Universidade do Minho Escola de Ciências Nuno Miguel Araújo Gomes Construção de uma biblioteca de referência de DNA barcodes para Isópodes marinhos (Crustacea: Isopoda) de Portugal e da Macaronésia Tese de Mestrado Mestrado de Ecologia Trabalho efetuado sob a orientação do Professor Doutor Filipe Costa Outubro de 2014
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Construção de uma biblioteca de referência de DNA barcodes ... de Mestrado Nuno Gomes... · espécimes e sequências de DNA, e aos Doutores Ronaldo Sousa, Marina Cunha e Susana
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Universidade do Minho
Escola de Ciências
Nuno Miguel Araújo Gomes
Construção de uma biblioteca de referência de DNA
barcodes para Isópodes marinhos (Crustacea: Isopoda) de
Portugal e da Macaronésia
Tese de Mestrado
Mestrado de Ecologia
Trabalho efetuado sob a orientação do
Professor Doutor Filipe Costa
Outubro de 2014
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Agradecimentos
Gostaria agradecer ao meu orientador, Doutor Filipe Costa pela oportunidade de trabalho nas
áreas da taxonomia e DNA barcoding e pelo auxilio na elaboração desta tese.
Um agradecimento à Doutora Luísa Borges e à Mestre Sara Ferreira pelo ensino e iniciação no
trabalho laboratorial.
Gostaria também de agradecer aos colegas Marcos Teixeira, Jorge Lobo e Cláudia Hollatz pela
ajuda, companheirismo e pelo bom ambiente de trabalho.
Um agradecimento ao Pedro Vieira e ao Doutor Henrique Queiroga pela disponibilização de
espécimes e sequências de DNA, e aos Doutores Ronaldo Sousa, Marina Cunha e Susana
Carvalho pela disponibilização de material bibliográfico importantes para a realização desta tese.
Este trabalho foi financiado por Fundos FEDER através do Programa Operacional de Factores de
Competitividade - COMPETE e por Fundos Nacionais através da FCT "Fundação para a Ciência e
a Tecnologia (FCT)” / MEC no âmbito dos projetos FCOMP-01-0124-FEDER-015429 (ref. FCT:
PTDC/MAR/113435/2009) e PEst-OE/BIA/UI4050/2014.
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Construção de uma biblioteca de referência de DNA barcodes para Isópodes
marinhos (Crustacea Isopoda) de Portugal e da Macaronésia
Resumo
Apesar de a ordem Isopoda constituir um dos mais diversos grupos de crustáceos presentes em
vários habitats marinhos, o conhecimento sobre a sua biodiversidade ainda é insuficiente,
comprometendo o planeamento de estratégias de gestão de meios marinhos. A utilização de
bibliotecas de referência de DNA barcodes (sequências de DNA obtidas a partir da extremidade
5’ do gene mitocondrial da sub-unidade I do citocromo oxidase, COI-5P) para auxiliar a
identificação e a catalogação de macro invertebrados bentónicos marinhos tem contribuído para
a melhoria do conhecimento sobre a composição e distribuição espacial destas comunidades,
possibilitando o recurso a técnicas de sequenciação de segunda geração para agilização de
métodos de monitorização. Este estudo teve como objetivos: 1) a compilação e elaboração de
uma lista atualizada (“checklist”) de espécies de isópodes marinhos registados em Portugal
continental e nos arquipélagos dos Açores e Madeira; 2) contribuir para a construção de uma
biblioteca de DNA barcodes de isópodes marinhos das mesmas regiões. A elaboração da lista
resultou na compilação de 146 espécies registadas desde zonas de mar profundo a zonas
costeiras e estuarinas. Para a construção de uma biblioteca de referência de DNA barcodes de
isópodes foram identificados 250 espécimes e geradas 105 sequências, resultantes de
sequenciação bidirecional englobando 26 morfoespécies, distribuídas por 32 MOTU´s,
recolhidas em vários pontos do Atlântico Nordeste, maioritariamente ao longo da costa de
Portugal e da Galiza e nos arquipélagos dos Açores, Canárias e Madeira. Todos os espécimes
foram catalogados na base de dados BOLD, incluindo dados sobre identificação taxonómica,
dados de colheita e respetivas sequências e cromatogramas. De modo a garantir a qualidade
dos resultados foram compiladas 60 sequências publicadas para comparação e classificação
das sequências obtidas. As divergências intraespecíficas para os espécimes analisados variaram
entre os 0 e os 2,8%, com uma divergência interespecífica média de 29%, variando entre 12% e
59%, comprovando-se a capacidade de descriminação do fragmento COI-5P para as espécies de
isópodes em estudo. Foram encontradas 2 linhagens alopátricas de Campecopea lusitanica com
22% de divergência, e 3 linhagens de Dynamene edwardsi separadas entre a costa de Portugal e
os arquipélagos da Madeira e Canárias com divergências entre os 18% e 21%.
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Construction of a DNA barcode reference library for marine Isopods (Crustacea:
Isopoda) from Portugal and Macaronésia
Abstract
Although the order Isopoda constitutes one of the most diverse groups of crustaceans, ocurring
in a wide range of marine habitats and transition ecosystems, a rigorous and extensive
knowldege of its biodiversity has not been reached yet, which may compromise the informed
planning and management of the marine environment. The use of DNA barcodes (DNA
sequences from the 5´end of the mitochondrial gene cytochrome oxydase I, or COI-5P) reference
libraries to aid species identification and inventories of marine macroinvertebrates, has
contributed to an improved knowledge of the composition and distribution of these communities,
and enabled possible uses of second generation sequencing in in high-throughput monitoring
methods. The objectives of this study were: 1) the compilation of an updated checklist for marine
isopod species registed in Portuguese continental waters, and the archipelagos of Azores and
Madeira; 2) contribute to the construction of a reference library of DNA barcodes for marine
isopods from the same regions. The checklist compiles 146 species recorded in a variety of
habitats, from deep-sea to coastal, estuarine and lagunar systems. As for the construction of the
DNA barcode reference library we obtained 105 DNA sequences, resulting from bidirecional
sequencing, assigned to 26 morphospecies and distributed in 32 MOTU´s, from specimens
collected along the Northeast Atlantic, mostly along the coast of Portugal and Galiza and in the
archipelagos of Azores, Canary and Madeira. Specimens were cataloged in the BOLD database
with taxonomic information, collection data, and respective sequence and cromatograms. To
assure the quality of the obtained data, 60 published COI-5 sequences were mined to compare
and classify the sequences here generated. Intraspecific divergences ranged from 0 to 2,8% for
the analysed specimens, and mean interspecific divergence was 29%, (ranging from 12% to 59%),
globally confirming the species diagnosis ability of COI-5P barcodes for these isopod species. In
addition, we detected two alopatric lineages of Campecopea lusitanica with a divergence of 22%,
as well as three divergent lineages of Dynamene edwardsi which split among the west coast of
Portugal and the archipelagos of Madeira and Canaries with a divergence ranging between 18
and 21%. The analises of partial sequences from the nuclear gene 18s rRNA of lineage-
representative specimens of D. edwardsi confirmed the patterns observed with COI-5P.
