas no permite evaluar descriptores reproductivos (floración y
fructificación).
Las variables caracterizadas fueron: superficie del tronco (SDT), color de las lenticelas del
vástago joven (CLVJ), color de la rama joven (CRJ), superficie de la rama joven (SRJ),
pubescencia de la superficie inferior de la hoja (PSIH), pubescencia de la superficie
superior de la hoja (PSSH), peciolo acanalado (PA), ángulo de inserción del peciolo foliar
(AIPF), numero de venas primarias de la hoja (NVPH), divergencia de las venas primarias
(DVP), forma de la hoja (FH), margen de la hoja (MH), forma de la base de la hoja (FBH),
forma del ápice de la hoja (FAH) y olor a anís (OA).
Cada una de las variables caracterizadas se encuentra categorizada de acuerdo al
descriptor IPGRI para aguacate (Tabla 1).
Con la información obtenida en campo de la caracterización de los 15 descriptores
morfológicos se realizó el análisis de correspondencia múltiple (ACM). Con el análisis de
la información anterior se determinó la similitud genética del germoplasma de aguacate
caracterizado, empleando el método de análisis clúster de mínima inercia de Ward con la
distancia de similaridad euclideana.
Materiales y métodos 29
4.3 Selección del material vegetal
Para la selección de las accesiones de P. americana del Banco de Germoplasma (B.G.)
de aguacate presente en CORPOICA, C.I. Palmira, se tuvo como criterio principal el origen
geográfico del material vegetal, y el análisis de agrupamiento de similitud genética
originado a partir del análisis de correspondencia múltiple (ACM) de la caracterización
morfológica del B.G. de aguacate, el cual generó grupos de accesiones por variables
morfológicas similares.
4.4 Selección de cepas de Phytophthora cinnamomi
Para el montaje del ensayo se seleccionaron dos cepas de P. cinnamomi, reportadas por
Rodriguez et al. (2013) como las más patogénicos de 22 aislamientos evaluados sobre
aguacate Hass utilizando la técnica de inoculación con micelio por herida al tallo.
Asilamientos colectados en diferentes zonas del país donde se evidenció muerte de
árboles de aguacate presumiblemente por Phytophthora spp. El estudio que permitió la
identificación de las dos cepas de P. cinnamomi tuvo como criterio la caracterización
morfológica macroscópica de crecimiento de la colonia (forma de roseta y tipo petaloide) y
Variable Escala
Superficie del tronco 3=Lisa, 7=Rugosa, 9=Muy rugosa
Color de las lenticelas del vástago joven. 1=Marfil, 2=Verde, 3=Marrón, 4=Rojo, 5=Purpura, 6=Otro
Color de la Rama Joven (hojas jóvenes de la punta de la rama)
1=Amarillo, 2=Verde, 3=Rojo, 4=Otro
Superficie de la rama joven. 1=Glabra, 2=Pubescente
Pubescencia de la superficie inferior de la hoja. 0=Ausente, 3=Escasa, 5=Intermedia, 7=Densa
Pubescencia de la superficie superior de la hoja. 0=Ausente, 3=Escasa, 5=Intermedia, 7=Densa
Peciolo Acanalado 0=Ausente, 1=Presente
Angulo de inserción del peciolo foliar. 1=Agudo, 2=Obtuso
Numero de venas primarias de la hoja. 1=1, escala asignada por no haber variabilidad
Divergencia de las venas primarias medida en ángulos.
1=45°, escala asignada por no haber variabilidad
Forma de la hoja. 1=Ovada, 2=Obovada-angosta, 3=Obovada, 4=Oval, 5=Redondeada, 6=Coediforme, 7=Lanceolada, 8=Oblonga, 9=Oblonga-lanceolada, 10=Otra
Margen de la hoja. 1=Entero, 2=Ondulado
Forma de la base de la hoja. 1=Aguda, 2=Obtusa, 3=Truncada
Forma del ápice de la hoja. 1=Muy agudo, 3=Agudo, 5=Intermedio, 7=Obtuso, 9=Muy obtuso
Olor a anís. 3=Tenue, 5=Intermedio, 7=Intenso
Tabla: 1 Variables seleccionadas para la caracterización morfológica del Banco de Germoplasma de aguacate y sus respectivas escalas de medición (IPGRI, 1995).
30 Caracterización morfológica y evaluación de la resistencia de materiales criollos de aguacate Persea americana Mill. A la pudrición radical del aguacate Phytophthora cinnamomi Rands en el centro de investigación Palmira de CORPOICA.
microscópica de las estructuras vegetativas y reproductivas (hifas coraloide,
clamidiosporas globosas) (Rodríguez et al., 2013).
Las cepas seleccionadas fueron Ag A-041 proveniente de Tribunas Córcega, Risaralda
(donada por la Universidad Nacional se Colombia Sede Palmira) y la cepa Ag A-003 de
Rionegro Antioquia colectada por CORPOICA (Rodríguez et al., 2013), en su respectivo
orden de acuerdo al grado de patogenicidad. La purificación e incremento de las cepas de
P. cinnamomi seleccionadas por patogenicidad para el ensayo se realizó en el laboratorio
de Fitopatología de CORPOICA C.I. Palmira en medio selectivo PDA+antibióticos y
(Mn) – (Zn), disuelto en un litro de agua por planta. La fertilización foliar se realizó cada 15
días con Tottal (18–10–4–0,021 (CaO) – 1,25 (MgO) – 3,3 (S) – 0,135 (B) – 0,0033 (Co) –
0,27 (Cu) – 0,032 (Fe) – 0,23 (Mn) – 0,009 (Mo) – 0,78 (Zn), a razón de 5 g/l y 300 cm3 por
planta distribuidos uniformemente en el follaje de la planta.
• Poda
Se realizó poda a las plantas para promover el crecimiento de yemas vegetativas (Figura
2). La conservación del germoplasma en materos tiene como finalidad reducir el desarrollo
foliar y radical de la planta. Igual situación se presenta con los bancos de germoplasma de
cítricos, guanábana y piña para las condiciones del CI Palmira. Para plantas en materos
se realiza, protocolariamente, poda de formación y crecimiento para reducir el desarrollo
vegetativo exuberante y conservar arboles de porte bajo. Los cortes fueron desinfectados
con pasta de Carboxín mas Captan y la tijera podadora con hipoclorito de sodio para
prevenir la diseminación de enfermedades.
Figura: 2 Materiales de aguacate conservados en materas en el B.G. de CORPOICA C.I. Palmira y poda para incentivar el crecimiento de yemas.
32 Caracterización morfológica y evaluación de la resistencia de materiales criollos de aguacate Persea americana Mill. A la pudrición radical del aguacate Phytophthora cinnamomi Rands en el centro de investigación Palmira de CORPOICA.
Posteriormente se realizó la colecta de yemas de 20 accesiones de aguacate y se
trasladaron al vivero Frutales del Eje Cafetero (vivero con registro ICA) ubicado en el
municipio de Calarcá en el departamento de Quindío en las coordenadas 4º28'46,3"̎N y
75º41'57,0"O̎ a una altitud de 1.377 m.s.n.m. (Anexo A), para la injertación por personal
especializado, permitiendo asegurar el mayor porcentaje de prendimiento de yemas por
escases en las plantas donadoras del banco de germoplasma.
4.6 Clonación del material vegetal
Para la colecta de las yemas se tuvo en cuenta el estado óptimo para su injertación (Figura
3), siguiendo la siguiente metodología descrita por Jaramillo et al. (2009):
• Selección de ramas jóvenes, con crecimiento activo y de mediana flexibilidad.
