Page 1
UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ ŞI FARMACIE “GR. T. POPA”
FACULTATEA DE FARMACIE
CONTRIBUŢII LA CERCETAREA
CHIMICO-TOXICOLOGICĂ
A ALCOOLULUI METILIC
Rezumatul tezei de doctorat
CONDUCĂTOR ŞTIINŢIFIC,
PROF. DR. FARM. ELENA BUTNARU
DOCTORAND
BIOLOG PRINCIPAL DOINA (BEJAN) MOALEŞ
IAŞI, 2011
Page 2
2
CUPRINS
Pag.
1. Introducere 1
1.1. Motivarea alegerii temei
1.2. Obiectivele tezei de doctorat
1
2
A. STADIUL ACTUAL AL CUNOAŞTERII
2. Metanolul. Istoric 4
2.1. Obţinerea metanolului 4
2.1.1. Obţinerea metanolului prin distilarea lemnului
2.1.2. Obţinerea metanolului din gazul de sinteză
5
5
3. Structură. Proprietăţi fizico-chimice 6
3.1. Structură
3.2. Proprietăţi fizice
3.3. Proprietăţi chimice
6
7
7
4. CONSIDERAŢII ASUPRA RISCULUI LA METANOL
10
5. Ecotoxicitatea metanolului 13
5.1. Surse naturale
5.2. Surse antropice
5.3. Circuitul metanolului în apă
5.4. Circuitul metanolului în atmosferă
5.5. Circuitul metanolului în condiţii anaerobe
5.6. Securitatea şi gestionarea metanolului
5.7. Prevederi referitoare la deşeurile de metanol
5.8. Metode de eliminare din mediu
13
14
15
16
16
16
17
18
6. Toxicitatea metanolului 19
6.1. Etiologia intoxicaţiilor
6.2. Toxicocinetică
19
19
6.2.1. Pătrundere. Absorbţie. Distribuţie
6.2.2. Biotransformarea metanolului. eliminare
19
19
6.2.2.1. Oxidarea metanolului la aldehidă formică
6.2.2.2. Oxidarea aldehidei formice la acid formic prin
intermediul formaldehid dehidrogenazei
6.2.2.3. Biotransformarea acidului formic la dioxid de carbon
şi apă prin intermediul folaţilor
20
23
24
6.3. Toxicodinamie
6.4. Factori care influenţează toxicitatea alcoolului metilic
25
26
6.4.1. Factori genetici
6.4.2. Factorii fiziologici
6.4.3. Ritmul circadian
6.4.4. Interacţiuni cu alte substanţe
26
26
27
27
Page 3
3
6.4.5. Existenţa efectului cumulativ
6.4.6. Factori dependenţi de mediu
27
29
6.5. Simptomatologia în intoxicaţia cu metanol 30
6.5.1. Simptomatologia în intoxicaţia acută
6.5.2. Simptomatologia în intoxicaţia cronică
6.5.3. Aspecte ale intoxicaţiei metanolice în sarcină
6.5.4. Leziuni anatomo-patologice
30
31
31
32
6.6. Tratamentul intoxicaţiei metanolice 32
6.6.1. Etapele tratamentului
6.6.2. Antidoturi specifice
32
33
7. Prezenţa metanolului şi a altor congeneri volatili cu potenţial toxic în
băuturile alcoolice
36
7.1. Toxicitatea principalilor congeneri volatili ce se regăsesc în distilatele
alcoolice
38
7.1.1. Toxicitatea alcoolului etilic
7.1.2. Toxicitatea aldehidei acetice
38
40
7.2. Toxicitatea altor congeneri volatili 40
7.2.1. Toxicitatea acetatului de etil
7.2.2. Toxicitatea acidului acetic
7.2.3. Toxicitatea alcoolilor amilici
30
40
41
8. Metode de analiză a alcoolului metilic 42
8.1. Metode calitative
8.2. Determinarea calitativă a metanolului din băuturile alcoolice
8.3. Metode de determinare cantitative
42
44
44
8.3.1. Dozarea metanolului din probe biologice
8.3.2. Determinarea cantitativă a metanolului din distilatele
alcoolice prin metoda colorimetrică
8.3.4. Dozarea metanolului din aer
44
46
46
8.4. Determinarea metanolului prin gaz-cromatografie (GC) 48
8.4.1. Metode de determinare a metanolului din sânge prin gaz-
cromatografie (GC)
8.4.2. Determinarea metanolului din băuturi alcoolice spirtoase prin
GC
49
50
B. CONTRIBUŢII PERSONALE
9. Dezvoltarea şi validarea unei metode de determinare a metanolului prin
gaz-cromatografie cuplată cu spectrometrie de masă (GC-MS)
53
9.1. Protocol de lucru
9.2. Dezvoltarea metodei
9.3. Validarea metodei
53
56
63
9.3.1. Liniaritatea
9.3.2. Limita de detecţie
9.3.3. Limita de cuantificare (LQ)
9.3.4. Intervalul (domeniul de lucru)
9.3.5. Precizia
63
68
69
69
70
9.3.5.1. Repetabilitatea
9.3.5.2. Precizia intermediară
71
72
Page 4
4
9.3.5.3. Reproductibilitatea 73
9.3.6. Acurateţea (Exactitatea) 74
9.4. Concluzii referitoare la determinarea metanolului prin GC-MS
75
10. Aplicabilitatea metodei de determinare a metanolului prin GC-MS 76
10.1. Obiectivele studiului
10.2. Protocol de lucru
10.3. Rezultate şi discuţii
76
76
78
10.3.1. Determinarea metanolului din distilatele alcoolice naturale
10.3.2. Determinarea concentraţiei etanolice din distilatele alcoolice
natural
10.3.3. Determinarea concentraţiei metanolului faţă de concentraţie
etanolului
10.3.4 Determinarea prin gaz-cromatografie cuplată cu spectrometrie
de masă a altor toxici volatili prezenţi în distilatele alcoolice
87
82
90
105
10.3. Concluzii
116
11. Dezvoltarea şi validarea unei metode de determinare cantitativă a
metanolului din probe biologice prin GC-MS
119
11.1. Obiectivele studiului
11.2. Dezvoltarea metodei
11.3. Validarea metodei
119
119
122
11.3.1. Liniaritatea
11.3.2. Limita de detecţie
11.3.3. Limita de cuantificare (LQ)
11.3.4. Intervalul (domeniul de lucru)
11.3.5. Precizia
122
126
126
127
127
11.3.5.1. Repetabilitatea
11.3.5.2. Precizia intermediară
127
129
11.3.6. Acurateţea (Exactitatea) 130
11. 4. Concluzii referitoare la determinarea metanolului din sânge prin
GC-MS
132
12. Aplicarea metodei GC-MS la determinarea cantitativă a metanolului
din probe biologice provenite de la animale de experienţă
134
12.1. Obiectivele studiului
12.2. Material şi metodă
134
134
12.2.1. Aparatura şi condiţiile de lucru
12.2.2. Protocol de lucru
12.2.3. Animalele de laborator
134
134
125
12.2.3.1. Particularităţi anatomo-fiziologice
12.2.3.2. Comportamentul animalelor de experienţă
12.2.3.3. Organizarea laboratorului de cercetare
12.2.3.4. Factori habituali
12.2.3.5. Alimentaţia animalelor de laborator
12.2.3.6. Stabilirea dozelor şi calea de administrare a
metanolului la animalele de laborator
12.2.3.7. Recoltarea probelor de sânge
12.2.3.8. Rezultate şi discuţii
136
136
137
137
138
138
139
140
12.3. Simptomatologia observată la iepurii din rasa „Olandez cenuşiu” 142
12.4. Dozarea metanolului prin GC-MS din sânge şi probe biologice la
iepuri din rasa „Olandez cenuşiu” (DL50). Observarea simptomatologiei
148
Page 5
5
12.4.1. Dozarea metanolului prin GC-MS din sânge 148
12.4.1.1. Stabilirea şi administrarea dozei de metanol DL100
la iepurii din rasa „Olandez cenuşiu”
12.4.1.2. Recoltarea probelor biologice
12.4.1.3. Rezultate şi discuţii
12.4.1.4. Simptomatologia intoxicaţiei metanolice acute cu
doză de metanol (DL100) la iepurii din rasa “Olandez
cenuşiu”
148
148
149
151
12.4.2. Determinarea concentraţiei de metanol prin GC-MS din
organe şi ţesuturi la iepuri din rasa „Olandez cenuşiu”
154
12.4.2.1. Protocolul de lucru
12.4.2.2. Rezultate şi discuţii
12.4.2.3. Concluzii
154
154
164
12.5. Determinarea concentraţiei de metanol în cazul intoxicaţiilor letale.
Prezentare de caz
167
12.5.1. Prezentarea cazului nr. 1.
12.5.2. Prezentarea cazului nr. 2
12.5.3. Concluzii
167
170
175
13. Incidenţa intoxicaţiilor letale cu alcool metilic din unele judeţe din
România (2005–2010)
177
13.1. Studiu statistic al intoxicaţiilor letale pentru toate judeţele
13.2. Studiu statistic al intoxicaţiilor letale pentru fiecare judeţ în parte
13.3. Concluzii
177
178
187
14. CONCLUZII GENERALE. CONTRIBUŢII ORIGINALE. PERSPECTIVE
DE CERCETARE
188
15. BIBLIOGRAFIE
198
ANEXA 1
STADIUL CUNOAŞTERII
1. INTRODUCERE
1.2. OBIECTIVELE TEZEI DE DOCTORAT
În contextual actual generat de importanţa elucidării mecanismului de acţiune a
metanolului asupra organismului uman, cât si de importanţa testelor toxicologice în cazul
intoxicaţiilor metanolice, prezenta teză de doctorat îşi propune următoarele obiective:
Validarea unei metode GC-MS de determinare şi cuantificare a metanolului din
Page 6
6
distilatele alcoolice.
Determinarea concentraţiei de metanol din distilatele alcoolice naturale prin metoda
GC-MS.
Determinarea altor congeneri volatili cu caracter toxic din distilatele alcoolice
naturale.
Validarea unei metode GC-MS de determinare a concentraţiei metanolice din probe
biologice, respective sânge şi ţesuturi.
Aplicarea metodei de determinare a metanolului din probe biologice într-un studiu
pe animale de laborator, respective pe iepuri, care cuprinde:
Evaluarea dinamicii intoxicaţiei metanolice analizând prin GC-MS probele de
sânge recoltat de la iepuri la interval prestabilite, în cazul administrării unei doze DL50 de
metanol.
Evaluarea stării de sănătate şi dinamica intoxicaţiei metanolice prin analiza GC-MS
a probelor de sânge în cazul administrării animalelor de metanol DL100.
Studierea variaţiei concentraţiei metanolice din ţesuturile animalelor de experienţă,
concentraţie determinată prin GC-MS.
Aplicarea metodei de determinare a concentraţiei de metanol din probe biologice
GC-MS, pe subiecţi umani (prezentări de caz).
Evaluarea statistică a numărului de cazuri de intoxicaţii letale din unele judeţe din
România.
Page 7
7
CONTRIBUŢII PERSONALE
9. DEZVOLTAREA ŞI VALIDAREA UNEI METODE DE DETERMINARE A
METANOLULUI PRIN CROMATOGRAFIE DE GAZE CUPLATĂ CU
SPECTROMETRIE DE MASĂ
Obiective:
Validarea unei metode GC-MS de determinare şi cuantificare a metanolului din
distilatele alcoolice.
Progresele realizate în stabilirea compoziţiei unor amestecuri complexe au fost
posibile datorită perfecţionării în ultimele decenii a tehnicilor cromatografice şi în special a
cromatografiei de gaze.
Datorită variabilităţii mari a substanţelor care compun un distilat din produse naturale
apare evidentă necesitatea utilizării unor detectori universali care să ofere un semnal analitic
pentru oricare din compuşii separaţi. Sensibilitatea, precizia şi adaptabilitatea la coloanele
capilare, au făcut ca spectrometrul de masă sa devenea cel mai utilizat tip de detector în
analiza probelor necunoscute multicomponenţiale separate prin cromatografie de gaze iar
spectrele de masă obţinute sa constituie un punct de plecare foarte important în elucidarea
structurilor chimice deci şi a proprietăţilor fizico – chimice şi farmacologice.
9.2. DEZVOLTAREA METODEI
Toate determinările gaz cromatografice au fost efectuate pe un cromatograf de gaze tip
Agilent Technologies 7890 A cuplat cu un spectrometru de masă tip Agilent Technologies
5975C inert MSD ca sistem de detecţie. Faza mobilă utilizată este constituită din heliu, cu un
debit de 1 mL/minut.
Astfel, au fost efectuate determinări iniţial pe o coloană nepolară (DB 5 MS, cu
următoarele dimensiuni: 30 m lungime x 0,25 mm diametru intern şi 0,25 µm grosimea
filmului depus pe pereţii interni ai coloanei). În urma analizei unei probe etalon ce conţine
metanol şi etanol se observă faptul că timpii de retenţie corespunzători celor doi compuşi sunt
relativ apropiaţi 1,539 minute pentru metanol şi 1,615 minute pentru etanol.
Fig. 9.1. Separarea metanolului de etanol pe coloană HP 5 MS
Page 8
8
Acest fapt nu este foarte important în situaţia în care cei doi alcooli se află în cantitate
mică în proba analizată, în schimb, dacă etanolul se află în concentraţie mare, există riscul ca
picul corespunzător etanolului să mascheze picul metanolului. Din acest motiv, în urma
consultării literaturii de specialitate (U.S. Pharmacopeia – Cromatographic Columns 2009-
2010)şi a datelor tehnice privind coloanele utilizate în cromatografia de gaze ne-am oprit în
cele din urmă la o coloană cromatografică Zebron – Phenomenex, de tip YB-WAXplus (cu
următoarele dimensiuni: 60 m lungime x 0,25 mm diametru intern şi 0,25 µm grosimea
filmului depus pe pereţii interni ai coloanei).
Fig. 9.2. Separarea metanolului de etanol pe coloană ZB-WAXplus
Analizând cromatograma obţinută se observă că timpul de retenţie pentru metanol este
de 6,650 iar pentru etanol este de 7,712. Dacă se ia în considerare şi lăţimea la bază a celor
două picuri (0,049 pentru metanol şi 0,117 pentru etanol) s-a calculat rezoluţia între aceste
două picuri, de 12,795, deci metoda este selectivă.
Am efectuat analize pentru mai multe rapoarte de splitare, anume 1/10, 1/50, 1/100 şi
1/1000. Analizând datele experimentale obţinute am considerat că raportul optim de splitare
este de 1/50.
În continuare, pentru picul cu valoarea timpului de retenţie 6,697 se înregistrează
spectrul de masă şi acesta se compară cu spectrele din biblioteca de spectre. Aşa cum se
observă din figura 9.7, pentru picul cu timpul de retenţie 6,697, după compararea spectrală se
obţine identitatea compusului corespunzător, în cazul de faţă metanolul.
Page 9
9
Fig. 9.7. Compararea spectrului de masă al compusului din probă cu cele din baza de date
(biblioteca de spectre de masă Wiley)
Un alt aspect avut în vedere îl constituie verificarea purităţii picului. Acest lucru este
opţional în analiza cromatografică. Puritatea picului poate fi definită ca fiind un factor de
prag, sub care se pot pune întrebări cu privire la precizia rezultatelor.
