CONNEXIN 43: DEN NYE BESLUTNINGSTAGER I … · konkomitant kemoterapi i 6 uger. Stråleområdet defineres efter en postoperativ MR-scanning og tillægges en margin på 2 cm, for så

KatrineMarieThygesenKandidatspecialeiKliniskVidenskabogTeknologi

AalborgUniversitet

CONNEXIN43:DENNYEBESLUTNINGSTAGERIBEHANDLINGENAFGBM-PATIENTER?

2

Titel:Connexin43:DennyebeslutningstageribehandlingenafGBM-patienter

Tema:SpecialeiKliniskVidenskabogTeknologiProjektperiode:1/2-1/62016 Abstract Projektgruppe:16gr10509Deltagere:KatrineMarieThygesen(studienr:20140839)

Vejleder:ParisaGazeraniBivejledere:JeppeNørgaardPoulsenJohannMarGudbergsson

Anslaginkl.mellemrum:78.828Sideantal:42Appendixsantal:5Bilagsantal:2Afsluttetden:1.juni2016Keywords:Connexin43,glioblastoma,biomarker,therapeuticresistance,realtimepolymerasechainreaction,immunofluorescensstaining,dotblotRapportensindholderfrittilgængeligt,menoffentliggørelse(medkildeangivelse)måkunskeefteraftalemedforfatterne.

Introduction:Theprognosisforglioblastoma(GBM)patientsispoorandtheriskofrecurrenceinpatientsisinevitabledespiteradiotherapyandadjuvantchemotherapy.TherapeuticresistanceisproposedtobeduetothepresenceofcancerstemcellsinGBM.Evidencesuggeststhatanincreaseingapjunctionproteinconnexin43(Cx43)expressionisrelatedtoanincreaseintherapeuticresistance.However,itisnotwellunderstoodyetwhetherandhowCx43mayplayakeyroleinoccurrenceoftherapeuticresistance.Hence,theaimofthisstudywastoinvestigateifCx43isexpressedinthecelllinesofU87MGandC16,andtoassessifCx43-expressioncanbeusedasabiomarkerasapotentialforthetherapeuticresistanceinGBMpatients.Method:ThepresenceofCx43inthecelllinesofU87MGandC16wasanalyzedbyreal-timePCR(RT-PCR)ofCx43-cDNA.Cx43-proteinexpressionandlocalizationwereanalyzedbyimmunofluorescencestainingandproteinexpressionwasverifiedbydotblot.Results:RT-PCRshowedtheexpressionofCx43inU87MG-cells,butnoexpressionwasfoundinC16-cells,whichwassimilartonegativeoutcomefromimmunofluorescencestaininganddotblotduetohighbackgroundnoise.LocalizationofCx43-proteincouldnotbeidentifiedinthesecelllines.Conclusion:ExpressionofCx43wasdemonstratedintheU87MGcellline,butnotinC16.FurtherexperimentsareneededtounderstandpresenceandroleofCx43inGBMandtherapeuticresistance,whichinturnwouldidentifyifCx43canbeusedasapotentialbiomarkertoassistinpatients’stratificationandplanningofindividualtreatmentsinthefuture.

3

ForordProjektrapportenerudarbejdetafKatrineMarieThygesen,specialestuderendeiKliniskVidenskabogTeknologi.Sigtetforsemestreterblandtandetatopnåfærdighediattilrettelæggeoggennemføreetprojektmedfokuspåimplementering,evalueringellervurderingafteknologianvendelseiforholdtiletableretkliniskviden.Formåletmedprojekteteratundersøgetilstedeværelsenafconnexin43itocellelinjerogvurderedensrelevanssombiomarkørfordenterapeutiskeresistensvedglioblastom.Idenforbindelseerderblevetanvendtcellelinjer,reagenserogudstyr,venligststillettilrådighedafafdelingenforBiomedicinvedAalborgUniversitet,somjeggerneviltakkefor.EndvidereviljegtakkeminevejledereParisaGazerani,JeppeNørgaardPoulsenogJohannMarGudbergssonforderesvejledningiprojektetogilaboratoriet.AalborgUniversitet,juni2016

4

LæsevejledningIrapportenerappendixogbilagfortløbendenummereret.Appendixermaterialeudarbejdetafforfatterenogbilagerindlægssedlermedprotokollerfraanvendteanalysekit.Henvisningtildisseskervedatmaterialetypenangivesefterfulgtafnummer,ex.appendix1.Vedanvendelseafforkortelsererdisseangivetiparentesførstegangdenoptræderefterdetfuldtudskrevneord.Pånæstesideerderenfuldoversigtoveranvendteforkortelseridetteprojekt.SomreferencesystemanvendesHarvardogderkildehenvisesitekstenpåfølgendemåde:ex.(Osswaldetal.2015).Vedhenvisningtilindholdiénsætningindsætteskildenførpunktumogvedhenvisningtilindholdifleresætningerindsætteskildenefterdensidstesætningefterpunktum.

5

ForkortelserATP:adenosintriphosphatBDWG:BiomarkersDefinitionWorkingGroupbp:baseparBSA:bovineserumalbuminCCN3:NOV(nephroblastomoverudtrykt)-proteincDNA:kopi-deoxyribonukleinsyreCNS:centralnervesystemetCSC:cancerstamcellerCTRL:kontrolCx43:connexin43DMEM:Dulbecco’smodifikationafEagle’sMediumdATP:deoxyadenosintriphosphatdCTP:deoxycytidintriphosphatdGTP:deoxyguanosintriphosphatdNTP:deoxynukleotidtriphosphatdTTP:deoxytymidintriphosphatEGF:epidermalvækstfaktorFCS:føtalkalveserumFDA:USFoodandDrugAdministrationGAPDH:glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenaseGBM:glioblastomGEN:gentamycinGJ:gapjunktionGLP:GoodLaboratoryPracticeIgG:immunglobulinGMgCl2:magnesiumcloridMGMT:O6-methylguanin-DNA-methyltransferasemRNA:messenger-ribonukleinsyreNEG:negativPBS:phosphatbufferedsaltvandPS:performancestatus