• Selección de varetas con yema terminal, de aproximadamente 15 cm de longitud
con presencia de un punto de corcho en el centro del tallo de aproximadamente 1 mm. Se
descartaron varetas que presentaron corcho, mayor al indicado, permitiendo de esta
manera asegurar mayor rendimiento al injertarla.
• Desinfección de varetas sumergiendo las yemas en una solución de Mancozeb o
Benomyl a una concentración de 1,5 g/l durante cinco minutos.
• Colocación de varetas en papel craft, con cinta de enmascarar identificando
claramente la accesión del banco de germoplasma del C.I. Palmira para garantizar la
identidad genética.
• Inmersión en agua para garantizar el humedecimiento rápido de las varetas, evitar
transpiración excesiva y posteriormente poder embalar en termo de poliestireno expandido
refrigerante para su transporte.
Se injertaron las 20 accesiones de aguacate sobre patrón nativo o común, 12 injertos por
cada accesión con el fin de garantizar nueve plantas por accesión requeridas para el
ensayo de infección, para un total de 240 plantas injertadas en el vivero seleccionado. En
el vivero las plantas se identificaron con un código que correspondió a un número
consecutivo para el aseguramiento de la identidad genética del material injertado (Figura
4).
Materiales y métodos 33
Figura: 3 Colecta, marcación y embalaje de las yemas.
La injertación se realizó el 03 de Octubre del 2013, las plantas permanecieron durante tres
meses en vivero antes de ser trasladas al C.I. Palmira. El manejo agronómico desde
injertación hasta el traslado fue el siguiente:
La semilla usada como portainjerto procedió de huerto básico de árboles nativos o
comunes procedentes de Alvarado, Tolima. El protocolo que realiza el vivero Frutales del
Eje Cafetero para la obtención de los patrones es el siguiente: 1. La semilla se selecciona
por tamaño y sanidad y es pre-germinada en arena durante 25 días previa desinfección
con Metalaxil y Clorpirifos. 2. Las plantas portainjerto son sembradas en bolsas de seis
litros de capacidad con medidas de 46 cm de larga por 23 cm de ancha, 3. Se utiliza como
sustrato una mezcla de tierra negra, arena y cisco de arroz, en proporción 3:1:1
respectivamente. 4. El sustrato es previamente desinfectado con Dazomet. 5. A cada bolsa
se le adiciona 5g de tierra inoculada con micorrizas como material biológico simbiótico. 6.
La injertación se realiza a 25 cm de altura del portainjerto, por el método de púa terminal y
Figura: 4 Proceso de injertación: corte para injerto en púa terminal (A), encinte (B) y planta injertada (C).
34 Caracterización morfológica y evaluación de la resistencia de materiales criollos de aguacate Persea americana Mill. A la pudrición radical del aguacate Phytophthora cinnamomi Rands en el centro de investigación Palmira de CORPOICA.
se cubre con bolsa plástica para conservar la humedad, con sobre-cubierta de bolsa de
papel para impedir el paso de luz y estimular un rápido crecimiento de la yema. 7. Cada
semana se realizan controles preventivos de plagas y enfermedades rotando Metalaxil,
Fosetil de aluminio, Carbendazim, Sulfitos de potasio y Clorpirifos.
Adicionalmente se injertó el cultivar Hass como testigo susceptible al patógeno,
procedentes del vivero PROFRUTALES LTDA (vivero con registro ICA) ubicado en el
municipio de Villa Gorgona, Valle del Cauca en las coordenadas 3°24'N 76°22'O a 950
m.s.n.m. Vivero que disponía de plántulas injertadas sobre patrón tipo antillano conforme
a la procedencia de la semilla utilizada para patronaje.
4.7 Clonación del material vegetal
Las plantas fueron trasladas al C.I. Palmira y ubicadas en vivero bajo cobertura plástica
para controlar la cantidad de agua suministrada, aisladas del suelo a 70cm de altura sobre
mesas de cemento y como soporte una matera de plástico de 6 litros (sin retirarlas de la
bolsa o contenedor de polietileno), distanciadas a 30cm una de otra para impedir el
contacto entre ellas a través del agua de percolación de riego y evitar posible
contaminación con zoosporas del patógeno a evaluar, y prevenir posibles disturbios
fitosanitarios entre una planta y otra (Figura 5). Las plantas permanecieron durante 20 días
en proceso de adaptación en estas condiciones de vivero antes de la inoculación del
patógeno por la técnica de herida al tallo.
Para mantener una alta humedad relativa, se llenaron tanques de cemento ubicados bajo
las mesas del vivero, con una capacidad de 190 litros cada tanque, ocho tanques para un
total de 1,52 m3. Se adicionó agua cada dos días según necesidades para mantener una
lámina de agua de 10 cm. El riego suplementario se realizó cada dos días para mantener
las plantas a capacidad de campo evitando el salpique entre plantas y mantener las
condiciones óptimas de humedad.
Materiales y métodos 35
4.8 Monitoreo climatológico
Se instaló una estación meteorológica portátil WatchDog serie 2009 para monitorear las
condiciones ambientales adecuadas para las plantas y para la expresión del patógeno
(Figura 6). La estación meteorológica se programó para registrar las variables de
temperatura y humedad relativa cada 30 minutos durante todo el tiempo de duración del
ensayo. Una vez terminado el periodo de evaluación la información fue descargada a un
ordenador y la información se analizó mediante gráficos de dispersión XY con los valores
registrados y las fechas de registro.
Figura: 5 Acondicionamiento de plantas en vivero, aisladas del suelo, en soporte de materas plásticas de 6 litros.
Figura: 6 Estación meteorológica portátil para monitoreo de condiciones ambientales.
36 Caracterización morfológica y evaluación de la resistencia de materiales criollos de aguacate Persea americana Mill. A la pudrición radical del aguacate Phytophthora cinnamomi Rands en el centro de investigación Palmira de CORPOICA.
4.9 Diseño experimental
Las plantas se distribuyeron de acuerdo al diseño experimental en bloques completos al
azar (BCA) con arreglo factorial en parcelas divididas (PD) asignando a las cepa de P.
cinnamomi la parcela principal, a las accesiones de P. americana la subparcela (Anexo B).
Se evaluaron dos cepas (Ag A-041, Ag A-003) y un tratamiento testigo denominado cepa
cero “0” o testigo inoculado con agar-agua, 21 genotipos de aguacate (19 accesiones
criollas, adicionalmente el cultivar Hass como testigo susceptible y el portainjerto Topa-
Topa usado en California por su resistencia a suelos salinos pero registrado como
susceptible a P. cinnamomi de acuerdo a Bernal et al. 2008; Zilberstein y Pinkas 1987), en
un arreglo factorial de 3 x 21 para un total de 63 tratamientos con tres repeticiones por
tratamiento y 189 plantas. Las evaluaciones se realizaron cada dos días a partir del quinto
día de inoculación durante 16 días, se analizó como parcelas subdivididas siendo la
subsubparcela el tiempo de evaluación con ocho fechas de lectura. Dada las altas
variaciones presentadas, los datos se transformaron con la raíz cuadrada para cada
observación.