În urma tuturor acestor experimente am stabilit condiţiile experimentale optime de
lucru:
cromatograf de gaze tip Agilent Technologies 7890 A; injector automat tip Agilent
Technologies 7683 B Series; detector spectrometru de masă tip Agilent Technologies 5975C
inert MSD; coloană cromatografică Zebron – Phenomenex, tip ZB-WAXplus (lungime de 60
m, diametru intern de 0,25 mm şi o grosime a filmului de 0,25 µm);
faza mobilă: heliu, cu un debit de 1 mL/minut;
volum injecţie de 0,1 µl; raport splitare 1 / 50; temperatura injectorului: 250C;
gradient temperatură în compartimentul coloanei: 50C, 20 minute, apoi temperatura
creşte cu 10C/min până la 250C unde este menţinută constantă încă 5 minute;
temperatura sursei MSD: 230C; temperatura cvadrupolului MSD: 150C;
modul de achiziţie a spectrelor: SCAN (urmărirea tuturor liniilor din spectrul de
masă);
domeniul de masă urmărit: 15 – 500 unităţi atomice de masă;
interpretarea rezultatelor obţinute: Agilent Technologies ChemStation software.
9.3. VALIDAREA METODEI
9.3.1. Liniaritatea
Reactivi utilizaţi în studiul liniarităţii:
etanol de puritate cromatografică (Merck);
metanol de puritate cromatografică (Merck);
apă bidistilată.
soluţiile standard: la un volum de 0,5 mL metanol se adaugă 5 mL etanol şi 4,5 mL
apă. Concentraţia în metanol s-a calculat ţinând cont de densitatea acestuia, conform relaţiei
în care:
d - densitatea metanolului (0,791 g/mL);
v – volumul de metanol luat în lucru (0,5 mL)
V – volumul final (10 ml)
metanol în 03955,010
5,0791,0/
V
vdmLg (5)
solvent – amestec de etanol şi apă în raport volumic de 1 / 1.
Din soluţia standard (39550 g/mL) s-au preparat soluţii de lucru prin diluare cu
solvent.
Pornind din aceeaşi soluţie stoc, s-au preparat un număr de 3 seturi de soluţii de lucru
pentru studiul linearităţii pe intervalul de concentraţie 4,94375 – 19775 g/mL. Fiecare din
aceste probe au fost analizate în condiţiile menţionate şi, din cromatogramele obţinute, s-a
determinat aria picurilor corespunzătoare metanolului.
În figura 9.9 se prezintă dreapta de calibrare obţinută în studiul liniarităţii metodei de
determinare a metanolului.
Page 10
10
Fig. 9.9 Dreapta de calibrare la determinarea metanolului prin GC-MS
Tabelul 9.3 Calculul statistic al dreptei de regresie
Coeficient de corelaţie ( r) 0,9982
Coeficient de regresie ( r2 ) 0,9963
Eroare standard a dreptei de regresie (SE) 1523112,271
Intercept 1569486,174
Pantă 4877,4
S-a studiat liniaritatea funcţiei de răspuns (s-a urmărit modificarea ariei picului în
funcţie de concentraţia injectată). Funcţia de răspuns este liniară pe domeniul studiat (4,9 –
19775 g/mL). Ecuaţia dreptei de regresie obţinute s-a calculat prin metoda celor mai mici
pătrate: Arie = 4877,4 x Concentraţia (g/mL) + 1569486,174
Analizând datele experimentale obţinute se observă că există două domenii de
liniaritate diferite, pe domeniul 4,9 – 2768,5 g/mL şi respectiv 2768,5 – 19775 g/Ml.
Arie pic = 6500,4 x Concentraţia - 11680
R2 = 0,9982
Arie pic = 4685,8 x Concentraţia + 3601973,7
R2 = 0,9980
0
20000000
40000000
60000000
80000000
100000000
120000000
140000000
0 5000 10000 15000 20000 25000
Concentraţie (ug/mL)
Ari
e p
ic
Fig. 9.10. Domenii de liniaritate la determinarea metanolului prin GC-MS
Tabelul 9.5. Calculul statistic al regresiei
Domeniu de concentraţie (g/mL) 4,9 – 2768,5 2768,5 – 19775
Coeficient de corelaţie ( r) 0,9991 0,9990
Coeficient de regresie ( r2 ) 0,9982 0,9980
Page 11
11
Eroare standard a dreptei de regresie (SE) 288313,9 1243540,6
Intercept -11679,5 3601973,7
Pantă 6500,4 4685,8
Concentraţia (g/mL) = 6500,4
11679,5 Arie
4685,8
3601973,7 Arie
Pe domeniul 4,9 – 2768,5 g/mL ecuaţia curbei de calibrare este:
Arie pic = 6500,4 x Concentraţia – 11679,5
Pe domeniul 2768,5 – 19775 g/mL ecuaţia curbei de calibrare este:
Arie pic = 4685,8 x Concentraţia + 3601973,7.
9.3.2. Limita de detecţie (LD) LD = 146,4 g/mL pe intervalul 4,9 – 2768,5 g/mL, respectiv LD = 875,8 g/mL
pe intervalul 2768,5 – 19775 g/mL.
9.3.3. Limita de cuantificare (LQ)
LQ = 443,5 g/mL pe intervalul 4,9 – 2768,5 g/mL, respectiv LQ =
2653,9 g/mL pe intervalul 2768,5 – 19775 g/mL
9.3.4. Intervalul (domeniul de lucru)
Având în vederea aceasta faptul că distilatele prezintă valori ale concentraţiei în etanol
foarte diverse, am considerat oportun să alegem ca interval de lucru: 3559,5 – 9887,5 g/mL;
9.3.5. Precizia metodei
9.3.5.1. Repetabilitatea analizei. Precizia sistemului
Tabelul 9. 8. Repetabilitatea injecţiei (Precizia sistemului)
Nr. Determinării Arie pic
1 29181942
2 29366891
3 29827788
4 29884137
5 29351896
Media 29522531
SD 313560,9
RSD 1,0621 %
Având în vedere valoarea deviaţiei standard relative obţinute (RSD = 1,0621%), se
poate afirma că la determinarea prin cromatografie de gaze a metanolului, sistemul este
precis.
Repetabilitatea analizei (precizia metodei)
Tabelul 9.9. Precizia metodei de determinare a metanolului prin GC-MS
Nr.det. Concentraţie teoretică Arie pic Concentraţie calculată %
Page 12
12
(g / mL) (g / mL)
1
3559,5
19987590 3496,9 98,2
2 19941825 3487,1 98,0
3 20100442 3521,0 98,9
4
5932,5
29254146 5474,4 92,3
5 29754916 5581,3 94,1
6 29672735 5563,8 93,8
7
9887,5
49055098 9700,2 98,0
8 49372967 9768,0 98,7
9 49365475 9766,4 98,7
Date statistice
Media 96,7
SD 2,5735
RSD 2,6601
Deviaţia standard relativă are o valoare mai mică de 5%, respectiv, (RSD) este de
2,6601 % pe domeniul 2768,5 – 19775 g/mL;
9.3.5.2. Precizia intermediară
Tabelul 9.10. Precizia intermediară de determinare a metanolului prin GC-MS
Nr.det. Concentraţie teoretică
(g / mL) Arie pic
Concentraţie calculată
(g / mL) %
1
3559,5
19970889 3493,3 98,1
2 20112781 3523,6 99,0
3 20071228 3514,7 98,7
4
5932,5
29390148 5503,5 92,8
5 29763692 5583,2 94,1
6 29757259 5581,8 94,1
7
9887,5
48931933 9673,9 97,7
8 48513789 9584,7 96,8
9 48538743 9590,0 96,9
Date statistice
Media 96,5
SD 2,2511
RSD 2,3336
Deviaţia standard relativă obţinută are o valoare mai mică de 5%, (RSD) este de
2,3336 % pe domeniul 2768,5 – 19775 g/mL.
9.3.5.3. Reproductibilitatea
Normele elaborate de ICH (International Conference of Harmonization) definesc
reproductibilitatea ca o precizie interlaboratoare în studii de colaborare. Deoarece nu am avut
posibilitatea de a aplica metoda şi în alte laboratoare, reproductibilitatea nu a fost studiată.
9.3.6. Acurateţea (Exactitatea)
Tabelul 9.11. Exactitatea metodei de determinare a metanolului prin GC-MS
Nr.det. Concentraţie teoretică
(g / mL) Arie pic
Concentraţie calculată
(g / mL) Regăsire %
1 3559,5
19922628 3483,0 97,9
2 19934729 3485,6 97,9
Page 13
13
3 19925152 3483,5 97,9
4
5932,5
29292047 5482,5 92,4
5 29298045 5483,8 92,4
6 29489809 5524,7 93,1
7
9887,5
48660751 9616,0 97,2
8 48587881 9600,5 97,0
9 48858334 9658,2 97,6
Date statistice
Regăsire medie 95,9
Minim 92,4
Maxim 97,9
Regăsirea medie în studiul exactităţii metodei de determinare a metanolului prin
cromatografie gaze cuplată cu spectrometrie de masă are valoarea de 95,9% pe intervalul 92,4
– 97,9%. Având în vedere faptul că, pentrui metodele cromatografice se acceptă un interval de
± 10%, rezultă că metoda este exactă.
9.4. CONCLUZII REFERITOARE LA DETERMINAREA METANOLULUI PRIN GC-MS
Cromatograf de gaze tip Agilent Tehnologes 7890 A, detector spectrometru de masă
tip Agilent Technologies 5975C inert MSD; coloană Zebron – Phenomenex, tip ZB-WAXplus
(lungime de 60 m, diametru intern de 0,25 mm şi o grosime a filmului de 0,25 µm), fază
mobilă heliu cu un debit de 1 mL/min.
gradient de temperatură în compartimentul coloanei: 50C timp de 20 minute, apoi
temperatura creşte cu 10C/min până la 250C unde este menţinută constantă încă 5
minute;
volumul de soluţie injectată este de 0,1 L şi un raport de splitare de 1 / 50 în portul
de intrare al injectorului ce are temperatura de 250C; temperatura sursei MSD de 230C şi
cea a cvadrupolului MSD de 150C;
identificarea metanolului se realizează prin compararea spectrală faţă de biblioteca
de spectre Wiley.
S-a studiat liniaritatea funcţiei de răspuns (s-a urmărit modificarea ariei picului în
funcţie de concentraţia injectată). Funcţia de răspuns este liniară pe domeniul studiat (4,9 –
19775 g/mL).
Pe domeniul 4,9 – 2768,5 g/mL ecuaţia curbei de calibrare este:
Arie pic = 6500,4 x Concentraţia – 11679,5
Pe domeniul 2768,5 – 19775 g/mL ecuaţia curbei de calibrare este:
Arie pic = 4685,8 x Concentraţia + 3601973,7.
Au fost calculate limitele de detecţie (LD = 146,4 g/mL pe intervalul 4,9 – 2768,5
g/mL, respectiv LD = 875,8 g/mL pe intervalul 2768,5 – 19775 g/mL) şi limita de
cuantificare (LQ = 443,5 g/mL pe intervalul 4,9 – 2768,5 g/mL, respectiv LQ = 2653,9
g/mL pe intervalul 2768,5 – 19775 g/mL) .
A fost stabilit intervalul de lucru: 3559,5 – 9887,5 g/mL;
Pentru estimarea preciziei s-au determinat:
repetabilitatea injecţiei (precizia sistemului) - RSD - 1,0621 %;
repetabilitatea analizei (precizia metodei) – RSD - 2,6601 %
precizia intermediară – RSD - 2,3336 %
Exactitate - regăsire medie de 95,9% pe intervalul 92,4 – 97,9% pe domeniul
2768,5 – 19775 g/mL.
Page 14
14
10. APLICABILITATEA METODEI DE DETERMINARE A METANOLULUI PRIN
CROMATOGRAFIE DE GAZE CUPLATĂ CU SPECTROMETRIE DE MASĂ
Obiective:
Determinarea concentraţiei de metanol din distilatele alcoolice naturale prin
metoda GC-MS.
Determinarea altor congeneri volatili cu caracter toxic din distilatele alcoolice
naturale.
10.2. PROTOCOL DE LUCRU
S-au analizeazat un numar de 98 de probe de distilate alcoolice naturale, care
constitue produse rezultate in urma distilarii amestecurilor de macerate de fructe (mere, pere,
prune, struguri ), macerate simple de prune sau struguri (tescovină). Aceste produse de
distilare denumite ţuică sau rachiu se regăsesc în toată ţara. Reţetele după care se prepară nu
au o specificitate aparte, acestea ţinând de “reteta personală” a celor care prepara aceste
produse, având astfel un caracter artizanal.
Probele au fost analizate conform metodei de determinare a metanolului din distilatele
alcoolice prin GC-MS utilizand acelaşi aparat şi aceiaşi parametri de lucru.
10.3. REZULTATE ŞI DISCUŢII
10.3.1. Determinarea metanolului din distilatele alcoolice naturale
Probele au fost prelevate din zona Moldovei în perioada 2007 – 2009. Majoritatea
probelor provin din judeţul Bacău respectiv 82 de probe celelelte 16 probe provin din alte
şapte judeţe.
Din cele 98 de probe de distilat analizate prin GC-MS s-au pus în evidenţă două
probe ca fiind sub limita de determinare şi una sub limita de cuantificare.
Cele 95 de probe prezintă concentraţii ale metanolului (g/mL distilat ) cuprinse între
499,5 - 8316,0 g/mL distilat. Vaoarea medie cea mai mare regăseşte în distilatele din prune,
respectiv 3320,46 g/mL distilat . Media cea mai scăzută a concentraţiei metanolului în
g/mL distilat se observă în probele de distilat alcoolic prelucrate din tescovină.
Fig. 10. 3. Variaţia valorii medii a concentraţiei metanolului (g/mL distilat)
funcţie de natura distilatelor
Page 15
15
Regulamentul CEE 1014/90 şi STP 57 – 92 prevede că valoarea concentraţiei de
metanol în băuturile alcoolice naturale se raportează la 100 mL alcool etilic anhidru.
Pentru raportarea concentraţiei metanolului faţă de 100 mL etanol anhidru s-a determinat
conţinutul în etanol pentru fiecare probă de distilat în parte, cu o metoda, conform legislatiei
in vigoare.
10.3.3. Determinarea concentraţiei metanolului faţă de concentraţia de etanol
Raportând concentraţia de metanol g/mL distilat la concentrţia de etanol din probele
analizate, s-au obţinut valori între 0,12 – 2,3 g/ 100 mL etanol anhidru, dintre care:
19 probe au valori ale concentrţiei metanolice peste limita admisă (peste 1,00 g/100
mL alcool etilic anhidru), din care:
6 probe cu valori ale concentraţiei in metanol peste limită, distilate din
tescovina, reprezentand 6,12% din totalul probelor analizate.
7 probe cu valori ale concentraţiei alcoolului metilic peste limita admisă,
provenite din amestec de fructe, îsemnând 7, 14% din totalul probelor de
distilat analizate.
6 probe cu valori ale concentraţiei metanolului peste limitele admise
reprezintă 6,12% din totalul probelor de distilate.
Din calculul concentraţiei medii a metanolului din probele de distilat analizate în
funcţie de materialul din care au fost prelucrate se observă :
0.41
0.58
0.92
0.48
0.62
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
Amestec f ructe Altele Prune Tescovina Toate
Concentraţiamedie a metanolului la 100 mL etanol anhidru
Fig. 10.6. Variaţia valorii medii a concentraţiei metanolului ( g/100 mL etanol anhidru)
funcţie de natura distilatelor
1.35
1.85 1.92
1.44 1.48
0
0.5
1
1.5
2
2.5
Comanesti (BC) Blăgeşti (BC) Straoani (BC) Panciu (VN) Altele
Concentraţia medie a metanoluluila 100 mL etanol anhidru
Fig. 10.9. Concentraţia medie pentru localităţile de provenienţă a distilatelor analizate care
au valori ale metanolului (la 100 mL etanol anhidru)
peste limitele admise de STAS-urile în vigoare
Page 16
16
În funcţie de provenienţa probelor cu valori ale concentraţiei metanolice peste limita
admisă se constată că distilatele din Localitatea Străoani Jud. Bacău (figura 10.9.) prezintă cea
mai mare medie a concentraţiei de metanol la 100 mL etanol anhidru, respective 1,92 g/100
mL etanol anhidru. Valoarea aceasta este urmată de valoarea concentraţiei medii a metanolului
din distilatele provenite din Localitatea Blăgeşti Jud. Bacău cu 1,85 g/100 mL etanol anhidru.
