Généralités UNIVERSITE D’ANTANANARIVO FACULTE DES SCIENCES DEPARTEMENT DE BIOCHIMIE FONDAMENTALE ET APPLIQUEE DIPLOME D’ETUDES APPROFONDIES DE BIOCHIMIE OPTION : BIOTECHNOLOGIE/ MICROBIOLOGIE Présenté par : RAHARINJATO Fanja Hanitriniala Maître es Sciences Soutenu le : 28 décembre 2006 devant la commission d’examen composée de : Président : Professeur RAZANAMPARANY Julia Louisette Rapporteur : Professeur ANDRIANARISOA Blandine Examinateurs : Docteur RAKOTO Danielle Doll Docteur : RAMAMONJISOA Daniel CONTRIBUTION A L’ETUDE DES ACTIVITES BACTERICIDE, FONGICIDE ET LARVICIDE DE Cinnamosma madagascariensis
101
Embed
CONTRIBUTION A L’ETUDE DES ACTIVITES BACTERICIDE ...biblio.univ-antananarivo.mg/pdfs/raharinjatovofh_sn_m2_06.pdfGlossaire GLOSSAIRE Anthropophile : qui vit dans un milieu fréquenté
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
Généralités
UNIVERSITE D’ANTANANARIVO
FACULTE DES SCIENCES
DEPARTEMENT
DE
BIOCHIMIE FONDAMENTALE ET APPLIQUEE
DIPLOME D’ETUDES APPROFONDIESDE BIOCHIMIE
OPTION : BIOTECHNOLOGIE/ MICROBIOLOGIE
Présenté par :
RAHARINJATO Fanja HanitrinialaMaître es Sciences
Soutenu le : 28 décembre 2006 devant la commission d’examen composée de :
Président : Professeur RAZANAMPARANY Julia Louisette
Rapporteur : Professeur ANDRIANARISOA Blandine
Examinateurs : Docteur RAKOTO Danielle Doll
Docteur : RAMAMONJISOA Daniel
CONTRIBUTION A L’ETUDE DES ACTIVITES
BACTERICIDE, FONGICIDE ET LARVICIDE
DE
Cinnamosma madagascariensis
Remerciements i
REMERCIEMENTS
« Tout ce que vous faites, faites le de bon cœur comme pour le Seigneur » Colossiens 3 :22
Je remercie mes parents de leurs précieux conseils et encouragements tout au long de
mes études.
Je remercie également mon frère, ainsi que mes sœurs d’avoir porté dans leurs
prières la réalisation de ce travail.
« Confie ton activité au Seigneur et tu réalisera tes projets » proverbes 16 :3
Le présent travail a été réalisé dans les laboratoires de :
Biotechnologie et Microbiologie ; Biochimie Appliquée aux Sciences Médicales,
Département de Biochimie Fondamentale et Appliquée, Faculté des Sciences
Microbiologie de l’environnement, au CNRE Tsimbazaza
Unité entomologie, à l’Institut Pasteur de Madagascar.
Je tiens à exprimer mes sincères remerciements aux honorables personnes qui ont voulu
de bonne grâce faire partie du Jury en qualité de :
Président : Professeur RAZANAMPARANY Louisette
Rapporteur : Professeur ANDRIANARISOA Blandine
Examinateurs : Docteur RAKOTO Danielle Doll
Docteur RAMAMONJISOA Daniel
Remerciements ii
Je témoigne ma profonde gratitude plus particulièrement à:
Monsieur le Professeur JEANNODA Victor, Chef de département de Biochimie
Fondamentale et Appliquée, Responsable des formations en 3e cycle, de m’avoir
donner la permission de soutenir ce travail.
Madame le Professeur ANDRIANARISOA Blandine, chef des Laboratoires de
Biotechnologie et Microbiologie, notre encadreur, pour son soutien et ses conseils
permanent, malgré ses nombreuses responsabilités.
Madame le Professeur RAHARISOLOLALAO Amélie ,Directeur de Laboratoire de
Chimie des Substances Naturels et de Chimie organique, pour sa grande contribution à
la réalisation de ce travail.
Monsieur le Docteur Antoine TALARMIN, Directeur de l’Institut Pasteur de
Madagascar, de m’avoir permis à réaliser une partie de ce travail dans l’Unité
Entomologie.
Monsieur le Docteur Jocelyn RATOVONJATO et à toute l’équipe de l’unité
Entomologie, qui m’ont beaucoup aidée le long de mon stage.
Monsieur le Docteur HARINANTENAINA Liva, enseignant chercheur de
TOKUSHIMA BUNUI University, Faculty of pharmaceutical Sciences, JAPAN, pour la
proposition du sujet, sa franche collaboration et son encouragement dans la réalisation
de ce mémoire.
A toute l’équipe du Laboratoire de Microbiologie de l’environnement, en me faisant
bénéficier leur expérience et leur compétence.
A tous les enseignants et les personnels du Département de Biochimie Fondamentale et
Appliquée.
Je remercie également mes ami(e) s et tous ceux qui, ont contribué de près ou de loin à
l’élaboration de ce mémoire, vos prière m’ont beaucoup aidée.
Abreviations
ABREVIATIONS ET ACRONYMES
C/M/E : Chloroforme/Méthanol/ Eau
°C : Degré Celsius
CCM : Chromatographie sur couche mince
CL 99 : Concentration létale 99%
CL 50 : Concentration létale 50%
CMB : Concentration Minimale Bactéricide
CMI : Concentration Minimale Inhibitrice
C.N.R.E : Centre National de la Recherche sur l’Environnement
HCl : Acide chlorhydrique
IPM : Institut Pasteur de Madagascar
Min : Minute
NaCl : Chlorure de Sodium
pH : Potentiel d’hydrogène
p/p : Poids par poids
p/v : Poids par volume
UV : Ultrat-violet
v/v : volume par volume
µg : Microgramme
µl : Microlitre
iii
Glossaire
GLOSSAIRE
Anthropophile : qui vit dans un milieu fréquenté par l’homme
Cycle biologique de moustiques : La succession des stades pré-imaginaux aquatiques
(œuf, larves, nymphe) et du stade imaginal aérien
(adultes).
Gravide : Qui porte un embryon.
Imago : Insecte adulte arrivé à son complet développement et apte à
se reproduire
Otite : nom donné à toute inflammation de l’oreille
Stade larvaire : L’ensemble des phénomènes qui commencent à l’éclosion
de l’œuf jusqu’à la formation des nymphes
Septicémie : Infection générale grave de l’organisme, caractérisée par
des décharges importantes dans le sang des germes
pathogènes.
Suppuration : production de pus
iv
Liste des tableaux
LISTE DES FIGURES Pages
Figure 1: Photo de : Cinnamosma madagascariensis………………………………………..7
Figure 2: Distribution géographique et lieu de récolte de l’espèce……………………….…..8
Figure 3: Antibiogramme sur Staphylococcus aureus de 5 extraits issus des différentes
DEUXIEME PARTIE : ETUDES CHIMIQUES DES EXTRAITS DE LA PLANTE Cinnamosma madagascariensis
I- Introduction……………………………………………………………..…….. 5
II- Matériels et méthodes…………………………………………………...….... 5 II-1 Matériels………………………………………………………………..…… 5 II-1-1 Le matériel végétal…………………………………………………..…. 5
A- Description botanique………………………………………………….. 5B -Distribution géographique et lieu de récolte…………………………… 6C – Préparation du matériel végétal……………………………………….. 6
A – Extraction à froid………………………………………………………. 9 A –1 Extraction aqueuse et hydroalcoolique à froid…………………….. 9 A- 2 Macération à l’éthanol absolu………………………………………. 9B – Extraction à chaud……………………………………………………… 9
II-2-2 Méthodes de purification ………………………………………………. 9A – Partage liquide – liquide……………………………………………….. 10B – Filtration sur charbon actif…………………………………………….. 10C – Précipitation par l’acétate neutre de plomb…………………………… 10
II-2-3 Méthode de concentration……………………………………………... 11 II -2-4 Détermination de la concentration et du Rendement……………… 11
A – Chromatographie sur couche mince………………………………….. 11 A -1 Principe…………………………………………………………….. 11 A-2 Technique…………………………………………………………… 11
B – Réaction de détection des familles chimiques………………………… 12 B -1 Les alcaloïdes……………………………………………………. 13
Test de Mayer, Wagner et Dragendorff…………………………… 13 B -2 Les tanins et les polyphenols…………………………………… 13
B -2 -1 Test à la gélatine…………………………………………… 14B -2 -2 Test à la gélatine salée…………………………………….. 14
B -3- 3 Test au chlorure ferrique………………………………………………….. 14 B- 3 Les triterpènes, stéroides, et les stérols insaturés……………… 14
B- 3- 1 Les stéroides et les tritèrpènes : test de Lieberman Burchard………………………………… 15
B- 3- 2 Les stérols insaturés : test de Salkowski……………………. 15 B - 4 Les anthraquinones : Test de Bornträger………………………... 15 B - 5 Les flavonoides et les leucoanthocyanes……………………….. 16
B -5 -1 Les flavonoïdes: test de Wilstater………………………….. 16B- 5- 2 Test de Bath- Smith………………………………………… 16
B - 6 Les saponines……………………………………………………. 16 B -7 Les desoxyoses : Test de Keller – Killiani……………………… 17 B - 8 Les iridoides……………………………………………………... 17
III – Résultats…………………………………………………………………….. 17 III - 1 Extraction…………………………………………………………………. 17 III - 2 Test Préliminaire…………………………………………………………. 18 III - 3 Purification………………………………………………………………... 20 III - 4 Etudes Analytiques………………………………………………………... 23 III - 4 -1 Chromatographie sur couche mince………………………………. 23 III - 4 -2 Criblage phytochimique……………………………………………… 24
IV – Discussions et conclusion…………………………………………………… 26
TROISIEME PARTIE : ETUDE BIOLOGIQUE
I- Introduction……………………………………………………………………. 27
II – Matériels et méthodes……………………………………………………….. 28
II-1 Matériels et méthodes pour l’étude des effets des extraits sur la croissance microbienne…………………………………………………………. 28
II -1-1-Matériels…………………………………………………………… 28A- Les microorganismes…………………………………………………………… 28B– Les milieux de cultures………………………………………………………….. 28
B -1 Les milieux utilisés pour l’étude des bactéries………………………… 28B - 2 Les milieux utilisés pour l’étude des souches