4.10 Variable de respuesta
De las observaciones en campo se obtuvieron registros de largo y ancho de la lesión por
espacio de ocho días de lecturas, los cuales se multiplicaron para obtener el área de la
lesión con la cual se determinó el Área Bajo la Curva del Progreso de la Enfermedad
(ABCPE) de tres (3) cepas, 21 genotipos de aguacate en 3 bloques para un total de 1.512
datos de ABCPE.
4.11 Inoculación
Se usó la metodología descrita por Jaramillo et al. (2009), de inoculación con micelio en
herida al tallo a cada planta, para evaluar la resistencia de los 21 genotipos de aguacate a
las dos cepas de P. cinnamomi seleccionadas por patogenicidad. El método se basa en
realizar una herida al tallo, a una altura de 5cm por encima del punto de injertación. La
herida se realizó de arriba hacia abajo con una hoja de bisturí sin afectar el leño de la
planta, retirando parcialmente una lengüeta de la corteza del tallo de aproximadamente
Materiales y métodos 37
2mm de profundidad. Al interior de la lengüeta se colocó un disco de agar de 6mm de
diámetro con micelio de P. cinnamomi. Posteriormente se cubrió la herida con parafilm
para evitar la caída del agar con micelio, regular la humedad, evitar la contaminación y
asegurar la colonización del patógeno. Las plantas testigo fueron inoculadas con la misma
metodología, por herida al tallo, con un disco de 6mm de diámetro de agar y agua sin
micelio (Anexo C).
5. Resultados y discusión
La interacción entre materiales criollos de aguacate y las dos cepas patogénicas de P.
cinnamomi Rands, para las condiciones del C.I. Palmira bajo los procedimientos y
protocolos enunciados en el capítulo anterior, se esbozan a continuación:
5.1 Caracterización morfológica del banco de germoplasma de aguacate del C.I. Palmira
De las 15 características morfológicas cualitativas medidas, cinco mostraron más de tres
clases fenotípicas, siendo forma de la hoja la de mayor clases fenotípicas presentes con
siete clases (obovada-angosta, obovada, oval, redondeada, coediforme, lanceolada y
oblongo-lanceolada) seguido de forma del ápice de la hoja con cinco clases fenotípicas
(muy agudo, agudo, intermedio, obtuso y muy obtuso); con cuatro clases fenotípicas: color
de la rama joven (amarillo, verde, rojo y otros colores), pubescencia de la superficie inferior
(ausente, escasa, intermedia y densa) y pubescencia de la superior de la hoja (ausente,
escasa, intermedia y densa); con tres clases fenotípicas: superficie del tronco (lisa, rugosa
y muy rugosa), forma de la base de la hoja (aguda, obtusa y truncada) y olor a anís (tenue,
intermedio e intenso); con dos clases fenotípicas: color de las lenticelas del vástago joven
(marrón y rojo), peciolo acanalado (presente y ausente) y margen de la hoja (entero y
ondulado). Las características: ángulo de inserción en el peciolo foliar, número de venas
primarias de las hojas y divergencia de las venas primarias presentaron una sola clase
fenotípica, por lo cual se consideran como características poco útiles para discriminar la
variabilidad entre accesiones de aguacate (Tabla 2).
40 Caracterización morfológica y evaluación de la resistencia de materiales criollos de aguacate Persea americana Mill. A la pudrición radical del aguacate Phytophthora cinnamomi Rands en el centro de investigación Palmira de CORPOICA.
Tabla: 2 Resumen de las características cualitativas registradas en 187 accesiones de aguacate
Variable Clase fenotípica y No. de individuos que la
presentaron.
Superficie del tronco 3(7), 7(123), 9(57) Color de las lenticelas del vástago joven. 3(183), 4(4) Color de la rama joven (hojas jóvenes de la punta de la rama) 1(4), 2(131), 3(50), 4(2) Superficie de la rama joven. 1(34), 2(153) Pubescencia de la superficie inferior de la hoja. 0(100), 3(47), 5(32), 7(8) Pubescencia de la superficie superior de la hoja. 0(101), 3(48), 5(24), 7(14) Peciolo acanalado 0(111), 1(76) Angulo de inserción del peciolo foliar. 1(187) Numero de venas primarias de la hoja. 1(187) Divergencia de las venas primarias medida en ángulos. 1(187) Forma de la hoja. 2(26), 3(2), 4(51), 5(59), 6(5), 7(13), 9(31) Margen de la hoja. 1(139), 2(48) Forma de la base de la hoja. 1(122), 2(60), 3(5) Forma del ápice de la hoja. 1(11), 3(67), 5(74), 7(33), 9(2) Olor a anís. 3(174), 5(8), 7(5)
El ACM para las 15 variables cualitativas caracterizadas permitió identificar las dos
primeras dimensiones como las de mayor aporte a la variabilidad observada con 11,14%
la primera dimensión y 10,56% la segunda para un total de 21,70% de variabilidad
explicada en el germoplasma de aguacate de Corpoica C.I. Palmira (Tabla 3). La primera
dimensión está definida por forma de la hoja (FH) con una contribución del 28,79%, forma
de la base de la hoja (FBH) con un porte de 22,53% y la segunda dimensión estuvo definida
por la pubescencia de la superficie superior de la hoja (PSSH) con un aporte de 12,3% y
pubescencia de la superficie inferior de la hoja (PSIH) con un 8,81%.
Tabla: 3 Análisis de correspondencia múltiple para variables cualitativas en 187 accesiones de Persea americana presentes en el banco de germoplasma de Corpoica C.I. Palmira.
Número Valor propio Porcentaje Porcentaje acumulado
1 0,4133 11,14 11,14
2 0,4023 10,56 21,70
De acuerdo con el análisis de clasificación jerárquica con base en el ACM se identificaron
cinco grupos a una distancia de 30 unidades (Anexo D), en los cuales los agrupamientos
responden a materiales con atributos cualitativos similares.
Resultados y discusión 41
El agrupamiento no permitió discriminar entre accesiones por centro de origen (estructura
genética). Dentro del germoplasma se encuentra accesiones reconocidas comercialmente
cuyo origen (previo a conservarse en el C.I. Palmira) es CORPOICA centro de
investigación La Selva donde se encontraba inicialmente el Banco de Germoplasma de
Aguacate (33,7% del germoplasma) y accesiones colectadas en Colombia entre 2007 y
2008 por CIAT-CORPOICA-PROFRUTALES (66,3% del germoplasma).
El primer grupo está constituido por las accesiones 1607, 135-15, 135-20, 135-21, 135-27,
42 Caracterización morfológica y evaluación de la resistencia de materiales criollos de aguacate Persea americana Mill. A la pudrición radical del aguacate Phytophthora cinnamomi Rands en el centro de investigación Palmira de CORPOICA.
Sasa-009, Toal-004, Vabu-014, Vabu-021, Varo-002 y Varo-006 el cual representa el
15,5% de la población estudiada. La variable más discriminante de este agrupo
corresponde al tipo de hoja redondeada con forma de la base de la hoja obtusa, forma del
ápice agudo, presencia del peciolo acanalado y superficie del tronco muy rugosa.
5.2 Selección del material vegetal
Dieciocho Accesiones de aguacate antillano se seleccionaron por zonas de colecta con el
objetivo de evaluar germoplasma de todo el territorio nacional teniendo en cuenta que la
variable de mayor discriminación morfológica, forma de la hoja, estuviese presente en cada
zona en sus diferentes formas. Como testigo resistente se eligió el clon CANO-008 de
Norcasia, Caldas identificado como material muy resistente a P. cinnamomi en evaluación
realizada en CIAT 2009, y como testigos susceptibles el cultivar Hass (Jaramillo et al.,
2009) y el portainjerto Topa-Topa (Gabor et al., 1990; Gabor y Coffey, 1991; Kellam y
Coffey, 1985), este último usado como patrón por presentar resistencia a algunas
enfermedades fungosas del suelo (Bernal et al., 2008) pero susceptible a P. cinnamomi
(Tabla 4).