10.3.4 Determinarea prin cromatografie de gaze cuplată cu spectrometrie de masă a
altor toxici volatili prezenţi în distilatele alcoolice
În urma analizei GC-MS, conform metodei prezentate, în cromatogramele probelor de
distilate naturale s-au identificat o serie de compuşi volatili denumiţi congeneri (Jung A.,
2010). Aceştia au fost identificaţi prin metoda SCAN comparându-se timpii de retenţie cu
datele din bibliotecile spectrale. Concentraţia acestora se calculează raportând aria picului ce
corespunde fiecărui compus detectat şi identificat, faţă de aria totală a picurilor detectate.
Concentraţia în mL/total congeneri a compuşilor volatili detectaţi si identificaţi s-a calculat
raportându-se procentul de arie al fiecăruia la concentraţia în volume a etanolului,
concentraţie ce a fost obţinută anterior .
În urma centralizării acestor date, s-a constatat că o parte din compuşii identificati se
regăsesc mult mai des în probele de distilate faţa de alţii. Astfel s-a efectuat un calcul statistic
privind frecvenţa detectării acestor compuşi, calcul care este prezentat în tabelul 10.13. Acest
tabel prezintă compuşii care au fost detectaţi în mai mult de 50 de determinări, valoarea
maximă, medie şi minimă a ariei procentuale din total compuşi volatili, a volumului (mL / mL
distilat) cât şi numărul de probe în care s-au detectat.
Tabelul 10.13. Compuşi detectaţi care au mai mult de 50 determinări
Compus detectat Area %
mL/100
mL
distilat
Nr.
1,4,7,10,13,16-Hexaoxacyclooctadec
Maxima 0,67 0,31
57,00 Media 0,20 0,08
Minima 0,03 0,01
12-Crown-4 / 12-Crown-5
Maxima 0,64 0,31
55,00 Media 0,21 0,09
Minima 0,21 0,09
Acetat de etil
Maxima 2,56 1,07
71,00 Media 1,04 0,45
Minima 0,23 0,09
Acetic acid
Maxima 2,49 0,88
73,00 Media 0,84 0,34
Minima 0,05 0,02
Alcool izoamilic
Maxima 1,56 0,87
96,00 Media 0,78 0,34
Minima 0,03 0,01
Ethanol
Maxima 99,01 69,80
98,00 Media 95,88 41,61
Minima 92,48 10,90
Ethanol, 2-(1-methylethoxy)-
Maxima 0,47 0,23
61,00 Media 0,17 0,07
Minima 0,47 0,23
Methanol Maxima 1,60 0,77
98,00 Media 0,73 0,30
Page 17
17
Minima 0,16 0,05
96%
1% 3%EtanolMetanolCongeneri
Fig. 10.13. Ponderea etanolului şi metanolului faţă de congeneri (% valori medii)
Din totalul compuşilor volatili detectaţi 96% reprezintă etanol, 3% alţi compuşi
volatili şi 1 % alcool metilic. Faţă de ponderea etanolului din distilatele analizate, metanolul
reprezintă 1,04%
10.3. CONCLUZII
În vederea determinării concentraţiei de alcool metilic şi a prezenţei compuşilor
volatili în distilatele alcoolice naturale, s-au analizat un număr de 98 de probe de distilate
alcoolice naturale care provin din zona Moldovei. Determinarea concentraţiei metanolului şi
a compuşilor volatili din distilatele alcoolice naturale s-a efectuat prin GC - MS, conform
metodei. Din cele 98 de probe de distilat analizate prin GC-MS s-au pus în evidenţă două
probe ca fiind sub limita de determinare şi una sub limita de cuantificare.
Cele 95 de probe prezintă concentraţii ale metanolului (g/mL distilat) cuprinse între
499,5 g/mL distilat şi 8316,0 g/mL distilat.
Regulamentul CEE 1014/90 şi STP 57 – 92 prevede că valoarea concentraţiei de
metanol în băuturile alcoolice naturale se raportează la 100 mL alcool etilic anhidru. Pentru
raportarea concentraţiei metanolului faţă de 100 mL etanol anhidru s-a determinat conţinutul
în etanol.
Raportând concentraţia de metanol g/mL distilat la concentrţia de etanol din probele
analizate, s-au obţinut valori între 0,12 – 2,3 g/ 100 mL etanol anhidru, dintre care:
- 19 probe au valori ale concentraţiei metanolice peste limita admisă (peste 1,00 g/100
mL alcool etilic anhidru), din care în funcţie de materialul din care s-au distilat sunt:
Tescovină - 6 probe
amestec de fructe - 7 probe
prune - 6 probe
Din calculul concentraţiei medii a metanolului din probele de distilat analizate care au
concentraţia metanolică peste limita admisă în funcţie de materialul din care au fost prelucrate
se observă :
valoarea medie cea mai mare a concentraţiei metanolice se regăseşte în
probele de distilate provenite din macerarea şi distilarea prunelor, respectiv
1,67 g/100 mL etanol anhidru;
valoarea medie cea mai scăzută o întâlnim la probele provenite din distilarea
amestecurilor de fructe de 1.38 g/100 mL etanol anhidru.
valoarea medie generală pe cele 19 probe de distilat cu concentraţii metanolice
peste limita admisă este de 1,51 g/100 mL etanol anhidru.
În funcţie de provenienţa probelor cu valori ale concentraţiei metanolice peste
Page 18
18
limita admisă se constată că cele mai multe provin din Comăneşti Jud. Bacău respectiv 7
probe, reprezentând 36% din totalul probelor, cele mai putine probe provenind din Panciu Jud.
Vrancea şi Străoani Jud. Bacău cu câte 2 probe şi un procent de 11%.
În urma analizei GC-MS, conform metodei prezentate, în cromatogramele
probelor de distilate naturale s-au identificat o serie de compuşi volatili denumiţi congeneri.
Din totalul compuşilor volatili detectaţi 96% reprezintă etanol, 3% alţi compuşi
volatili şi 1 % alcool metilic. Faţă de ponderea etanolului din distilatele analizate, metanolul
reprezintă 1,04% .
11. DEZVOLTAREA ŞI VALIDAREA UNEI METODE DE DETERMINAREA
CANTITATIVĂ A METANOLULUI DIN PROBE BIOLOGICE PRIN
CROMATOGRAFIE DE GAZE CUPLATĂ CU SPECTROMETRIE DE MASĂ
Obiective:
Validarea unei metode GC-MS de determinare a concentraţiei metanolice din probe
biologice, respective sânge şi ţesuturi.
Intoxicaţiile metanolice de diferite etiologii, dar cu precădere cu etiologie alcoolică,
constituie cauza multor urgenţe medicale, dar şi a multor decese (Şorodoc L., 2009).
Important în acest sens este ca diagnosticul cu privire la natura toxicului la care a fost expus
pacientul să fie pus cât mai prompt pentru administrarea unei scheme de tratament adecvate.
În acest sens s-a încercat elaborarea şi validarea unei metode de determinare a metanolului din
produsele biologice într-un timp scurt şi eficient. Prin această metodă s-a avut în vedere
analizarea din punct de vedere calitativ şi cantitativ a metanolului din sânge, dar şi din organe,
în cazul examenului toxicologic pe cadavru.
11.2. DEZVOLTAREA METODEI
Pentru a realiza separarea, identificarea şi determinarea cantitativă a metanolului din
probe biologice prin cromatografie de gaze, cuplată cu spectrometrie de masă, au fost
efectuate iniţial o serie de teste, obligatorii de altfel, pentru a stabili condiţiile experimentale
optime de analiză (Dorneanu V., 2003, Lazăr D., 2000).
Toate determinările gaz cromatografice au fost efectuate pe un cromatograf de gaze tip
Agilent Technologies 7890 A cuplat cu un spectrometru de masă tip Agilent Technologies
5975C inert MSD ca sistem de detecţie. Faza mobilă utilizată este constituită din heliu, cu un
debit de 1 mL/minut.
În ceea ce priveşte alegerea coloanei staţionare folosite s-a avut în vedere
determinarea metanolului din distilate alcoolice astfel, ca fază staţionară a fost utilizată o
coloană polară Zebron – Phenomenex, de tip YB-WAXplus (60 m x 0,25 mm; 0,25 µm).
Portul de intrare al injectorului se află la o temperatură de 250C. Cantitatea de probă
injectată este de 1 L cu un raport de splitare de 1/50.
Faza mobilă - heliu (debit 1 mL/min).
Programul de temperatură porneşte de la 50C (temperatură menţinută constantă timp
de 16 minute) şi creşte la 250C cu o viteză de 25C.
În ceea ce priveşte sistemul de detecţie, parametrii de lucru sunt următorii:
temperatura sursei MS: 230C;
temperatura quadrupolului: 150C;
mod de achiziţie (SIM – Single Ion Monitoring) - mod de lucru: SIM, ionii
înregistraţi fiind cei cu raportul M/Z = 15, 29, 31 şi 32;
detecţie oprită între minutul 12 şi 15 (interval de timp necesar pentru eliminarea apei
din probă).
Page 19
19
Fig. 11. 2. Cromatograma unei soluţii ce conţine metanol (provenienţă – intestin)
Fig. 11.3. Spectrul de masă al picului cu timpul de retenţie 6,755
Fig. 11.4. Compararea spectrului de masă al compusului din probă
Page 20
20
În ceea ce priveşte modul de preparare a probelor pentru izolarea alcoolului metilic,
acestea au fost prelucrate prin distilare conform metodei Cordebard
11.3. VALIDAREA METODEI
11.3.1. Liniaritatea
Pentru evaluarea liniarităţii s-a avut în vedere un necesar de minim 5 valori ale
concentraţiei pentru cel puţin trei serii de soluţii de substanţe standard de diferite concentraţii
(de regulă concentraţia de interes ± 20 până la 50% pentru valorile extreme de concentraţie (
Yowomo M., 2005, Roman L., 1998).
Reactivi necesari:
metanol de puritate cromatografică (Merck);
apă bidistilată;
soluţiile standard.
În ceea ce priveşte pregătirea standardelor de lucru s-a procedat astfel:
Pentru calculul concentraţiei în metanol se are în vedere densitatea metanolului (d) în
mg/mL (0,791), volumul de metanol şi volumul final al probei.
Astfel, pentru prepararea standardelor de lucru s-a lucrat în modul următor: un volum
(v) de 0,5 mL metanol a fost amestecat cu un volum de 9,5 mL sânge obţinându-se un volum
total (V) de 10 mL soluţie stoc (ST 1) a cărei concentraţie se calculează folosind formula
următoare:
0,791 0,50,03955 g/mL=39550 g/mL
10
d v
V
Din soluţia astfel obţinută au fost preparate prin diluare cu sânge soluţii de diferite
concentraţii. Aceste soluţii au fost supuse distilării conform modului descris.
Pornind din aceeaşi soluţie stoc, s-au preparat un număr de 3 seturi de soluţii de lucru
pentru studiul linearităţii pe intervalul de concentraţie 4,94 – 19775,00 g/mL. Fiecare din
aceste probe au fost analizate în condiţiile menţionate şi, din cromatogramele obţinute, s-a
determinat aria picurilor corespunzătoare metanolului.
Se reprezintă grafic variaţia ariei medii în funcţie de concentraţie şi se determină
intervalul de concentraţie pentru care această variaţie este liniară. Se trasează dreapta de
regresie pentru acest interval şi se determină coeficientul de corelaţie (r), deviaţia standard a
pantei dreptei de regresie (s) şi ecuaţia dreptei ce redă modificarea ariei picului în funcţie de
concentraţie:
Arie pic = a x Concentraţia + b
a = panta, b = intercept
În figura 11.5. se prezintă dreapta de calibrare obţinută în studiul liniarităţii metodei de
determinare a metanolului.
Page 21
21
Arie pic = 7041,6 x Concentraţia + 6137,3
R2 = 0,9994
0
10000000
20000000
30000000
40000000
50000000
0 2000 4000 6000 8000
Ari
e p
ic
Concentraţie (ug / mL)
Fig. 11.5. Dreapta de calibrare la determinarea metanolului prin GC-MS-SIM
Tabelul 11.3. Calculul statistic al dreptei de regresie
Coeficient de corelaţie ( r) 0,9997
Coeficient de regresie ( r2 ) 0,9994
Eroare standard a dreptei de regresie (SE) 297196,35
Intercept 6137,3
Pantă 7041,6
Funcţia de răspuns este liniară pe domeniul studiat (4,9 – 19775 g/mL sânge sau
1,65 – 6591,67 g / mL distilat).
11.3.2. Limita de detecţie
Utilizând datele obţinute la studiul liniarităţii se obţine:
LD = 139,3 μg/mL
11.3.3. Limita de cuantificare (LQ)
Estimarea LQ s-a realizat pe baza erorii standard a dreptei de regresie şi a pantei
dreptei de regresie.
LQ = 422,1 μg/mL
11.3.4. Intervalul (domeniul de lucru)
A fost stabilit intervalul de lucru: 139,3 – 6591,67 g/mL distilat respectiv 417,9 –
19775,01 g/mL sânge.
11.3.5. Precizia
Pentru estimarea preciziei s-au determinat:
repetabilitatea injecţiei (precizia sistemului) pentru un număr de 5 determinări,
valoarea deviaţiei standard relative (RSD) fiind de 0,8748 %;
repetabilitatea analizei (precizia metodei) pentru trei soluţii independente la trei
nivele de concentraţie diferite pentru care valoarea deviaţiei standard relative (RSD) este de
4,6811 % pe domeniul 263,67 – 527,33 g/mL distilat;
precizia intermediară pentru trei soluţii independente la trei nivele de concentraţie
diferite pentru care valoarea deviaţiei standard relative (RSD) este de de 4,1078 % pe
Page 22
22
domeniul 263,67 – 527,33 g/mL distilat;
11.3.6. Acurateţea (Exactitatea)
Pentru estimarea exactităţii s-a determinat regăsirea pentru un număr de trei probe
la trei nivele de concentraţie diferite obţinându-se o regăsire medie de 98,0% pe intervalul
93,2 – 102,8%.
11.4 CONCLUZII REFERITOARE LA DETERMINAREA CANTITATIVĂ A
METANOLULUI DIN PROBE BIOLOGICE PRIN GC-MS.
» cromatograf de gaze tip Agilent Technologies 7890 A; detector spectrometru de
masă tip Agilent Technologies 5975C inert MSD; coloană cromatografică Zebron –
Phenomenex, tip ZB-WAXplus (lungime de 60 m, diametru intern de 0,25 mm şi o grosime a
filmului de 0,25 µm); injector automat tip Agilent Technologies 7683 B Series;
» faza mobilă: heliu, cu un debit de 1 mL/minut;
» volum injecţie de 1 µl; raport de splitare 1 / 50;
» temperatura injectorului: 250C;
» gradient temperatură în compartimentul coloanei: 50C (temperatură menţinută
constantă timp de 16 minute) şi creşte la 250C cu o viteză de 25C.
» temperatura sursei MSD: 230C; temperatura cvadrupolului MSD: 150C;
» modul de achiziţie a spectrelor: SIM (urmărirea liniilor din spectrul de masă cu
raportul M/Z = 15, 29, 31 şi 32);
» interpretarea rezultatelor obţinute: Agilent Technologies ChemStation software.
S-a studiat liniaritatea funcţiei de răspuns. Funcţia de răspuns este liniară pe
domeniul studiat (4,9 – 19775 g/mL sânge sau 1,65–6591,67 g/mL distilat). Ecuaţia dreptei
de regresie obţinută (în cazul exprimării concentraţiei pe mL distilat) s-a calculat prin metoda
celor mai mici pătrate.
Au fost calculate limitele de detecţie (LD = 139,3 g/mL) şi limita de cuantificare
(LQ = 422,1 g/mL).