6

P/S:penicillin/steptomycinRIPA-buffer:radioimmunoprecipitationassaybufferRT-PCR:realtime-polymerasekædereaktionSAP:saponinSOP:StandardOperatingProcedureTCGA:TheCancerGenomeAtlasT/E:trypsin/EDTATm:smeltetemperaturTMZ:temozolomid

Tabel-ogskemaoversigtTabel1:IncidensrateforEuropaTabel2:EksempelpåenbloksøgningTabel3:OversigtoveropnåedekoncentrationerafmRNA-templateTabel4:OversigtoverblandingsforholdafbestanddelenetilcDNA-syntesenTabel5:OversigtovermængdeafmRNA-templateogtilførtnukleasefritvandtilhvercDNAsyntese-reaktionTabel6:Inkuberingstiderog–temperaturertiliScriptTMcDNASynthesisKittet.Tabel7:PrimerspecifikationerforCx43ogGAPDH.Tabel8:TemperaturerogtidfortrinihverPCR-cyklus.Tabel9:SkematiskangivelseafantaldotssatpånitrocellulosemembranenTabel10:BiomarkersDefinitionWorkingGroup,definitionerpåhhv.enbiomarkørogetkliniskendpointSkema1:ProcessoverlitteraturgennemgangSkema2:Fordelingafcellelinjeri24-brøndspladetilimmunfluorescensfarvning

BilledeoversigtBillede1:CellelinjeU87MGBillede2:CellelinjeC16Billede3:GelindeholdendeRT-PCR-produktfraU87MG-cellelinjen

7

Billede4:GelindeholdendeRT-PCR-produktfraC16-cellelinjenBillede5:ImmunfluorescensfarvningafU87MG-celler Billede6:ImmunfluorescensfarvningafC16-cellerBillede7:DotblotoverCx43-proteiniU87MG-ogC16-cellelinjerne

AppendixoversigtAppendix1:UdregningafcellekoncentrationtiludsåningAppendix2:ViabilitetstestAppendix3:RT-PCRtestkørslerAppendix4:FremgangsmådeforEGF-stimuleringogfikseringogimmunfluorescensfarvningAppendix5:Fremgangsmådenforudførelseafdotblot

BilagsoversigtBilag1:AurumTMTotalRNAMiniKit(Bio-rad)protokolBilag2:iScriptTMcDNASynthesisKit(Bio-Rad)protokol

8

Indholdsfortegnelse1.Indledning.................................................................................................................................................92.Problemanalyse....................................................................................................................................102.1Incidens............................................................................................................................................................102.2Klassificering..................................................................................................................................................102.3Mortalitet.........................................................................................................................................................112.4Behandling......................................................................................................................................................112.5Terapeutiskresistens..................................................................................................................................122.6TerapeutiskresistensvedCx43...............................................................................................................13

3.Problemafgrænsning..........................................................................................................................164.Formål......................................................................................................................................................174.1Problemformulering....................................................................................................................................17

5.Metode.....................................................................................................................................................185.1Litteratursøgning..........................................................................................................................................185.2Projektopsætning.........................................................................................................................................195.3Analyser...........................................................................................................................................................205.3.1Celledyrkning...............................................................................................................................................................205.3.2Epidermalvækstfaktor-stimulering..................................................................................................................215.3.3IdentificeringafCx43mRNA................................................................................................................................225.3.3.1mRNA-oprensning...............................................................................................................................................................225.3.3.2cDNA-syntese.........................................................................................................................................................................225.3.3.3Realtimepolymerasekædereaktion...........................................................................................................................24

5.3.4IdentificeringafCx43-proteinetsekspressionoglokalitet.....................................................................255.3.4.1Immunfluorescensfarvning..............................................................................................................................................255.3.4.2Dotblot.....................................................................................................................................................................................26

6.Resultater...............................................................................................................................................286.1UndersøgelseafCx43mRNAiGBM-cellerinvitro............................................................................286.2EkspressionoglokaliseringafCx43-proteiniGBM-cellerinvitro..............................................296.3Semi-kvantitativundersøgelseafCx43-protein.................................................................................32

7.Diskussion..............................................................................................................................................337.1Metodediskussion.........................................................................................................................................337.1.1Projektopsætning.......................................................................................................................................................337.1.2.UndersøgelseafCx43mRNA...............................................................................................................................337.1.3ExpressionafCx43-protein...................................................................................................................................34

7.2Resultatdiskussion.......................................................................................................................................357.2.1EffektenafEGFpåU87MG-cellelinjen..............................................................................................................367.2.2UdtrykkelsenafCx43iU87MG-ogC16-celellinjerne................................................................................367.2.3Cx43-proteinetsfunktioneriforholdtiløgetterapeutiskresistensvedGBM................................377.2.3.1Funktion:Intercellulærkommunikation...................................................................................................................377.2.3.2Funktion:migration/invasion........................................................................................................................................38

7.2.4Cx43sombiomarkørifremtiden........................................................................................................................398.Konklusion.............................................................................................................................................439.Perspektivering....................................................................................................................................4410.Referenceliste.....................................................................................................................................45

9

1.Indledning

Prognosenforglioblastom(GBM)-patientererdårligogrisikoenforrecidiveruundgåeligtrodsstråle-ogadjuvantkemoterapi(Stuppetal.2005;Ostrometal.2015).Enårsagtildettemenesatværeterapeutiskresistens,blandtandetgennemdenmuligetilstedeværelseafcancerstamceller(CSC)(Beieretal.2011).Connexin43(Cx43)formodesatværeenafgørendemedspilleridenterapeutiskeresistensvedGBM(Osswaldetal.2015),hvorforderpådetteproteinersærligfokusindenforforskningenafGBM.Enfremtidigmuliganvendelseafdetteproteinkanværesombiomarkørfordenterapeutiskeresistens.