Resultados y discusión 43
Tabla: 4 Accesiones de aguacate seleccionados para el estudio y su respectiva procedencia
Genotipo de aguacate
Procedencia Coordenadas de colecta
Boca-021 1 Carmen de Bolívar-Bolívar 09°44′43,4″N, 75°16′28,2″O Caro-019 1 Rosas-Cauca 02°14′10,0″N, 76°44′32,6″O Cavi-041 1 La Victoria-Caldas 05°20′36,1″N, 74°54′20,2″O Cepu-008 1 Pueblo bello-Cesar 10°24′57,8″N, 73°38′54,8″O Husu-004 1 La Suaza-Huila 01°55′16,5″N, 75°49′14,7″O Masa-031 1 Santa Marta-Magdalena 11°12′90,7″N, 74°02′68,8″O Mevi-001 1 Villavicencio-Meta 04°01′17,3″N, 73°14′28,8″O Natu-001 1 Tumaco-Nariño 01°32′54,4″N, 78°41′49,8″O Natu-002 1 Tumaco-Nariño 01°34′24,4″N, 78°42′02,0″O Quiqui-030 1 Quimbaya-Quindío 04°37′37,1″N, 75°44′59,0″O Quite-027 1 La Tebaida-Quindío 04°27′50,3″N, 75°48′22,0″O Saca-014 1 Carmen del chucuri-Santander 06°39′03,2″N, 73°35′51,7″O Saca-017 1 Carmen del chucuri-Santander 06°44′23,8″N, 73°35′40,6″O Toma-003 1 Mariquita-Tolima 04°40′14,2″N, 74°59′07,5″O Vabu-014 1 Buga-Valle del Cauca 03°52′40,6″N, 77°00′44,7″O Vapa-062 1 Palmira-valle 03°30′37,9″N, 76°19′33,9″O Varo-002 1 Rozo-Valle del Cauca 03°36′39,0″N, 76°25′29,0″O Varo-006 1 Rozo-Valle del Cauca 03°36′39,0″N, 76°25′29,0″O Cano-008 2 Norcasia-Caldas 05°36′38,9″N, 74°52′35,9″O Topa-topa 3 Ojai-California 03°36′43,6″N, 76°18′53,5″O Hass 4 Vivero PROFRUTALES 03°36′43,6″N, 76°18′53,5″O
Tipo de selección: 1 Distancia genética (ACM), 2 Accesión resistente (Jaramillo et al., 2009), 3 Portainjerto susceptible (Gabor et al., 1990; Kellam y Coffey, 1985) y 4 Cultivar susceptible (Jaramillo et al., 2009).
5.3 Monitoreo climatológico en el área de estudio
La información colectada de temperatura y humedad relativa de la estación meteorológica
portátil durante los 25 días de observación permitió establecer que las condiciones
estuvieron dentro de los rangos óptimos para la expresión de la enfermedad según Rojas
(2004). La temperatura promedio diaria durante el ensayo fue de 26,6°C ± 1,77°C y la
humedad relativa promedio diaria fue de 64,3% ± 9,1%. Se presentaron variaciones diarias
promedio de 6,34°C y 24,58% de humedad relativa (Figura 7 y 8; Anexo E y F). Las
temperaturas más bajas se registraron entre las 04:00 y 08:30 de la mañana llegando a
20,3°C, y las temperaturas más altas entre las 02:00 y 03:30 de la tarde con el mayor valor
de 31,9°C. La humedad relativa ambiental más baja registrada durante el ensayo se
presentó entre la 01:00 y 04:00 de la tarde con un valor mínimo de 51% y los valores más
altos entre las 06:00 y 10:00 de la mañana presentando un valor máximo de 93,8% de
humedad relativa ambiental.
44 Caracterización morfológica y evaluación de la resistencia de materiales criollos de aguacate Persea americana Mill. A la pudrición radical del aguacate Phytophthora cinnamomi Rands en el centro de investigación Palmira de CORPOICA.
Figura: 7 Temperatura (ºC) registrada durante el periodo de las evaluaciones.
Figura: 8 Humedad relativa máxima, mínima y promedio (%) registrada durante el periodo de las evaluaciones.
Resultados y discusión 45
5.4 Síntomas y niveles de expresión de la enfermedad por cepa evaluada
Al día siguiente de la inoculación la cepa Ag A-041 de P. cinnamomi presentó los síntomas
de la enfermedad en la zona de inoculación en el material criollo Quiqui-030 de Quimbaya,
Quindío, la cual fue la accesión más susceptible en el ensayo. La necrosis observada
presentaba color café oscuro y de consistencia húmeda. La enfermedad evidenció
síntomas de progreso durante todo el tiempo del ensayo, necrosando el tallo hacia arriba
y hacia abajo de la lesión. La celeridad del avance de la necrosis se dio en mayor
proporción hacia el ápice del tallo (copa) en sentido ascendente. (Figura 9).
La cepa Ag A-003 tardó cinco días en expresar los síntomas de la enfermedad en la zona
de inoculación en el material criollo Quiqui-030. El área necrosada no presentó un
desarrollo visual significativo de la enfermedad en el tallo de las plantas inoculadas, con
excepción del cultivar Hass donde se evidenció un necrosamiento continuo del área
afectada, pero menos pronunciado que el causado por la cepa Ag A-041. El avance de la
enfermedad medida a través del área necrosada fue poca, evidenciando en campo que la
cepa Ag A-003 es de menor nivel de patogenicidad que la cepa Ag A-041, debido al tiempo
tardío en presentar la infección y por la mínima infección que causó durante el tiempo que
se desarrolló el ensayo (Figura 10).
Cinta parafilm cubriendo
zona de inoculación.
Zona necrosada cinco días
después de la inoculación de la
cepa Ag A-041.
Yema terminal de la planta
doblada por muerte parcial de
tejido del tallo soporte.
Figura: 9 Necrosamiento del tallo de planta de aguacate causado por la cepa Ag A-041 de Phytophthora cinnamomi cinco días después de la inoculación en la accesión de aguacate Quiqui-030.
46 Caracterización morfológica y evaluación de la resistencia de materiales criollos de aguacate Persea americana Mill. A la pudrición radical del aguacate Phytophthora cinnamomi Rands en el centro de investigación Palmira de CORPOICA.
Las plantas inoculadas con el tratamiento testigo agar más agua sin micelio del patógeno
no presentaron ningún síntoma de la enfermedad. En estas plantas solo se presentó una
oxidación del tejido en el área del corte realizado para simular la inoculación, durante todo
el ensayo (Figura 11). El secamiento del tejido, sin un evidente necrosamiento patogénico,
registrado en todas las unidades experimentales que fueron sometidas a este tratamiento,
demuestra la confiabilidad que el proceso de inoculación ha logrado, permitiendo
garantizar los resultados obtenidos. Además de esto se pudo determinar que la infección
expresada por el necrosamiento húmedo del tejido del tallo en el área intervenida fue
ocasionado por las estructuras invasivas de las cepas de P. cinnamomi y no por un
disturbio aislado en la planta, observable en todos los tratamientos y repeticiones del
ensayo con presencia del patógeno.