A fost stabilit intervalul de lucru: 139,3–6591,67 g/mL distilat respectiv 417,9 –
19775,01 g/mL sânge;
Pentru estimarea preciziei s-au determinat:
repetabilitatea injecţiei (precizia sistemului) – RSD - 0,8748 %;
repetabilitatea analizei (precizia metodei) – RSD - 4,6811 %
precizia intermediară – RSD - 4,1078 %
Pentru estimarea exactităţii - regăsire medie 98,0 % pe intervalul 93,2 – 102,8 %.
12. APLICABILITATEA METODEI GC-MS LA DETERMINAREA CANTITATIVĂ A
METANOLULUI DIN PROBE BIOLOGICE PROVENITE DE LA ANIMALE DE
EXPERIENŢĂ
Obiective :
1. Determinarea variaţiei concentraţiilor de metanol în sânge în cazul injectării de
metanol cu doza de DL50 la iepuri din rasa “Olandez cenuşiu” şi observarea
simptomatologiei intoxicaţiei.
2. Determinarea variaţiei concentraţiilor de metanol în sânge şi organe în cazul
injectării de metanol cu doza de DL100 la iepuri din rasa „Olandez cenuşiu” şi observarea
simptomatologiei intoxicaţiei.
Pentru studierea absorbţiei, acumulării toxicului, s-a optat pentru testarea toxicităţii
metanolului pe organismul animal, în conformitate cu legislaţia în vigoare. Acest studiu s-a
Page 23
23
efectuat în cadrul Laboratorului de Biologie Animală din cadrul Universităţii “V. Alecsandri”
Bacău, Facultatea de Biologie, pe un lot de iepuri. Rasa utilizată în vederea cercetării a fost
„Iepurele cenuşiu olandez”. Studiile pe animale sunt supuse legislaţiei în vigoare respectiv
OG. 37/2002 cu privire la protecţia animalelor folosite în scopuri ştiinţifice sau în scopuri
experimentale aprobată cu L 471 /2002.
12.2. MATERIAL ŞI METODĂ
Metoda a fost testată pe mai multe tipuri de probe biologice (sânge, ţesut), efectuate pe
acelaşi aparat şi aceiaşi parametri utilizaţi la validarea metodei.
Pentru ca probele de sânge şi ţesuturi să poată fi analizate prin GC-MS, au fost
prelucrate prin distilare (metoda Cordebard).
DETERMINAREA VARIAŢIEI CONCENTRAŢIILOR DE METANOL ÎN SÂNGE ÎN
CAZUL INJECTĂRII DE METANOL CU DOZA DE DL50 LA IEPURI DIN RASA
„OLANDEZ CENUŞIU” ŞI OBSERVAREA SIMPTOMATOLOGIEI INTOXICAŢIEI
12.2.3.6. Stabilirea dozelor şi modul de administrare a metanolului la animalele de
experienţă
Lotul experimental a fost compus din cinci femele de iepuri aparţinând rasei
„Olandez cenuşiu”. Acestea prezintă o masă corporal cuprinsă între 2000 şi 2400 g. Din punct
de vedere anatomo–fiziologic, sunt mature având vârsta de şase luni. Dozele de alcool
metilic care s-au administrat în vederea inducerii intoxicaţiei metanolice au fost stabilite faţă
de literatura de specialitate (Roe O., 1982, Silverman J., 2002, Ciudin E., 2004).
Administrarea dozei s-a efectuat intraperitoneal. S-a optat pentru acest gen de
administrare deoarece doza de administrat este mai mică, iar posibilitatea de administrare
orală a toxicului era destul de scăzută ţinând cont de comportamentul sensibil al iepurelui.
Administrarea intravenoasă a metanolului ar fi indus necroza endovenoasă, ceea ce ar fi
periclitat atât sănătatea animalului pe durata experimentului cât si deprecierea locurilor de
elecţie în vederea recoltării sângelui pentru analiză. Pentru fiecare exemplar s-a calculat doza
de administrare în funcţie de masa corporală.
Tabelul 12. 4. Doza de metanol DL50 calculată pentru lotul experimental de iepuri,
conform masei corporale
Nr. Masă corporală g Doză administrată DL50
1. 2000 4,8 mL
2. 2400 5,5 mL
3. 2300 5,3 mL
4. 2200 5,1 mL
5. 2000 4,8 mL
12.2.3.7. Recoltarea probelor în urma administrării metanolului în doză DL50 la
iepurii din rasa „Olandez cenuşiu”
Probele de sânge s-au recoltat din vena femurală, la următoarele intervale:
I – 75 minute,
II – 195 minute,
III – 375 minute.
12.2.3.8. Rezultate şi discuţii
Page 24
24
Din rezultatele obţinute în urma analizei sângelui recoltat la intervale prestabilite, se constată ca
cea mai scăzută concentraţie la prima serie de recoltări, respectiv la 75 de minute s-a înregistrat la
iepurele numărul 1, cu o valoare de 0,69 mg/mL şi cea mai crescută la iepurele numărul 3 cu 0,95 mg /
mL. La a doua serie de recoltări, la 195 de minute, valoarea cea mai mică s-a înregistrat la iepurele nr. 5
( 0,75 mg /mL), valoarea cea mai mare înregistrându-se la iepurele nr. 3 cu 1,02 mg/mL. Seria a treia de
recoltări se evidenţiază cu 0,68 mg/mL reprezentând valoarea cea mai mică şi 0,89 mg/mL, reprezentând
valoarea cea mai crescută.
Fig. 12.1. Reprezentarea grafică a valorilor concentraţiei metanolice
din probele de sânge recoltate în prima etapă
Conform acestor valori este evident că în minutul 75 metanolul nu era complet în
circuitul metabolic, vârful concentraţiei regăsindu-se în minutul 195, ţinând cont că în
minutul 375 concentraţiile erau deja în descreştere. În prima parte a metabolismului creşte
concentraţia cu 0,012 mg/mL pe minut, de la minutul 75 până la minutul 195 e înregistrează o
creştere extreme de lentă de 0,0002 mg/mL pe minut ca panta descendentă sa se exprime cu o
descreştere de 0,0004 mg/mL. Se poate spune că dacă absorbţia este foarte rapidă
metabolismul este extrem de lent.
12.3. SIMPTOMATOLOGIA ÎNTOXICAŢIEI METANOLICE ÎN URMA ADMINISTRĂRII
DE METHANOL ÎN DOZĂ DL50 LA IEPURII DIN RASA “ OLANDEZ CENUŞIU”
Pe parcursul derulării experimentului s-au urmărit o serie de parametri fiziologici şi s-
au făcut observaţii referitoare la simptomatologia intoxicaţiei metanolice
La primul interval de recoltare la 75 de minute sensibilitatea la metanol a fost minimă.
Simptomatologia intoxicaţiei metanolice s-a concretizat la toţi subiecţii practic la cel de-al
doilea interval de recoltare, respectiv la 195 de minute de la injectare. La a treia recoltare la
intervalul de 375 de minute toţi subiecţii prezentau aceiaşi simptomatologie, respective
somnolenţă, dezechilibru motor, dificultăţi de deplasare, manifestată cu precădere la
membrele inferioare posterioare prin imposibilitatea de coordonare şi mişcare, stare general
de relaxare.
Page 25
25
212.4
272.4
240.6231
0
50
100
150
200
250
300
0 75 195 375
Pu
lsu
ri/m
inu
t
Minute
Fig. 12. 4. Variaţia în timp a pulsului mediu
ca simptomatologie observată după administrarea DL50
Evoluţia valorilor pulsului este diferită de la individ la individ, în medie valoarea cea
mai crescută raportându-se la minutul 75 de la administrarea metanolului, având o evoluţie
descendentă în raport cu evoluţia concentraţiei metanolice regăsită în probele de sânge
recoltate pe intervalele prestabilite. Această evoluţie atât a concentraţiei metanolice
determinată din sânge cât şi a simptomatologiei denotă faptul că toxicitatea metanolului are
un caracter individualizat în funcţie de fiecare subiect.
12.4. DOZAREA METANOLULUI PRIN GC-MS DIN SÂNGE ŞI PROBE BIOLOGICE LA
RASA DE IEPURI“OLANDEZ CENUŞIU” (DL100).
Observarea simptomatologiei intoxicaţiei.
12.4.1. Dozarea metanolului prin GC-MS din sânge a
A doua etapă a experimentului s-a desfăşurat la un interval de 72 de ore de la
încheierea primei etape pe aceiaşi subiecţi. S-a optat pentru un astfel de interval între cele
două serii de experimente pentru ca organismul subiecţilor să elimine complet metanolul şi
produşii de metabolism ai acestuia şi starea de sănătate să revină la normal pentru a nu
denature simptomatologia intoxicaţiei metanolice. În acest interval iepurii au fost hrăniţi şi
hidrataţi corespunzător normelor de hrană şi îngrijire, urmârindu-se îndeaproape
comportamentul pentru a depista eventualele deficienţe sau afecţiuni. După 72 de ore iepurii
prezentau o stare de sănătate bună şi un comportament normal.
12.4.1.1. Stabilirea şi administrarea dozei de metanol DL 100 la iepurii din rasa “
Olandez cenuşiu”
A doua doză administrată a constituit o doză letală DL100, doză calculată în funcţie
de masa corporală a fiecărui subiect.
Tabelul 12.9. Cantitatea de metanol DL100 administrat la iepurii
din rasa „Olandez cenuşiu” în funcţie de masa corporală
Nr. Masă corporală g Doză administrată DL100
1. 2000 9,6 mL
2. 2400 11,0 mL
3. 2300 10,6 mL
4. 2200 10,2 mL
Page 26
26
5. 2000 9,6 mL
12.4.1.2. Recoltarea probelor biologice
Recoltarea probelor de sânge în vederea determinării metanolului s-a efectuat în două
serii, a câte 5 mL, prima serie la 75 de minute, a doua serie în momentul decesului subiectului
testat.
seria 1 – la 75 minute de la expunere,
seria 2 – în momentul decesului subiectului testat.
12. 4.1.3. Rezultate şi discuţii
Rezultatele privind concentraţia de methanol din sângele recoltat în cea de-a doua
etapă a experimentului sunt exprimate în tabelul 12.11., intervalul de timp la care s-a făcut
recoltarea respective, prima probă la 75 de minute şi a a doua probă la momentul decesului,
cât şi valorile concentraţiei metanolice obţinute prin analiza GC-MS.
Tabelul 12.11. Valorile concentraţiei metanolului determinat în sânge la iepuri
în cazul intoxicaţiei acute cu DL100 (4,8 mL/kg corp)
Greutate
corporală
(g)
Subiecţii
Doza
DL100
metanol
(mL)
75
minute
Metanol determinat în sânge
(mg/mL) în momentul decesului
105 160 180 200
2000 1 9,6 1,08 1,55
2400 2 11 1,76 1,82
2300 3 10,6 1,77 1,76
2200 4 10,2 1,39 1,31
2000 5 9,6 1,29 1,23
Din datele etalate în tabelul 12.11. se observa că la 75 de minute de la administrarea
dozei de metanol DL100, valorile concentraţiei metanolului în sânge sunt variabile, cea mai
mică valoare fiind înregistrată la subiectul nr. 1, cu 1,08 mg/mL faţă de cea mai mare valoare
înregistrată la subiectul 3 cu o valoare de 1,77 mg/mL.
Fig. 12.5. Variaţia concentraţiei de metanol din probele de sânge înainte şi după exitus
Page 27
27
În cazul valorilor concentraţiilor metanolice determinate din sânge în momentul
decesului subiecţilor, se constată de asemeni o mare fluctuaţie de valori, care ţin de factorii
individuali şi de intervalul de timp la care s-a produs decesul. Faţă de perioada de
supravieţuire de la administrarea metanolului până la deces, cel mai mult a supravieţuit
subiectul nr. 2 cu 200 de minute, cel mai puţin supravieţuind subiectul nr. 3 cu 105 minute.
Variaţia cea mai mare dintre valoarea concentraţiei metanolice în viu şi valoarea
concentraţiei metanolice la deces a fost înregistrată la subiectul nr. 1 care la 75 de minute de
la injectarea cu metanol avea o concentraţie metanolică de 1,08 mg/mL şi în momentul
decesului de 1,55 mg / mL, diferenţa dintre cele două valori acumulându-se în 85 de minute.
Calculându-se o rată de acumulare pentru cei cinci iepuri, din momentul injectării până la
minutul 75, metanolul a avut o rată de acumulare cuprinsă între 0,014 - 0,023 mg/mL/minut.
12.4.1.4. Simptomatologia întoxicaţiei metanolice acute cu doză de methanol
DL100 la iepurii din rasa “ Olandez cenuşiu”
Concomitent cu recoltarea probelor de sânge s-au făcut observaţii privind
simptomatologia intoxicaţiei acute provocate de metanolul injectat intraperitoneal la iepurii
de experienţă pentru DL100 (4,8 mL/Kg corp). După 75 de minute de la injectarea a
metanolului DL100 se observă apariţia somnolenţei, dezechilibrului motor, a stării de relaxare,
a urechilor lăsate, ochi exoftalmici, puls filiform, la toţi subiecţii testaţi. Dacă la doza de
metanol DL50 simptomatologia intoxicaţiei la 75 de minute de la administrarea metanolului
era prezentă cu simptome uşoare la 60 % dintre subiecţi, la o administrare a unei doze de
DL100, simptomatologia intoxicaţiei este prezentă la 100% din subiecţi. În funcţie de
rezistenţa fiecărui organism şi mai ales în funcţie de particularităţile metabolice ale fiecărui
subiect, aceştia au supravieţuit mai mult sau mai puţin. Insuficienţa cardio respiratorie, au
determinat decesul subiecţilor după 105-200 minute de la administrarea DL100.
12.4.2. Determinarea concentraţiilor de metanol prin GC-MS din organe şi ţesuturi la
iepuri din rasa „Olandez cenuşiu”
12.4.2.1. Protocol de lucru
După exitus toţi subiecţii testaţi prin administrare intraperitoneală a unei doze DL100
cu metanol, au fost autopsiaţi. Conform protocolului de prelevare de probe biologice s-au
prelevat de la fiecare subiect fragmente de organe în vederea examenului toxicologic. Astfel s-
au recoltat fragmente de creier, ochi, fragmente de cord, plămân, ficat şi rinichi. Probele s-au
condiţionat separate pentru fiecare tip de ţesut, în flacoane sterile, prevăzute cu capac etanş şi
etichetate . Fiecare etichetă a fost inscripţionată cu : numărul iepurelui, conţinut, data şi ora
prelevării. Pentru examenul toxicologic al ţesuturilor în vederea determinării concentraţiei de
metanol s-au prelevat câte 5 g ţesut din fiecare organ. Pentru acurateţea rezultatelor, probele
au fost cântărite cu o balanţă analitică ANH.
