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1 - CONTAGEM DIRETA AO MICROSCPIO (Ref. 1) um mtodo rpido, mas a
preciso depende do tcnico e do nmero de contagens feitas. Pode ser
utilizado inclusive, quando h slidos em suspenso. Permite, tambm,
avaliar o nmero de clulas vivas e clulas no ativas, mediante o uso
de azul de metileno ou da tcnica da colorao diferencial. 1.1 -
EQUIPAMENTOS E MATERIAIS UTILIZADOS Microscpio Cmara de Neubauer e
lamnula Pipetas Pasteur Pipetas de 1 ml Bales de diluio Azul de
metileno 0,1 % (P/V)
1.2 - A CMARA DE NEUBAUER
Inicialmente era utilizada para a contagem de hemcias, da os
nomes hemacitmetro ou cmara hematimtrica. Consiste em uma placa de
vidro em cujo centro h dois campos escavados de igual profundidade.
Sobre estes campos colocada a lamnula, formando, ento, um
compartimento de volume conhecido, no qual introduzida a suspenso
celular. Macroscopicamente, a cmara apresenta o seguinte
aspecto:
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Cada campo formado por uma matriz de 5 x 5, conforme ilustrado
abaixo.
Ao visualizar em microscpio tico utilizando aumento de 400 vezes
pode ser observado a rea referente ao de um quadrado dos 25 que
compem ao volume total de 0,1 mm3. Na contagem, via de regra,
utiliza-se um mtodo estatstico, que consiste em contar os quadrados
assinalados. Sendo assim, faz-se necessrio adotar um critrio que
indique com clareza qual linha deve ser considerada para a
contagem. Um bom critrio considerar como pertencente ao quadrado de
linhas superior e lateral esquerda, conforme indicado na figura
seguinte.
Desta forma, so contadas as clulas que estejam sobre as linhas
indicadas. direita e abaixo no so contadas as clulas, conforme
ilustrado no exemplo a seguir.
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1.3 - METODOLOGIA EXPERIMENTAL A - Em balo de diluio de volume
apropriado, colocar gua destilada at a metade e adicionar azul de
metileno 0,1 % (P/V) na proporo de 5 ml para cada 100 ml de volume
total. B - Pipetar 1 ml de suspenso, completar o volume e
homogeneizar. C - Fixar a lamnula sobre o campo. D - Com o auxlio
de uma pipeta Pasteur, introduzir a suspenso diluda no
compartimento formado entre a lamnula e a cmara de Neubauer, de
modo que todo o campo seja preenchido.
E - Proceder contagem, utilizando aumento de 400 vezes e mdia
luminosidade.
Aconselha-se fazer, no mnimo, 4 contagens para cada amostra.
Para um bom resultado, a literatura recomenda que a diluio seja
feita, de modo que se tenha entre 40 e 60 clulas em cada um dos 25
quadrados.
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1.4 - CLCULOS Sejam: N: nmero de clulas em cada quadrado V:
volume de cada quadrado, V = 4 x 10-4 ml (Volume de 1/25 = 1 mm x 1
mm x 0,1 mm = 0,1 mm3 = 4 x 10-4 ml) N: mdia de clulas para cada
contagem Logo: 1 5 N = ------ Ni (eq. 3) 5 i=1 e N X = ------- x
fator de diluio x 25 (eq. 4) V X em nmero de clulas/ml calculada ao
efetuar a contagem de uma nica cmara de placa de Neubauer. Para n
contagens de cmaras ao microscpio calcular a mdia aritmtica, 1 n X
= ------ Xi (eq. 5) n i=1
Observao ao microscpio de levedura S. cerevisiae com aumento de
400x, para contagem de clulas em soluo aquosa de azul de
metileno
Referncia 1 - BSCS. US. Biological Science - Interaction of
Experiments and Ideas, 2nd. Ed., Englewood Cliffs, Prentice Hall,
London, 1970.