10

2.Problemanalyse

2.1IncidensForekomstenafcancericentralnervesystemet(CNS),iEuropa,varierermellem4,5til11,2nyetilfældepr100.000/årformændogfra1,6til8,5pr100.000/årforkvinder.Deterhyppigstvoksne,derfårcanceriCNSogsærligtældrederrammes,hvorincidensenforaldersgruppen65+liggerpå18,5pr100.000/år.DenhyppigstforekomnecancertypeblandtcanceriCNSerastrocytisketumorermedensamletincidensratepå4,8pr100.000/år.Dennæsthyppigsteeroligodendroglialetumorermedensamletincidenspå0,4pr100.000/år.Astrocytisketumorererfordeltblandtkønnenemed5,7pr.100.000/årformændog4,0pr.100.000/år.Setabel1.(Crocettietal.2012)IDanmarkblevderi2014diagnosticeret826personermedhjernecancerogforekomstenvarformænd15,9pr100.000ogforkvinder11,8pr100.000.(Cancerregisteret2014)Region Årstal Cancer Incidens

Samlet Mænd KvinderEuropa 1995-2002 Astrocytiske

tumorer4,8* 5,7* 4,0*

Oligodendroglialetumorer

0,4* 0,4* 0,3*

Tabel1:IncidensrateforEuropaopgjortoverårene1995-2002fordeltpåcancertype.*Standardiseretincidensratepr.100.000/år(Crocettietal.2012)

2.2KlassificeringGliomerudgør31%afallehjernetumorerogerdermeddenhyppigstforekomneform.81%afallegliomerermaligne.Gliomerudspringerfrahjernensstøtteceller,gliacellerne.Gliomerinfiltrerediffusthjernemassenogmetastaseresjældent.(Ostrometal.2013;Ostrometal.2015)Gliomererinddeltefteroprindelsesstedogomfattercancertyperneastrocytomer,oligodendrogliomerogependymomas(RobbinsogCotran,2010).GBMklassificeressomWorldHealthOrganisation(WHO)-gradlVastrocytom(Kumaretal.2010)ogmed54,4%erGBMdenstørstegruppeafgliomer(Ostrometal.2013).

11

2.3MortalitetAfallediagnosticeredecancereudgørcanceriCNSkun1,3%.TilgengældercancereiCNSansvarligefor2,5%afallecancer-relaterededødstilfælde.(Weinberg2014)EfterdiagnosenGBMerstillet,erdengennemsnitligeprognoseforoverlevelse14,6månedermedbehandling(Stuppetal.2005),hvorimoddenkunerca.3månederudenbehandling(Tran&Rosenthal2010).Under5%afGBM-patienterneleverlængereend5år(Ostrometal.2015).IDanmarker48%afpatienternemeddiagnosenGBMilive1årefterdiagnosenerstilletogefter2årer21%afdisseilive(DanskNeuroOnkologiskGruppe2014a).

2.4BehandlingBehandlingafGBMindbefatteroperation,stråleterapiogkemoterapi.Vedoperationfjernessåvidtmuligalttumorvæv.PågrundafGBM’sinfiltrerendeegenskaberdetmegetsjældentmuligatbortopererealttumorvæv.Efteroperationenbehandlesderførstmedstråleterapiogkonkomitantkemoterapii6uger.StråleområdetdefineresefterenpostoperativMR-scanningogtillæggesenmarginpå2cm,forsåvidtmuligatundgåatbestrålenormalthjernevæv.Dereftergivesderadjuvantkemoterapiénugeommånedeni6måneder.Detteerdenbehandling,hvordeterbevistatgivedenlængsteoverlevelse.(DanskNeuroOnkologiskGruppe2014b)Vedbehandlingenkanderopståakutte,forbigåendebivirkningeriformafimmunsuppression,træthed,huderytem,hårtabogmellemørebetændelse(Athanassiouetal.2005;Stuppetal.2005).Derkanogsåopståsenebivirkningerhoslangtidsoverlevereiformafdemenssymptomer.Desudenforventesdet,atsygdommenvilprogrediereforca.50%afGBM-patienterneunderbehandlingsforløbet.Progressionaftumormedførerofteintraktablesymptomerinklusivpersonlighedsændringer,hvilketnedsætterpatienterneslivskvalitet.(DanskNeuroOnkologiskGruppe2014b)Strålebehandlingenhardesudenvistatkunnegivedårligerescoreafemotionellefunktionerogkvalitetaffritidsaktiviteter(Kiebertetal.1998).TrodsGBM-patienterfårdenbehandling,dergiverlængstoverlevelse,erunder5%ilive5årefterdiagnosenerstillet.Desudenerbehandlingenikkeudenbivirkningerforpatienten,hvordenneslivskvalitetnedsættes.Desidstetoårtierharderværetfokuspåsygdommen,menfremskridtetharværetbegrænset.Detstørstefremskridtharværet,atkonkomitantkemoterapigennemsnitlighargivetpatienterne2,5månedlængereatlevei(Stuppetal.2005).

12

Enmuligforklaringpå,hvorforGBM-patienterharenhøjrisikoforforekomstafrecidiv,kanvære,atnogleaftumorcellerneerresistenteoverfordenbehandling,dergives.