Phoratopodidea, Sphaeromatidea e Valvifera. Os Isópodes são tipicamente achatados
dorsalmente, excetuando espécies da subordem Anthuroidea, apresentam o corpo dividido em
três partes: a cabeça (cephalon) com dois pares de antenas, um pereon (tórax) de sete
segmentos com sete pares de pereópodes, à excepção de espécies da família Gnathidae, e o
pleon (abdómen) formado por cinco segmentos, por vezes fundidos, e o pleotelson (Naylor,
1972). Espécies da subordem Epicaridea devido à sua natureza parasítica podem apresentar
perda de certas estruturas ou substituição por estruturas especializadas (Williams e Boyko,
2012).
Os isópodes como membros da superordem Peracarida não possuem fases larvares,
com a exceção de certos grupos de espécies parasitas (Williams e Boyko, 2012), passando
diretamente para uma fase juvenil denominada manca (Kavanagh, 2009). Tipicamente os ovos
são incubados num marsúpio ventral durante 1-2 meses dependendo da espécie (Naylor, 1972).
Durante as fases juvenis estes organismos desenvolvem o sétimo par de pereópodes e
dependendo da espécie podem adquirir dimorfismo sexual através de mudas sucessivas
(Naylor,1972). Os isópodes são crustáceos sem capacidade de nadar livremente, adotando por
isso um habitat bentónico (Naylor, 1972) possuindo baixa capacidade de dispersão, à exceção
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de fenómenos de deriva em algas, ou rafting (Franke et al., 1999), tornando os casos de
isolamento populacional bastante acentuados (Naylor, 1972).
As espécies pertencentes aos taxa Bopyroidea e Cryptoniscoidea são conhecidas como
parasitas de outros crustáceos, incluindo Isópodes (Naylor, 1972; Ramdane et al., 2007; Shields
e Gómez-Gutierrez, 1996; Williams e Boyko, 2012), existindo ainda espécies capazes de
endoparasitismo (Hosie,2008; Kuris et al., 2004; Kuris et al., 2005; Peresan e Roccatagliata,
2005). Espécies pertencentes aos taxa Cymothooidea, Aegidae e Gnathidae são ectoparasitas de
peixes (Williams e Boyko, 2012), no entanto, as espécies pertencentes à família Gnathidae,
apenas apresentam comportamentos de parasitismo durante a sua fase larvar, denominada
praniza (Smit e Davies, 2004).
1.2 Registo fóssil e classificação da ordem Isopoda
O primeiro registo fóssil, pertencente à espécie de Hesslerella shermani, subordem
Phreatoicidea, remonta ao carbonífero superior (Schram, 1970). Os primeiros registos de
parasitismo de decápodes por bopirídeos remontam ao período Jurássico (Markham, 1986).
Fósseis encontrados ao longo de vários pontos do mundo entre os períodos Jurássico e Plioceno
(Bowman, 1971; Feldmann, 2006; Feldmann, 2009; Guinot et al., 2005 Karasawa et al., 2008)
representam maioritariamente as subordens Cymothoida e Sphaeromatidea (Poore e Bruce,
2012). Embora seja aceite que a ordem Isopoda forma um grupo monofilético, as relações com
outros crustáceos peracarídeos permanecem conflituosas ou inconclusivas (Jenner et al., 2009;
Poore, 2005; Wilson, 2009). Alguns estudos cladísticos entre grupos desta ordem indicam as
subordens Phreatoicidea, Asellota e Oniscidea como os grupos mais primitivos da ordem
Isopoda (Brusca e Wilson, 1991; Wagele, 1989). Estudos moleculares apontam para uma
possível colonização de habitats de mar profundo por espécies da sub ordem Asellota a partir de
algumas migrações de águas pouco profundas, resultando na radiação de várias linhagens de
mar profundo (Luana et al., 2012; Raupach et al., 2009), a partir do princípio do período
Pérmico (Lins et al., 2012).
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1.3 Importância ecológica e impacto ambiental e económico
A ordem Isopoda é um dos taxa mais diversas (e.g. Carvalho et al., 2013; Cunha et al.,
1997; Cunha et al., 1999; Marques et al., 1994) entre todos os crustáceos descritos,
apresentando grande relevância para o funcionamento das comunidades marinhas devido à
grande diversidade de espécies e de nichos ecológicos que pode ocupar (Naylor, 1972; Poore e
Bruce, 2012), tendo grande importância na alimentação da fauna ictiológica (Pires, 1987) e
resiliência a fatores de stress (Bordalo et al., 2011; Prato et al., 2006), levando à possibilidade
de utilização de certas espécies de isópodes em ensaios de bioacumulação (Longo et al., 2013).
Contudo verifica-se também a existência de espécies classificadas como sensíveis nas listas de
espécies dos índices bióticos AMBI (Borja et al., 2000) e Bentix (Simboura e Zenetos, 2002),
como por exemplo as espécies pertencentes aos géneros Gnathia, Eurydice, Jaera e Cymodoce,
realçando a importância deste grupo de organismos em tarefas de monitorização e conservação
marinha.