Cicatriz de hoja.
Yema axilar.
Zona afectada por P. cinnamomi en
punto de injertación, cubierta por cinta
parafilm.
Cicatriz de la injertación en púa
terminal.
Figura: 10 Necrosamiento reducido del tallo de planta de aguacate causado por la cepa Ag A-003 de Phytophthora cinnamomi 20 días después de la inoculación en la accesión de aguacate Quiqui-030.
Resultados y discusión 47
Las accesiones de aguacate susceptibles a P. cinnamomi (cepas: Ag A-041 y Ag A-003),
presentaron un avance progresivo de la enfermedad desde los primeros días de la
inoculación del patógeno, causando necrosamiento rápido y ascendente en el tallo de la
planta. Lo anterior generó secamiento de las hojas defoliándose pocos días después de la
inoculación. La afección en las plantas susceptibles causó la muerte rápida del material
injertado (copa), sin llegar a alcanzar la cicatriz del injerto.
Diez días después de la inoculación, en todos los tratamientos con cepas del patógeno, se
registró un sobre-crecimiento blanquecino sobre el área de inoculación (Figura 12),
característica que presentan las plantas cuando son severamente afectadas por este
patógeno (Mora et al., 2007 apud, Lemus, 2009). Las plantas con tratamiento testigo
inoculadas con agar más agua no registraron el sobrecrecimiento blanquecino. El
crecimiento blanquecino fue sembrado en PDA+ y se obtuvo crecimiento de micelio en
forma tipo roseta característico de P. cinnamomi.
Herida cicatrizada sin
presencia de necrosamiento.
Figura: 11 Oxidación del tejido afectado por el corte con inoculación de agar más agua, sin expresión de síntoma de necrosis causado por Phytophthora cinnamomi 20 días después de la inoculación en la accesión de aguacate Quiqui-030.
48 Caracterización morfológica y evaluación de la resistencia de materiales criollos de aguacate Persea americana Mill. A la pudrición radical del aguacate Phytophthora cinnamomi Rands en el centro de investigación Palmira de CORPOICA.
Con el fin de confirmar que los síntomas de necrosamiento eran causados por el patógeno
inoculado, se realizó re-aislamiento del patógeno en el laboratorio de Fitopatología de
CORPOICA C.I. Palmira. Se tomaron trozos de tallos con los síntomas de la enfermedad,
que fueron cortados en proporción de 50% tejido afectado y 50% tejido no afectado,
tomando tejido interno del tallo y parte de la corteza del mismo. Se desinfectó con
hipoclorito al 1% y alcohol al 96%, para posteriormente ser sembrados en cajas Petri con
medio selectivo de PDA+antibióticos y fungicidas para garantizar el aislamiento de P.
cinnamomi. Todo el proceso se realizó en cabina de flujo laminar garantizando la asepsia
del proceso. Se observó crecimiento de micelio 3 días después de la siembra el cual fue
trasladado a PDA donde se observó crecimiento de la colonia de micelio tipo roseta o
Sobre-crecimiento presentado en
las plantas inoculadas con P.
cinnamomi.
Figura: 12 Plantas de aguacate con crecimiento blanquecino sobre el área afectada por la inoculación con Phytophthora cinnamomi.
Resultados y discusión 49
petaloide característico de P. cinnamomi (Figura 13). Se realizaron montajes de placa para
identificar el patógeno presente. Las estructuras observadas corresponden a las descritas
para P. cinnamomi con micelio tipo coraloide (hifas protuberantes) y clamidosporas
globosas (Figura 14). El micelio tipo coraloide es la principal característica que diferencia
a P. cinnamomi de otras especies de Phytophthora, ya que es la única especie de este
género que posee esta peculiar característica de poseer nodos (vesículas hinchadas) en
sus hifas.
Figura: 13 Crecimiento de colonia de micelio tipo petaloide de reaislamiento de material vegetal de aguacate inoculado con cepas de Phytophthora cinnamomi.
50 Caracterización morfológica y evaluación de la resistencia de materiales criollos de aguacate Persea americana Mill. A la pudrición radical del aguacate Phytophthora cinnamomi Rands en el centro de investigación Palmira de CORPOICA.
Las plantas más susceptibles al patógeno presentaron un rápido avance de la lesión,
llegando a ocasionar la muerte de la parte superior de la planta (copa). Las plantas que
presentaron menor necrosamiento del tallo cercano a la zona de inoculación presentaron
diferentes niveles de infección. Cabe resaltar que las plantas que presentaron menor
avance de la enfermedad, si presentaron infección causada por la alta concentración del
micelio inoculado, mínima en comparación con las plantas que presentaron crecimiento
rápido del área afectada y necrosada (Figura 15). Además de la mayor área afectada,
también se observaron síntomas de afección por el patógeno, tales como amarillamiento
de las hojas y pérdida de vigor de las plantas.
5.5 Síntomas de la enfermedad en las plantas inoculadas
Los síntomas observados en las plantas por afección del patógeno, fueron inicialmente la
pudrición de color marrón a negro en la zona de la inoculación del patógeno, la cual se
incrementó ascendentemente invadiendo tejido sano de tallos y ocasionando la caída de
hojas en las zonas de necrosis del tallo. La parte superior de la planta, por encima de la
zona de inoculación presentó decaimiento o pérdida de vigorosidad, clorosis general de
ramas y hojas, marchitamiento y defoliación. Las plantas detuvieron su crecimiento en
Figura: 14 Micelio tipo coraloide (micelio con protuberancias o nodos) de la cepa Ag A-041 de Phytophthora cinnamomi.
Resultados y discusión 51
comparación con las plantas inoculadas con cepa testigo que presentaron un mayor
desarrollo y se inició un proceso de emisión de yemas axilares por debajo de la zona de
infección como respuesta al desorden fisiológico presentado.
5.6 Análisis de varianza (ANDEVA) para la interacción cultivar criollo vs. Cepa de P. cinnamomi Rands
El análisis de varianza (ANDEVA) de los resultados del ensayo para el ABCPE presentó
diferencias estadísticas altamente significativas (P ≤ 0,01) entre las dos cepas de P.
cinnamomi, entre las 21 accesiones de aguacate, entre las fechas de lectura (tiempo). Así
mismo se registraron diferencias altamente significativas para las interacciones de cepa
por genotipo, cepa por tiempo, genotipo por tiempo y cepa por genotipo por tiempo (Tabla
5). Lo anterior indica que por lo menos una de las cepas registró mayor severidad, las
accesiones de aguacate presentan un progreso variable de la enfermedad, en el tiempo
las cepas presentan diferentes niveles de infección y que las cepas afectaron de manera
diferente las accesiones de aguacate (Figura 16).
Figura: 15 Planta con alta resistencia (izquierda), planta con resistencia intermedia (centro) y planta susceptible (derecha).
52 Caracterización morfológica y evaluación de la resistencia de materiales criollos de aguacate Persea americana Mill. A la pudrición radical del aguacate Phytophthora cinnamomi Rands en el centro de investigación Palmira de CORPOICA.
Tabla: 5 Análisis de Varianza del ABCPE de la inoculación de 21 clones de aguacate con dos aislamientos de Phytophthora cinnamomi.