Fongiques………………………………………………….. 30C - Les disques pour antibiogramme……………………………………………… 31
D - La stérilisation………………………………………………………………… 31E - Les antibiotiques de références………………………………………………… 31
II -1 2 Méthodes………………………………………………………….. 31A – Identification des microorganismes………………………………………....... 31
A -1 Etude des caractères morphologiques et culturaux……………........ 31 A -1 -1 Examen macroscopique……………………………………...... 31 a – Principe…………………………………………………………... 31 b – Mode opératoire…………………………………………………. 31 A -1- 2 Examen microscopique……………………………………....... 32 A -1-2 -1 Observation à l’état frais……………………. ………...... 32 a – Principe……………………. ………………………………......... 32 b – Mode opératoire…………………………………………………. 32 A – 1 -2 -2 Observation après coloration Gram……………………. 32 a – Principe………………………………………………………....... 32 b – Mode opératoire……………………. ………………………........ 33 A -2 Etude des caractères biochimiques…………………………….….... 34 A -3 Etude des germes sur milieu sélectif……………………………...... 36 A – 3- 1 Milieu Baird –Parker…………………………………….….... 36 a – Principe………………………………………………………....... 36 b – Mode opératoire……………………………………………......... 36 A – 3 -2 Milieu Cereus Sélectif Agar………………………….............. 36 a – Principe………………………………………………………....... 36 b – Mode opératoire……………………………………………….… 36 A -3 -3 Milieu Sabouraud…………………………………………….... 37 a – Principe…………………………………………………………... 37 b – Mode opératoire…………………………………………………. 37
B – Spectre d’activité anti – microbienne des extraits…………………………….. 37 B – 1 Le test d’antibiogramme……………………………………... …... 37 a- Principe………………………………………………………….... 37 b- Mode opératoire………………………………………………. …. 38 B – 2 Détermination de la CMI et de la CMB…………………………... 40 B -2-1 Détermination de la CMI………………………………………. 40 B – 2-1-1 Méthode de disque sur milieu solide……………….......... 40 B – 2-1-2 Méthode de disque sur milieu liquide………………….... 40 B -2-1 Détermination de la CMB…………………………………....... 40
II-2 Matériels et méthodes pour l’étude des effets de l’extrait sur les larves de moustique…………………………………………………………………………. 41
II -2-1-Matériels ………………………………………………………..... 42A- Les moustiques ………………………………………………………………… 42B- L’insectarium ………………………………………………………………….. 42
II -2 2-Méthodes ………………………………………………………… 43A – Collecte de moustiques ……………………………………………………..... 43
B- Technique d’élevage……………………………………………………………. 43 B-1 Elevage des adultes …………………………………………………. 43
B-2 Méthode de collecte des œufs ………………………………………. 44 B-3 Elevage des larves …………………………………………………. 44
C- Test de sensibilité aux larves de moustiques …………………..……………….. 45 C -1 Etablissement de la ligne de base ………………..………………….. 45 C- 2 Détermination de la CL 50 et CL 99………………..……………….. 46
III Résultats………………………………………………………………………… 47
III – 1 Effets des extraits sur les microorganismes………………..……………….. 47 III-1-1 Etude microbiologique…………………………………………………… 47A – Caractères morphologiques……………………………………………………… 47B – Caractères biochimiques des bactéries Gram -…………..………………………. 47C- Caractères culturaux sur milieu sélectif ………………………………………….. 51
III – 1 -2 Effets des extraits sur la croissance microbienne ………………… 53A –Test d’antibiogramme …………………………………………………………… 53B – Détermination de la CMI et de la CMB ……………………………………… 56
B-1 Détermination de la CMI …………………………………………….. 59 B-2 Détermination de la CMB…………………………………………….. 60
III -2 Effets des extraits sur les larves de moustiques……………………………… 60A- Etablissement de la ligne de base………………………………………………... 61B- Détermination de la CL 50 et CL 99 …………………………………………….. 61
IV- Discussions et conclusion ……………………………………………………… 62
CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES……………………............. 64ANNEXESREFERENCES BIBLIOGRAPHIQUESRESUME
Introduction
Sur une population mondiale de plus de 6 milliards d’habitants, 2,2 milliards sont
exposés à des infections paludéennes dans quelques 90 pays. Selon les estimations les plus
récentes, il y aurait 400 à 500 millions de cas cliniques chaque année, dont plus de 90% dans
les pays de l’Afrique tropicale [3,49]. En outre, d’après la statistique de l’OMS, le paludisme
provoque chaque année dans le monde un nombre de décès qui se situe entre 1,4 à 2,6
millions, dont plus de 90% dans les pays tropicaux de l’hémisphère sud. Ce sont les
conditions climatiques de ces pays qui favorisent la prolifération des maladies transmises par
des moustiques comme le paludisme, la filariose et actuellement la dengue et la fièvre
chikungunya [31, 52]. Aussi, près des deux cinquièmes de la population mondiale dans 100
pays, sont menacés par des épidémies de dengue. Particulièrement à Madagascar, en Asie et
dans les Iles de l’Océan Indien, la fièvre chikungunya a récemment provoqué d’importantes
épidémies et est devenue un problème majeur de santé publique. Mais pour le moment il
n’existe aucun vaccin ni traitement de cette maladie. Ainsi, une des solutions pour enrayer
cette épidémie est la lutte antivectorielle [31,52].
Pour lutter contre les maladies vectorielles, des insecticides synthétiques tels que les
substances organophosphorées (fenitrothion, malathion) et organochlorées (DDT, lindane) ont
été employés mais ils se sont révélés toxiques pour l’environnement [24, 49,24]
Le DDT a pollué les nappes phréatiques et les glaces polaires,
Le lindane pourrait provoquer des cancers chez les agriculteurs et plus récemment le
friponil est suspecté d’engendrer des oedèmes chez les utilisateurs. Ainsi, l’utilisation
des produits chimiques peut à long terme nuire gravement à la santé publique par la
présence des résidus qui provoquent de nombreuses intoxications (allergies, effets
cancérigènes, pathologie du foie et du poumon, troubles hormonaux),
A cause du rythme de reproduction des insectes et leur exceptionnelle capacité de
s’adapter à l’environnement, des problèmes de résistance sont apparus et constituent l’une des
causes de l’échec des programmes d’éradication du paludisme [53, 54,55].
Malgré la production de nouveaux antibiotiques par les industries pharmaceutiques
pendant ces trois dernières décennies, l’utilisation répétée des agents antimicrobiens et
l’insuffisance des contrôles des maladies ont mené à la résistance des microorganismes aux
antibiotiques [45, 63].
1
Introduction
Face à ces problèmes, des substances naturelles d’origine animale, végétale ou
microbienne peuvent apporter des solutions pour diminuer la pollution de l’environnement,
ainsi que le problème de résistance et d’effets toxiques. On peut citer :
L’espèce Bacillus thuringiensis qui est les bio-insecticides le plus utilisé dans le
monde [4].
Le genre Bacculovirus, un virus exclusivement pathogène d’invertébrés qui a été exploité et
est classé maintenant parmi les bio-insecticides. A ce jour, deux préparations
(carpovirusine et Mamestrine) à base de Bacculovirus ont été homologuées, elles sont
produites par la Société NPP (Natural Plant Product) [4].
Des extraits de Dichtyota une algue marine tuent les larves d’Anopheles stephensi [10];
l’huile essentielle d’Ageratum conyzoides tue les larves de Aedes aegipti Le genre
Gambusia affinis, un poisson larvivore est considéré comme le moyen de lutte
antimoustique le plus efficace en Tunisie [22]. En outre, dans le domaine des cosmétiques,
différentes sortes d’huiles essentielles sont maintenant commercialisées pour entretenir la
peau.
Dans le cadre de la lutte antivectorielle, cette étude recherche l’activité larvicide et le
pouvoir antibactérien des extraits de Cinnamosma madagascariensis. Les enquêtes effectuées
auprès des guérisseurs et des tradi- praticiens avec les données bibliographiques ont indiqué
que cette plante a des vertus médicinales [7, 8, 58]. De plus, son endémicité et sa rareté sont
les raisons pour lesquelles nous l’avons choisie comme matériel d’étude.
La première partie de ce mémoire présente les généralités, la deuxième partie
concernera l’étude chimique des extraits de C. madagascariensis. La troisième partie
présentera les travaux biologiques réalisés sur les différents extraits. La conclusion générale et
les perspectives constituent la dernière partie
2
Etude chimique
PREMIERE PARTIE :
GENARALITE
Généralités
I- LES PESTICIDES
I-1 DEFINITIONLes pesticides sont des produits phytopharmaceutiques contenant des substances
naturelles ou synthétiques destinées à :
protéger les végétaux contre les organismes nuisibles
lutter contre les vecteurs de maladies humaines
détruire les animaux ravageurs de cultures
II-2 CLASSIFICATIONCes produits se repartissent en plusieurs classes [56]:
Les fongicides agissent sur les champignons
Les herbicides détruisent les mauvaises herbes
Les rodenticides combattent les rongeurs
Les bactéricides agissent sur les bactéries parasites
Les insecticides agissent sur les insectes.