Embora as populações nativas de Isópodes parasitas não possuam grande impacto
sobre as populações de espécies hospedeiras (Williams e Boyko, 2012), o parasitismo de
espécies de valor comercial produzidas em aquacultura pode levar ao descarte de peixe com
destino ao consumo público (Bharadhirajan et al., 2014; Nowak, 2007). No entanto, as espécies
parasitas invasoras têm um grande impacto sobre as espécies hospedeiras nativas (Dumbauld et
al., 2011). Nos Estados Unidos da América, Quénia e Tanzânia foram reportados casos de
erosão em mangais por ação do isópode perfurador Sphaeroma terebrans (Rehm, 1976;
Svavarsson et al., 2002). Outro grande impacto económico relaciona-se com isópodes
perfuradores de madeira do género Limnoria, causando danos em construções submersas e
embarcações de madeira (Bruce e Gordon, 2005; Menzies, 1957; Borges e Costa, 2014).
Devido à associação de limnorídeos a embarcações, este género encontra-se atualmente
distribuído por várias regiões (Cookson, 1991). Outras espécies invasoras registadas incluem
espécies como Cirolana harfordi, Paradella dianae e Paracerceis sculpta para a região da
Austrália (Poore e Storey, 1999), e a espécie Synidotea laticauda em Espanha (Cuesta et al.,
1996).
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1.4 Impedimento taxonómico e o uso de metodologias moleculares
As zonas Europeias de águas pouco profundas, como zonas de fácil acesso e perto dos
grandes centros urbanos, mantêm-se como habitats bem estudados, sendo os grandes desafios
na inventariação de espécies de isópodes, as zonas de difícil acesso como zonas de mar
profundo (Poore e Bruce, 2012), e os possíveis grandes complexos de espécies crípticas dentro
de certos géneros como Dynamene ou Cymodoce (Poore e Bruce, 2012).
Embora sejam um dos grupos mais abundantes de crustáceos peracarídeos, a
identificação de certos grupos de isópodes marinhos pode levantar dúvidas relacionadas com o
elevado dimorfismo sexual de certas espécies e falta de descrições de fêmeas ou machos
adultos e juvenis (Horton, 2000). No entanto o maior problema relacionado com a taxonomia de
isópodes marinhos prende-se com a fragmentação da informação e grandes assimetrias na
cobertura geográfica e a ausência de chaves de identificação completas, ou sem descrição de
caracteres morfológicos importantes (Horton, 2000).
A taxonomia como base de investigação ecológica são fundamentais para assegurar
resultados de qualidade e com relevância para efeitos de conservação (Bortolus, 1998). O uso
de metodologias de DNAbarcoding (Hebert et al., 2003) em ambientes marinhos pode levar a
um aumento do conhecimento sobre a biodiversidade refinando e acelerando processos de
identificação de espécies através da associação de um fragmento standardizado da região 5´ do
gene mitocondrial citocromo c oxidase I (COI-5P) a uma única espécie. A escolha do gene COI-
5P como código de barras de DNA para espécies animais, tem como bases a herança
uniparental, contrariamente a genes nucleares, a ausência de intrões e uma taxa evolutiva
superior comparada com outros genes (Radulovici et al., 2010), levando a um grande
espaçamento entre as distâncias genéticas intra e interespecíficas, denominado de barcoding
gap. No entanto o uso do gene COI pode apresentar falta de resolução em casos de hibridização,
espécies com divergência recente (Radulovici et al., 2010), ou casos de introgressão
mitocondrial (Kemppainen et al., 2009). O uso deste gene em DNA barcoding de organismos
marinhos tem revelado resolução suficiente para a descriminação de várias espécies de isópodes
(Costa et al., 2007; Radulovici et al., 2009; Xavier et al., 2012), bem como na diferenciação de
complexos de espécies crípticas, como por exemplo a presença de duas linhagens crípticas de
Ligia oceanica no Atlântico Europeu (Raupach et al., 2014), a descoberta de três linhagens de
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Excirolana brasiliensis na costa do Chile (Varela and Haye, 2012) e quatro linhagens do isópode
de mar profundo Chelator insignis na Islândia (Brix et al., 2014b), ou a presença de quinze
linhagens distintas de Ligia occidentalis no Pacífico, entre o sul da Califórnia e México (Markow e
Pfeiler, 2010), tendo-se demostrado também útil como ferramenta auxiliar para a descrição de
novas espécies (Brix et al., 2014a; Khalaji-Pirbalouty e Raupach, 2014). O uso do gene COI-5P
em estudos filogeográficos também pode fornecer dados importantes sobre a biologia de
organismos marinhos como a distribuição espacial da variabilidade genética de populações
(Raupach et al., 2014; Vagelli et al., 2009; Xavier et al., 2011), a conectividade e fluxo de genes
entre populações (Palero et al., 2008) ou a monitorização de invasões de espécies não
endémicas (Xavier et al., 2009).
O desconhecimento taxonómico pode resultar em identificações erradas de espécimes
levando por vezes a conclusões incorretas sobre a distribuição geográfica da espécie em questão
(Xavier et al., 2009), tornando fundamentais descrições de distribuição para fins de conservação
e investigação (Dormann, 2007). Uma das principais fontes de incerteza taxonómica deve-se à
parcialidade das identificações (Rocchini et al., 2011; Soberón e Peterson, 2004), no entanto
com o uso de metodologias de DNAbarcoding e com recurso a bibliotecas de referência de
qualidade, é possível diminuir esta imparcialidade. O uso de uma zona padronizada para
investigação torna também possível um aumento do valor comparativo entre diferentes estudos.
Deste modo, a construção de uma biblioteca de referência robusta possibilitará a identificação
de espécies invasoras (Saunders, 2009) ou de espécies de impacto económico (Borges et al.,
2012), e a aplicação de metodologias de meta barcoding de grande escala recorrendo a
sequenciação de segunda geração (Costa e Antunes, 2012), com possibilidade de uso de índices
de biodiversidade genéticos como por exemplo gAMBI (Aylagas et al., 2014).
1.5 Objetivos gerais
Com o intuito de melhorar o conhecimento da biodiversidade presente na costa de Portugal e
agilizar as tarefas de biomonitorização de macrobentos incluídas na Diretiva Quadro da Água
(Diretiva 2000/60/CE do Parlamento Europeu e do Conselho, de 23 de Outubro de 2000), é
proposto:
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- A atualização de uma checklist de espécies marinhas de isópodes compilando informação
fragmentada sobre a distribuição geográfica na costa Portuguesa (Capítulo 2).