Fuente de variación GL CM P valor b
Bloque 2 1,69 0,0002 ** Cepa 2 2389,43 <,0001 **
Bloque x cepa. E(a) 4 0,64
Genotipo 20 13,18 <,0001 **
Cepa x genotipo 40 12,47 <,0001 **
Bloque x genotipo (cepa). E(b) 120 5,32
Tiempo 7 174,19 <,0001 **
Cepa x tiempo 14 77,68 <,0001 **
Genotipo x tiempo 140 0,53 <,0001 **
Cepa x genotipo x tiempo 280 0,46 <,0001 **
Error (c) 882 0,20 Total 1.511
C.V: 21,28%.
GL: grados de libertad. P valor b: probabilidad de encontrar valores mayores de F. CM: cuadrado medio. ** Diferencia latamente significativa
Figura: 16 Avance de la enfermedad para dos cepa de Phytophthora cinnamomi (Ag A-041 muy patogénica, Ag A-003 poco patogénica y Ag A-000 testigo agar más agua) sobre tres accesiones de aguacate: Quiqui-030 muy susceptible, Cepu-008 medianamente resistente y Natu-001 muy resistente.
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Ag A-041 Ag A-003 Ag A-000Are
a b
ajo
la c
urv
a d
el pro
gre
so d
e la
enfe
rmedad (
AB
CP
E)
Cepa
Avance de la enfermedad para tres accesiones de aguacate (Muy susceptible, medianamente resistente y muy resistente) vs. tres cepas de
Phytophthora cinnamomi.
QUIQUI-030
VARO-006
NATU-001
Resultados y discusión 53
Los valores de F para cada una de las fuentes de variación, reportan diferencias altamente
significativas para todas las fuentes de variación. Fueron estimadas según el error
asociado a cada una de ellas, diferenciándose tres tipos de error: Error tipo (a) para la
interacción Bloque*Cepa, Error tipo (b) para la interacción Bloque*Genotipo (Cepa), y Error
tipo (c) para la interacción Cepa*Genotipo*Tiempo (Tabla 5).
A partir del análisis de varianza y la separación de medias mediante el test de comparación
múltiple de promedios de Tukey, se identificó la cepa Ag A-041 de Tribunas Córcega,
Risaralda como la más patogénica al obtener el mayor valor promedio de ABCPE sobre
las diferentes accesiones de aguacate. La cepa Ag A-003 de Rionegro, Antioquia presentó
diferencia estadística respecto a la cepa testigo Ag A-000 indicando que si tuvo un nivel
de patogenicidad pero con un valor menor de ABCPE frente a la cepa Ag A-041 (Tabla 6).
Este resultado comprobó las observaciones realizadas del ensayo donde se evidenció que
la cepa Ag A-003 no registró una alta patogenicidad sobre las accesiones de aguacate
evaluadas.
Tabla: 6 Niveles de patogenicidad de 2 cepas de Phytophthora cinnamomi sobre aguacate y cepa testigo (agar más agua).
Agrupamiento Tukey Promedio Cepa
A 4,086 Ag A-041 B 0,741 Ag A-003 C 0,000 Ag A-000
La diferencia significativa estadística presentada entre accesiones de aguacate indica que
los genotipos expresaron diferentes respuestas al patógeno representada por valores
promedios de ABCPE.
5.7 Respuesta de las accesiones criollas de aguacate a las cepas de P. cinnamomi
De acuerdo con el análisis de comparación de medias de Tukey, de las 21 accesiones de
aguacate evaluadas, 5% presentaron un alto nivel de resistencia. La accesión NATU-001
del departamento de Nariño, municipio de Tumaco, fue la que mostró los valores de
ABCPE más bajos entre las accesiones a las cepas de P. cinnamomi evaluadas. Cinco por
54 Caracterización morfológica y evaluación de la resistencia de materiales criollos de aguacate Persea americana Mill. A la pudrición radical del aguacate Phytophthora cinnamomi Rands en el centro de investigación Palmira de CORPOICA.
ciento (5%) de las accesiones mostraron resistencia, 23% con resistencia intermedia, 57%
presentaron baja resistencia, 5% mostraron ser susceptibles y 5% muy susceptibles,
siendo la accesión de aguacate QUIQUI-030 de Quimbaya, Quindío, la más afectada,
registrando los más altos valores de ABCPE (Tabla 7). El cultivar Hass reportado como
susceptible al patógeno en Colombia, presentó el segundo promedio más alto de ABCPE
seguido de la accesión CARO-019 de Rosas, Cauca, seguido del portainjerto Topa-topa
reportado en EE.UU. como susceptible. Lo anterior ha permitido demostrar que la
metodología de infección con herida al tallo en aguacate es un procedimiento de
evaluación indirecta válido para caracterizar la respuesta genética a P. cinnamomi.
El material que registró la mayor resistencia, NATU-001, fue colectado en el municipio de
Tumaco, Nariño (Tabla 4), en la costa pacífica de Colombia a 25 m.s.n.m. con una
temperatura promedio de 29ºC con oscilaciones entre 16 y 33ºC, humedad relativa
promedio de 83,86%, precipitación de 2.792mm por año, topografía relativamente plana
favoreciendo sobresaturación e inundaciones del terreno. El municipio se caracteriza por
un clima cálido húmedo característico del bosque húmedo tropical (BHT), condiciones
ideales para el desarrollo y posible infección de plantas de aguacate por P. cinnamomi.
Esta condición ambiental descrita, la convierte en un área con potencial para colectar
plantas resistentes al problema de la pudrición radical. La condición alógama de la planta
de aguacate genera mayor variabilidad genética que propicia la aparición de individuos con
diferentes niveles de resistencia. Esto se evidencia con la accesión NATU-002 que a pesar
de haber sido colectada en la misma zona agroecológica que la accesión NATU-001
presento una baja resistencia en el presente ensayo.
La accesión CANO-008 reportada por Jaramillo et al. (2009) como material resistente fue
utilizada en el presente ensayo como testigo resistente registrando el segundo valor más
bajo de ABCPE confirmando así los resultados previos. Esta accesión fue colectada en el
municipio de Norcasia, Caldas a 551 m.s.n.m. con una temperatura media anual de 25ºC,
precipitación promedio anual de 3.675mm, humedad relativa ambiental promedio de
76,76%. Norcasia registra clima cálido que se caracteriza por fuertes lluvias en cortos
tiempo, generando un ambiente óptimo para la aparición de P. cinnamomi en cultivos de
aguacate, ambiente que favorece la diversidad biológica del patógeno así como la
Resultados y discusión 55
interacción con los individuos de la población de aguacate y toda la variabilidad posible en
la región. Dichas condiciones ambientales son ideales para una alta producción de
esporangios y liberación y movimiento de las zoosporas por las altas precipitaciones de
estas zonas que favorecen el traslado de las propágulos del patógeno entre raíces de
árboles infectados a raíces de plantas sanas a través de medio liquido (exceso de agua de
lluvia) (Andrade-Hoyos, 2012). De acuerdo a lo anterior los materiales NATU-001 y CANO-
008 fueron colectados de zonas de alta humedad con temperaturas promedios entre 25 y
29ºC. El anterior escenario abre la posibilidad de identificar portainjertos de aguacate
criollos resistentes al problema de pudrición radical para cada zona agroclimática
productora en Colombia, debido al proceso de adaptación al cual se han sometido las
plantas en cada región o zona agroclimática.
Es importante destacar que la colecta y evaluación de plantas escapes (plantas
sobrevivientes a muertes por pudrición radical en zonas de BHT) son consideradas
potenciales como estrategia que permite identificar portainjertos promisorios al manejo de
la pudrición radical por presión de cepas severas de P. cinnamomi diferentes a las
estudiadas.