II-3 INSECTICIDES [56]
Selon leurs origines, on peut les classer en 2 catégories:
Les insecticides biologiques :
Ce sont des insecticides préparés à partir d'organismes vivants ou des substances qu'ils
produisent. Ils sont produits sur le principe de la lutte biologique. Les bio-insecticides sont
très spécifiques : chacun n'est actif que sur un nombre limité d'espèces. Ils respectent donc les
autres espèces de l’écosystème.
Les insecticides chimiques:
Ce sont des insecticides de synthèse, ils se répartissent en 4 classes selon leur
composition chimique :
• Les organochlorés (DDT, HCH, Lindane,..)
• Les carbamates (Propoxur,..)
• Les organophosphorés (Malathion, Fenitrothion.)
• Les pyréthrinoïdes (Perméthrine, Deltaméthrine,..)
3
Généralités
II LES CANELLACEAEII-1 CARACTERES GENERAUXLa famille des Canellaceae appartient à l’embranchement des Angiospermes, à la
classe des Dicotylédones. Ce sont des arbres aromatiques et de saveur brûlante dans toutes ses
parties. Elle ne comporte que 9 espèces, groupés en 4 genres [9,33, 42].
Winteranna et Cinnamodendron sont endémiques de l’Amérique du Sud,
Warburgia est endémique de l’Afrique de l’Ouest
Cinnamosma, endémique et seul représentant de la famille à Madagascar.
Le genre Cinnamosma comprend 3 espèces :
Cinnamosma fragrans, colonisatrice des sables entre 0 et 800m d’altitude, pousse en
abondance dans la région Nord de Madagascar.
Cinnamosma macrocarpa dans la forêt orientale entre 0 à 300m
Cinnamosma madagascariensis qui pousse surtout dans la partie Est de l’île.
II- 2- LE GENRE C. madagascariensis :I -2-1Classification : [42]
Règne : VEGETAL
Embranchement : ANGIOSPERMES
Classe : DICOTYLEDONES
Super Ordre : MAGNOLIDAE
Ordre : MAGNOLIALE
Famille : CANELLACEAE
Genre : Cinnamosma
Espèce : madagascariensis
Noms vernaculaires : Sakaihazo, Hazomafana
I-2-2 Utilisation : [33, 58, 61]D’après la littérature et nos enquêtes sur terrain, outre son pouvoir mystique, les
guérisseurs l’emploient comme anti- diarrhéique, anti-tussif et pour lutter contre les maladies
vénériennes. Par son goût brûlant, on la fait boire sous forme de tisane aux femmes qui
viennent d’accoucher pour éviter la tranchée utérine.
4
Généralités
DEUXIEME PARTIE :ETUDES CHIMIQUES DES EXTRAITS DE LA PLANTE
5
Etude chimique
I- INTRODUCTION
Les données bibliographiques ont montré que les principaux constituants du principe
actif du genre Cinnamosma sont les sesquiterpenoides, les alcaloïdes et les flavonoïdes
[25, 70]
• Ferrari et Casagrande en 1969 ont identifié la structure de 3 sesquiterpenoides
(Cinnamolide, Cinnamosmolide et Cinnamodial) dans les extraits de C. fragrans
• Ferrari et Vecchietti en 1979 ont isolé 2 alcaloïdes dans les extraits de C.
madagascariensis
• L’huile essentielle de C .fragrans est connue pour ses vertus médicinales.
Pour notre part, nous avons étudié les extraits de C. madagascariensis.
II- MATERIELS ET METHODES
II-1 MATERIELSII-1-1 Le matériel végétal
A-DESCRIPTION BOTANIQUE [7, 9, 33]
Cinnamosma madagascariensis est un arbre qui peut atteindre une hauteur de 10 à
20m, rarement arbuste.
Les feuilles sont simples, alternes, ovales, lancéolées. Elles ont 4 à 8 cm de longueur et 2 à 4
cm de largeur. Généralement, elles sont plus ou moins coriaces, épaisses, vert foncé sur les
deux faces, d’aspect lisse luisant. Le pétiole est court et épais (lignifié). La nervure latérale est
souvent visible et peu saillante sur la face inférieure.
Les fleurs sont solitaires ou plus ou moins fasciculées par 3 à 5.
La figure 1 montre le genre Cinnamosma madagascariensis.
5
Figure 1 : Cinnamosma madagascariensis
B-DISTRIBUTION GEOGRAPHIQUE ET LIEU
DE RECOLTE [53, 58]
Cette plante est très fréquente dans des zones à climat humide du coté de versant
oriental de Madagascar, dans la forêt d’Analamazaotra, à Andasibe, dans la station forestière
de Lakato, et dans les environs de Fénérive Est. Au Sud de Madagascar, il apparaît depuis le
niveau de la mer à 50m d’altitude (Ste Luce et Fort –Dauphin). Au Nord, il se trouve dans la
forêt d’Analabe, dans la partie d’Ambodisatrana et Ampitiliantsambo. Au centre, il pousse
entre 950 à 1150m d’altitude dans la région de Ranomafana. La plante a été récoltée au mois
de Juillet 2005 dans la forêt de Lakato à Moramanga, Faritany de Toamasina.
La figure 2 montre le lieu de récolte et les points de localisation de C. madagascariensis
Figure 2: Point de localisation et lieu de récolte de Cinnamosma madagascariensis
C-PREPARATION DU MATERIEL VAGETAL
Les écorces de tige fraîche sont séchées à l’abri du soleil pendant deux semaines, puis
réduites en poudre à l’aide d’un microbroyeur CULATTI. La poudre ainsi obtenue constitue
notre matériel d’étude, elle est mise dans une boite stérile et conservée à la température
ambiante.
II-1-2 Les produits chimiques:Les produits chimiques utilisés pour réaliser ce travail sont de qualité pour analyse, de
marque MERCK, PROLABO, LABOSI.
Des plaques de gel de silice 60F254 de dimensions 20x20cm, d’épaisseur 0,2mm sont
utilisées pour la chromatographie sur couche mince.
II- 2 METHODESII-2-1 Méthode d’extraction
A- EXTRACTION A FROID
A-1 Extraction aqueuse et hydroalcoolique à froid
La poudre végétale est mise en suspension dans le solvant d’extraction constitué par
de l’eau distillée ou de l’éthanol à 75%, suivant un rapport 1/10, c'est-à-dire 1g de poudre
dans 10ml de solvant. L’ensemble est soumis à une agitation magnétique pendant 3h à la
température ambiante, puis laissé macérer pendant une nuit à +4° C. Après une réagitation de
30min, le macérat est filtré sur 4 épaisseurs de gaze pour éliminer le résidu solide. Le filtrat
est ensuite centrifugé à 8000g pendant 30min. Le culot est éliminé et le surnageant est
récupéré et concentré par évaporation sous pression réduite. L’extrait concentré est ensuite
lyophilisé. La poudre obtenue constitue notre extrait aqueux ou hydroalcoolique brut à froid.
A-2 Macération à l’éthanol absolu :
La poudre végétale est macérée dans de l’éthanol dans un rapport 1/10 (p/v) pendant 3
jours à la température ambiante. Le macérat est filtré sur 4 épaisseurs de gaze pour éliminer
les tourteaux. Le filtrat est ensuite centrifugé à 8000g pendant 30mn. Le surnageant est
récupéré. La suite de la manipulation est identique à celle de l’extraction hydroalcoolique. La
poudre obtenue après lyophilisation constitue notre extrait éthanolique brut à froid.
B- EXTRACTION A CHAUD
La poudre végétale est délayée dans le solvant d’extraction (eau distillée ou éthanol),
suivant un rapport 1/10 (p/v). Le mélange obtenu est chauffé à reflux pendant 2h sous
agitation magnétique à la température ambiante, la décoctée est laissée macérer pendant une
nuit au réfrigérateur
+4 °C. La suite de la manipulation est la même que pour les extractions à froid. La poudre
obtenue après lyophilisation constitue notre extrait aqueux ou éthanolique brut à chaud.
L’extrait brut présentant le plus grand halo d’inhibition sur Escherichia coli, Staphylococcus
aureus, Candida albicans sera choisi pour la suite de notre expérience [43].
II-2-2 Méthode de purificationUn fractionnement suivant une polarité croissante est réalisé sur l’extrait brut EB.
Différentes étapes comme le traitement par la chaleur, la précipitation par l’acétate neutre de
plomb (ANP), la filtration sur charbon actif, ont été effectuées pour purifier le principe actif et
pour compléter les données sur ses propriétés physico- chimiques.
Cette purification partielle est guidée à la fois par des tests d’antibiogramme sur les souches
de Staphylococcus aureus, Escherichia coli et Candida albicans, et par le test d’homogénéité
par chromatographie sur couche mince avec comme solvant le système
Chloroforme/Méthanol/Eau (17/6/1) (v/v).
A- PARTAGE LIQUIDE- LIQUIDE [15, 26, 27, 29, 67]
Il s’agit d’un fractionnement suivant une polarité croissante.
A -1 Principe :Le partage liquide –liquide est une technique de séparation basée sur la solubilité d’un
soluté entre 2 solvants non miscibles de polarités différentes.
A -2 technique:L’extrait brut est repris dans de l’eau distillée et introduit dans une ampoule à
décanter. Un égal volume d’hexane y est ajouté, et pour qu’il y ait plus de contact, une
agitation est effectuée. Le mélange est ensuite laissé au repos, puis par décantation 2 phases
sont obtenues: une phase hexanique (organique) supérieure et une phase aqueuse inférieure.
Cette dernière est soumise, de nouveau, à 2 autres fractionnements successifs avec l’hexane.
Toutes les fractions hexaniques sont rassemblées puis évaporées. Les traces d’hexane se
trouvant dans la phase aqueuse sont également évaporées. Cette fraction hexanique est notée
F1
Ensuite, un égal volume d’acétate d’éthyle est ajouté dans la phase aqueuse. Après agitation et
décantation la phase acétate éthylique est retirée tandis que la phase aqueuse va subir 2 autres
fractionnements successifs avec le même solvant. Toutes les fractions acétate éthylique sont
rassemblées. La fraction obtenue après évaporation est notée F2. La phase aqueuse est ensuite
traitée de la même manière que précédemment, mais cette fois ci avec le butanol. La fraction
butanolique est notée F3.