- A iniciação da construção de uma biblioteca de referência de DNA barcodes para a ordem
Isopoda, para ser usada em investigação, conservação e tarefas de monitorização (Capítulo 3).
- A revisão do estatuto taxonómicos através do confronto entre as identificações baseadas na
morfologia e os DNA barcodes obtidos (Capítulo 3).
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Capítulo 2
Checklist de Isópodes marinhos
(Crustacea: Isopoda) para a costa de
Portugal continental, Açores e Madeira
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Capítulo 2
Checklist de Isópodes marinhos (Crustacea: Isopoda) para a costa
de Portugal continental, Açores e Madeira
2.1 Introdução
Os crustáceos marinhos da ordem Isopoda são um dos grupos mais abundantes de
peracarídeos, com uma grande variabilidade morfológica e ecológica. Embora sejam um grupo
abundante desde zonas estuarinas, intertidais e até zonas de mar profundo, o conhecimento
sobre estes organismos na costa de Portugal é sobretudo fornecido por trabalhos, em
comunidades de macrobentos (e.g. Cunha et al., 1997; Cunha et al., 1999; Marques et al.,
1982; Mucha et al., 2003; Reis et al., 1982; Sousa et al., 2006; Sousa et al., 2008),
fragmentados ao longo da costa e com maior incidência em zonas estuarinas.
A falta de conhecimento na taxonomia de certos tipos de organismos tem levado a um
desequilíbrio entre a quantidade de dados recentes e dados mais antigos, tornando a existência
de sinonímias elevada (Baselga et al., 2010), e a possibilidade de desvios nas distribuições
geográficas (Rocchini et al., 2011). Uma compilação de registos de ocorrência de isópodes
marinhos pode permitir um melhor mapeamento das distribuições geográficas, auxiliar a
identificação de certos organismos, bem como aumentar o conhecimento sobre um dos grupos
mais abundantes de macrobentos.
2.2 Metodologia
A elaboração da checklist de espécies marinhas de Isópodes presentes na costa
Portuguesa foi baseada em literatura científica, incluindo pesquisa em estudos de ecologia (e.g.
Cunha et al., 1999; Pereira et al., 2006), parasitologia (e.g. Hermida et al., 2012; Kuris et al.,
Regista-se também um elevado número de endemismos nos arquipélagos, com doze espécies
endémicas dos Açores e duas espécies endémicas da Madeira. Todos os valores de
profundidade foram registados entre os valores propostos em Schotte et al., (1995), contudo os
valores limite de profundidade para cada espécie poderão não ser os adequados para os
espécimes da costa Portuguesa, uma vez que esses dados foram compilados através de vários
registos em diferentes zonas de ocorrência numa escala mundial. Esta checklist vem acrescentar
às últimas checklists elaboradas para a Península Ibérica (Junoy e Castelló, 2003) e para a
Macaronésia (Castelló e Junoy, 2007), vinte e seis novos registos, sendo a maioria espécies
registadas em mar profundo com vinte e três espécies, dois novos registos de espécies parasitas
e um registo de uma espécie de águas pouco profundas.
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LCO1490 (Forward) GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG Folmer et al, 2004
HCO2198 (Reverse) TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA
LoboF1 (Forward) KBTCHACAAAYCAYAARGAYATHGG Lobo et al., 2013
LoboR1 (Reverse) TAAACYTCWGGRTGWCCRAARAAYCA
18sAi (Forward) CCTGAGAAACGGCTACCACATC Whiting et al., 2002
18sBi (Reverse) GAGTCTCGTTCGTTATCGGA
Tabela 2.3- Ciclos de temperatura utilizados nas reações de amplificação dos fragmentos de COI-5P e de 18s rRNA, em função do primer utilizado.
Ciclo de PCR utilizado Primer
1-Desnaturação a 94°C (60s) CrustDF1/
2- (5 Ciclos)- Desnaturação a 94°C (30s), hibridização a 45°C (90s) CrustDR1
e extensão a 72°C (60s) E
3- (35 Ciclos) Desnaturação a 94°C (30s), hibridização a 51°C (90s) HCO2198/
e extensão a 72°C (60s) LCO1490
4-Extensão final a 72°C (5min.)
1-Desnaturação a 94°C (60s) 2- (5 Ciclos) Desnaturação a 94°C (45s), hibridização a 56°C (45s) e extensão a 72°C (60s) LoboF1/
3- (45 Ciclos) Desnaturação a 94°C (30s), hibridização a 54°C (90s) LoboR1
e extensão a 72°C (60s)
4-Extensão final a 72°C (5min.)
1-Desnaturação a 94°C (180s) 2- (35 Ciclos) Desnaturação a 94°C (30s), hibridização a 45°C (90s) 18sAi/18sBi
e extensão a 72°C (60s) 4-Extensão final a 72°C (5min.)