2.5TerapeutiskresistensDererhypoteser,indenforGBM-tumorcellersterapeutiskeresistens,somblandtandetomhandlertilstedeværelsenafcancerstamceller(Beieretal.2011).Enøgetgradafselvfornyelseerethallmarkforcancerceller(Hanahan&Weinberg2000).Tumorererheterogeneogdetharvistsig,atnogleaftumorcellernebesidderstørreselvfornyelsesevneendandre.IhjernetumorerbeskrivesdissesomCSC’er.(Singhetal.2003)IfølgeReyaetal.2001hypotiseresdet,atderinormalestamcellererbestemtesignalveje,somstyrercellernesselvfornyelse.HvisCSC’erharsammegrundlæggendeegenskabersomnormalestamceller,vildetbetyde,atCSC’erkanhavesammeegenskabertilatstyreselvfornyelsen.Dettekanblandtandetværeethøjtniveauafanti-apoptotiskeproteiner,hvilketvilgøreCSC’ernesværeatbekæmpe.DethypotiseresdesudenatCSC,ligesomnormalestamceller,ermereresistenteoverforkemoterapiendmodnedeceller/tumorceller,formentligpågrundafdethøjeniveauafanti-apoptotiskeproteiner.Dettevilbetyde,atselvomkemoterapienbekæmperdemeredifferentieredetumorceller,erderfortsatrisikoforrecidivviaCSC.(Reyaetal.2001)Ilitteraturenbeskrivesdiversefaktorer,derharvistsigathavebetydningfordenterapeutiskeresistensvedGBMinvitrooginvivo.Derfindesikkefuldenighedomfaktorerne,dogbeskrivessærligtMGMT(O6-methylguanin-DNA-methyltransferase)-enzymetsomenvigtigmodulatorafkemoresistenseniGBM,vedatMGMT-udtrykkelseøgerresistensenafcancerceller.(Beieretal.2011)Kemoterapimedtemozolomid(TMZ)fungererved,atTMZalkylererDNA’etpåO6-positionenpåguanin,hvilketinducererdobbeltstrengetDNAtilatbrydeogaktivererapoptoseafcellen.DenneDNA-skadekanrepareresgennemMGMT-enzymetved,atdetfjerneralkylgruppenogdermedmodvirkereffektenafTMZ.(Bleauetal.2009)DenneeffektskulleteoretisksetværeligefremkorreleretmedgradenafMGMT-udtrykkelsenogdermedøgegennemsnitligoverlevelsehosGBM-patientermedøgetMGMT-udtrykkelse,hvilketderogsåkonkluderesinoglestudier(Sonodaetal.2009;Hegietal.2005;Zhangetal.2013).Dogerderogsåfund,somindikerer,atgradenafMGMT-udtrykkelseikkeharenindvirkningpåterapiresponsen,hvorforMGMT-statusikkeerenpålideligmarkørforkemoresistensen(Costaetal.2010;Parketal.2009).

13

EnbiomarkørfordenterapeutiskeresistensvilkunnegiveonkologenetstyrketgrundlagforattilpassebehandlingentildenenkeltepatientogdermedøgedengennemsnitligeoverlevelseogprogressionsfrieoverlevelseforGBM-patienten.Biomarkørererperdefinitionobjektive,kvantificerbarekarakteristikaafbiologiskeprocesser(Strimbu&Tavel2010).WHOdefinererenbiomarkørsom”næstenenhvermålingsomafspejlerenvekselvirkningmellemetbiologisksystemogenpotentielfare,somkanværekemisk,fysiskellerbiologisk.Denmålteresponskanværefunktionelogfysiologisk,biokemiskpåcelleniveau,ellerenmolekylærinteraktion”(WHO1993).Hvisderudfrabiomarkørresultatetskalforetagesbehandlingsmæssigebeslutningererdetsærligtafgørende,atvaliditetenafbiomarkørenerhøjogdeterderforvigtigtatfastlæggedetpræciseforholdmellemdenmåltebiomarkørogdetkliniskeudfald.(Strimbu&Tavel2010)VedplanlægningafGBM-patientersbehandlingsforløbanvenderonkologenflererelevantefaktorer,somharbetydningforvalgafstråleområdeogstråle-ogkemoterapidosis.Derelevantefaktorererpatientensperformancestatus(PS),tumorstørrelse,antaltumorer,baselineadministrationafbinyrebarkhormonogkliniskefaktorersompatientensalder,sundhedstilstandogsamtidigesygdomme.(DanskNeuroOnkologiskGruppe2014b)Dissefaktorerogenbiomarkørforeffektenafbehandlingenvilværestærkeværktøjerforonkologenvedplanlægningafdenenkeltepatientsbehandlingsforløb(Gorliaetal.2012).Ennyopdagetmuligmedspillerogmuligbiomarkørfordenterapeutiskeresistensergapjunktion-proteinetCx43.Connexinererintegralmembranproteinersom,vedatreageremedhinanden,oligomereogdannerintercellulærekanaler,gapjunktions(GJ).Kanalerneskabercelle-cellekontaktogtilladerpassageafioner,intercellulæremetabolitterogsignalmolekylerfracytoplasmaiencelletilnabocellen.Cx43erbredtudtryktiflereorganerogcelletyper,ogerdetvigtigsteGJ-proteinihjertet.(InterPro2016)Cx43iGBMmenesatkunneydeterapeutiskresistensgennemopreguleringafproteinetiGJ,hvorigennemblandtandetmulticellulærkommunikationkanforegåogdermedgivekollektivterapeutiskresistensblandttumorcellerne(Osswaldetal.2015).

2.6TerapeutiskresistensvedCx43Cx43erudtryktibådeastrocytterogneuraleprogenitorceller,sombeggemenesattagedeliudviklingenafGBM.Flerestudierviser,atennedsatudtrykkelseafCx43-proteinetgenerelterassocieretmedenstigningicelleproliferationogenhøjeretumorgrad(Huangetal.1999;