B- FILTRATION SUR CHARBON ACTIF [35]
B -1 Principe :Le charbon actif est un support chromatographique adsorbant des composés ayant
entre autres un noyau aromatique. Cette technique est utilisée pour décolorer les extraits
B -2 Méthode :Dans un entonnoir bouché avec des fibres de verre, une couche de charbon actif est
déposée (Jeannoda, 1986).
L’entonnoir est ensuite adapté à une fiole reliée à une pompe à vide. Après humidification
préalable de la couche de charbon actif avec de l’eau distillée, l’extrait à traiter est filtré sous
pression réduite. Enfin, une filtration sur papier filtre de l’extrait recueilli dans la fiole à vide
est nécessaire pour éliminer les fines particules de charbon.
C - PRECIPITATION PAR L’ACETATE NEUTRE DE
PLOMB (ANP)
0.1 Principe :L’ANP est un sel de métal lourd. Il permet d’éliminer diverses substances dont les
protéines, les acides nucléiques, les tanins et d’autres substances phénoliques.
0.2 Mode opératoireUne solution de 0,5ml d’acétate neutre de plomb (20% p/v) est versée goutte à goutte
dans 50ml d’extrait brut sous agitation magnétique. Le précipité formé est éliminé par
centrifugation de 10min à 27200g. L’excès de plomb est éliminé par précipitation à l’aide
d’une solution de phosphate disodique 10% (p/v). Le précipité éventuel est écarté par une
deuxième centrifugation.
II-2-3 Méthode de concentration
L’évaporation du solvant ou la concentration des différents extraits est effectuée à
50°C à l’aide d’un évaporateur rotatif HEIDOLPH. La pression est réduite à l’aide d’une
pompe à vide.
II-2-4 Détermination du rendement
Les différents extraits et la fraction obtenue lors de la purification sont évaporés à sec.
Le résidu est pesé afin de déterminer sa concentration et son rendement. Ce dernier a été
calculé d’après la relation :
R : rendement en Pourcentage (%)
Pv : poids du ballon vide (g)
Ps : poids du ballon avec le résidu sec (g)
Q : poids de la poudre de départ (g)
II-2-5 Méthodes analytiques
A-CHROMATOGRAPHIE SUR COUCHE MINCE (CCM)
[5, 28, 57, 71, 72]
A-1 Principe :C’est une chromatographie liquide d’adsorption. La phase mobile est un mélange de
solvants, la phase fixe est un solide finement pulvérisé sur un support en verre ou plastique
doué de propriété adsorbante. Ainsi, la séparation des substances est en fonction de leur
affinité pour l’adsorbant (support de chromatographie) d’une part, et de leur solubilité dans le
Ps – P v
R= x 100
Q
système de solvants d’autre part. Généralement en CCM, les substances de faible polarité
migrent plus rapidement que les composants polaires.
A -2 Technique :o Dépôt de l’échantillon :
La plaque de verre de gel de silice est découpée aux dimensions voulues et réactivée
pendant 10mn à l’étuve à 100°C. Puis, des fins traits horizontaux de 7mm espacés de 6mm
sont tracés au crayon, à 2cm du bord inférieur et à 1,5cm de chaque bord latéral de la plaque.
Pour chaque extrait à chromatographier, 4 à 6 dépôts sont effectués sur chaque trait à l’aide
d’un capillaire de verre. Puis les dépôts sont séchés à l’aide d’un séchoir à main.
o Développement :
Le développement consiste à faire migrer le solvant sur la plaque, il s’agit d’une
chromatographie ascendante. La plaque préalablement préparée est placée en position
verticale dans une cuve contenant le solvant qui monte par capillarité
Du papier filtre imbibé de solvant de migration est placé contre la paroi de la cuve pour
qu’elle soit saturée par les vapeurs d’éluant. Quand le front du solvant arrive à 0.5cm du bord
supérieur de la plaque, la chromatographie est arrêtée. La plaque est enfin retirée de la cuve et
séchée à l’aide d’un séchoir à main.
o Révélation du chromatogramme :
Le chromatogramme est révélé par 2 méthodes :
1 e méthode :
Les substances sont observées directement sous lumière ultra- violette aux longueurs
d’onde égale à 254nm et 366nm.
2 e méthode :
La plaque est pulvérisée avec le réactif à la vanilline sulfurique qui permet de
visualiser les constituants chimiques sous forme de taches. C’est un réactif universel pour
révéler les substances ayant des chaînes carbonées suffisamment longues.
B DETECTION DES FAMILLES CHIMIQUES [11, 12, 23]
Le criblage phytochimique est l’ensemble des tests physico- chimiques qui font
apparaître soit une précipitation, soit une coloration. C’est une méthode générale utilisée pour
faire l’inventaire des grandes familles chimiques (alcaloïdes, tanin..) présentes dans l’extrait
ou la fraction à analyser.
La détection de chaque famille chimique est réalisée à partir de 1ml d’extrait évaporé à sec.
B -1 ALCALOIDES [11, 12]
Ce sont des composés organiques d’origine naturelle, azotés, plus ou moins basiques,
doués à faible dose des propriétés pharmacologiques marquées (antibiotique, antipaludéenne).
Ils peuvent être précipiter par les métaux lourds, d’où leur caractérisation par les réactifs
suivants :
Réactif au mercure-ioduré de potassium (Mayer)
Réactif à l’iodobismuthite de potassium (Dragendorff)
Réactif iodo-ioduré (Wagner)
Déroulement des tests : Le résidu d’évaporation à sec est macéré dans 4 ml d’acide chlorhydrique 2N pendant
10mn. Le macérât est filtré sur papier filtre et la solution limpide est répartie dans 4 tubes à
essai :
Le 1e sert de témoin
Les 3 autres sont utilisés pour le test avec les réactifs de Mayer, Wagner, et
Dragendorff.
Quatre gouttes de chaque réactif sont additionnées dans chacun des 3 tubes. La
présence d’alcaloïdes est signalée par un précipité ou une floculation. Si ces derniers se
dissolvent après ajout d’éthanol à 80%, la présence d’alcaloïdes dans l’extrait est confirmée.
B -2 LES TANINS ET LES POLYPHENOLS
[11,12]
Ce sont des composés polyphénoliques, ayant parfois des propriétés antiseptiques et
antidiarrhéiques. Ils précipitent les protéines comme la gélatine.
On distingue 2 types de tanins :
Tanins hydrolysables
Tanins non hydrolysables ou tanins condensés
Déroulement des tests : Le résidu d’évaporation à sec est repris dans 4ml d’eau distillée chaude. La solution
est ensuite partagée dans 4 tubes à essai :
Le 1e tube sert de témoin
Les 3 autres pour la détection et l’identification des tanins, ainsi que des autres
composés polyphénoliques.
B -2-1 Test à la gélatine:Trois gouttes de gélatine 1% sont additionnées dans le 2e tube. Si l’extrait contient des
tanins hydrolysables de type catéchique, une floculation apparaît.
B -2-2 Test à la gélatine salée:
Trois gouttes de gélatine salée (10g de Na Cl dans 100ml de gélatine aqueuse à 1%)
sont mises dans le 3e tube. L’apparition d’un précipité montre la présence des tanins de type
pyrogallique.
B-2-3 Tests au chlorure ferrique:
Dans le 4e tube, 3 gouttes de chlorure ferrique en solution méthanolique sont
additionnées.
Si la solution devient vert –noir, l’extrait contient un tanin de type catéchique
Si la solution vire au bleu –noir, il s’agit d’un tanin de type pyrogallique.
Lorsque le test avec le chlorure ferrique est positif (apparition de couleur bleu – noir
ou vert – noir) mais celui avec la gélatine ou la gélatine salée est négatif, l’extrait contient un
ou des composés polyphénoliques autres que les tanins.
B -3 LES TRITERPENES, STEROIDES et les
STEROLS INSATURES [11, 12, 23]
Les triterpènes sont des composés polycycliques à 30 atomes de carbone. Les stéroïdes
sont des composés tétracycliques issus de triterpènes. Les stérols insaturés sont des alcools
secondaires, dérivés de triterpènes tetracycliques.
Les triterpènes et stéroïdes sont mis en évidence par le test de LIEBERMANN –
BURCHARD.
La présence de stérols insaturés est détectée par le test de Salkowski.
Déroulement des testsLe résidu sec est repris dans 4ml de chloroforme. Une agitation suivie d’une filtration
est effectuée. Ensuite, la solution est répartie dans 3 tubes à essai.
Le 1e tube sert de témoin ; les 2 autres serviront aux tests.
B -3-1 Les stéroïdes et triterpènes : test de LIEBERMANN BURCHARD
Quatre gouttes d’anhydride acétique sont additionnées dans le 2e tube. Après agitation,
3 gouttes d’acide sulfurique sont versées le long de sa paroi.
L’apparition d’un anneau rouge à l’interface des 2 phases signifie la présence des triterpènes,
mais le virage au vert de la phase supérieure prouve la présence des stéroïdes.
Ces 2 réactions peuvent être visualisées en même temps.
B -3-2 Les stérols insaturés : test de SALKOWSKI
Un volume de 1ml d’acide sulfurique concentré est versé le long da la paroi du 3e tube
incliné à 45° C. Un anneau rouge formé à l’interface signale la présence de stérols insaturés.
B -4 LES ANTHRAQUINONES [11,12]
Les anthraquinones sont caractérisées par la présence des composés phénoliques plus
ou moins oxydés. Elles font partie du groupe des quinones naturelles (Benzoquinone,
naphtoquinone, anthraquinone). Elles peuvent être sous forme libre ou héterosidique. Elles
sont détectées par le test de BORNTRÄGER.