56
3.2.4 Tratamento e análise de dados
Edição e alinhamento de sequências, e construção de árvores filogenéticas
Todas as sequências obtidas foram editadas com recurso ao software MEGA5 (Tamura
et al., 2011), consistindo na verificação dos cromatogramas, remoção de zonas ilegíveis e
primers correspondentes, e correção de bases ambíguas (N). As sequências editadas foram
alinhadas com recurso ao método Clustal W (Thompson et al., 1994) implementado no software
MEGA5, seguido de uma inspeção cuidadosa do alinhamento obtido para detetar a eventual
ocorrência de inserções e deleções, e após tradução foi verificada a presença de codões stop,
desvios na grelha de leitura ou padrões aminoacídicos anormais, seguindo as recomendações de
Song et al., (2008) para despistar de ocorrência de pseudogenes. O conjunto de resultados foi
submetido a uma busca de sequências homólogas na base de dados GenBank (Benson et al.,
2005), através da ferramenta BLAST (Altschul et al., 1990), e na base de dados BOLD
(Ratnasingham e Hebert, 2013). A escolha do melhor modelo de substituição para o conjunto de
dados foi efetuada através do software JModelTest (Darriba et al., 2012; Guindon e Gascuel,
2003) com um esquema de três substituições. A análise filogenética foi efetuada através dos
métodos Maximum Likelihood (ML) (Aldrich, 1997) e Inferência Bayesiana (IF) (Yang e Rannala,
1997) com o modelo de substituição General Time Reversible (GTR) +G+I (Tavaré, 1986),
sugerido na análise para escolha de modelos, e com o método Neighbour-Joining (NJ) (Saitou e
Nei, 1987), utilizando o modelo de substituição nucleotídica Kimura 2 parameter (K2P) (Kimura,
1980), como um dos métodos mais utilizados em estudos desta natureza. As análises ML e NJ
foram efetuadas através do software MEGA5 e a análise de inferência bayesiana efetuada com o
software MrBayes (Huelsenbeck e Ronquist, 2001). As árvores ML e NJ foram submetidas a 500
e 10000 bootstraps (Felsenstein, 1985), respetivamente, para determinar o grau de suporte dos
nós dos ramos. A construção de árvores por inferência bayesiana foi efetuada após análise de
720000 gerações, com uma frequência de amostragem de 500 gerações através de 4 cadeias
com uma temperatura de 0,1 e com um descarte de 25% da análise inicial. Todos os priors
foram mantidos em default. A construção da visualização da árvore foi efetuada com o software
FigTree. A construção das árvores filogenéticas foi ainda efetuado sem adição de outgroups
externos de modo a evitar fenómenos de long-branch attraction (Bergsten, 2005), resultados da
aproximação de ramos longos e distintos por artefactos metodológicos.
57
Delimitação de MOTUs
De modo a delinear espécies putativas, cada cluster monofilético com divergência
interna inferior a 3% foi designado uma unidade taxonómica molecular operacional (MOTU)
(Blaxter et al,, 2005), deste modo expondo possíveis espécies crípticas e diminuindo os impactos
de sinonímia (Kekkonen e Hebert, 2014). Este valor foi escolhido como aproximação aos limites
intraespecíficos com base em dados publicados para crustáceos (Costa et al., 2007; Lefébure et
al., 2006; Radulovici et al., 2009). O valor de 3% tem um carácter unicamente indicativo, não
devendo ser considerado como um limite taxativo na delimitação de espécies. O cálculo das
distâncias inter e intraespecíficas foram efetuadas com o software MEGA5, através do modelo de
substituição nucleotídica K2P.
Classificação dos DNA barcodes da biblioteca de referência
De modo a atribuir um grau de fiabilidade das identificações dos espécimes analisados
foi usado o sistema de classificação proposto em Costa et al., 2012 (Tab. 2.4), com o uso das
sequências compiladas em bases de dados públicas. Dada a impossibilidade de verificar as
identificações das sequências compiladas, MOTU´s que compreendam exclusivamente estas
sequências não foram incluídos nas análises de classificação bem como no cálculo de distâncias
intraspecíficas.
Tabela 2.4- Sistema de classificação dos DNA barcodes da biblioteca de referência baseado em Costa et al., (2012)
Grau de fiabilidade taxonómica
Descrição
Nível A Concordância externa - as sequências formam um grupo monofilético com divergência interna ≤ 3% em conjunto com sequências da mesma espécie compiladas de bases de dados públicas
Nível B Concordância interna- as sequências formam um grupo monofilético com divergência interna ≤ 3% em conjunto com as da mesma espécie da biblioteca de referência
Nível C
Concordância sub-óptima- as sequências formam um grupo monofilético com divergência interna superior 3% em conjunto com sequências da mesma espécie, quer sejam de bases de dados públicas quer da biblioteca de referência
Nível D Dados insuficientes- número de espécimes analisados insuficiente (<3) Nível E DNA barcodes discordantes- cluster formado por diferentes espécies
58
Teste de saturação de substituição nucleotídica e reconstrução de filogenias profundas
Para determinar a fiabilidade do sinal nucleotídico na reconstrução de filogenias
profundas, devido à grande variabilidade e redundância associadas à terceira posição de cada
codão, foram realizados testes de saturação de substituição nucleotídica (Xia e Lemey, 2009)
com o software DAMBE (Xia et al., 2000), através do teste Xia et al. (2003), para todas as
posições do codão e para a primeira e segunda posição em conjunto. Estes valores de saturação
são calculados através das frequências de nucleótidos em cada posição. De modo a ultrapassar
a limitação do software na análise de um máximo de 32 MOTU´s foram usados nos cálculos de
saturação 10000 subsets para maximizar o número de combinações. De modo a diluir o efeito
de zonas extremamente divergentes, o conjunto de dados foi submetido a uma redução do
alinhamento para apenas uma zona central do alinhamento relativamente conservada com 265
pares de bases com o sotware Gblocks (Castresana, 2000). Para a reconstrução de filogenias
profundas foram feitas as seguintes árvores: NJ apenas com a primeira e segunda posição do
codão com o modelo de substituição nucleotídico K2P e 10000 bootstraps; e NJ com o modelo
de substituição aminoacídica Jones Taylor Thornton (JTT) (Jones et al., 1992) e 1000 bootstraps
para todo o alinhamento e para o alinhamento conservado obtido por Gblocks; ML com a
primeira e segunda posição do codão com o modelo GTR+G+I e 500 bootstraps (Tab. 2.5). O
modelo de substituição aminoacídica JTT sendo o modelo mais actualizado entre os disponíveis
no programa MEGA5.0.