14

Soroceanuetal.2001;Puetal.2004;Caltabianoetal.2010).GenomiskdataomCx43ogGBMfraTheCancerGenomeAtlas(TCGA)databaseviser,atettabafCx43betyderøgetvækstaftumorogatCx43fungerersomvæksthæmmer.Dogerdetteikkealtidtilfældet.FraTCGA-databasenviserdetsigogså,at57%afprimæreGBMtumorerudtrykkeretreduceretniveauafCx43,hvorderesterende43%udtrykkeretforhøjetniveau.UdtrykkelsenafCx43understregerheterogenitetenafGBM-tumorerogattumor-mikromiljøetkanhaveindvirkningpåCx43-udtrykkelsen.LigeledesudtrykkesCx43ogsåiikke-neoplastiskeastrocytter,hvilketbetyder,atCx43’sfunktionafhængeraftumorscellulærestatus.(Sinetal.2012)Cx43menesathaveflereegenskaber,sombeskytterogstyrkertumorentilvækst.GennemCx43-GJhartumorcellerneøgetpermeabilitetfornoglemetabolitter,såsomATPogglutamat,derkanværemedtilatstyrkevækstenaftumor(Goldbergetal.2002;Goldbergetal.1999).Cx43erogsåpermeabelforglukose,somkanpåvirkecancercelle-metabolismen(Rouachetal.2008;Herrero-gonzálezetal.2009).DerkandogogsåskeennedreguleringafcellevækstvedCx43gennempåvirkningafinteragerendeproteiner,fxCCN3.CCN3ersærliginteragerendemedCx43’sC-terminalogdethypotiseresattilstedeværelsenafCx43forebyggertranslokationenafCCN3tilnukleus,somellersvillestimuleretilcellevækst(Sinetal.2008;Fuetal.2004).Imodsætningtilcelleproliferation,hvorennedsatudtrykkelseafCx43kanfremmecelleproliferation,menesenøgetCx43-udtrykkelseatværemedtilatfremmecellemigration(Xuetal.2006).Mekanismernebagmigrationsegenskaberneerfortsatuklare,mendetmenesatdannelsenafGJmellemgliomacellerogastrocytterkanhaveenkritiskrolleigliomainvasion.Ligeledesmenesdet,atcellemigrationstyrkes,nårGJ-dannelseerlavmellemgliomaceller,menhøjmellemgliomacellerogastrocytter.EnlavGJ-koblingmellemgliomacellerfremmeraltsåcellemigration,hvilketogsåerioverensstemmelsemed,atennedsatCx43-udtrykkelsekorrelerermedøgetgliomamalignitet.(Sinetal.2015)IetstudielavetpårottererCx43-udtrykkelseblevetvisttilatgøreGJ-dannelsemellemgliomacellerogastrocyttermuligogattumorcelleinvasionihjerneparenkymetbliverhjulpetpåvejafCx43-udtrykkelseicancercellerne.DesudenvistestudietatantalletafCx43-udtrykkendecellerstegmedca.enfaktor30idetnormalehjerneparenkym,allerede4dageefterindlejringafGBM-tumoriraskrotte-hjernevæv.(Linetal.2002)Dethypotiseres,atsærligtdemigrerendeogprolifererendecancercellererCSCogatdetsærligterCSC’er,dererstærktresistenteoverforstråleogkemoterapien,hvilketviløgerisikoenforrecidivafsygdommen.(Reyaetal.2001)

15

SombeskrevetanvenderGBM-cellerGJtilproliferationogmigration.GJerogsåmedtilatsammenkoblemedandrecelleroverstoreafstande.DettenetværkafGJanvendestilmulticellulærkommunikationblandttumorcellerneogsombeskyttelsemodstråleterapidrevetapoptose.GJ-forbundnecancercellererblevetundersøgt,ogblandtandetietstudieafOsswaldetal.2015vardissecellerstortsetbeskyttetmodapoptose,hvorimodcancercellerudenGJdødeefterstråleterapi.SomfølgeafstrålingenstegdesudencancercellernesantalafGJogdermedogsåkommunikationenmedkalciummellemcellerne.(Osswaldetal.2015)LetøgedekalciumkoncentrationererinvolveretiGBM-apoptose(Mcferrinetal.2012),hvilketertilfældetvedstråle-induceretcytotoxicitet(Tombaletal.2002).SådannekoncentrationerneutraliseresvedtilstedeværelsenafGJ,formentligvedatfordelekalciumbølgenmellemdeforbundneceller,fordervedatøgeresistensenafbehandlingen.(Osswaldetal.2015)Cx43kanhavestortpotentialesombiomarkørfordenterapeutiskeresistensvedGBM-behandlingen,hvorfordetervigtigtatfåafklarettilstedeværelsenafCx43icancercellelinjerinvitroogdermedmuliggørevidereforskningpådisse.ForskningomkringCx43iGBMharindtilvideremestforegåetpådiversecancercellelinjerogpåmindregrupperafGBM-patienter.Tumorersyderstheterogenesammensætningogpotentialerindenforvækst,differentieringogmigration,somogsåisærsesiGBM,ermedtilatgøreforskningicancermegetomfangsrig.DeterderfornødvendigtatfastlæggetilstedeværelsenafCx43icancercellelinjer,somsåkanværegrundlagforvidereforskningmedhenblikpåfastlæggelseafCx43-egenskaber,muligeanvendelighedsombiomarkørfordenterapeutiskeresistensogsomguidetilplanlægningafbehandlingen.

16

3.ProblemafgrænsningGBMerenaggressivcancerformmeddårligprognose.DengennemsnitligeoverlevelseforGBM-patienterer14,6månedermedbehandlingogiDanmarkoverleverkun48%detførsteårmedsygdommen,somerreducerettil21%efter2år.(Stuppetal.2005;Tran&Rosenthal2010;DanskNeuroOnkologiskGruppe2014a)BehandlingenforGBMergennemdesidstetoårtierkunblevetforbedretvedtilføjelsenafkonkomitantkemoterapi,somhargivetpatienternegennemsnitlig2,5månedlængereatlevei(Stuppetal.2005).Enmuligforklaringkanværeatnogleaftumorcellernekanværeresistenteoverfordenbehandlingdergives.SærligtMGMT-genetmenesathavebetydningfordenterapeutiskeresistens,menforskningsresultaternepåområdeterdelte(Costaetal.2010;Parketal.2009),hvorfordetnyopdagedeGJ-protein,Cx43,fåropmærksomhedensomenmuligbiomarkørfordenterapeutiskeresistens.Cx43menesathaveindvirkningpåtumorvækst,migrationaftumorcellerogkommunikationmellemtumorceller.Egenskabersomermedtilatbeskytteogstyrketumoren.(Goldbergetal.2002;Linetal.2002;Osswaldetal.2015)TrodsvariationeniudtrykkelseafCx43iGBMformodesdetdog,atenopreguleringafCx43harenindvirkningpådenterapeutiskeresistensvedGBM,formentliggennemøgetproliferationinogletumorcellerogøgetmigrationiandre.IfremtidentænkesdenneopreguleringafCx43atkunnebliveanvendtsomenbiomarkørfordenterapeutiskeresistenshosdenenkeltepatient.