Page 28
28
12.4.2.2. Rezultate şi discuţii
Tabelul 12.13. Valorile medii ale metanolului (în mg/g probă) în diferite ţesuturi în
cazul intoxicaţiei cu DL100 la iepure (4,8 mL metanol/kg corp)
Proba din organe g / mL
distilat
g/15 mL
distilat
g/5 g
probă g/ g probă mg/g probă
Proba 1 - creier 3679098 521,61 7824,13 7824,13 1564,83 1,56
Proba 2 - creier 3579940 507,53 7612,91 7612,91 1522,58 1,52
Proba 3 - creier 4426633 627,77 9416,53 9416,53 1883,31 1,88
Proba 4 - creier 3550442 503,34 7550,07 7550,07 1510,01 1,51
Proba 5 - creier 3805323 539,53 8093,02 8093,02 1618,60 1,62
Media creier 1,62
Proba 1 - Ochi 3093642 438,47 6576,99 6576,99 1315,40 1,32
Proba 2 - Ochi 3527116 500,03 7500,38 7500,38 1500,08 1,50
Proba 3 - Ochi 3997805 566,87 8503,04 8503,04 1700,61 1,70
Proba 4 - Ochi 2971125 421,07 6316,01 6316,01 1263,20 1,26
Proba 5 - Ochi 2848426 403,64 6054,64 6054,64 1210,93 1,21
Media ochi 1,40
Proba 1 - Cord 2717506 385,05 5775,75 5775,75 1155,15 1,16
Proba 2 - Cord 3620022 513,22 7698,29 7698,29 1539,66 1,54
Proba 3 - Cord 5310150 753,24 11298,60 11298,60 2259,72 2,26
Proba 4 - Cord 3615458 512,57 7688,57 7688,57 1537,71 1,54
Proba 5 - Cord 3871257 548,90 8233,47 8233,47 1646,69 1,65
Media cord 1,63
Proba 1 - Pulmon 3581997 507,82 7617,29 7617,29 1523,46 1,52
Proba 2 - Pulmon 4594036 651,54 9773,13 9773,13 1954,63 1,95
Proba 3 - Pulmon 4295518 609,15 9137,23 9137,23 1827,45 1,83
Proba 4 - Pulmon 4883413 692,64 10389,56 10389,56 2077,91 2,08
Proba 5 - Pulmon 3302258 468,09 7021,39 7021,39 1404,28 1,40
Media pulmon 1,76
Proba 1 - Ficat 504,51 7567,72 7567,72 1513,54 1,51
Proba 2 - Ficat 3872742 549,11 8236,63 8236,63 1647,33 1,65
Proba 3 - Ficat 8951123 1270,31 19054,59 19054,59 3810,92 3,81
Proba 4 - Ficat 3805323 539,53 8093,02 8093,02 1618,60 1,62
Proba 5 - Ficat 5235669 742,66 11139,94 11139,94 2227,99 2,23
Media ficat 2,16
Page 29
29
Proba 1 - Rinichi 3101566 439,59 6593,88 6593,88 1318,78 1,32
Proba 2 - Rinichi 3417077 484,40 7265,98 7265,98 1453,20 1,45
Proba 3 - Rinichi 5220016 740,44 11106,59 11106,59 2221,32 2,22
Proba 4 - Rinichi 3396388 481,46 7221,90 7221,90 1444,38 1,44
Proba 5 - Rinichi 4436601 629,18 9437,76 9437,76 1887,55 1,89
Media rinichi 1,66
Media generală
organe 1,70
Minima 1,16
Maxima 3,81
Faţă de rezultatele obţinute cea mai mare concentraţie s-a obţinut în proba de ficat
recoltată de la subiectul nr. 3 cu o valoare de 3,81 mg/mL. Cea mai scăzută valoare s-a regăsit
în fragmentul de cord recoltat de la subiectul nr. 1, respectiv 1,16 mg/mL. Media valorilor
concentraţiilor metanolice pe tipurile de organe prelucrate a fost de 1,70 mg/mL, din care
media concentraţiilor metanolice obţinute din creier reprezintă 1,62 mg/mL, cord 1,63
mg/mL, plămân 1,76 mg/mL, rinichi 1,66 mg/mL şi cea mai mare valoare în ficat cu 2,16
mg/mL.
Fig. 12.13. Variaţia valorilor medii ale concentraţiei metanolului
determinat în organe faţă de valoarea medie generală în organe, determinată
în cazul intoxicaţiei provocate de DL100 la iepure. ( 4,8 mL /kg )
În figura 12.13. este prezentată fluctuaţia concentraţiei de metanol în organele
analizate. Astfel, sunt prezentate valorile medii ale concentraţiei metanolice obţinute din
analiza GC-MS a probelor prelevate de la cei cinci iepuri, probe din creier, ochi, cord,
plămân, ficat şi rinichi. Acestea sunt prezentate comparativ cu valoarea mediei generale. Din
sinteza datelor rezultă că valoarea medie cea mai mare s-a determinat în ficat, respectiv 2,16
mg / mL, iar valoarea cea mai scăzută s-a înregistrat în ochi, de 1,40 mg/mL. Concentraţia din
pămâni, de 1,76 mg/ mL este mai mare datorită afinităţii crescute a metanolului pentru celula
alveolară pulmonară cât şi funcţiei respiratorii care stimulează circulaţia la nivel pulmonar.
Concentraţia metanolică scăzută de la nivelul ochilor se explică prin faptul că globii oculari
prezintă o mare cantitate de lichid provenit din lichid lacrimal şi umoare apoasă. Valoarea
medie generală a concentraţiei metanolice s-a calculat la 1,70 mg/mL, valoare reprezentativă
faţa de valorile obţinute pe organele analizate.
Figura 12.19. exprimă reprezentarea grafică a mediilor concentraţiilor de metanol
Page 30
30
determinate la cei cinci subiecţi prin GC-MS din sânge, creier, ochi, cord, plămân, ficat şi
rinichi, după administrarea de metanol în doză DL100 (4,8 mL/Kg) faţa de timpul de
supravieţuire. Din reprezentarea grafică reiese că subiectul nr. 3 a acumulat cea mai mare
cantitate de metanol respective 2,2 mg/mL, acesta de altfel a avut perioada cea mai scurtă de
supravieţuire (105 min). Următoarea valoare a concentraţiei metanolice este cea a subiectului
nr. 2 cu 1,63 mg/mL, acest a decedat ultimul la 200 de minute. Subiectul nr. 5 cu o
concentraţie metanolică de 1,60 mg/mL decedează la 180 de minute de la injectare la fel ca
subiectul nr. 4 cu 1,53 mg/mL. Subiectul cu valoarea concentraţiei metanolice cea mai scăzută
este iepurele nr. 1 cu 1,42 mg/mL, care a supravieţuit 155 de minute.
Conform timpului de supravieţuire faţă de valoarea mediei concentraţiei pentru fiecare
din cei cinci iepuri analizaţi, se constată că valoarea medie a concentraţiei metanolice nu este
relevant în procesul de supravieţuire, metabolismul individual având un rol hotărâtor, fapt
expus în figura 12.19.
Fig. 12.19. Valoarea medie a concentraţiei metanolice la cei cinci subiecţi testaţi cu
metanol DL100 (4,8 mL/Kg) faţă de timpul de supravieţuire din momentul injectării
Datele obţinute privind concentraţia metanolică ce se regăseşte în sângele şi
organele iepurilor testaţi la metanol în doză DL100 (4,8 mL/ Kg), corelate cu masa corporală
faţă de intervalul de supravieţuire evidenţiază faptul că în cazul în care expunerea la metanol
se face conform masei corporale, aceasta nu prezintă importanţă majoră în procesul de
supravieţuire.
12.5. Determinarea concentraţiei de metanol în cazul intoxicaţiilor
letale. Prezentare de caz
Marea majoritate a intoxicţiilor metanolice se produc pe fondul consumului de băuturi
alcoolice în exces şi care prezintă o concentraţie metanolică peste limita admisă. Acest gen de
intoxicaţii conduc de cele mai multe ori la un final nefast, deoarece intoxicaţia cu alcool etilic
maschează simptomatologia intoxicaţiei metanolice înârziind astfel aplicarea medicaţiei
antidot specifice. Tarele de sănătate, cât şi starea de confuzie, obnubilare sau chiar coma
pacienţilor sunt factori importanţi în diagnosticarea precoce a intoxicaţiilor metanolice. De o
importanţă majoră în aplicarea diagnosticului sunt examenele complementare şi in mod
Page 31
31
special examenele biochimice şi nu în ultimul rând examenul toxicologic al sângelui. În cele
ce urmează se prezintă două cazuri de intoxicaţii metanolice care s-au prezentat la Spitalul
Judeţian Bacău şi au decedat la câteva ore de la internare.
12.5.1 Prezentarea cazului nr. 1
O pacientă de 32 de ani este internată în secţia Urgente a Spitalului Judeţean Bacău în
data de 21.02.2010 cu diagnosticul “Coma gradul III, şoc toxic în observaţie”. La examenul
clinic general, pacienta prezenta tegumente reci marmorate, secreţii albicioase abundente la
nivelul căilor respiratorii, TA nu se poate măsura, AV-68/minut, pupile midriatice bilateral,
ROT absente, raluri bronşice bilateral. Examenele complementare respectiv, examenul
biochimic al sângelui relevă: amilază -117 U/L, GGT–113 U/L, TGO–331 U/L şi TGP–147
U/L. Din datele de anchetă rezultă că femeia era o consumatoare cronică de băuturi alcoolice.
Starea gravă a pacientei cât şi a lipsei de informaţii privind toxicul care a fost ingerat
pe fondul consumului de băuturi alcoolice, a condus la o diagnosticare dificilă. Evoluţia a fost
gravă cu deprimare respiratorie, pacienta moare prin stop cardio-respirator după 9 ore de la
internare. În urma examenului toxicologic s-a constatat că in momentul decesului pacienta
prezenta o alcoolemie de 1,90g‰. Analiza concentraţiei metanolice din sange şi organe s-a
efectuat prin GC-MS, conform metodei, valorile fiind prezentate în tabelul 12.14.
Tabelul 12.14. Valorile concentraţiei metanolice din sânge
şi organe determinate prin GC/MS
Nr. Distilat
Concentraţia metanolului
µg/mL sânge,
sau g ţesut
mg/mL sânge,
sau g ţesut
g/1000 mL
sânge/g ţesut
1 Sânge 1720,342 1,720 1,72
2 Ficat 795,506 0,795 0,79
3 Bilă 2661,306 2,661 2,66
4 Stomac 2287,104 2,287 2,28
5 Intestin 1639,867 1,639 1,63
6 Rinichi 1590,389 1,590 1,59
Valoare medie 1,78
Datele obţinute pun în evidentă valorile crescute ale concentraţiilor metanolice atât în
sânge cât şi în organele cercetate. Astfel, în sânge concentraţia metanolului este de 1,720 g‰,
în ficat de 0,795 g ‰, în bilă de 2,661 g ‰, în stomac 2,287 g ‰, în intestin de 1,639 g ‰ iar
în rinichi de 1,590 g ‰.
Fig. 12.21. Variaţia concentraţiei de metanol în sânge şi organe
Page 32
32
Datorită coeficientului bun de lipo–hidrosolubilitatate, metanolul se distribuie în
majoritatea organelor, cu precădere în organele cu concentraţii mari de apă. În cazul de faţă, în
bilă concentraţia metanolica este de trei ori mai mare faţă de concentraţia metanolică din ficat,
unde s-a înregistrat cea mai scăzută valoare. Variaţia mare a valorilor concentraţiilor
metanolice este explicată în primul rând de examenul anatomo-patologic. În cazul de faţă
steatoza hepatică cu degenerescenţă grasă, explică pe de o parte distribuţia neuniformă a
toxicului, cât şi accentuarea scăderii ratei metabolice a metanolului, cu potenţarea efectului de
acumulare. Valorile mari ale concentraţiei metanolice din stomac şi intestin pun în evidenţă
faptul că expunerea la metanol s-a făcut prin ingestie. Astfel, consumul excesiv de băuturi
alcoolice coroborat cu tarele de sănătate (leziuni bacilare vechi, steatoză hepatică, alcoolism
cronic) şi nu în ultimul rând concentrţia mult peste limită a metanolului din băuturile
alcoolice consumate au dus în cazul de faţă la deces. Valoarea concentraţiei metanolice
determinată în sânge şi organe fiind fatală chiar şi în cazul unui organism sănătos.
12.5.2. Prezentarea cazului nr. 2
În luna februarie 2011, un bărbat de 65 de ani este internat în secţia Urgenţe a S.J.U.
Bacău, la ora 14, 50 cu diagnosticul de : Comă profundă. Şoc toxic. În momentul internării,
tegumente reci, marmorate, hipotermie 34 ° C, pupile midriatice bilateral, areactive la lumină,
ROT absente, RCA abolite, TA – 80/50, AV – 60/ minut, GCS-6, examenul Compiuter
Tomograf nu s-a putut efectua.
Examenele complementare, respectiv analizele biochimice pun în evidenţă
următoarele valori : Creatinină - 1,35, TGP- 45, GOT- 65, GGT- 171, CO2 - 8, K- 6,39, Na -
156,4 , Gluc.- 143, pH – 6,8.
Cu toate eforturile de susţinere a vieţii, la ora 06,50 decedează în urma stopului
cardio-respirator.
Din analiza toxicologică reiese că acesta a consumat băuturi alcoolice cu o
concentraţie metanolică mult peste limită (1 g/100 mL etanol anhidru), constatându-se o
concentraţie etanolică de 0,90 g ‰ la 16 ore de la internare.
În urma analizei GC-MS a probelor biologice, s-au obţinut următoarele rezultate,
prezentate în tabelul 12.15.
Tabelul 12.15. Valorile concentraţiei metanolice din sânge
şi organe determinate prin GC-MS
Nr. Distilat
Concentraţia metanolului
µg/mL sânge, sau
g ţesut
mg/mL sânge, sau
g ţesut
g/1000 mL
sânge/g ţesut
1 sânge 526,6 0,526 0,52
2 creier 677,8 0,677 0,67
3 pulmon 946,1 0,946 0,94
4 cord 621,1 0,621 0,62
5 ficat 771,0 0,771 0,77
6 bila 1056,7 1,056 1,05
7 pancreas 924,2 0,924 0,92
8 stomac 1235,9 1,235 1,23
9 intestin 1345,2 1,345 1,34
10 rinichi 1483,5 1,483 1,48
Valoare medie 1,35
Datele prezentate în tabelul 12.15, pun în evidenţă valorile mari ale concentraţiei
metanolice obţinute stomac, intestin, rinichi, valori de 1,23 g‰ , 1,34 g‰, 1,48 g‰. Valori
Page 33
33
apropiate s-au obţinut în pulmon cu 0,94 g‰ şi pancreas cu 0,92 g‰. În bilă s-a determinat
1,05 g‰. Valori mai mici s-au determinat în sânge şi anume 0,52 g‰, în creier 0,67 g‰ şi în
ficat 0,77 g‰ , date exprimate şi în figura 12.23 .
Fig. 12.23. Variaţia concentraţiei de metanol în sânge şi organe
Din analiza toxicologică prin GC-MS a sângelui şi a organelor în cazul de faţă se
constată o fluctuaţie a valorilor cu pondere mare pe rinichi, intestin şi stomac şi mai scăzută
pe creier, cord şi ficat. Valoarea concentraţiei metanolice din sânge a fost cea mai scăzută
valoare determinată la caz, ceea ce denotă că metabolismul metanolului era în dinamică.
12.5.3. Concluzii faţă de cazuistică
Cele două cazuri prezentate constituie practic două exemple de intoxicaţie
metanolică letală. În ambele cazuri pacienţii au fost internaţi în stare comatoasă, astfel încât
epicriza foilor de observaţie nu a putut fi completată cu date care ar fi putut avea o reală
importanţă în stabilirea diagnosticului. Ancheta cazurilor stabilea cu certitudine că ambii
pacienţi au consumat băuturi alcoolice în exces, prezentând în mod evident simptomatologia
intoxicaţiei etanolice.
Faţă de datele din literatură, valorile concentraţiei metanolice obţinute în urma
analizei probelor biologice prin GC-MS, se încadrează în intervalele valorice obţinute şi în
alte cazuri de intoxicaţii letale cu metanol, respectiv intervalul 0,52– 2,66 g‰ metanol
(Ashley L., 1992, Vaida H., 1997, Watson WA., 2003). Comparaţia valorile privind ponderea
concentraţiei de metanol obţinute la cazul nr.1 faţă de ponderea concentraţiei metanolice la
cazul nr. 2, pe aceleaşi organe conform valorilor expuse în tabelele nr. 12.14. şi 12.15. se
prezintă în figura nr. 12.25.