Tabela 2.5- Diferentes métodos e parâmetros utilizados para a análise de filogenias profundas, com base nas sequências de COI-5P de 165 espécimes
Método de reconstrução
Tipo de sequência
Modelo de substituição
Nº de bootstraps
Posição do codão utilizada
Outros parâmetros
Neighbour-Joining Amino-acídica JTT 1000
Neighbour-Joining Amino-acídica JTT 1000
Redução com GBlocks
Neighbour-Joining Nucleotídica K2P 10000 1+2
Maximum-Likelihood Nucleotídica GTR+G+I 500 1+2
59
3.3 Resultados
3.3.1 Construção e classificação da biblioteca de referência
Dos 250 espécimes analisados, foram obtidas 105 sequências de COI-5P, e usadas na
construção de cladogramas (Fig. 1.2; Fig 2.1, 2.2 e 2.3 em Anexo) conjuntamente com 60
sequências compiladas das bases de dados GenBank e BOLD, distribuindo-se por um total 30
espécies (Tab. 3.2 e 3.3 em Anexo). Nas sequências Idotea emarginata AF241933, Idotea
baltica AF241916 e AF241889, Idotea metallica AF241928 e Idotea granulosa AF241935
(Wares e Cunningham, 2001), recolhidas do GenBank detectou-se uma zona na extremidade 5’
(posição 34 a 44 do nosso alinhamento) contendo uma sequência amino-acídica (com cerca de
8-9 aminoácidos) anormalmente diferenciada das restantes, apesar de se encontrar numa zona
extremamente conservada, presente em todos os isópodes deste estudo. Por se tratar de um
conjunto de sequências de um mesmo estudo suspeita-se de alguma incorrecção comum, pelo
que se decidiu remover a zona inicial destas sequências. Após classificar as sequências obtidas
(Tab. 2.6) verifica-se uma falta de dados de COI-5P com uma grande incidência de espécies sem
DNA barcode de referência. Das 105 sequências obtidas para 26 espécies analisadas foram
encontrados 32 MOTU´s, apresentando uma divergência intraespecífica entre 0 e 2,8% e uma
divergência interespecífica média de 29% com um valor mínimo de 12% e com um valor máximo
de 59%. Os maiores valores de distâncias interespecíficas são obtidos em espécimes da família
Anthuridae, sendo o grupo mais divergente entre todos os espécimes analisados. Os valores de
distância congenéricos envolvendo sequências geradas e compiladas para 7 géneros
representados por 35 espécies, incluindo linhagens divergentes, variam entre os 5% e os 29%
(Tab. 2.7).
60
Figura 1.2- Árvore NJ compactada obtida pela análise de 165 sequências de COI-5P de isópodes marinhos com recurso ao modelo K2P. Junto a cada nó é apresentado o repespectivo grau de suporte obtido por análise bootstrap a partir de 10000 réplicas.
Tabela 2.6- Classificação dos MOTU´s obtidos baseada em Costa et al., 2012 e respetiva distância interna e desvio padrão, calculados com o modelo K2P.
Espécie Classificação Divergência interna (K2P) ± d.p.
Anthuridae não identificado D 0,006 ± 0,003 Anthura gracilis D Sequência única Astacilla danmonensis D Sequência única Campecopea hirsuta B 0,0005 ± 0,0004 Campecopea lusitanica C 0,12 ± 0,01 Cleantis prismatica D 0,13 ± 0,017 Cyathura carinata B 0,01 ± 0,003 Cymodoce emarginata D Sequência única Cymodoce sp. D Sequência única Cymodoce sp. D 0 ± 0 Dynamene bidentata B 0,002 ± 0,0007 Dynamene magnitorata B 0,01 ± 0,002 Dynamene edwardsi C 0,104 ± 0,008 Eurydice spinigera D 0,003 ± 0,002 Idotea balthica A 0,025 ± 0,004 Idotea chelipes C 0,068 ± 0,008 Idotea granulosa A 0,005 ± 0,001 Idotea neglecta B 0,009 ± 0,002 Idotea pelagica A 0,005 ± 0,001
Ischyromene lacazei B 0,009 ± 0,002 Jaera albifrons A 0,012 ± 0,003 Lekanesphaera terceirae D 0,024 ± 0,007 Lekanesphaera hookeri A 0,028 ± 0,005 Sphaeroma serratum D 0,058 ± 0,009 Sphaeromatidae sp. B 0,001 ± 0,001 Stenosoma lancifer A 0,002 ± 0,001
Tabela 2.7- Distâncias nucleotídicas congenéricas para 7 géneros de isópodes, determinadas a partir de sequências de COI-5P e calculadas com o modelo de sustituição K2P
Género Taxa Distância congenérica mínima (K2P) Distância congenérica máxima (K2P)
Os espécimes identificados como Dynamene edwardsi, com identificação confirmada
pelo Doutor David Holdich, especialista taxonómico neste género, apresentam três linhagens
distintas: uma linhagem para o sul de Portugal, uma para Gran Canária e uma linhagem
partilhada para a Madeira e La Palma (Fig. 3), aqui considerada apenas uma MOTU pelo facto
de a distância entre espécimes dos dois locais não ultrapassar 3%. As linhagens de Portugal e o
grupo Madeira\La Palma distanciam-se em média 21%, as linhagens de Portugal e Gran Canária
22%, e entre Gran Canária e o grupo Madeira\La Palma distanciam-se 16%. A divergência entre
as duas grandes linhagens presentes nos arquipélagos é confirmada com o marcador molecular
18s rRNA (Fig.4), com 0,3% de divergência entre as linhagens de Gran Canária e de Madeira\La
Palma, e sem partilha de haplótipos entre grupos.
Figura 1.3- Árvore NJ obtida pela análise de sequências de COI-5P da espécie Dynamene edwardsi com recurso ao modelo K2P. Junto a cada nó é apresentado o repespectivo grau de suporte obtido por análise bootstrap a partir de 10000 réplicas.
63
Figura 1.4- Árvore NJ obtida pela análise de sequências de 18s rRNA da espécie Dynamene edwardsi, separando
a linhagem de Gran Canária (CAL7-001, TAL8-001)) do grupo Madeira\La Palma (restantes sequências de D.
edwardsi). A análise foi efetuada com recurso ao modelo K2P. Junto a cada nó é apresentado o respectivo grau de
suporte obtido por análise bootstrap a partir de 10000 réplicas.
3.3.3 Saturação de substituição nucleotídica
Quando testada a saturação para todas as posições do codão, a saturação obtida é
superior à saturação esperada para uma topologia assimétrica (Tab. 2.8). Quando a terceira
posição do codão é retirada para o cálculo da saturação verifica-se um aumento de posições
invariáveis bem como uma diminuição significativa da saturação obtida para topologias
assimétricas (Tab.2.8). Devido ao desconhecimento da verdadeira topologia de uma árvore
filogenética, é seguro assumir que o modelo mais adequado para reconstruir filogenias
profundas com sequências de COI-5P, deverá usar apenas a primeira e segunda posição do
codão, permitindo assim o uso de modelos de substituição nucleotídica para reconstrução
filogenética.