17

4.FormålDetteprojekttesterførsteskridtiennybiomarkør-drevet-teknologi,medhenblikpåfremtidigimplementeringoganvendelseibehandlingenafGBM-patienter.MedprojektetsøgesatafdækketilstedeværelsenafCx43itocellelinjerinvitro.AfcellelinjererudvalgtC16ogU87MG,hvilkebeggeerudledtframandligepatientermedgradIVGBM.U87MGerkommercielttilgængeligogC16erudledtpåAalborgUniversitettilforskningsbrug.U87MGmenesatudtrykkeCx43imodsætningtilC16,sommenesikkeatudtrykkeCx43.Meddenteoretiskeforudsætning,atCx43erenpålideligbiomarkørfordenterapeutiskeresistens,søgesdetatbelyseCx43-proteinetsanvendelighedsombiomarkørfordenterapeutiskeresistensvedbehandlingafGBM-patienterogvurderehvordanonkologerkanbrugesådanennyteknologitilattræffebeslutningeromkringbehandlingenafderespatientifremtiden.

4.1Problemformulering

ErCx43udtrykicellelinjerneC16ogU87MGoghvordankanCx43-ekspressionenanvendessombiomarkørfordenterapeutiskeresistensvedbehandlingenafglioblastomifremtiden?

18

5.MetodeIdetfølgendeafsnitbeskrivesdenlitteratursøgning,dererforetagetiprojektet.Desudenbeskrivesprojektetseksperimentelleopsætningogdenanvendtemetodeinærværendeprojekt,hvilket,tilidentificeringafCx43,omfattercelledyrkning,epidermalvækstfaktor(EGF)-stimulering,mRNA-oprensning,cDNA-syntese,realtimepolymerasekædereaktion(Rt-PCR),immunfluorescensfarvningogdotblot.

5.1LitteratursøgningLitteratursøgningeniprojektetblevindledtmedfritekstsøgningerforatafdækkeogfokusereprojektetsproblemstilling.DerblevanvendtdatabasersomPubmed,AalborgUniversitetsbibliotekogGoogleScholar.Fritekstsøgningernebestodafordsom”glioblastoma”,”treatmentoutcome”,”drugresistance”og”Connexin43”.Efterfølgendeblevderforetagetnyestruktureredelitteratursøgninger,somhavdeudgangspunktiproblemformuleringenogresultaternefundetgennemdenanvendtemetode.Afteknikkerblevderblandtandetanvendtboolskeoperatorerforentenatindsnævre(AND)ellerudvide(OR)søgningerneidevidenskabeligedatabaser.Derudoverblevderanvendttesaurus,foratsikreinklusionenafindbyrdesrelateredesynonymer(Rienecke&Jørgensen2006).LitteratursøgningerneblevforetagetidatabasersomPumbedogScopus.Destudier,derblevinkluderet,blevudvalgtpåbaggrundafderesrelevansogkvalitetforprojektetsemneoggennemgåetvedhjælpafenkritisklitteraturvurdering.Itabel2seseteksempelpåenbloksøgningforetagetvedensystematisklitteratursøgningiPubmed.

OR AND OR AND OR

”Glioma”[Mesh] ”Connexin43"[Mesh] ”CellProliferation"[Mesh]”Glioblastoma”[Mesh] ”GJA1protein,mouse"

[SupplementaryConcept] ”Cell

Communication"[Mesh] ”GJA1protein,human"

[SupplementaryConcept] "GapJunctional

IntercellularCommunication*"

"Cx43*" ”CellMovement"[Mesh] "Cellmigration*"Tabel2:Eksempelpåenbloksøgning,somerforetagetiPubmed.

19

Bloksøgningenitabel2giverfølgendesøgestrenge:(((("Glioma"[Mesh])OR"Glioblastoma"[Mesh]))AND(((("Connexin43"[Mesh])OR"GJA1protein,mouse"[SupplementaryConcept])OR"GJA1protein,human"[SupplementaryConcept])OR"Cx43*"))AND((((("CellMovement"[Mesh])OR"CellProliferation"[Mesh])OR"CellCommunication"[Mesh])OR"Cellmigration*")OR"GapJunctionalIntercellularCommunication*").Den25/5-16gavsøgningen79resultateripubmed,hvorførstesorteringsketevedtitelgennemgang.Dernæstblevabstraktpådetitel-udvalgteartiklerlæst,hvorfraartiklertilfuldgennemlæsningblevvalgt.Processensesiskema1.

5.2ProjektopsætningStudietbyggerpåinvitrocelledyrkningafcellelinjerneU87MGogC16imonolag.DerforetagesstimuleringafcellelinjernemedEGF.TilstedeværelsenafCx43undersøgesvedudførelseafRT-PCRpåbeggecellelinjer.DesudenmærkesCx43medfluorescensmedhenblikpåatidentificereproteinetsexpressionogpositionicellerne.Derudføresogsåetdotblot,tilverificeringafCx43-proteinetsudtrykkelseicellelinjerne.TilvurderingafCx43sommuligbiomarkørfordenterapeutiskeresistensvedGBM-behandlingen,anvendesresultaterneafinvitrolaboratorieforsøgenesammenholdtmedvidenskabeliglitteraturpåområdet.