Fig. 12.25. Valori comparative între ponderea concentraţiei metanolice
obţinută din sânge şi organe la cazul nr. 1 şi cazul nr. 2
Page 34
34
Având în vedere valorile expuse în figura 12.25, faţă de dinamica intoxicaţiei
metanolice, putem afirma că distribuţia şi absorbţia toxicului în organe la cele două cazuri
cercetate, este diferită. În baza acestor cercetări, se poate preciza că în momentul decesului la
cazul nr. 2, faţă de cazul nr. 1, metanolul era în faza de eliminare. Acest fapt este relevat în
primul rând de valoarea mare a concentraţiei metanolice din rinichi (1,48 g ‰) faţă de
valoarea obţinută în sânge (0,52 g‰), cât şi de valoarea mare din plămâni (1,05 g‰).
Analizând datele obţinute la cazul nr. 1, se observă o distribuţie diferită faţă de cazul nr. 2.
Deoarece concentraţia metanolică din sânge este mai mare faţă de concentraţia metanolică din
rinichi (tabelul 12.14.), se poate preciza că momentul decesului s-a produs în plin proces
metabolic, în faza de acumulare. Momentul decesului la scurt timp de la internare (9 ore), a
fost precipitat de mai mulţi factori şi anume în primul rând de tarele de sănătate a pacientei
(leziunile bacilare specifice infecţiei cu bacil Koch, ficat steatozic) şi nu în ultimul rând
concentraţia etanolică de 1,90 g‰.
În urma analizei celor două cazuri, s-a constatat că decesul a survenit ca urmare a
consumului excesiv de băuturi alcoolice contrafăcute, care în mod evident prezentau
concentraţii ale metanolului peste limita admisă.
13. INCIDENŢA INTOXICAŢIILOR LETALE CU ALCOOL METILIC ÎN UNELE
JUDEŢE DIN ROMÂNIA ÎN PERIOADA 2005 – 2010
13.1. STUDIUL STATISTIC AL INTOXICAŢIILOR LETALE
PENTRU TOATE JUDEŢELE
Studiul statistic privind intoxicaţiile letale cu metanol s-a efectuat în urma consultării
datelor preluate de la Serviciile de Medicină Legală a cincisprezece judeţe din România.
Datele cuprind: numărul de cazuri de morţi violente în urma intoxicaţiei metanolice, vârsta,
sexul, provenienţa persoanei decedate cât şi prezenţa alcoolului etilic sau a altor toxici
determinaţi în sânge. În tabelul 13.1. sunt prezentate datele privind numărul de cazuri de
intoxicaţii metanolice pentru fiecare judeţ pe fiecare an, din 2005 până în 2010.
Tabelul 13.1. Numărul de cazuri de intoxicaţii metanolice
în 15 judeţe din România în perioada 2005 – 2010
Judeţ 2005 2006 2007 2008 2009 2010 Total
Alba 0 0 2 0 0 1 3
Bacău 0 13 4 0 3 3 21
Braşov 0 3 6 0 0 3 12
Buzău 2 0 0 0 1 1 4
Gorj 0 4 0 1 0 1 6
Neamţ 1 0 1 1 0 1 4
Olt 0 1 1 0 0 0 2
Suceava 0 0 0 0 0 1 1
Vrancea 2 1 1 2 3 1 10
Brăila 0 0 0 1 2 0 3
Galaţi 0 0 0 0 0 0 0
Botoşani 0 0 0 0 0 0 0
Vaslui 0 0 0 0 0 0 0
Mehedinţi 0 0 0 0 0 0 0
Bistriţa
Năsăud 0 0 0 0 0 0 0
Situaţia numărului total de cazuri înregistrate pe acest interval din cele cinsprezece
judeţe este prezentată în figura 13.1., unde se observă că judeţul cu cele mai multe cazuri de
Page 35
35
intoxicaţii letale este judeţul Bacău cu 25 de cazuri. Este urmat de judeţul Braşov cu 12 cazuri
şi judeţul Vrancea cu 10 cazuri.
Fig. 13.1. Totalul intoxicaţiilor metanolice
din cinsprezece judeţe pe intervalul 2005 – 2010
Sintetizând datele obţinute din cele zece judeţe în care în perioada 2005 – 2010 au
existat cazuri de intoxicaţii metanolice letale, s-au obţinut o serie de rezultate privind totalul
cazurilor de intoxicaţii letale în funcţie de sex şi în funcţie de provenienţă.
În funcţie de sex, s-au înregistrat un număr de 53 de cazuri de bărbaţi şi 13 cazuri de
femei. Faţa de provenienţa celor decedaţi în urma intoxicaţiei metanolice cele mai multe
cazuri au fost înregistrate din mediul rural, respectiv 48 de cazuri faţă de 18 cazuri din mediul
urban. Aceste aspecte au fost sintetizate în figurile 13.2. şi 13.3.
Fig. 13. 2. Situaţia statistică a numului de bărbaţi faţă de numărul de femei decedaţi în
urma intoxicaţiei metanolice pe fiecare judeţ.
Page 36
36
Fig. 13.3. Situaţia statistică a cazurilor de intoxicaţii metanolice letale
în funcţie de provenienţă
Din ambele figuri se observă că judeţul Bacău prezintă cele mai multe cazuri de
decese atât la bărbaţi cât şi la femei, totodată, comparative cu datele sintetizate de la celelalte
judeţe, prezintă şi cele mai multe cazuri din mediul rural şi mediul urban. Din acest punct de
vedere, este urmat de judeţul Braşov cu 11 cazuri bărbaţi şi un caz de sex feminine, iar în
funcţie de origine 8 cazuri din mediul rural cu patru cazuri din mediul urban.
În funcţie de grupele de vârstă ale intoxicaţilor cu metanol s-a efectuat o statistică pe
şase grupe de vârstă, se observă că grupa de vârstă 41- 50 ani prezintă cele mai multe cazuri
de decedaţi în urma intoxicaţiei metanolice, respectiv 19 cazuri. Aceste aspect au fost
sintetizate şi prezentate în figura 13.4.
Fig. 13. 4. Numărul de cazuri de decese în urma intoxicaţiei metanolice
în funcţie de grupa de vârstă
Fig. 13.5. Numărul total de cazuri în funcţie de intervalul 2005 – 2010
Page 37
37
Datele din figura 13.5. oferă o imagine de ansamblu a numărului de cazuri de morţi
violente prin intoxicaţie cu alcool metilic. Este evidentă diferenţa de la un an la altul, cea mai
evidentă fluctuaţie fiind între anul 2005 cu 5 cazuri şi 2006 cu 22 de cazuri. De asemeni în
anul 2007 se înregistrează 13 cazuri ca în 2008 numărul de cazuri să se reducă la 5, urmând o
evoluţie în creştere, astfel în 2009 se ajunge la 9 cazuri, iar în 2010 la 12 cazuri.
13.3. CONCLUZII
Analizând datele preluate de la Serviciile de Medicină Legală din 15 judeţe privind
cazurile de morţi violente care s-au produs în urma intoxicaţiilor metanolice, s-a constatat:
Judeţele Galaţi, Botoşani, Vaslui, Mehedinţi şi Bistriţa Năsăud, pe intervalul studiat
nu a prezentat nici un caz de intoxicaţie metanolică letală;
Din cele 10 judeţe în care s-au înregistrat cazuri de intoxicaţii letale, s-a înregistrat
un total de 66 de cazuri, Judeţul Bacău prezentând cele mai multe cazuri, respectiv 21 de
cazuri, cele mai puţine cazuri înregistrându-se în judeţul Suceava şi anume, un caz;
În funcţie de sex, cele mai multe cazuri s-au înregistrat la bărbaţi, respectiv 53 de
cazuri şi 13 femei;
În funcţie de origine, din mediul rural au provenit 48 de cazuri faţă de 18 din mediul
urban;
Faţă de grupele de vârstă în care s-au încadrat subiecţii, grupa 41–50 care prezintă
19 cazuri, urmată la un scurt interval de grupa 51–60 cu 16 cazuri, numărul cel mai scăzut
s-a înregistrat în grupa 61–70 cu 3 cazuri;
Numărul total de cazuri pentru fiecare an analizat, pune în evidenţă anul 2006 cu 22
de cazuri, evoluţia fiind fluctuantă.
14. CONCLUZII GENERALE
Metanolul este prezent în numeroase produse de larg consum, dar majoritatea
cazurilor de intoxicaţii metanolice se produc în urma consumului de băuturi alcoolice care
prezintă o concentraţie metanolică peste limita admisă de 1g / 100 mL etanol anhidru.
Metanolul din aceste produse de distilare rezultă din degradarea părţii lemnoase a seminţelor
fructelor cât şi din degradarea substanţelor pectice din dermul fructelor şi al seminţelor
acestora. De asemeni, prezenţa metanolului în produsul finit de distilare este strâns legată de
tehnica de prelucrare a fructelor şi mixurilor de fructe.
În contextual actual generat de importanţa elucidării mecanismului de acţiune a
metanolului asupra organismului uman, cât si de importanţa testelor toxicologice în cazul
intoxicaţiilor metanolice, prezenta teză de doctorat si-a propus următoarele obiective:
Validarea unei metode GC-MS de determinare şi cuantificare a metanolului din
distilatele alcoolice.
Determinarea concentraţiei de metanol din distilatele alcoolice natural prin metoda
propusă. Determinarea altor congeneri volatili cu caracter toxic din distilatele alcoolice
natural.
Validarea unei metode GC-MS de determinare a concentraţiei metanolice din probe
biologice, respective sânge şi ţesuturi.
Aplicarea metodei de determinare a metanolului din probe biologice într-un studiu
pe animale de laborator.
Aplicarea metodei de determinare a concentraţiei de metanol din probe biologice
GC-MS, pe subiecţi umani (prezentări de caz).
Evaluarea statistică a numărului de cazuri de intoxicaţii letale din judeţe din
România.
În lucrarea de faţă, prin analiza gaz cromatografică a probelor alcoolice am urmărit
Page 38
38
separarea a cât mai multor componente din matricea complexă în vederea identificării
acestora precum şi determinarea cantitativă a metanolului prezent în acestea. În acest sens am
pus la punct o metodă de analiză a metanolului prin cromatografie de gaze cuplată cu
spectrometrie de masă. Determinările gaz cromatografice au fost efectuate pe un cromatograf
de gaze tip Agilent Technologies 7890 A cuplat cu un spectrometru de masă tip Agilent
Technologies 5975C inert MSD ca sistem de detecţie. În urma consultării literaturii de
specialitate cât şi în urma testelor în vitro am stabilit următoarele condiţii de lucru:
separarea cromatografică se realizează pe o coloană Zebron – Phenomenex, tip ZB-
WAXplus (lungime de 60 m, diametru intern de 0,25 mm şi o grosime a filmului de 0,25 µm),
fază mobilă este constituită din heliu cu un debit de 1 mL/min,
gradient de temperatură în compartimentul coloanei: 50C timp de 20 minute, apoi
temperatura creşte cu 10C/min până la 250C unde este menţinută constantă încă 5 minute;
volumul de soluţie injectată este de 0,1 L şi un raport de splitare de 1 / 50 în portul
de intrare al injectorului ce are temperatura de 250C;
detecţia se realizează prin spectrometrie de masă cu temperatura sursei MSD de
230C şi cea a cvadrupolului MSD de 150C;
identificarea metanolului se realizează prin compararea spectrală faţă de biblioteca
de spectre Wiley.
Pentru ca metoda sa fie validată am studiat liniaritatea funcţiei de răspuns. Funcţia de
răspuns este liniară pe domeniul studiat (4,9–19775 g/mL). Ecuaţia dreptei de regresie
obţinute s-a calculat prin metoda celor mai mici pătrate:
Arie = 4877,4 x Concentraţia (g/mL) + 1569486,174
Pe domeniul 4,9 – 2768,5 g/mL ecuaţia curbei de calibrare este:
Arie pic = 6500,4 x Concentraţia – 11679,5
Pe domeniul 2768,5 – 19775 g/mL ecuaţia curbei de calibrare este:
Arie pic = 4685,8 x Concentraţia + 3601973,7.
Au fost calculate limitele de detecţie (LD = 146,4 g/mL pe intervalul 4,9 – 2768,5
g/mL, respectiv LD = 875,8 g/mL pe intervalul 2768,5 – 19775 g/mL) şi limita de
cuantificare (LQ = 443,5 g/mL pe intervalul 4,9 – 2768,5 g/mL, respectiv LQ = 2653,9
g/mL pe intervalul 2768,5 – 19775 g/mL) folosind estimarea acestor limite pe baza
deviaţiei standard şi a pantei dreptei de regresie.
A fost stabilit intervalul de lucru: 3559,5 – 9887,5 g/mL;
Pentru estimarea preciziei s-au determinat:
repetabilitatea injecţiei (precizia sistemului) pentru un număr de 5 determinări,
valoarea deviaţiei standard relative (RSD) fiind de 1,0621 %;
repetabilitatea analizei (precizia metodei) pentru trei soluţii independente la trei
nivele de concentraţie diferite pentru care valoarea deviaţiei standard relative (RSD) este de
2,6601 % pe domeniul 2768,5 – 19775 g/mL;
precizia intermediară pentru trei soluţii independente la trei nivele de concentraţie
diferite pentru care valoarea deviaţiei standard relative (RSD) este de 2,3336 % pe domeniul
2768,5 – 19775 g/mL.
Pentru estimarea exactităţii s-a determinat regăsirea pentru un număr de trei probe
la trei nivele de concentraţie diferite obţinându-se o regăsire medie de 95,9% pe intervalul
92,4 – 97,9% pe domeniul 2768,5 – 19775 g/mL.
Metoda astfel validată am aplicat-o în vederea determinării concentraţiei de alcool
metilic şi a prezenţei compuşilor volatili în distilatele alcoolice natural. Astfel am analizat un
număr de 98 de probe de distilate alcoolice natural, provenite din zona Moldovei .
Din cele 98 de probe de distilat analizate prin GC-MS conform metodei, două probe
au avut valori ale concentraţiei metanolului sub limita de detecţie şi una sub limita de
Page 39
39
cuantificare.
Cele 95 de probe prezintă concentraţii ale metanolului (g/mL distilat ) cuprinse între
499,5g/mL - 8316,0 g/mL. Valoarea medie cea mai mare se regăseşte în distilatele din
prune, respectiv 3320,46 g/mL distilat. Media cea mai scăzută a concentraţiei metanolului
în g/mL distilat se observă în probele de distilat alcoolic prelucrate din tescovină.
Regulamentul CEE 1014/90 şi STP 57–92 prevede că valoarea concentraţiei de
metanol în băuturile alcoolice naturale se raportează la 100 mL alcool etilic anhidru.
Pentru raportarea concentraţiei metanolului faţă de 100 mL etanol anhidru am determinat
conţinutul în etanol conform unei metode de determinare a concentraţiei etanolice din
distilatele alcoolice conformă cu legislaţia.
Raportând concentraţia de metanol g/mL distilat la concentrţia de etanol din probele
analizate, am constatat:
19 probe au avut valori ale concentraţiei metanolice peste limita admisă (peste 1,00
g/100 mL alcool etilic anhidru), din care :
valoarea maximă determinată este de 2,30 g/mL etanol anhidru
6 probe cu valori ale concentraţiei metanolice peste limită au ca materie primă
tescovina.
7 probe cu valori ale concentraţiei alcoolului metilic peste limita admisă, provenite
din amestec de fructe.
6 probe cu valori ale concentraţiei metanolului peste limitele admise provenite din
prune.
Din calculul statistic privind concentraţia medie a metanolului din probele de distilat
analizate care au concentraţia metanolică peste limita admisă în funcţie de materialul din care
au fost prelucrate se observă:
valoarea medie cea mai mare a concentraţiei metanolice se regăseşte în probele de
distilate provenite din macerarea şi distilarea prunelor, respectiv 1,67 g/100 mL etanol
anhidru;
valoarea medie cea mai scăzută o întâlnim la probele provenite din distilarea
amestecurilor de fructe de 1.38 g/100 mL etanol anhidru.
valoarea medie generală pe cele 19 probe de distilat cu concentraţii metanolice peste
limita admisă este de 1,51 g/100 mL etanol anhidru.