Tabela 2.8- Resultados do teste de saturação de substituição nucleotídica (Iss- Saturação esperada; Issc- Saturação obtida para topologias simétricas- Sym e assimétricas- Asym; P- Valor de probabilidade)
Posições do codão usadas Iss Iss.cSym P Iss.cAsym P
Com o uso de vários métodos de reconstrução e modelos de substituição, o
agrupamento entre os vários organismos mantem-se semelhante (Fig. 1.5), embora certos
clusters variem a sua posição nas várias análises, nomeadamente as espécies Idotea chelipes,
Ischyromene lacazei, Campecopea lusitanica, Campecopea hirsuta, Eurydice spinigera e o
espécime Saduria entomon DQ889111 (Costa et al., 2007), compilado da base de dados
GenBank. De entre todas as sub-ordens analisadas, apenas espécimes pertencentes à sub-
ordem Anthuridea apresentam uma relação monofilética.
Figura 1.5- Árvores radiadas contendo as sub-ordens Sphaeromatidea (verde), Valvifera (vermelho), Asellota (amarelo), Anthuridea (azul) e Flabillifera (roxo). A- NJ com modelo JTT; B- NJ após redução com Gblocks e com modelo JTT; C- NJ com 1ª e 2ª posição do codão e modelo K2P; D- ML com a 1ª e 2ª posição do codâo e com o modelo GTR+G+I
65
3.4 Discussão
3.4.1 Construção da biblioteca de referência
Em todas os tipos de árvores analisadas é formado um igual número de MOTU´s, 32
para 26 espécies, sem ocorrência de polifilias, embora existam casos formação clades
separados para a mesma espécie como nos casos de Dynamene edwardsi e Campecopea
lusitanica. A distância interespecífica mínima de 12% é bastante superior à distância
intraespecífica máxima de 2,8% denotando-se a existência de um barcoding gap para a maioria
das espécies identificadas. As maiores distâncias interespecíficas são apresentadas por
espécimes pertencentes à família Anthuridae, sendo um grupo extremamente divergente em
termos nucleotídicos e morfológicos em relação às restantes famílias da sub-ordem Isopoda. É
de notar o estado incipiente das bases de dados de sequências de COI para espécimes da
ordem Isopoda no Atlântico Nordeste, tendo sido obtidas pela primeira vez 15 sequências de
espécies relativamente comuns em vários pontos das costas Europeias. Dos 250 espécimes
analisados foram obtidas 105 sequências para 26 espécies, tendo falhado a amplificação de 1
espécime de Stenosoma acuminatum e vários espécimes de Lekanesphaera e Cymodoce
apenas identificados até ao género. Relativamente as sequências compiladas no GenBank
também é possível verificar a capacidade de discriminação para a maioria das espécies de
isópodes compiladas, contudo o número de sequências únicas é bastante elevado
3.4.2 Classificação da biblioteca de referência
Na construção da biblioteca de referência notou-se uma maior incidência de espécimes
classificados com o nível B, não havendo sequências publicadas para a maioria das espécies
analisadas, sendo as únicas identificações taxonómicas classificadas com o nível A, pertencentes
às espécies Stenosoma lancifer, Jaera albifrons e Idotea balthica Como característico dos
peracarídeos, os isópodes carecem de fase larvar e, em consequência apresentam populações
potencialmente mais isoladas e com menor fluxo genético entre si. No entanto, existem casos
como a espécie Idotea balthica com espécimes amostrados nos lados Europeu e Norte-
americano do Atlântico que apresentam divergências dentro dos limites habituais. Embora a
espécie Idotea balthica seja uma espécie capaz de apresentar comportamentos migratórios de
grandes distâncias por rafting, o mesmo não acontece com a espécie Jaera albifrons que
66
também apresenta uma divergência dentro dos limites para espécimes de Portugal e do Canadá.
O espécime marcado na árvore como Cyathura sp. AF520440 (Haye et al., 2004) foi
considerado como um possível erro na submissão da sequência ao GenBank ou um erro de
identificação, uma vez que esta sequência não agrupou com a família Anthuridae que forma um
grupo monofilético extremamente divergente, tendo sido usado nos cálculos de divergência
interna para o MOTU de Jaera albifrons. Os espécimes identificados como Idotea chelipes,
classificados com o nível C, apresentam uma distância interna de 7%, existindo a possibilidade
de os dados recolhidos para esta espécie poderem incluir as três sub-espécies descritas, Idotea
chelipes chelipes para águas Atlânticas, Idotea chelipes mediterranea e Idotea chelipes bocqueti
para águas Mediterrânicas, que segundo Charfi-Cheikhrouha et al. (1998) apresentam um
padrão de divergência semelhante na análise de aloenzimas. No entanto foi confirmado nesse
mesmo estudo que estes espécimes de diferentes sub-espécies apresentam descendências
viáveis após realização de cruzamentos. Os espécimes Cymodoce PEN5-002, PEN19-001 e
BUA21-1 não foram identificados até à espécie, uma vez que ainda se apresentavam num
estado juvenil.
3.4.3 Possíveis complexos de linhagens crípticas
Quanto aos espécimes identificados como Cleantis prismática, embora estes
apresentem uma divergência interna de 13% podendo indicar a presença de duas linhagens
distintas, o baixo número de amostras não permite realizar inferências mais conclusivas, sendo
uma das sequências obtida no GenBank e recolhida na Corunha (Xavier et al, 2012) e outra
amostrada em Viana do Castelo. O mesmo acontece com o espécime identificado como
Sphaeroma serratum apresentando uma divergência interna de 6% entre um espécime
amostrado em Viana do Castelo e uma sequência compilada no GenBank sem referência a local
de recolha. Nos casos dos espécimes identificados como Campecopea lusitanica observou-se
uma divergência de 22% entre espécimes recolhidos em águas continentais (Portugal e Galiza) e
espécimes recolhidos em Porto Santo (Madeira), indicando a existência possível de duas
linhagens distintas. Morfologicamente estes espécimes parecem coincidir com os morfotipos A e
B descritos em Bruce e Holdich (2002), com o morfotipo A aproximando-se dos espécimes
recolhidos no continente e o morfotipo B dos espécimes de Porto Santo. Os valores de
divergência encontrados para as três linhagens de Dynamene edwardsi são semelhantes a
67
valores de outras linhagens crípticas encontrados nas espécies Ligia occidentalis com uma gama
de divergência entre as 15 linhagens encontradas de 13,2% a 26,7% (Markow e Pfeiler, 2010) e
Excirolana brasiliensis com 3 linhagens de divergência entre os 14% e 19% (Varela e Haye,
2012). Com a análise das sequências de 18s rRNA existem apenas 3 nucleótidos de diferença
entre as linhagens de Gran Canária e do grupo Madeira/ La Palma, não havendo contudo
qualquer distinção entre sequências de espécimes de La Palma e Madeira, neste último caso em
contraste com se observou com COI-5P, apesar de a distância não ser pronunciada (<3%).