56 Caracterización morfológica y evaluación de la resistencia de materiales criollos de aguacate Persea americana Mill. A la pudrición radical del aguacate Phytophthora cinnamomi Rands en el centro de investigación Palmira de CORPOICA.
Tabla: 7 Niveles de resistencia de 21 accesiones de aguacate del Banco de Germoplasma de CORPOICA C.I. Palmira a 2 cepas de Phytophthora cinnamomi.
QUITE-027 1,398 BC CAVI-041 1,394 BC VAPA-062 1,371 BC MEVI-002 1,316 BC VABU-014 1,312 BC
Resistente CANO-008 1,057 BC
Alta resistencia NATU-001 0,760 C
La interacción cepa por genotipo fue altamente significativa, lo cual según Vallejo y Estrada
(2013) se identifica como resistencia vertical, donde la interacción diferencial entre las
variedades del hospedero (accesiones de aguacate para este caso) y las razas del
patógeno (cepas de P. cinnamomi) determinan la resistencia vertical controlada por un solo
gen (resistencia monogénica). La infección negativa de la cepa testigo indica que el método
de inoculación se realizó adecuadamente ya que no se presentó sintomatología
fitopatológica en las plantas testigo.
La diferencia altamente significativa en el tiempo para ABCPE indica que el avance de la
enfermedad fue creciente en el tiempo según los resultados. Así como se presentó
interacción Cepa*Genotipo, también se registró interacción de Cepa*Tiempo,
Genotipo*Tiempo y Cepa*Genotipo*Tiempo. Lo anterior demuestra que el avance de la
Resultados y discusión 57
enfermedad depende de la cepa y es progresivo a medida que avanza el tiempo. Tanto
para cepa como para genotipo se observó avance de la enfermedad de forma variable en
función del tiempo.
Al evaluar la cepa Ag A-041, el genotipo NATU-001 registró el menor valor de ABCPE,
mientras que QUIQUI-030 el de mayor valor (Figura 17, Anexo G). Por otra parte, la cepa
Ag A-003 registró valores de ABCPE 90% menores que la cepa Ag A-041 demostrando
que el genotipo con mayor avance de la enfermedad fue el cultivar Hass, evaluado como
testigo susceptible en este ensayo (Figura 18, Anexo I) y la accesión NATU-001 con el
menor valor de ABCPE. La cepa Ag A-000, testigo sin patógeno, no presentó ABCPE para
ninguno de los genotipos de aguacate, evidenciando que la inoculación se realizó con
todas las medidas asépticas necesarias para garantizar un adecuado ensayo
disminuyendo el error experimental (Figura 17 Y 18, Anexo H).
Figura: 17 Niveles de resistencia de 6 accesiones de aguacate a la cepa Ag A-041 de Phytophthora cinnamomi según el ABCPE y respuesta de tratamiento testigo con la cepa Ag A-000.
58 Caracterización morfológica y evaluación de la resistencia de materiales criollos de aguacate Persea americana Mill. A la pudrición radical del aguacate Phytophthora cinnamomi Rands en el centro de investigación Palmira de CORPOICA.
Figura: 18 Niveles de resistencia de 6 accesiones de aguacate a la cepa Ag A-003 de
Phytophthora cinnamomi según el ABCPE y respuesta de tratamiento testigo con la cepa
Ag A-000.
Debido a la alta variabilidad genética en P. americana, acentuado por su comportamiento
dicogámico se sugiere colectar la mayor diversidad posible de plantas con atributos
superiores de resistencia a la enfermedad pudrición radical del aguacate para ser
evaluados con cepas agresivas de P. cinnamomi.
Es importante analizar y discutir la importancia de los materiales criollos antillano, que se
desarrollan bajo condiciones ambientales de BHT con temperaturas entre 18 y 26ºC, de 0
a 800 m.s.n.m., alta humedad relativa y precipitación por encima de los 1.000mm anuales
(Bernal et al., 2008). Las condiciones anteriores favorecen la infección por P. cinnamomi y
a su vez la selección natural de materiales resistentes a la enfermedad causada por este
oomyceto.
Según Girard (1986) apud. Sandoval et al. (2010) y algunos autores Bernal et al. (2008),
la raza antillana tiene su origen en las mesetas bajas de la costa norte Colombiana en
Resultados y discusión 59
estribaciones de la Sierra Nevada de Santa Marta desde donde fue llevada a las Antillas,
sitios que fueron visitados en la colecta. Con los avances suministrados en este estudio se
logró demostrar la importancia de las colectas de individuos “escapes” que permita en el
mediano plazo contar con portainjertos con resistencia a la enfermedad pudrición radical
del aguacate y así contribuir al desarrollo competitivo del sector aguacatero del país.
6. Conclusiones y recomendaciones
6.1 Conclusiones
• Existe amplia diversidad genética en el Banco de Germoplasma de aguacate de
CORPOICA C.I. Palmira, caracterizada a través de descriptores morfológicos cualitativos
para 187 accesiones de este banco.
• La técnica de infección de Phytophthora cinnamomi mediante la inoculación de
micelio con herida al tallo en plántulas injertadas (clones criollos) de aguacate, es replicable
siguiendo la metodología del presente trabajo, tomada de Jaramillo et al. (2009).
• Basados en los resultados obtenidos, el genotipo NATU-001 fue caracterizado
como muy resistente para las dos cepas del patógeno evaluadas.
• En la presente caracterización se encontraron diferentes niveles de resistencia a la
pudrición radical por Phytophthora spp. en aguacate, mediante la técnica de herida al tallo
del injerto clonado.
• Con base en los resultados obtenidos, se concluye que en el banco de
germoplasma de aguacate del C.I. Palmira, existen diferentes niveles de resistencia
genética al patógeno causante de la pudrición radical por P. cinnamomi.
• Los cultivares criollos NATU-001 y CANO-008 se destacan como muy resistente y
resistente a las dos cepas de P. cinnamomi evaluadas, posiblemente a la naturaleza
endógena o genética, al demostrarse mediante diseño experimental el avance de la
enfermedad medida como área bajo la curva del progreso de la enfermedad (ABCPE), con
un nivel estadístico de significancia alto.
62 Caracterización morfológica y evaluación de la resistencia de materiales criollos de aguacate Persea americana Mill. A la pudrición radical del aguacate Phytophthora cinnamomi Rands en el centro de investigación Palmira de CORPOICA.
6.2 Recomendaciones
• Continuar las caracterizaciones del banco de germoplasma de aguacate criollo de
CORPOICA C.I. Palmira, con el fin de establecer una colección núcleo de materiales
altamente promisorios para evaluar en campo la resistencia a Phytophthora cinnamomi
Rands.
• Confrontar estos resultados mediante protocolos de infección directa a la raíz con
el fin de establecer correlaciones entre los dos métodos y evaluar la eficiencia y eficacia
de estos protocolos de infección y caracterización de genotipos de aguacate.
• Realizar este tipo de investigación con portainjertos clonados por la técnica de
etiolación con doble injertación para evaluar el posible efecto del portainjerto de origen
sexual sobre la expresión de síntomas de la enfermedad pudrición radical del aguacate.
• Evaluar nuevos cultivares de aguacate, con énfasis en razas antillanas del Banco
de Germoplasma del C.I. Palmira, conocidos como criollos, como posibles fuentes de
resistencia a P. cinnamomi.