În concluzie, din cele 98 de probe de distilate alcoolice naturale 19 probe prezentau
valori ale concentraţiei alcoolului metilic peste limita admisă, reprezentând 19,38%.
În urma analizei GC-MS, conform metodei prezentate, în cromatogramele probelor de
distilate naturale am identificat o serie de compuşi volatili denumiţi congeneri. Aceştia au
fost identificaţi prin metoda SCAN comparându-se timpii de retenţie cu datele din bibliotecile
spectrale. Am calculate concentraţia acestora raportând aria picului ce corespunde fiecărui
compus detectat şi identificat, faţă de aria totală a picurilor detectate, respectiv ariile picurilor
compuşilor volatili ce au putut fi detectaţi prin această metodă.
Concentraţia în mL/total congeneri a compuşilor volatili detectaţi si identificaţi am
calculat-o raportând procentul de arie al fiecărui pic la concentraţia în volume a etanolului,
concentraţie ce a fost obţinută anterior .
Faţă de totalul compuşilor volatili detectaţi prin GC-MS, 96% reprezintă etanol, 3%
alţi compuşi volatili şi 1 % alcool metilic. Faţă de ponderea etanolului din distilatele analizate,
metanolul reprezintă 1,04% .
Intoxicaţiile metanolice de diferite etiologii, dar cu precădere cu etiologie alcoolică,
constituie cauza multor urgenţe medicale, dar şi a multor decese. Important este ca
diagnosticul cu privire la natura toxicului la care a fost expus pacientul să fie pus cât mai
rapid pentru administrarea unei scheme de tratament adecvate. În acest sens am încercat
elaborarea şi validarea unei metode de determinare a metanolului din produsele biologice într-
un timp scurt şi eficient. Prin această metodă am analizat metanolul din probe de sânge, cât şi
Page 40
40
din organe, în cazul examenului toxicologic pe cadavru.
Pentru a realiza separarea, identificarea şi determinarea cantitativă a metanolului din
probe biologice prin cromatografie de gaze, cuplată cu spectrometrie de masă, am efectuat
iniţial o serie de teste în vitro, obligatorii de altfel, pentru a stabili condiţiile experimentale
optime de analiză, având în vedere metoda GC-MS de determinare a metanolului din distilate
alcoolice.
În ceea ce priveşte modul de preparare a probelor pentru izolarea alcoolului metilic,
acestea au fost prelucrate prin distilare conform metodei Cordebard. S-au pregătit o serie de
standarde de lucru pentru validărea metodei. Pentru calculul concentraţiei în metanol se are în
vedere densitatea metanolului (d) în mg/mL (0,791), volumul de metanol şi volumul final al
probei.
Astfel, pentru prepararea standardelor de lucru am lucrat în modul următor: un volum
(v) de 0,5 mL metanol a fost amestecat cu un volum de 9,5 mL sânge obţinându-se un volum
total (V) de 10 mL soluţie stoc (ST 1) a cărei concentraţie se calculează folosind formula
următoare:
0,791 0,50,03955 g/mL=39550 g/mL
10
d v
V
Din soluţia astfel obţinută am preparat prin diluare cu sânge soluţii de diferite
concentraţii. Aceste soluţii au fost supuse distilării conform modului descris anterior.
Distilatele astfel prelucrate le-am analizat pe un cromatograf de gaze tip Agilent
Technologies 7890 A cuplat cu un spectrometru de masă tip Agilent Technologies 5975C inert
MSD ca sistem de detecţie. Faza staţionară - coloană polară Zebron – Phenomenex, de tip
YB-WAXplus (60 m x 0,25 mm; 0,25 µm).
Portul de intrare al injectorului se află la o temperatură de 250C. Cantitatea de probă
injectată este de 1 L cu un raport de splitare de 1 / 50.
Faza mobilă este constituită din heliu (debit 1 mL / min).
Programul de temperatură porneşte de la 50C - temperatură menţinută constantă timp
de 16 minute şi creşte la 250C cu o viteză de 25C/ min.
În ceea ce priveşte sistemul de detecţie, parametrii de lucru sunt următorii:
temperatura sursei MS: 230C;
temperatura quadrupolului: 150C;
mod de achiziţie (SIM – Single Ion Monitoring)
mod de lucru: SIM, ionii înregistraţi fiind cei cu raportul M/Z = 15, 29, 31 şi 32;
detecţie oprită între minutul 12 şi 15 (interval de timp necesar pentru eliminarea apei
din probă).
Identificarea metanolului se realizează prin compararea spectrală faţă de biblioteca de
spectre Wiley.
S-a studiat liniaritatea funcţiei de răspuns. Funcţia de răspuns este liniară pe
domeniul studiat (4,9–19775 g/mL sânge sau 1,65–6591,67 g/mL distilat).
Au fost calculate limitele de detecţie (LD = 139,3 g/mL) şi limita de cuantificare
(LQ = 422,1 g/mL) folosind estimarea acestor limite pe baza deviaţiei standard şi a pantei
dreptei de regresie.
A fost stabilit intervalul de lucru: 139,3 – 6591,67 g/mL distilat respectiv 417,9 –
19775,01 g/mL sânge;
Pentru estimarea preciziei s-au determinat:
repetabilitatea - RSD 0,8748 %;
repetabilitatea analizei (precizia metodei) – RSD 4,6811 % pe domeniul 263,67 –
527,33 g/mL distilat;
precizia intermediară - RSD 4,1078 % pe domeniul 263,67 – 527,33 g/mL distilat;
Pentru estimarea exactităţii s-a determinat - regăsirea medie de 98,0% pe intervalul
Page 41
41
93,2 – 102,8%.
Aplicabilitatea metodei de determinare a metanolului din probe biologice s-a testat
într-un studiul experimental ce se bazează pe testarea toxicităţii alcoolului metilic pe animale
de laborator. În cazul de faţa s-a folosit un lot format din cinci iepuri din rasa“ Iepurele
olandez cenuşiu”, experimentele desfăşurându-se în cadrul Laboratorului de Biologie Animală
a Universităţii “V Alecsandri” Bacău.
Studiul pe animale de experienţă a avut următoarele obiective:
1. Determinarea variaţiei concentraţiilor de metanol în sânge în cazul injectării de
metanol cu doza de DL50 la iepuri din rasa “Olandez cenuşiu” şi observarea simptomatologiei
intoxicaţiei.
2. Determinarea variaţiei concentraţiilor de metanol în sânge şi organe în cazul
injectării de metanol cu doza de DL100 la iepuri din rasa „Olandez cenuşiu” şi observarea
simptomatologiei intoxicaţiei.
S-a urmărit evoluţia intoxicaţiei metanolice din punct de vedere simptomatic cât şi din
punct de vedere toxicologic prin analiza probelor de sânge recoltate la intervale determinate
respective la 75, 195 şi 375 de minute.
Determinarea metanolului prin GC-MS s-a efectuat prin analiza distilatelor obţinute
din probele de sânge şi organe, conform metodei prezentate, pe acelaşi aparat şi aceiaşi
parametri pe care i-am utilizat la validarea metodei. Din punct de vedere toxicologic în prima
fază a experimentului, am obţinut valori ale concentraţiei de metanol în sânge pe urmatoarele
intervale de recoltare:
75 minute : 0,68 mg/mL - 1,02 mg/mL
195 minute: 0,75 mg/mL - 1,02 mg/mL
375 minute: 0,68 mg/mL - 0,89 mg/mL.
Faţă de evoluţia simptomatologiei, la 75 de minute de la administrarea toxicului 60 %
dintre subiecţi prezentau modificări minore a simptomatologiei, ca la minutul 375, 100 % din
subiecţi prezentau o simptomatologie ce releva deteriorării majore a stării de sănătate.
Evoluţia valorilor pulsului a fost diferită de la individ la individ, în medie valoarea cea mai
crescută raportându-se la minutul 75 de la administrarea metanolului.
În cea de-a doua etapă a experimentului am testat variaţia concentraţiilor de metanol
în sânge în cazul injectării de metanol cu doza de DL100 (4,8 mL/Kg corp) la iepuri din rasa
“Olandez cenuşiu”. Am efectuat două recoltări, prima la un interval de 75 de minute, cea de-a
doua recoltare efectuându-se în momentul decesului subiecţilor.
La primul interval de recoltare am obţinut valori ale concentraţiei metanolice cuprinse
între 1,08 mg/mL şi 1,77 mg/mL. A doua recoltare a fost efectuata intervale diferite în funcţie
de momentul decesului fiecărui subiect. Am obţinut valori ale concentraţiei metanolice
cuprinse între 1,23 mg/mL, şi 1,82 mg/mL.
Faţă de valorile obţinute din analiza organelor recoltate în urma decesului subiecţilor
testaţi cu metanol DL100, am constatat că cea mai mare concentraţie metanolică medie s-a
determinat în urma analizării ficatului cu o valoare de 2,16 mg/mL, iar cea mai scăzută
valoare s-a determinat în ochi cu o valoare medie de 1,40 mg/mL. Din punct de vedere al
fiecărui subiect în parte, am obţinut valori fluctuante şi diferite pe organe la fiecare subiect
analizat. Valoarea medie cea mai mare s-a obţinut la subiectul nr. 3 de 2,20 mg/mL şi cea mai
mică valoare la subiectul nr. 1 cu o valoare medie de 1,42 mg/mL. Datele obţinute privind
concentraţia metanolică ce se regăseşte în sângele şi organele iepurilor testaţi la metanol în
doză DL100 (4,8 mL/ Kg), corelate cu masa corporală faţă de intervalul de supravieţuire,
evidenţiază faptul că în cazul în care expunerea la metanol se face conform masei corporale,
aceasta nu prezintă importanţă majoră în procesul de supravieţuire.
Marea majoritate a intoxicaţiilor metanolice se produc pe fondul consumului de
băuturi alcoolice în exces şi care prezintă o concentraţie metanolică peste limita admisă.
Page 42
42
În perioada 2010 – 2011 la SJU Bacău s-au prezentat două astfel de cazuri, care
constituie practic două exemple de intoxicaţie metanolică letală. În ambele cazuri pacienţii au
fost internaţi în stare comatoasă şi soc toxic. Ancheta cazurilor stabilea cu certitudine că ambii
pacienţi au consumat băuturi alcoolice în exces, prezentând în mod evident şi
simptomatologia intoxicaţiei etanolice.
Comparând valorile privind ponderea concentraţiei de metanol obţinute la cazul nr. 1
faţă de ponderea concentraţiei metanolice la cazul nr. 2, pe aceleaşi organe se constată că în
cazul numărul 1 decesul a survenit în plin proces metabolic şi acumulare a metanolului. În
cazul numărul 2 decesul a survenit în faza de eliminare a metanolului.
În ambele cazuri se poate spune că a fost vorba de o dublă intoxicaţie atât metanolică cât şi
etanolică. Simptomatologia acută a intoxicaţiei etanolice cât şi lipsa datelor de anchetă au
mascat intoxicaţia metanolică, conducând spre exitus.
Analizând datele preluate de la Serviciile de Medicină Legală din 15 judeţe privind
cazurile de morţi violente care s-au produs în urma intoxicaţiilor metanolice, s-a constatat:
Judeţele Galaţi, Botoşani, Vaslui, Mehedinţi şi Bistriţa Năsăud, pe intervalul studiat
nu a prezentat nici un caz de intoxicaţie metanolică letală;
Din cele 10 judeţe în care s-au înregistrat cazuri de intoxicaţii letale, s-a înregistrat
un total de 66 de cazuri, Judeţul Bacău prezentând cele mai multe cazuri, respectiv 21 de
cazuri.
În funcţie de sex, cele mai multe cazuri s-au înregistrat la bărbaţi, respectiv 53 de
cazuri şi 13 la femei;
În funcţie de provenienta , din mediul rural au provenit 48 de cazuri faţă de 18 din
mediul urban;
Faţă de grupele de vârstă în care s-au încadrat subiecţii, cele mai multe cazuri
înregistrându-se pe grupa 41–50 care prezintă 19 cazuri.
Numărul total de cazuri pentru fiecare an analizat, pune în evidenţă anul 2006 cu 22
de cazuri, evoluţia fiind fluctuantă.
În urma acestui studiu, consider ca metanolul este un toxic activ plasat în numeroase
produse de largă circulaţie, la care are acces un segment important din populaţie. Deşi se
cunosc în mare parte efectele toxice ale acestuia, prezenţa sa în băuturile alcoolice prezintă cel
mai mare risc. Datorită faptului că în majoritatea cazurilor decesul subiecţilor a survenit ca
urmare a consumului de băuturi alcoolice contrafăcute care în mod evident prezentau
concentraţii ale metanolului peste limita admisă se impun măsuri de control asupra băuturilor
alcoolice preparate artizanal. Se impune de asemeni avertizarea a populaţiei privind
potenţialul toxic al alcoolului metilic, acordândui-se importanţa cuvenită în categoria
toxicelor.
CONTRIBUŢII ORIGINALE
1. Am elaborat şi validat o metodă modernă de determinare a metanolului prin
cromatografie de gaze cuplată cu spectrometria de masă, din distilate alcoolice.
2. Am evaluat concentraţia metanolului din distilatele alcoolice naturale produse
artizanal în funcţie de materialul din care au fost distilate şi în funcţie de localităţile din care
provin.
3. Am elaborat şi validat o metodă în vederea determinării a metanolului din probe
biologice, respectiv sânge şi ţesuturi, prin cromatografie de gaze cuplată cu spectrometria de
masă.
4. Am evaluat dinamica intoxicaţiei metanolice pe baza concentraţiilor metanolului
determinate în sânge la intervale prestabilite într-un studiu pe organism animal, respectiv pe
iepuri.
5. Am evaluat distribuţia metanolului în organe în cazul intoxicaţiei letale, într-un
studiu pe animale de laborator (iepuri), cât si pe subiecţi umani, decedaţi în urma consumului
Page 43
43
de băuturi alcoolice care aveau concentraţii metanolice peste limita admisă.
6. Am efectuat o situaţie statistică a intoxicaţiilor metanolice letale din judeţele din
România.
PERSPECTIVE DE CERCETARE
Tema tezei de doctorat oferă premizele către noi direcţii de cercetare:
Analiza concentraţiei de metanol din distilatele alcoolice naturale în funcţie de
specia de fruct din care s-a prelucrat distilatul, respective specia de strugure din care provine
tescovina, sau specia de prune din care s-a prelucrat distilatul.
Analiza concentraţiei de metanol din distilatele alcoolice naturale în funcţie de
vechimea distilatului.
Analiza concentraţiei metanolului din distilatele alcoolice natural în funcţie de
perioada de fermentare şi păstrare a materialului fructifer în vederea distilării.
Analiza concentraţiei de metanol din distilatele alcoolice naturale în funcţie de
gradul de infestare a materialului fructifer cu diferite specii de fungi.
Analiza concentraţiei de metanol din sânge în urma consumului de sucuri naturale.
Analiza concentraţiei de metanol din sânge în urma consumului de băuturi
răcoritoare acidulate îndulcite cu aspartam.
Analiza concentraţiei metanolului metabolic în funcţie de diferite afecţiuni ale
organismului.
Analiza concentraţiei metanolului din apele reziduale din staţiile de epurare a
apelor.
Analiza concentraţiei de metanol din diferite produse de curăţare.
Page 44
44
BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ
6. * * * „2008 World Methanol Analysis”. www.cmaiglobal.com.
https://www.cmaiglobal.com/Marketing/News/WMA2008.pdf. Accesat la 9 ianuarie 2010
9. Hayes AW, et al. FATS, Principles and Methods of Toxicology, Third edition Raven Press, N.Y. 1994; (4 ):
129-142; 364-377
10. Ioniţă P I. Curs de chimia compuşilor organici cu funcţiuni simple. Universitatea din Bucureşti, 2008
11. Sun Y, Ong K Y. Detection Technologies for Chemical Warfare Agents and Toxic Industrial Chemical. CRC
Press, United Kindom, 2004
12. Luminiţa Agoroaiei, Elena Butnaru. Toxici gazosi şi volatili, Editura „Gr. T. Popa”, U.M.F., Iaşi 2005; 103 –
109.