Déroulement du testLe résidu sec est redissous dans 5ml d’eau distillée, puis 5ml de benzène sont ajoutés.
Le tout est versé dans une ampoule à décanter et est agité énergiquement. La phase organique
est rassemblée et additionnée de 1ml d’ammoniaque 25%. Après agitation, le virage au rouge
de la solution indique la présence d’anthraquinone.
B -5 LES FLAVONOIDES et les
LEUCOANTHOCYANES [23]Ce sont des composés polyphénoliques largement distribués dans le règne végétal. Ils
sont formés par 2 noyaux benzéniques et une chaîne carbonée à 3 atomes de carbone. Le test
de WILSTATER est réalisé pour observer la présence de flavonoïdes et celui de BATE
SMITH pour les leucoanthocyanes.
Déroulement des tests Un volume de 7ml d’éthanol est versé dans le résidu d’évaporation. La solution ainsi
obtenue est répartie dans 4 tubes à essai, dont le premier sert de témoin et les 3 autres pour le
test.
B -5-1 Les flavonoïdes : test de WILSTATER
Dans le 2e tube, 1ml d’acide chlorhydrique 2N et 2 morceaux de tournure de
magnésium sont additionnés.
En plus des composants précédents, 1ml d’eau distillée et 1 ml d’alcool isoamylique sont
versés dans le 3e tube
La présence de flavonoïdes se traduit par un changement de couleur de la phase supérieure :
de l’orange au rouge pourpre pour les flavones
de rouge au pourpre pour les flavonoles (2e tube)
de l’orange au rouge violacé pour les flavonones (3e tube)
B -5-2 Les leucoanthocyanes: test de BATE SMITH
Le 4e tube est additionné de 1ml d’acide chlorhydrique 2N; l’ensemble est chauffé
pendant 30min dans un bain –marie à 100°C.
La présence de leucoanthocyanes est indiquée par le virage au rouge de la solution après
refroidissement.
B - 6 LES SAPONINES: indice de mousse
Les saponines sont des hétérosides à genine stéroidique ou triterpénoidique. Dans un
tube à essai de 1cm de diamètre, le résidu sec est agité énergiquement pendant 1mn avec 2ml
d’eau distillée. La formation d’une mousse persistante pendant 15min prouve la présence de
saponines.
B - 7 LES DESOXYOSES: test de KELLER
KILLIANI
Le résidu d’évaporation est dissous dans 2ml de solution aqueuse de chlorure ferrique
à 10%. La solution est ensuite transvasée dans un tube à essai et 4ml d’acide acétique glacial
y sont ajoutés. Après une brève agitation, le tube est incliné à 45° C et 0,5ml d’acide
sulfurique concentré y est ajouté.
B - 8 LES IRIDOIDES [11,12]
Le résidu d’évaporation à sec est redissous dans de l’eau distillée. Quatre gouttes
d’acide chlorhydrique concentré y sont ajoutées. Le mélange est mis dans un bain- marie
pendant 30min. L’apparition d’une coloration bleue après refroidissement indique la présence
d’iridoïdes.
III- RESULTATS
III - 1 Extraction
Les méthodes d’extraction à froid et à chaud effectuées sur la poudre de l’écorce ont
permis d’avoir 5 extraits:
2 aqueuses à froid et à chaud
2 à l’éthanol absolu à froid et à chaud et
1 hydroalcoolique 75% à froid
Leurs caractéristiques sont consignées dans le tableau 1
Tableau 1: Caractéristiques des extraits obtenus par les différentes techniques
d’extraction :
Caractéristiques
Extractions
COULEUR ASPECT GOUT C°
(mg/ml)
pH
Aqueuse à froid Brune Sirupeux Amer 60 5,79
Ethanol absolu à froid Jaune paille Visqueux Amer
piquant
78 4,70
Hydroalcoolique 75%à
froid
Jaune paille Sirupeux Amer
piquant
70,15 5,10
Aqueuse à chaud Brune Sirupeux Amer 88,72 5,18
Ethanol absolu à chaud Jaune paille Visqueux Amer
piquant
104,5 4,72
D’après ce tableau, les extraits aqueux sont en général de couleur brune, à aspect
sirupeux et ont un goût amer. Les extraits avec l’éthanol absolu et hydroalcoolique 75% ont
respectivement un aspect visqueux et sirupeux. Leur couleur est jaune paille et ils ont un goût
amer –piquant.
III -2 Test préliminaire
Des tests préliminaires d’antibiogramme sur Staphylococcus aureus, Escherichia coli,
et Candida albicans ont été effectués.
Le tableau 2 donne les diamètres des halos d’inhibition en mm suivant le type d’extraction et
les germes-tests
Tableau 2: Effets des 5 extraits sur les germes-tests
Germes –tests
Types d’extraction
Escherichia
coli
Staphylococcus
aureus
Candida
albicans
Aqueuse à froid 6 9 10
Aqueuse à chaud 6 6 9
Hydroalcoolique 75% à froid 6 12 10
Ethanol absolu à froid 6 8 8
Ethanol absolu à chaud 6 7.5 9
En se référant aux normes décrites dans la partie 3, Etude biologique, le tableau
montre que Staphylococcus aureus et Candida albicans sont sensibles aux extraits avec un
halo d’inhibition de diamètre supérieur à 9mm, tandis que E.coli ne l’est pas, le diamètre du
halo d’inhibition etant inférieur à 7mm.
Pour l’extrait hydroalcoolique à froid, le diamètre du halo d’inhibition est de 12mm
avec Staphylococcus aureus et 10mm avec Candida albicans. Ainsi, il s’avère le plus actif
parmi les 5 extraits préparés. C’est la raison pour laquelle l’extrait hydroalcoolique à froid
noté maintenant EB (Extrait Brut) a été choisi pour la suite de notre expérience.
La figure 3 montre l’antibiogramme pour Staphylococcus aureus.
Figure 3 : Antibiogramme des différents extraits bruts sur Staphylococcus aureus
Légendes:
1 : Extrait éthanolique absolu à froid
2 : Extrait hydroalcoolique 75% à froid
3 : Extrait aqueux à froid
4 : Extrait éthanolique absolu à chaud
5 : Extrait aqueux à chaud
III -3 Purification
Plusieurs techniques ont été essayées en vue d’avoir un extrait partiellement purifié.
Le procédé présenté sur la figure 4, réalisé sur EB a permis d’avoir 4 fractions semi –
purifiées dont les caractéristiques sont rassemblées dans le tableau 3.
Extraction hydroalcoolique 75%
Hexane
1
Acétate- d’éthyle
2
Extrait brut (EB) 2.88g
Phase aqueuse
Phase aqueuse
Phase hexanique F1
297.28mg
Phase acétate éthylique F
2
820.8mg
Phase butanolique F3
547.2mg
Phase aqueuse 615.2mg
Poudre de l’écorce 25g
Butanol 3
1-2-3 : Fractionnement
Figure 4: Schéma récapitulatif des procédés d’extraction et de fractionnement
Tableau 3: Données qualitatives de EB avec ses différentes fractions semi- purifiées
Figure 11 Escherichia coli et Salmonella sp cultivées sur milieux Hajna-Kligler et
mannitol-mobilité-nitrate
C- CARACTERES CULTURAUX SUR MILIEUX
SELECTIFS :
Les caractères culturaux des quelques souches étudiées sur milieux sélectifs sont
donnés dans le tableau 11et illustrés sur les figures 12, 13, 14.
Tableau 11 : Les caractères culturaux des 3 souches microbiennes sur milieux
sélectifs
SOUCHES CARACTERES CULTURAUX
Staphylococcus aureus Colonie blanche sur milieu Baird Parker
Bacillus cereus Colonie blanche sur milieu Cereus Selectif Agar
T1 :Escherichia coli sur milieu HAJNA- KLIGLER : Glucose +, lactose +, gaz +, SH2-T2 : Milieu de HAJNA- KLIGLER non ensemencéT3 : Salmonella sp sur milieu MANNITOL- MOBILITE – NITRATE : Mannitol +, mobili té +T4 : Milieu MANNITOL- MOBILITE – NITRATE non ensemencé
Etude biologique 54
Trichophyton rubrum Colonie blanche duveteuse à pigment jaune rouille au verso
Figure 12 : Staphylococcus aureus sur milieu Baird Parker
Etude biologique 55
Figure 13 : Trichophyton sur milieu Sabouraud
Figure 14 : Bacillus cereus sur Cereus Selectif Agar
L’étude des caractères morphologiques, culturaux et biochimique des souches a
permis de confirmer leur identité.
III- 1- 2 Effets des extraits sur la croissance microbienne
A- TEST D’ANTIBIOGRAMME
Les résultats du spectre d’activité de l’EB avec les fractions purifiées présentés dans le
tableau 12 et illustré sur les figures 15 et 16 montrent que EB est actif vis-à-vis de
Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Bacillus cereus et Candida albicans.
Néanmoins, Bacillus cereus est le plus sensible avec un halo de 13mm.
Concernant les fractions partiellement purifiées :
• F1 est à la fois active vis- à vis de Bacillus cereus et Candida albicans
• Staphylococcus aureus et Streptococcus pneumoniae sont tous les deux sensibles à la
fraction F2.
Etude biologique 56
• La fraction butanolique F3 possède une activité sur Candida albicans et Streptococcus
pneumoniae.
• La fraction aqueuse F4 est inactive à tous les microorganismes.