3.4.4 Reconstrução filogenética
Com o uso do marcador genético COI-5P desenhado especificamente para diferenciação
entre espécies, a falta de resolução para filogenias profundas torna-se evidente na visualização
das árvores construídas. Contudo com o uso de diferentes métodos na reconstrução é possível
obter um sinal filogenético fiável (Fig. 1.5). É de notar que embora em nenhuma das análises as
sub-ordens analisadas apresentem monofilia, à exceção da sub-ordem Anthuridea (Fig. 1.5), a
grande maioria dos espécimes agrupam na respetiva sub-ordem. Existem também ramos
problemáticos que variam a sua posição dependendo do tipo de análise utilizada,
nomeadamente as espécies Idotea chelipes, Ischyromene lacazei, Campecopea lusitanica,
Campecopea hirsuta e Eurydice spinigera, podendo agrupar em certos modelos na respetiva
sub-ordem. Embora o conjunto de dados não seja suficientemente representativo para uma
análise robusta é evidente uma possível relação entre as sub-ordens Valvifera e Sphaeromatidea
(Fig. 4) indo ao encontro com outros dados publicados em filogenia de isópodes (Brandt e Poore,
2003) incluindo dados com o marcador molecular 18s rRNA (Wetzer et al, 2013). Com o
aumento do número de sequências de COI-5P disponíveis e com um uso direcionado de
diferentes ferramentas, modelos, e métodos de construção de árvores filogenéticas, a
quantidade e qualidade de informação que é possível obter pode aumentar consideravelmente.
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73
Capítulo 4
Considerações finais
74
Capítulo 4
Considerações finais
A proteção da fauna marinha Ibérica é essencial sendo a biodiversidade em espécies de
Isópodes uma das maiores e uma parte importante das comunidades de invertebrados
bentónicos marinhos, com elevados graus de endemismo para as zonas dos Açores e Madeira. A
elaboração da biblioteca de referência contribuiu para a obtenção de DNA barcodes para 26
espécies, das 146 espécies compiladas na checklist, com a possível adição de um novo registo
para a espécie Cymodoce emarginata cuja identificação requer confirmação. Foi confirmada
também a capacidade de discriminação de espécies da ordem Isopoda a partir de sequências de
COI-5P, observando-se o agrupamento das espécies em clados monofiléticos para a maioria dos
espécimes analisados A deteção de 3 linhagens com elevada divergência e geograficamente
delimitadas do morfotípo Dynamene edwardsi na Macaronésia e na costa sul de Portugal sugere
a existência de um complexo de espécies crípticas, evidenciadas por sequências de genes
mitoncondriais e nucleares. A clarificação deste complexo requer o alargamento de amostragem
de modo a incluir espécimes de outras ilhas dos arquipélagos da Madeira e Canárias, bem como
espécimes de populações Mediterrânicas. A divergência entre linhagens continentais e linhagens
presentes nos arquipélagos é também evidenciada pela divergência encontrada entre duas
linhagens de Campecopea lusitanica podendo indicar isolamento por distância entre as ilhas e o
continente. De modo a completar a biblioteca de referência de DNA barcodes para a ordem
Isopoda será necessário um alargamento das redes de amostragem, de modo a obter espécimes
de várias gamas de profundidade bem como aumentar os tipos de habitat amostrados. Para
além da grande biodiversidade de Isópodes presente na costa Portuguesa foi verificada a
importância da conservação deste grupo devido ao grande pool de biodiversidade genética
presente em espécimes Ibéricos, sendo este pool de importância vital para a sobrevivência e
manutenção a longo prazo para estas espécies com baixa capacidade de dispersão. A crescente
construção de bibliotecas de referência de sequências de COI-5P e uso de diferentes
metodologias de análise de sequências e construção de árvores filogenéticas, com possibilidade
de utilização de dados de sequências públicas, permite analisar a diversidade genética e história
evolutiva de populações em grande escala.
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Anexos
Tabela 3.1- Lista de sinónimos para as espécies de isópodes compiladas na checklist, segundo a base de dados WORMS.
Lekanesphaera terceirae NGIM24-003 Açores LCO1490/HCO2198 Lekanesphaera hookeri NGIM13-001 Rio Minho Lobo F1/Lobo R1 Lekanesphaera hookeri NGIM13-004 Rio Minho LCO1490/HCO2198 Lekanesphaera hookeri NGIM13-005 Rio Minho Lobo F1/Lobo R1 Lekanesphaera hookeri NGIM13-006 Rio Minho LCO1490/HCO2198 Stenosoma lancifer BUA7-001 Figueira da Foz LCO1490/HCO2198 Stenosoma lancifer BUA7-003 Figueira da Foz LCO1490/HCO2198
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Figura 2.1- Árvore NJ obtida pela análise de 165 sequências de COI-5P de isópodes com recurso ao modelo K2P. Junto a cada nó é apresentado o repespectivo grau de suporte obtido por análise bootstrap a partir de 10000 réplicas.
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Figura 2.2- Árvore ML obtida pela análise de 165 sequências de COI-5P de isópodes com recurso ao modelo GTR+G+I. Junto a cada nó é apresentado o repespectivo grau de suporte obtido por análise bootstrap a partir de 500 réplicas.
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Figura 2.3- Árvore IF obtida pela análise de 165 sequências de COI-5P de isópodes com recurso ao modelo GTR+G+I.