13. Klaassen C, ed Cassaret and Doull’s Toxicology: The basic science of poisons, 6th ed. New York, McGraw-
Hill, 2001
17. Dorneanu Maria, Ştefănescu Eugenia, Rogut Odette. Chimie organica. Sinteze şi reacţii de recunoaştere, Ed.
Gr.T.Popa UMF Iaşi, 2002
43. * * * EPA (U.S. Environmental Protection Agency). Acute Exposure Guideline Levels (AEGLs). Methanol
Results (Proposed). AEGL Program, Office of Pollution, Prevention and Toxics, U.S. Environmental Protection
Agency, 2004
58. Some distilled fruit spirits contain, normally, high quantities of .62. Hui YN, Wai – Kit Nip, Nollet LML.
Food Biochemistry and Food Procesing. Blackwell Publissing, United States, 2006
62. Levy P, Hexdall A, Gordon P, Boeriu C, Heller M, Nelson L. Methanol Contamination of Romanian Home –
Distilled Alcohol. Journal of Toxicoloy, Clinical Toxicology, 2003; 41(1): 23-28
66. Stanciulescu G, Rusnac D, Bortos G. Tehnologia distilatelor alcoolice din fructe si vin. Editura Ceres,
Bucuresti, 1975
69. * * * Standard Profesional : STP 57-92/1992 elaborat de Intreprinderea Viei şi Vinului cu acordul
Ministerului Agriculturii şi Alimentatiei, 1992
70. * * * Regulamentul Nr. 110/2008 al Parlamentului European şi al Comisiei din 2008 privind definirea,
desemnarea, etichetarea si protectia indicatiilor geografice ale bauturilor spirtoase, 2008
141. Beliş V. Tratat de Medicina Legală, Ed. Medicală, Bucuresti, 1995; 2 (7): 138-155
142. Dermengiu D, Gorun G. Toxicologie Medico-Legală, Ed. Viata Medicala Romaneasca, Bucuresti, 2006;
146. Leikin & Paloucek’s. Poisoning & Toxicology Handbook 3rd Edition. Lexi Comp INC Hudson, Ohio, 2002;
600-602; 810-812
150. Richard C.Dart, MD, Ph.D(ed) Medical Toxicology Third Edition Lippincott Williams & Wilking, 2004;
1216
158. Graw M, Haffner HT, Althaus L, et al. Invasion and distribution of methanol. Arch Toxicol 2000; 74(6):
313-321
195. Wexier P, Anderson B D, Ann de Peyster, Gad SC, Hakinnen P J, Kamrin M A, Betty J Locey, Mehendale H
M, Pope C N, Shugart LR. Enciclopedia of Toxicology, Second Edition, Hardcover, 2005; 3: 56
200. Stegink LD, Filer LJ, Bell EF, et al. Effect of Repeated Ingestion of Aspartame-Sweetened Beverage on
Plasma Amino Acid, Blood Methanol, and Blood Formate Concentrations in Normal Adults. Metabolism, 1989;
38: 357-363
216. Charles JC, Heilman RL. Metabolic acidosis, Hospital Physician march, 2005; 37-42
217. Casaletto JJ. Differential diagnosis of metabolic acidosis, Emerg. Med.Clin. N. Am, 2005; 23: 771-787
237. Leakso O, Haapala M, Jaakkolo P, et al., FT-IR Breath Test in the Diagnosis and Control of Methanol
Intoxications, J Anal Toxicol, 2001; 25(1): 26-30
238. Watson WA, Litovitz TL, Rodgers GC, Klein-Schwartz W, Youniss J, Rose SR, Borys D, May ME. 2002
Annual Report of the American Association of Poison Control Centers Toxic Exposure Surveillance
System. American Journal of Emergency Medicine 2003; 21(5): 353-421
Page 45
45
241. Bologa Cristina. Aspecte practice în abordarea acidozei metabolice de cauză toxică, Revista Medicală
Română, 2010; Vol. LVII, Nr. 2: 83-87
248. Vieriu Socaciu R. Teorie şi practică medico-legală în contextul legislaţiei actuale, Ed. Medicală Universitară
Iuliu Haţeganu Cluj Napoca, 2002;
249. Vaida H, Rusu A I, Zaharia Daniela, Moşoigo P, Florian Ş. Intoxicaţie colectivă cu alcool metilic în
penitenciarul Gherla în perioada iunie – august 1997. Rom. J. Med. Leg. 1997; 5(3): 229-233
276. Roe O. Species Differences in Methanol Poisoing, CRC Critical Reviews in Toxicology, 1982; 10(40): 275-
286
278. Vincent J, Marcovilivk, MD, Focep Peter T. Pous, MD, Focep.Emergency Medicine.Secret Questions and
Answers. Reveal the Secrets to Safe and Effective Emergency Medicine 3rd Edition Philadelphia USA, 2003;
363-607
304. * * * G4350-90020 7820 Gas Chromatograph Advanced User Guide, Agilent Technologies, USA, 2009
318. * * * Regulamentul CEE Nr. 2870/2000 Al Comisiei Europene din 19.12.2000 de stabilire a metodelor
comunitare de referinţă pentru analiza băuturilor alcoolice
323. Dorneanu V, Maria Stan. Metode Chimice şi intstrumentale de analiză, Ed. Gr. T. Popa UMF Iaşi, 2003; 23-
33; 438-445
329. Lazăr Doina, Lazăr M.I., Gaby Nutturez, Metode cromatografice si spectrale aplicate în controlul
medicamentului, Ed. „Terra Nostra” Iaşi 2000
333. Jung Adriana, Jung H, Auwarter V, Pollak S, Farr A M, Hecser L, Şchiopu A. Volatile congeners in
alcoholic beverages : analysis and forensic significance. Romanian Journal of Legal Medicine, 2010; Vol. XVIII
(4): 265 – 271
337. Ashley L. et ed., Determining volatile organic compounds in human blood from a large sample population
by using purge and trop gas chromatography/mass spectrometry, Anal. Chem., 1992; 64: 1201-1209
338. Streete J, et al. Gas Chromatographic separation of volatile substances by head-space capillary gas
chromatography to aid the diagnosis of acute poisoning Analyst, 1992; 117: 1111-1127
346. Şorodoc L, Lionte C, Rusalim Petriş O, Victoriţa Şorodoc. Toxicologie clinică de urgenţă. Intoxicaţii acute
nemedicamentoase, Ed. Junimea, Iaşi, 2009; 1: 19 – 35
349. Silverman J. Animal breeding and research protocols- the missing link Lab.Anim.N.Y. 2002; 19: 31
350. Stemek N.H. Role of the institutional animal care and use committee in te morning research, Ethics Behav.,
1997; 173
356. Ciudin Elena. Biologia animalelor de laborator, Editura ALFA, Iaşi, 2004; 109 – 158
358. * * * OG. 37/2002 Protecţia animalelor folosite în scopuri ştiinţifice sau în scopuri experimentale aprobată
cu L 471/2002
368. Scott P.W.R. - Gas chromatography detectors, Library For Science, LLC, 2003
369. * * * Agilent 5973N MSD Hardware Manual, Agilent Technologies, USA, 1999
372. Yuwono, M.; Indryanto, G. – Validation of Chromatographic method of analysis, Profiles of Drug
Substances, Excipients, and Related Methodology, Edited by Harry G. Brittain, Academic Press, Elsevier, 2005;
32: 243 – 262
373. Mei-Ling Wang, Jih-Terng Wang, Youk-Meng Choong. Simultaneous quantification of methanol and
ethanol alcoholic beverage using a rapid gas cromatographie method coupling with dual internal standard. Food
Chemistry, Aug. 2004; 86: 609-615
376. * * * U.S. Pharmacopeia Forum – Cromatographic Columns – Edition 2009-2010
381. Robert L, Grob PhD, Eugen F, Barry PhD. Modern Practice of Gas Cromatography 4 th Edition ISBN 978-
0-471-22983-4 June 2004
382. Roman L, Bojiţă M, Săndulescu R. Validarea metodelor de analiză şi control, Ed. Medicală, 1998
391. * * * Regulamentul Nr. 110/2008 al Parlamentului European şi al Comisiei din 2008 privind definirea,
desemnarea, etichetarea şi protecţia indicaţiilor geografice ale băuturilor spirtoase
Page 46
46
LISTA CU LUCRĂRI ŞTIINŢIFICE PUBLICATE
1. Doina Moaleş, Şpac A F, Dorneanu V,
Elena Butnaru. Validation of a gas
cromatographic method for metanol determination. Farmacia, 2011, 1(59):
70 – 77.
2. Doina Moaleş, Şpac A F, Maria Prisecaru,
Elena Butnaru. The process and
validation of methanol determination from biological samples by means of a gas-
chromatographic method together with mass spectrometry. SCIENCIFIC STUDIES AND
RESEARCHES. Biology. Animal series. Editure “ALMA MATER “ Bacău, 2011, 21: 17 –
22.
3. Doina Moaleş, Şpac A F, Maria Prisecaru,
Elena Butnaru. Determining the
concentration of methanol from natural distillate. SCIENCIFIC STUDIES AND
RESEARCHES. Biology. Animal series. Editure “ALMA MATER “ Bacău, Nov. 2010, 19 :
51 – 61.
4. Doina Moaleş, Şpac A F, Maria Prisecaru,
Elena Butnaru. Determining the
concentration of alcohol from the natural distillates. SCIENCIFIC STUDIES AND
RESEARCHES. Biology. Animal series. Editure “ALMA MATER “ Bacău, Nov. 2010, 19 :
63 - 72.
5. Doina Moaleş, Elena Butnaru, Maria Prisecaru, Bădără
M. Statistical considerations
on lethal intoxication with methyl alcool from Bacău District during the period 1994 – 2007.
SCIENCIFIC STUDIES AND RESEARCHES. Biology. Animal series. Editure “ALMA
MATER “ Bacău, Nov. 2007, 13 : 28- 32.
Page 47
47
CURRICULUM VITAE
Doctorand Biolog Specialist în Toxicologie Medico-Legală
Doina (Bejan) Moaleş
STUDII
2011 Doctorat fără frecvenţă în specialitatea Toxicologie: „Contribuţii la
cercetarea chimico-toxicologică a alcoolului metilic”
2006-2008 Masterat cu durata de doi ani „Protecţia şi Valorificarea Resurselor
Biologice”, Universitatea din Bacău, Facultatea de Ştiinţe, Biologie.
2001-2005 Facultatea de Ştiinţe, Secţia Biologie, Universitatea din Bacău.
1982-1987 Liceul Sanitar Bacău, clasa de Farmacie.
SPECIALIZĂRI PROFESIONALE
2009 – Biolog specialist – Toxicologie Medico – Legală
PREGĂTIRE POSTUNIVERSITARĂ
8-10 / 25-26 .
02. 2010
Curs de serologie –stagiu pregătire în vederea determinării grupei
sanguine la persoana vie şi la cadavru. Institutul de Medicină Legală Iaşi
24.03.2009
„Proiectarea hărţilor de control Levey – Jennings”, Asociaţia de Calitate
în Laboratoare „Calilab” , OBBCSSR
16.03.2009 „Asigurarea şi controlul calităţii în laboratoarele medicale”, Asociaţia de
Calitate în Laboratoare „Calilab” , OBBCSSR
7 - 9. 03. 2008 „Elemente de toxicologie clinică”, Universitatea de Medicină şi Farmacie
Iaşi
1 – 10. 02. 2008 „Expertiza Medico-Legală în decesele cauzate de consumul de droguri” ,
Universitatea de Medicină şi Farmacie Iaşi
17. 10. 2007 „Incertitudinea de măsurare în laboratoarele medicale”, Asociaţia de
Calitate în Laboratoare „Calilab” , OBBCSSR
13 – 15. 09.
2007
„Indicatori biotoxicologici în intoxicaţii profesionale”, Universitatea de
Medicină şi Farmacie Iaşi
1 – 13. 10. 2006 “Examenul Serologic Criminalistic al Corpurilor Delicte”, Universitatea de
Medicină şi Farmacie „Carol Davila” Bucureşti
21. 11. – 9.12.
2005
Curs practic de iniţiere în toxicologia medico-legală, Institutul de
Medicină Legală Iaşi
EXPERIENŢĂ PROFESIONALĂ
Perioadă Funcţia Locul de
muncă
Sarcini şi responsabilităţi
5.05.2009-
prezent
Biolog
specialist
Serviciul de
Medicină
Legală
Bacău
Determinarea şi dozarea toxicelor din sânge şi urină
la persoana vie, determinarea şi dozarea toxicelor
din sânge, urină şi organe la cadavru, determinarea
şi dozarea toxicelor din corpuri delicte. Examenul
serologic al grupelor de sânge la persoana vie şi
cadavru. Pregătirea şi gestionarea reactivilor şi
instrumentelor de laborator.
1.11. 2005-
4.50.2009
Biolog Serviciul de
Medicină
Legală
Bacău
Determinarea şi dozarea toxicelor din sânge şi urină
la persoana vie, determinarea şi dozarea toxicelor
din sânge, urină şi organe la cadavru, determinarea
şi dozarea toxicelor din corpuri delicte. Responsabil
cu gestionarea deşeurilor chimice şi biologice
periculoase.
Page 48
48
PARTICIPAREA LA MANIFESTĂRI ŞTIINŢIFICE
26 –
28. 05.
2011
Congresul Naţional de Medicină Legală. Studiu privind concentraţia alcoolului
metilic din distilatele alcoolice naturale. Sesiune postere.
13 –
15. 05.
2011
„15th PanhellenicPharmaceutical Congress” Atena Grecia. Variations of metanol
concentration in natural distilates, determined through GC-MS. Sesiune postere.
16. 03.
2011
Seminar “Drogurile. Tendinţe, impacturi şi soluţii”. Universitatea “George Bacovia”
Bacău
18 –
20. 11.
2011
ECOLOGY AND PROTECTION OF ECOSYSTEMS THE 9 EDITION.
BIOLOGY AND SUSTAINABLE DEVELOPMENT INTERNATIONAL
SYMPOSIUM, Bacău. The determination of alcoholic content of distillates by gas
chromatography-mass spectrometry method. Sesiune postere.
9 – 12.
09.
2009
Simpozionul de Micologie din România, Iaşi
8- 11.
09.
2008
Simpozionul de Micologie din Romănia, Bacău
15. 05.
2008
Simpozionul „Biodiversitate şi Tinereţe” , Universitatea din Bacău, Facultatea de
Ştiinţe, Catedra de Biologie. Studiu retrospectiv privind intoxicaţiile letale cu
metanol în Judeţul Bacău. Articol prezentat.
20- 22.
05.
2008
Congresul Naţional de Medicină Legală. The lethal intoxication with methyl alcool
from Bacău district during the period 1994-2007. Articol prezentat.
11. 04.
2008
Simpozionul internaţional “Educaţie ecologică- educarea conştiinţelor”,
Inspectoratul Scolar al Judeţului Bacău. La limita dintre otravă şi medicament:
HELLEBORUS sp. Articol prezentat.
APARTENENŢA LA SOCIETĂŢI ŞTIINŢIFICE ŞI PROFESIONALE
Profesionale OBBCSSR
Ştiinţifice Societatea Micologică din România
ALTE MENŢIUNI
Lucrări publicate – 5 lucrari
Premii
15.05.2008 – Menţiune – pentru realizarea şi prezentarea lucrării ştiinţifice:
Studiu retrospectiv privind intoxicaţiile letale cu metanol în Judeţul Bacău. Simpozionul
„Biodiversitate şi Tinereţe”, Universitatea din Bacău, Facultatea de Ştiinţe, Catedra de
Biologie.