Tableau 12 : Mesures du diamètre des halos d’inhibition de EB et ses
fractions partiellement purifiées
Extraits
Souches
EB F1 F2 F3 F4
Staphylococcus aureus 12 7 11 7 7
Escherichia coli 6 6 6 6 6
Pseudomonas aeruginosa
6 6 6 6 6
Candida albicans 12 9 6 12 7
Bacillus cereus 13 12 9 8 6
Streptococcus pneumoniae 8 6 8 8 6
Klebsiella oxytoca 6.5 6.5 6 6.5 6
Enterobacter cloacea
6 6 6 6 6
Cryptococcus
neoformans 6 6 6 6 6
Trichophyton rubrum 7 7 6 6 6
Shigella boydii 6 6 6 6 6
Etude biologique 57
Salmonella typhi 6.5 6 6 6 6
Figure 15 : Spectre d’activité de EB et les 4 fractions sur Bacillus cereus
Figure 16 : Spectre d’activité de EB et les 4 fractions sur Candida albicans
: 1 : EB : Extrait brut
2 : F1 : Fraction hexanique
3 : F2 : Fraction acétate éthylique
Etude biologique 58
4 : F3 : Fraction butanolique
5 : F4 : Fraction aqueuse
B- DETERMINATION DE LA CMI ET DE LA CMB
La CMI et la CMB de EB et de ses fractions actives sont déterminées sur les 3
souches : Bacillus cereus, Staphylococcus aureus et Candida albicans
B - 1 Détermination de la CMI :Les résultats de la détermination de la CMI en milieu liquide des extraits sont
présentés dans les tableaux 13, 14 et 15.
Tableau 13: Détermination de la CMI en milieu liquide de EB et la
fraction F1 vis-à vis de Bacillus cereus.
Tubes 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10C°EB
(mg/ml) 70.15 35.07
CMI
17.53 8.76 4.38 2.19 1.09 0.54 Témoin
1
Témoin 2
Aspect LIMPIDE TROUBLE Limpide TroubleC°F1
(mg/ml) 40 20 10 5
CMI
2.5 1.25 0.62 0.31 Témoin
1
Témoin 2
Aspect LIMPIDE TROUBLE Limpide Trouble
F1 : Fraction hexanique
EB : Extrait Brut
C°: Concentration (mg/ml)
Etude biologique 59
Tableau 14: Détermination de la CMI en milieu liquide de EB et la fraction F2 vis- à –
vis de Staphylococcus aureus
Tubes 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
C° EB
(mg/ml)
70.15 35.07 17.53 8.76
CMI
4.38 2.19 1.09 0.54 Témoin
1
Témoin
2
Aspect LIMPIDE TROUBLE Limpide Trouble
C°F2
(mg/ml)
40 20 10 5
CMI
2.5 1.25 0.625 0.312 Témoin
1
Témoin
2
Aspect LIMPIDE TROUBLE Limpide Trouble
F2: Fraction éthylique
Tableau 15: Détermination de la CMI sur milieu liquide de EB et la fraction F3 vis- à –
vis de Candida albicans.
Tubes 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
C° EB
(mg/ml)
70.15
CMI
35.07 17.53 8.76 4.38 2.19 1.09 0.54 Témoin
1
Témoin
2
Aspect LIMPIDE TROUBLE Limpide Trouble
C°F3
(mg/ml)
40 20
CMI
10 5 2.5 1.25 0.625 0.312 Témoin
1
Témoin
2
Aspect LIMPIDE TROUBLE Limpide Trouble
F3: Fraction butanolique
Les résultats montrent que les valeurs de la CMI de EB vis-à-vis de Bacillus cereus,
Staphylococcus aureus et Candida albicans sont respectivement de 17,53 ; 4,38 et 35,07
Etude biologique 60
(mg/ml). Les figures 17, 18, 19 montrent la CMI déterminée en milieu solide. Les valeurs
sont identiques à celles déterminées en milieu liquide.
Figure 17 : Détermination de la CMI de F1 sur Bacillus cereus.
1: 0.62l mg/ml 3: CMI= 2.5 mg/ml 5: 10 mg/ml
2: 1.25 mg/ml 4: 5 mg/ml) 6: 20 mg/ml
Figure 18 : Détermination de la CMI de EB sur Staphylococcus aureus
1: 2.19 mg/ml 3: 8.76 mg/ml 5: 35.07 mg/ml
2: CMI= 4.38 mg/ml 4: 17.53 mg/ml
Etude biologique 61
Figure 19 : Détermination de la CMI de F3 sur Candida albicans
1: 0.625 mg/ml 3: 2.5 mg/ml 5: CMI= 10 mg/ml
2: 1.25 mg/ml 4: 5 mg/ml
B - 2 Détermination de la CMB :
Les CMB de EB et ses fractions sont notées dans le tableau 16.
Tableau 16: Concentration minimale bactéricide (mg/ml) de EB et ses fractions
Extraits
Germes EB F1 F2 F3
Bacillus cereus 35.07 10
Staphylococcus aureus 70.15 40
Candida albicans 70.15 40
Pour Bacillus cereus, les valeurs de la CMB de EB et de F1 sont respectivement de
35.07 mg/ml et 10 mg/ml. Pour Staphylococcus aureus et Candida albicans, la CMB est égale
à 70.15 mg/ml pour EB et 40 mg/ml pour F2 et F3.
III- 2 Effets des extraits sur les larves de moustiqueA- ETABLISSEMENT DE LA LIGNE DE BASE
Etude biologique 62
Le test est réalisé selon la méthode décrite au paragraphe C-1 (p. 45). Les résultats
sont résumés dans les tableaux 17 et 18.
Tableau 17: Pourcentage de mortalité des larves Anopheles gambia en fonction de
la concentration en EB
Extrait (mg /ml) Temps de contact (heure)
nombre testé Nombres de morts
% morts
Controle éthanol24 40 2 5,00
1.6 24 80 7792,50
0.8 24 80 6277,50
0.4 24 80 1113,75
0.1 24 80 7 8,75
Tableau 18: Pourcentage de mortalité des larves Aedes albopictus en fonction de la
concentration en EB
Extrait (mg /ml)
Temps de contact (heure)
nombre testéNombres de morts
% morts
Controle éthanol 24 24 2 5.00
1.6 24 80 79 98,75
0.8 24 80 65 81,25
0.4 24 80 26 32,50
0.1 24 80 2 2,50
La concentration de l’extrait varie de 0.1 à 1.6 (mg/ml). Plus la concentration augmente, plus
le pourcentage des larves mortes augmente.
Etude biologique 63
B-
DETERMINATION
DE LA CL50 ET CL99
Après l’analyse des résultats sur le Logiciel log Probit, l’estimation de la CL50 (24h) et
CL 99 est donné dans le tableau 19.
Tableau 19 : Résultat des CL 50 et CL 99 de l’EB sur les larves de moustiques
CL
Espèces CL 50 (mg/ml) CL 99 (mg/ml)
Aedes albopictus 0,473 2,07
Anopheles gambiae 0,696 1,576
CL : Concentration létale
Les valeurs de la CL50 sont respectivement de 0,473 et 0,696 pour Aedes albopictus et
Anopheles gambiae. Les larves de ces 2 espèces sont donc sensibles à EB. La performance de
l’extrait est mesurée par la CL 50, Plus cette valeur est faible, plus l’extrait est actif.
IV- DISCUSSION ET CONCLUSION :
Etude biologique 64
L’étude microbiologique nous a permis de confirmer l’identité de chaque souche à
tester.
L’Extrait brut (EB) est actif vis-à-vis de Staphylococcus aureus, de Bacillus cereus, de
Streptococcus pneumoniae et de Candida albicans. Pour Bacillus cereus la valeur de la CMI
est égale à 17,53mg/ml. Ainsi, EB est plus performant que les extraits de Phyllarthron
madagascariensis (IBRAHIM, 2005) et Gambeya boiviniana (RASOATAHINA, 2005) dont
les CMI sont respectivement de 37,5mg/ml et 50mg/ml.
La CMI de EB sur Staphylococcus aureus est égale à 4,38mg/ml. EB est donc plus actif que
l’extrait de l’espèce codée THL (TSIRINIRINDRAVO 2004), mais moins performant que
l’extrait de Pittosporum (RAZAFITSALAMA 2006) dont les valeurs de CMI sont
respectivement 12,73 et 1,2 mg/ml.
Concernant les fractions, la fraction hexanique est à la fois active vis-à-vis de Bacillus
cereus et Candida albicans
Streptococcus pneumoniae est assez sensible à la fraction acétate éthylique F2, et à la fraction
butanolique. F3 La fraction F2 est aussi active sur Staphylococcus aureus.
La fraction butanolique F3 inhibe la croissance de Candida albicans.
Bien que les fractions soient partiellement purifiées, les résultats indiquent que leur activité
dépend des principes actifs présents.
En se référant au tableau 7 (p.39), liste des antibiotiques spécifiques des germes
utilisés, il apparaît que le mode d’action des fractions F1 et F2 est semblable à celui de la
vancomycine qui est l’antibiotique de référence pour les 3 bactéries Gram positif. Il est
possible que l’extrait et ses 2 fractions agissent au niveau de la synthèse protéique par
provocation d’anomalie lors de la lecture du code génétique. Si c’est le cas, ces extraits
pourraient être bactériostatiques.
Candida albicans est sensible à EB et la fraction butanolique F3. Les dérivés
imidazolés qui perturbent l’étape essentielle de la synthèse de la membrane cellulaire
(Ergostérol) sont recommandés pour traiter les dermatophytes et les levures. Aussi, le mode
d’action de la fraction F3 semblerait identique à celle des dérivés imidazolés qui possèdent à
la fois des propriétés anti- bactériennes et anti – fongiques.
Les résultats de l’activité larvicide ont montré que EB est actif vis- à vis de Anopheles
gambiae et Aedes albopictus avec des CL50 respectivement de 0,696 et 0,473 mg/ml.
Etude biologique 65
A titre comparatif, EB est moins actif que l’extrait hexanique de tige de Mundulea sericea,
(CL100 égale à 1mg/ml), mais il est plus performant que l’extrait de plante codée THL dont
la CL 50 sur les larves de l’espèce Anopheles gambiae est égal à 15,16mg/ml.