Skema1:Procesoverlitteraturgennemgang

20

5.3Analyser

5.3.1CelledyrkningIprojektetblevcellelinjerneU87MGogC16anvendt.U87MGstammerfraencaucasisk44-årigmandmedglioblastomgradlVastrocytom,somerkommercielttilgængeligt.C16eroprensetpåAalborgUniversitetogstammerfraen43årigmandmeddiagnosticeretglioblastom.Cellelinjerne,U87MG(passage5)ogC16(passage6),blevoptøetfra–140°CogdyrketiT175-flaskertilsatetdyrkningsmedieindeholdendeDulbecco’smodifikationafEagle’sMedium(DMEM)(Corning),10%føtalkalveserum(FCS),1%penicillin/steptomycin(PS)(Gibco)og0,5%gentamycin(GEN)(Gibco)ogopbevaretivarmeskabved37°Cog5%CO2.Foratopretholdelevedygtigecellelinjerblevderløbendeskiftetmedieogudførtpassagerafcellerne,nårdetblevnødvendigt.Billede1og2viserhenholdsvisU87MG-ogC16-cellerveddyrkning.

Billede1:CellelinjeU87MG(passage7)veddyrkning,x4.30%konfluens.

21

Billede2:CellelinjeC16(passage8)veddyrkning,x4.50%konfluens.

5.3.2Epidermalvækstfaktor-stimuleringStimuleringafcellelinjernesketemedEGF.Vedenpassendekonfluens(60-90%)blevcellernehøstetvedhjælpaftrypsin/EDTA(T/E).CellerneblevinkuberetmedT/Eivarmeskab(37°C)ica.4mintilcellernehavdeløsnetsig.T/Eblevinaktiveretmeddyrkningsmedieogsuspensionenblevoverførttilplastrørogcentrifugeretved300gi5minved20°C.Herefterblevcellerneresuspendereti1mLmedieogtaltvedhjælpaftællekammer.EGF-stimuleringafC16-cellelinjenblevudførtien6-brøndsplade,hvorcellerneblevudsåetienkoncentrationpå5000celler/cm2.Seudregningiappendix1.Vedopnåelseafmonolag,blevderibrønd1-3stimuleretmedEGF(20ng/mL).Brønd4-6fungeredesomkontrologfikderforblotskiftetmedie.SammeprocesblevudførtpåU87MG-cellelinjen,dogblevdisseudsåetitoT25-flasker(enEGF-stimuleret(20ng/mL)ogenkontrol),dadevedudsåningi6-brøndspladenløsnedesigfrapladenvedEGF-stimulering.HerblevderudførtviabilitetstestafU87MG-cellernefra6-brøndspladenforatundersøgeomcellernedødevedEGF-stimulering.Seappendix2forfremgangsmådeogudregningafviabilitetstesten.

22

5.3.3IdentificeringafCx43mRNATilidentificeringafCx43mRNAicancercellelinjerneblevderanvendtRT-PCR.DaderiprojekteterfokuspåcancercellernesudtrykkelseafproteinetCx43blevmRNAoprensetfracellelinjerne,somderefterblevoversattilcDNAforherpåatkøreRT-PCR.5.3.3.1mRNA-oprensningmRNAblevoprensetfracancercellelinjernevedanvendelseafAurumTMTotalRNAMiniKit(Bio-rad).Producentensprotokol(sebilag1)blevfulgtudfraspin-procedurerenbeskrevettiloprensningafmRNAfradyrkedecellelinjer.Denneprocesbestodafflerepåhinandenfølgendetrin.GennemprocessenblevcancercellernelyseretforatfåadgangtilmRNA’et.mRNA’etblevefterfølgendeoprensetienoprensningssøjlesommRNA’etbindertilogaltandetcellematerialevaskesvæk.AfslutningsvisblevmRNA’etløsnetfraoprensningssøjlenmedenelueringsopløsningogoverførttiletmikrorør.Etnanophotometer(NanoDrop1000,ThermoScientific)blevanvendttilkvantificeringafdetoprensedemRNA(setabel3),somefterfølgendeblevopbevaretved-80°C.

5.3.3.2cDNA-synteseForatkunneanvendemRNA-templatentilPCR-analysenblevdennekonverterettilkopi-DNA(cDNA).TildenneprocesbleviScriptTMcDNASynthesisKit(Bio-Rad)anvendt,sebilag2.Kittetbestodafreaktionsmix(indeholdendeoligo(dT)ogvilkårligehexamerprimere),reversetranskriptaseognukleasefritvand,somblevblandetidetforhold,derervistitabel4.MængdenafnukleasefritvandafhangafkoncentrationenafmRNAtemplate.

Cellelinje mRNA-template

koncentration

(ng/mL)

Konc.-ratio,

280nm

Konc.-ratio,

230nm

U87MG–EGF 566,8 2,09 2,09U87MG-CTRL 554,8 2,06 2,02C16–EGF 355,1 2,01 2,18C16–CTRL 348,5 2,07 2,14

Tabel3:OversigtoveropnåedekoncentrationerafmRNA-templateogdertilhørendekoncentrationsratioerved280og230nanometer.

23

Inedenståendetabel(tabel5)fremgårdethvormangeµLmRNA-template,derblevanvendttilhvercDNAsyntese-reaktionoghvormegetvand,derblevtilførthvercDNAsyntese-reaktion.

cDNAsyntese-reaktionerneblevinkuberetiettermiskcykliseringsapperatsomvarindstilletefterprotokolleniiScriptTMcDNASynthesisKittet.Setabel6.Tid(min) Temperatur(°C)

5 2530 425 85

Bestanddele Mængde(µL)

Reaktionsmix 4Reversetranskriptase 1Nukleasefritvand XmRNAtemplate Xialt 20

Cellelinje/

cDNA

syntese-

reaktion

mRNA-

templatetil

iScript(xµL)

(=1000µL/mRNA-

template)

Vandmængde:

(20-1-4-x)µL

U87MG–EGF 1,76 13,24U87MG-

CTRL

1,8 13,2

C16–EGF 2,82 12,18C16–CTRL 2,87 12,13

Tabel5:OversigtovermængdeafmRNA-templateanvendttilhvercDNAsyntese-reaktionogmængdeaftilførtnukleasefritvandtilhvercDNAsyntese-reaktion.MængdeafanvendtemRNA-templateerberegnetsomangivetiparentesitabellen.