• Estructurar un plan de colecta que permita acceder a nuevas accesiones de
aguacate, posible raza antillana, que se encuentran aún dispersas, con características
sobresalientes por su resistencia a P. cinnamomi.
• Evaluar en campo y bajo diferentes condiciones el comportamiento de los cultivares
evaluados en la presente investigación a fin de corroborar la expresión de síntomas y el
desarrollo de la copa y patrón.
• Evaluar métodos directos de inoculación por infección a la raíz, con las mismas
cepas, a fin de correlacionar los protocolos de infección.
• Se sugiere clonar los genotipos de aguacate mediante la técnica de etiolación con
doble injertación (EDI), que permitan garantizar la identidad genética de los materiales.
Conclusiones y recomendaciones 63
• Incluir las cepas de P. cinnamomi colectadas para trabajos relacionados al banco
de germoplasma de microorganismos de CORPOICA para garantizar una adecuada
conservación.
Anexos:
Anexo: A Ubicación de la procedencia de los genotipos de aguacate y vivero de injertación y desarrollo de la evaluación.
66 Caracterización morfológica y evaluación de la resistencia de materiales criollos de aguacate Persea americana Mill. A la pudrición radical del aguacate Phytophthora cinnamomi Rands en el centro de investigación Palmira de CORPOICA.
Anexo: B Distribución de las 21 accesiones de aguacate de acuerdo al diseño experimental en BCA con arreglo factorial en Parcelas Subdivididas.
Anexos 67
a) Implementos: punta, bisturí,
mechero, toallas papel,
alcohol.
c) Corte en bisel.
Herida superficial.
c) Cortar discos
de agar con
micelio de
6mm.
d) Inocular disco de
agar con micelio
en herida del tallo.
f) Cubrir herida con disco
de agar y micelio con
cinta parafilm.
h) Monitoreo de
avance de la
enfermedad cada
2 días.
j) Medición de largo
y ancho del
progreso de la
enfermedad.
Anexo: C Diagrama del proceso de infección con micelio mediante la técnica de herida al tallo.
68 Caracterización morfológica y evaluación de la resistencia de materiales criollos de aguacate Persea americana Mill. A la pudrición radical del aguacate Phytophthora cinnamomi Rands en el centro de investigación Palmira de CORPOICA.
Anexo: D Clasificación jerárquica de 187 accesiones de aguacate del Banco de Germoplasma de CORPOICA C.I. Palmira obtenido a partir de análisis de correspondencia múltiple (ACM).
Anexos 69
20
22
24
26
28
30
32
Te
me
ratu
ra (
°C)
Fechas de evalaución del ABCPE
Temperatura (°C) registradá durante la evaluación del ABCPE
Anexo: E Registro de Temperatura (cada 30 minutos) durante el periodo de las evaluaciones.
Anexo: F de Humedad relativa (cada 30 minutos) durante el periodo de las
evaluaciones.
70 Caracterización morfológica y evaluación de la resistencia de materiales criollos de aguacate Persea americana Mill. A la pudrición radical del aguacate Phytophthora cinnamomi Rands en el centro de investigación Palmira de CORPOICA.
Anexo: G Niveles de resistencia de 21 accesiones de aguacate a la cepa Ag A-041 de
Phytophthora cinnamomi según el ABCPE.
Anexo: H Niveles de resistencia de 21 accesiones de aguacate a la cepa Ag A-003 de Phytophthora cinnamomi según el ABCPE.
Anexos 71
Anexo: I Niveles de resistencia de 21 accesiones de aguacate a la cepa Ag A-000 de Phytophthora cinnamomi según el ABCPE (cepa testigo agar más agua).
Bibliografía
Acosta, I. Y. 2008. Pruebas de tolerancia a Phytophthora cinnamomi Rands en plántulas
de aguacate criollo Mexicano (Persea americana Mill. Var. drymifolia. Tesis de pregrado
en Biología. Universidad Michoacana de San Nicolás de Hidalgo. Morelia, Michoacan,
México. 55 p.
Agronet. 2015. Sistema de Estadísticas Agropecuarias SEA. Disponible en:
http://www.agronet.gov.co/www/htm3b/ReportesAjax/VerReporte.aspx. Consulta: Febrero
del 2015.
Alexopoulos, C. J., Mins, C. W. y Blackwell, M. 1996. Introductory Mycology. JOHN WILEY
AND SONS, INC.Pp 63.
Alcántar, J. J. 2008. Tecnología para la producción de aguacate en México, importancia
económica y social. Instituto nacional de investigaciones forestales, agrícolas y pecuarias.
México. 224 p.
Asociación Nacional de Café (Anacafé). 2004. Cultivo de aguacate. Programa de
diversificación de ingresos de la empresa cafetera. Asociación Nacional de Café. Ciudad
de Guatemala, Guatemala. 23 p.
Andrade-Hoyos, P. 2012. Selección de portainjertos de aguacate para tolerancia-
resistencia a Phytophthora cinnamomi Rands. Tesis de doctorado en ciencias con énfasis
en Fitopatología. Colegio de Postgraduados. Institución de Enseñanza e Investigación en
Ciencias Agrícolas. Montecillo, México. 110 p.
Bartoli, J., A., A. 2008. Manual técnico del cultivo del aguacate Hass (Persea americana
L.). Fundación Hondureña de Investigación Agrícola (FHIA). 53 p.
74 Caracterización morfológica y evaluación de la resistencia de materiales criollos
de aguacate Persea americana Mill. A la pudrición radical del aguacate
Phytophthora cinnamomi Rands en el centro de investigación Palmira de
CORPOICA.
Bernal, J. A., Díaz, C. A., Tamayo, A., Córdoba, O., Londoño, M. E., Londoño, M. 2008.
Tecnología para el Cultivo del Aguacate. CORPOICA, Centro de Investigación La Selva,
Rionegro, Antioquia, Colombia. Manual Técnico 5. 242 p.
Bellon, M. R., Barrientos, P. A. F., Colunga, G. M. P., Perales, H., Reyes, A. J. A., Rosales,
S. R., Zizumbo, V. D. 2009. Diversidad y conservación de recursos genéticos en plantas
cultivadas, en Capital natural de México, vol. II: Estado de conservación y tendencias de
cambio. Conabio, Méx., p. 365-368.
Bergh, B. O. 1992. The origin, nature, and genetic improvement of the avocado. Calif.
Avocado Soc. Yearbook. 76: 61-75.
Bergh, B., Ellstrand, N. 1986. Taxonomy of the avocado. Calif. Avocado Soc. Yearbook 70:
135-145
Botha, T., F.C. Wehner y J. Kotzé., M. 1989. An evaluation of in vitro screening techniques
for determining tolerance of avocado rootstocks to Phytophthora cinnamomi. South African
Avocado Grower’s Assoc. Yearbook. 12: 60-63
Cañas, G., P. Galindo, L., F. Arango, R. Saldamando, C., I. 2015. Diversidad genética de
cultivares de aguacate (Persea americana) en Antioquia, Colombia. Agronomía
Mesoamericana. 26(1): 129-143.
Coffey, M. D.1987. Phytophthora root rot of avocado: an integrated approach to control in
California. Plant Disease. 71:1046-1052.
Cohen, Y. y Coffey, M. D. 1986. Systemic fungicides and the control of oomycetes. Annual
Review Phytopathology 24:311-338.
Coria, A. V. M. 2009. Tecnología para la producción de aguacate en México. Libro técnico