L’activité larvicide de notre EB est comparable à celle de l’insecticide de référence
(MALATHION) proposé par l’OMS.
Jusqu’à présent, aucune référence bibliographique n’a mentionné le pouvoir larvicide
d’extrait de Cinnamosma madagascariensis. Cette étude constitue la première expérience sur
les larves de Aedes albopictus à notre connaissance.
CONCLUSION
GENERALE ET
PERSPECTIVES
Etude biologique 64
CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES
Cette étude effectuée sur les extraits de Cinnamosma madagascariensis, bien que
préliminaire nous a permis de :
fournir un plus d’informations sur les propriétés physico-chimiques des principes
actifs ;
mettre en évidence les métabolites secondaires dans les extraits;
déterminer le pouvoir anti- microbien de EB et des extraits semi-purifiés
se familiariser avec les techniques d’élevage de moustique et de donner les premières
informations sur la propriété larvicide contre Anopheles gambiae et Aedes albopictus.
Dans l’avenir, nous envisageons :
d’améliorer les différentes méthodes d’extraction et de purification des principes actifs;
de déterminer la structure de ces principes actifs;
de déterminer le pouvoir larvicide de chaque fraction,
d’approfondir l’activité larvicide des fractions purifiées
de déterminer l’activité imagocide de EB et des fractions purifiées.
Annexes
ANNEXESAnnexe 1:Composition des réactifs pour la révélation des chromatogrammes
Réactif à la vanilline sulfurique
Vanilline ………………………………….0.5g
Acide sulfurique concentré………………100ml
Annexe 2 :Composition des réactifs pour les tests des alcaloïdes
Réactif de MAYER :Chlorure mercurique…………………13.5g
Iodure de potassium……………………50g
Eau distillée …………………………1000ml
Réactif de WAGNER :Iodure de potassium…………………………2g
Iode………………………………………1.47g
Eau distillée……………………………..1000ml
Réactif de DRAGENDORFF :Solution A :
Silicate de Bismuth…………………………..1.7g
Acide tartrique concentré……………………..20g
Eau distillée……………………………………..30ml
Solution B :
Iodure de potassium…………………………………10g
Eau distillée………………………………………40ml
Un volume de solution A est mélangé à un volume de solution B.10g d’acide tartrique et
100ml d’eau distillée est ensuite ajouté à ce mélange.
Annexes
Annexe 3 :Composition des différents milieux de cultures microbienne.
Milieux de culture pour l’étude des souches microbiennesMilieux d’isolement
Milieu bouillon nutritif
Nutrient broth………………………….. 8g
Extrait de levure…………………………..4g
Glucose…………………………………….5g
Eau distillée………………………………..1000ml
Milieu Gélose nutritive
Extrait de viande………………………………….3g
Peptone……………………………………………10g
Agar………………………………………………..7g
Eau distillée ………………………………………..1000ml
pH = 7.2
Milieu Sabouraud pour les levures et champignon:
Tryptone ………………………………………2g
Glucose ………………………………………..8g
Eau distillée…………………………………….200ml
Milieu Gélose Sabouraud pour les levures et champignon
Tryptone ………………………………………2g
Glucose ………………………………………..8g
Agar……………………………………………. 4g
Eau distillée…………………………………….200ml
Milieux d’identification de quelques bactéries Gram- (galeries
biochimique)
Milieu de HAJNA- KLIGLER
Peptone……………………………………………….15g
Annexes
Extrait de viande………………………………………3g
Extrait de levure………………………………………3g
Peptone pepsique de viande……………………………5g
Chlorure de sodium ……………………………………5g
Sulfate ferreux………………………………………..0.2g
Thiosulfate de sodium ………………………………..0.3g
Lactose………………………………………………… 10g
Glucose…………………………………………………..1g
Rouge de phénol…………………………………….. 0.024g
Agar ……………………………………………………. 11g
Eau distillée………………………………………… 1000ml
pH= 7.5
Milieu MANNITOL- MOBILITE – NITRATE
Hydrolysat trypsique de caséine …………………………10g
Nitrate de potassium…………………………………….. 1g
Mannitol …………………………………………………8.5g
Rouge de Phénol ………………………………………… 0.04g
Agar ………………………………………………………. 3.5g
Eau distillée ………………………………………….. 1000ml
pH= 7.6
Milieu de SIMMONS
Citrate de sodium ………………………………………….. 1g
Chlorure de sodium ………………………………………… 5g
Sulfate de magnésium ……………………………………… 0.2g
Phosphate mono ammoniaque ………………………………... 1g
Phosphate potassique…………………………………………. 1g
Bleu de bromothymol ……………………………………… 0.08g
Agar……………………………………………………………15g
Eau distillée………………………………………………… 1000ml
pH= 7.1
Milieu LYSINE – FER
Annexes
Peptone bactériologique ……………………………………….. 5g
Extrait de levure…………………………………………………3g
Glucose………………………………………………………… 1g
L-lysine ……………………………………………………… 10g
Citrate de fer ammoniacal …………………………………… 0.5g
Thiosulfate de sodium …………………………………… 0.04g
Pourpre de bromocresol …………………………………… 0.02g
Gélose …………………………………… ………………. 14.5g
Eau distillée ………………………………………………… 1000ml
pH= 6.7
Milieu UREE-INDOLE
L- tryptophane ……………………………………… 0.3g
Phosphate monopotassique ……………………… 0.1g
Phosphate dipotassique ……………………… 0.1g
Chlorure de sodium ……………………………. 0.5g
Urée ………………………………………… 2g
Alcool à 90°C …………………………. 1ml
Rouge de phénol à 1% ………………………. 0.25ml
Eau distillée ……………………… …………….... 100ml
Les Milieux séléctifsMilieu Cereus Selectif Agar
- Extrait de viande ………………………. 1g
- Peptones de caséine ………………………. 10 g
- D (-)mannitol ………………………. 10 g
- chlorure de sodium ……………………… 0g
- Emulsion de jaune d’oeuf ……………………… 100 ml
- Agar-agar ……………………… 12 g
- Eau ……………………… 1000 ml
Sulfate de polymyxine-B ……………………… 0,01 à 0,1 g
Rouge de phénol ……………………… 0,025 g
pH = 7,2 ± 0,2
Annexes
Milieu de Baird Parker
Extrait de viande ……………………… 5g
Peptone de caséine ……………………… 10g
Extrait de levure ……………………… 1g
Pyruvate de sodium ……………………… 10g
Glycine ……………………… 12g
Chlorure de lithium ……………………… 5g
Agar ……………………… 15g
Eau distillée ……………………… 1000ml
Le Milieux pour le test d’antibiogrammeMilieu de MULLER- HINTON
Infusion de viande de bœuf déshydraté ……………………… 300g
Hydrolysat acide de caséine ……………………… 17.5g
Amidon de maïs ……………………… 1.5g
Agar ……………………… 10g
Eau distillée ……………………… 1000ml
pH= 7.4
Annexe 4 :Composition des réactifs pour la coloration Gram
Violet de gentiane
Violet cristal ……………………… 1g
Alcool à 95° ……………………… 10ml
Acide phenique ……………………… 2g
Eau distillée ……………………… 100ml
Lugol
Iode ……………………… 3g
Iodure de potassium ……………………… 9g
Eau distillée ……………………… 900ml
Fushine de Ziehl
Fushine basique ……………………… 0.3g
Annexes
Alcool 95° ……………………… 10ml
Phénol cristallisé ……………………… 5g
Eau distillée ……………………… 95ml
Annexe 5 :Tableau 1 : Préparation des
extraits pour le test sur les
larves de moustiques
249
249
249
249
Références bibliographiques
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES1. ADRIAN J., FRANCE R; La science alimentaire de A à Z: Chaire de biochimie
industrielle et agro - alimentaire. Paris: TEC et DOC Lavoisier, 1991: 867p
3. ANONYME. Paludisme:séquençage du génome du moustique Anopheles gambiae. La lettre de l'Institut Pasteur 2003 ; 40 :3-5.
4. ANONYME. The Bacillus thuringiensis (Bt) production handbook(http://www.cplpress.com/contents/ l 0.htm) 2005.
5. BAILLET A., RAKOTOMANGA S., FERRIER D., PELLERIN F., Application de la dérivation par l'isocyanate de phényle à l'analyse chromatographique de molécules phénoliques (antioxydants). Journal of chromatography.1990; 2:337-347.
6. BECHTLE R.M., SCHER R. Antibiotic and chemotherapy, 1958; 8: 559 – 606.
7. BOITEAU P. Médecine traditionnelle et pharmacopée: Précis de matière médicale malgache. Madagascar: Agence de coopération culturelle et technique, 1986; 141p.
8. BOITEAU P. Précis de matière médicale malgache. Antananarivo: La librairie de Madagascar, 1979; 97p.
9. BOITEAU P., BOITEAU M., ALLORGE- BOITEAU L. Dictionnaire des noms Malgaches des végétaux. Collection nature: Flore de Madagascar. Grenoble : Alzieu éditeur, 1997; 490p.
10. BRAMONIA, THANGAM T. KATHIRESAN K. Toxic effect of seaweed extracts on mosquito larvae. India J. Med. 1988; 35: 37p.
11. BRUNETON J. Pharmacognosie et phytochimie, plantes médicinales. Paris : technique et documentation Lavoisier, 1993 : 893p.
12. BRUNETON J. Elément de phytochimie et de pharmacognosie. Paris : technique et documentation Lavoisier, 1987 : 585p.
13. BUGNICOURT M. Dictionnaire de microbiologie générale. Paris : Ellipse editor, 1995; 991p.
14. CHABASSE D., GUIGUEN CL., CONTET - AUDONEAU N. Mycologie médicale. Paris: Ellipses, 1995: 631p
15. COTE G. Technique de l'Ingénieur et génie des procédés. Extraction liquide - liquide 1998 ; 2 :763p.
33. HUMBERT H. Flore de Madagascar et des Comores : 136e bis famille, Paris: typographie Firmin-Didot et Cie, 1954.
34. IBRAHIM S.A. Etude chimique, biochimique et biologique des feuilles de Phyllarthron madagascariensis (Bignoniaceae). [Mémoire de DEA: Biochimie]. Antananarivo: Université d'Antananarivo, 2005.
35. JEANNODA V. Etude chimique, biologique et toxicologique du principe convulsivant des Connaracées de Madagascar. (Thèse de Doctorat d’Etat: Sciences). Strasbourg: Université Louis Pasteur de Strasbourg, 1986.
36. JOURNAL OF ANTIMICROBIAL CHEMOTHERAPY : Supplement S1 to volume 48 July 2001. Antimicrobial Susceptibility Testing: a report of the Working Party on Susceptibility Testing of the British Society for Antimicrobial Chemotherapy. http://www.jac.oupjournals.org/content/vol48/suppl_1/ 2006
37. JUPEAU V.A., SCAVIZZI M. Sensibilité des bactéries aux antibiotiques : méthodes d'études en biologie clinique. In: Encyclopédie médicale chirurgicale: Maladies infectieuses, édition technique, Paris, 1990. 1099p.
38. LARPENT J.P., LARPENT- GOURGAN M. Mémento technique de microbiologie, 3e éd. Paris : TEC -DOC Lavoisier, 1997 : 417p
39. LARPENT J.P. Pseudomonas et bactéries aérobies. In : LARPENT J. P. Microbiologie des aliments : Technique de labo. Londres, Paris, New York : Technique et documentation Lavoisier, 1997 : 111- 127.
41. LECLERC H., BUU- HOI A., GOLDSTEIN F., ALLOUCH P., DABERNAT H., DUBLANCHET A. Antibiogramme : interprétation des principaux phénotypes de résistance. Sanofi Diagnostics Pasteur, 1995: 35p.
42. MABBERLEY D.J. The plant book. Cambridge: Cambridge University press, 1987: 706p.
43. MARCHAL N. Initiation à la microbiologie. Paris : Dunod, 1992.
44. MARCHAL N., BOURDON J.L., RICHARD C. Les milieux de culture pour l'isolement et l'identification biochimique des bactéries, 4e éd. Paris : Doin éditeur, 1991.
45. MASAHIRO O., TUTUMIMOTO SATO, KENTARO OKA, MASAKO SEKI. Antibacterial activity of dipropofol and related compounds.Pharm bull. 2005; 28: 1120-1122.
46. MERCK. Manuel de Microbiologie (classeur). Paris: MERCK; 1997.
47. MEYER A., DAIANA J., LECLERC H. Cours de microbiologie générale. Paris, Doin éditeur, 1984 : 309p.
48. MEYER A., DEIANA J., LECLERC H. Cours de microbiologie générale. Paris, Doin éditeur, 1994: 494p.
49. MILIJAONA R., JAMBON R., RAHARIMALALA L. Refloquine resistant strains of Plasmodium falciparum madagascar: Impact on tourists and public health. Annal of tropical medicine 2000; 94: 313.
50. MOULINIER C. Parasitologie et Mycologie médicales : élément morphologie et de biologie. Paris: Edition Médicale Internationale; 2003.
51. MULLER J.H, HINTON J. Milieu de cultures. Proc. Soc. Exp. Path. 1941; 29: 181-
183.
52. O.M.S. Lutte contre les vecteurs de paludisme et autres maladies transmises par les moustiques. Genève: O.M.S, 1995: 102p.
53. O.M.S. Résistance des vecteurs aux pesticides. Genève : O.M.S, 1992 : 68p.
54. O.M.S. Résistance aux pesticides des vecteurs et réservoir de maladies. Genève. O.M.S, 1986: 94p.
55. RAKOTONDRAINIBE E., Le GOFF G., RAJAONARIVELO E., RAHARIMANGA R., RAJAONARIVELO V., RABARISON. Sensibilité aux insecticides des vecteurs du paludisme sur les hautes terres de Madagascar après cinq années de luttes antivectorielle. Archives Institut Pasteur. 2000; 66: 32-35.
56. RAMADE F. ; THYBAUD E. Ecotoxicologie des composés organohalogénés. Insecte- insecticides- Santé. Colloque national d’Angers, mode d’action et utilisation des insecticides. ACTA, 1985 :464-485.
57. RANDERATH K. Chromatographie sur couches minces. Paris : Edition Gauthier Villars, 1971: 399p.
58. RANDRIAMAHEFA M. RAKOTOZAFY A. Guide de la pharmacopée Malgache. Antananarivo: 1979 : 406p.
59. RANDRIANARIVO H.R. Isolement, caractérisation chimique et biologique des principes toxiques de Albizia arenicola (MIMOSOIDAE, FABACEAE). [Thèse de Doctorat]. Antananarivo: Université d'Antananarivo, 2003.
60. RASOATAHINA V. Etude chimique et toxicologique des principes toxiques de feuilles de Gambeya boiviniana (Sapotaceae). [Mémoire de DEA: Biochimie]. Antananarivo: Université d'Antananarivo, 2005.
Références bibliographiques
61. RASOLOMANANA C.J. C, RANDRIANASOLO S; Pharmacopée de l'Ambongo et de Boina. CIDST, 1993, 727p.
62. RAZAFINTSALAMA V. Etude chimique et toxicologique des principes toxiques de Pittosporum (Pittosporaceae).[Mémoire de DEA : Biochimie]. Antananarivo : Université d’Antananarivo, 2006.
63. ROSARIO R., BETTY B. et coll. Larvicidal, antimycobacterial and antifungal compounds from the bark of the Peruvian plant Swartzia polyphylla. Pharm bull. 2006; 54: 278-279.
64. SCHAECHTER, MEDOFF, EINSENTEIN. Microbiologie et Pathologie infectieuse. Paris: De Rock université; 1999: 295p
65. SINOT J. Evaluation de l'activité des antibiotiques in vitro. In : Le MINOR L. Bactériologie médicale. Doin éditeur, 1985 : 343p.
66. SINOT J. Evaluation de l'activité antibactérienne des antibiotiques in vitro. In : L. LE MINOR et M. VÉRON : Bactériologie médicale, 2ème éd., Flammarion, Paris, 1990. 297-315.
67. SKOOG D.A., HOLLER F.J., NIEMANN T.A. Principles of instrumental Analysis. Genève, Suisse: Saunders College Publishing.1998.
68. TERRAC M. L. Contribution à l'étude des plantes médicinales de Madagascar et de l'île Maurice. [Thèse de Doctorat en pharmacie]. Paris, 1947.
69. TSIRINIRINDRAVO H.L. Activité bactéricides et insecticides de l'espèce codée THL du genre Ageratum (ASTERACEAE). [Mémoire de DEA : Biochimie]. Antananarivo: Université d'Antananarivo, 2004; 61p.
70. VECCHIETTI V., FERRARI G. Alkaloid and lignan constituents of Cinnamosma madagascariensis. Phytochem., 1979; 9:1847-1849.
71. VERNING G. Chromatographie sur couche mince : technique et application en chimie organique. Paris : Dunod, 1970 : 178p.
72. WAGNER H., BLADT S., Z GAINDSKI E.M Plant drug analysis: A thin layer chromatography. Atlas.1984. 253p
73. WATTIEZ N. STERNON F. Elément de chimie végétale. Paris: Masson édition; 1942. 467p
74. ZEIGLER D.R. Bacillus Genetic Stock Center Catalog of Strains: Bacillus thuringiensis and Bacillus cereus. Seventh Edition. 1999: 56 p
Nom : RAHARINJATO
Prénom : Fanja Hanitriniala
Titre de Mémoire: CONTRIBUTION A L’ETUDE DES ACTIVITES BACTERICIDE,
FONGICIDE ET LARVICIDE DE cinnamosma madagascariensis (CANELLACEAE)
RESUME
Cinnamosma madagascariensis, endémique et une des 3 espèces représentant
de la famille des Canellaceae a fait l’objet de notre étude.
Différents types d’extraits ont été réalisés avec la poudre de l’écorce. Le test
d’antibiogramme effectué avec E.coli, Staphylococcus aureus et Candida albicans a
montré que l’extrait hydroalcoolique noté EB avec une concentration de 70,15mg/ml est
le plus performant parmi les extraits préparés.
Les principes actifs de EB sont adsorbés par le charbon actif, ils perdent leur
activité à une température supérieure à 60°C. Le criblage phytochimique a montré que
cet extrait contient des stéroides et triterpènes, des flavonoides, des leucoanthocyanes
et des saponines.
Après fractionnement, 4 fractions contenant des substances de polarité
différentes ont été obtenues.
La révélation du chromatogramme avec de la vanilline sulfurique montre 9
bandes majeures pour EB, respectivement 4 et 5 bandes pour la fraction hexanique F1
et la fraction acétate éthylique F2, 3 bandes pour la fraction butanolique F3, et 2 bandes
pour la fraction aqueuse F4.
D’après les tests microbiens, il a été remarqué que F1 est actif vis-à-vis de
Bacillus cereus avec une CMI=2,5 mg/ml et une CMB=10mg/ml. Candida albicans est
sensible à F3 avec une CMI=10 mg/ml et une CMB =40 mg/ml.
Concernant l’activité larvicide, EB tue les larves de Anopheles gambiae avec un
CL50=0,696 mg/ml et CL99=1,576 mg/ml. Pour Aedes albopictus ces valeurs sont
respectivement de 0,473 et 2,07mg/ml.
Mots clés : Canellaceae, Cinnamosma madagascariensis, CCM, CMI, CMB, bactéricide,