Tabel6:Inkuberingstiderog–temperaturertilkonverteringenafmRNAtilcDNAefteriScriptTMcDNASynthesisKittet.

Tabel4.OversigtoverblandingsforholdetafbestanddelenetilcDNA-syntesenmediScriptTMcDNASynthesisKit(Bio-Rad).

24

Efterendtprotokolblevprøverne,indeholdendecDNA,anbragtpåfrys(-18°C)tilsenereRT-PCR-analyse.5.3.3.3RealtimepolymerasekædereaktioncDNAfracellelinjerneC16ogU87MG,EGF-stimuleretogkontrol,blevfortyndetmednukleasefritvandtilenkoncentrationpå0,5ng/µL.RT-PCRamplifikationerneblevudførtmedTechne3PrimeThermalCycler,hverienopløsningmedentotalvolumenpå25µLindeholdende12,5µLDreamTaqGreenPCRMasterMix(ThermoScientific),4µLcDNA-template,0,5µLafhverprimer(10mM)og7,5µLnukleasefritvand.DreamTaqGreenPCRMasterMixindeholdteDreamTaqTMDNApolymerase,DreamTaqGreenbuffer,4mMMgCl2ogdNTP’er(dATP,dCTP,dGTPogdTTPpåhver0,4mM).RT-PCRamplifikationerneblevudførtmeddobbeltbestemmelseogennegativkontrolvedanvendelseafnukleasefritvandsomtemplate.HverRT-PCRamplifikationindeholdteeninternpositivkontroliformafhousekeepinggenetglyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase(GAPDH).Specifikationerforprimereanvendtsesitabel7.RT-PCRamplifikationerneblevudførtgennem40cyklusser,setabel8fortemperaturogtidforhvertrinienRT-PCRamplifikationscyklus.

Tabel7:PrimerspecifikationerforCx43(connexin43)ogGAPDH(glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase)primersekvenser(Chengetal.2015)ogdissesoptimaletemperatur(Tm)forhold(ThermoFisherScientific2016b).Trin Temperatur(°C) Tid(sec)

Denaturering 95 30Annealing 57 30Extention 72 30

Gen Primere Tm,°C

Cx43 Forward: 5’-TAC CAA ACA GCA GCG GAG TT-3’ 59,2Reverse: 5’-TGG GCA CCA CTC TTT TGC TT-3’ 59,9

GAPDH Forward: 5’-GAG TCA ACG GAT TTG GTC GT-3’ 57,5Reverse: 5’-GAC AAG CTT CCC GTT CTC AG- 3’ 58,6

Tabel8:TemperaturerogtidfortrinihverRT-PCR-cyklus.

25

TilvisualiseringafRT-PCRprodukterneblevfremstilleten2%agarosegel(1gagarosepulveropløsti50mLTris-acetat-EDTA(TAE)-buffer,somefteropvarmningblevtilsat4µLethidiumbromid.EthidiumbromidbindertildobbeltstrengetDNAogfluorescereved600nm.IdenafkøledegelblevRT-PCRprodukterneloadetsammenmedenGeneRuler100bpPlusDNALadder(ThermoScientific),somgjordedetmuligtatstørrelsesestimeredobbeltstrengetDNA100-3000basepar.Gelelektroferesenblevkørtved100Vica.20min.DerblevudførttestkørslerafRT-PCR-analysenforatfindedenrettemængdetemplatetilanalysen,optimalhousekeepinggenogforatforbedrekompetenceniatanvendeanalysemetoden.Opsætningogresultataftestkørslernekansesiappendix3.

5.3.4IdentificeringafCx43-proteinetsekspressionoglokalitetTilidentificeringafCx43-proteinetsekspressionoglokalitetiU87MG-ogC16-cellelinjerneblevderanvendtimmunfluorescensfarvning.EfterfølgendeblevtilstedeværelsenafCx43-proteinetverificeretmedetdotblot.5.3.4.1ImmunfluorescensfarvningTilimmunfluorescensfarvningblevU87MG-ogC16-cellelinjernefremdyrketien24-brøndsplade,hvor3brøndeforhvercellelinjeblevstimuleretmedEGFog5brøndeforhvercellelinjefungeredesomkontrol.Sefordelingiskema2.Vedencellekonfluenspåca.60%blevcellernefikseretmed4%formaldehydogimmunfarvetvedatfølgefremgangsmådenhertil,seappendix4.Tilblokeringafbaggrundsstøjogøgecellernespermeabilitetforantistofferne,blevderanvendtenPBSbuffertilsat5%BSA(bovineserumalbumin)og0,1%SAP(saponin).AntistofferneanvendttildenindirekteimmunfluorescensfarvningvaretprimærtkaninpolyklonaltantistofspecifikforCx43(abcam2016a)ogetsekundærtæsel-anti-kaninIgGpolyklonaltantistofmedAlexafluor-555konjugat(abcam2016b).Antistofferneblevanvendtienkoncentrationpå1:1000.TilkernefarvningblevanvendtHoechst33342LiveStainien1:2000koncentration(ThermoFisherScientific2016a).

26

C16 U87MGEGF EGF EGF EGF EGF EGFCTRL CTRL CTRL CTRL CTRL CTRLCTRL CTRL(neg) Cellestok CTRL CTRL(neg) Cellestok

Cellestok Cellestok Cellestok Cellestok Cellestok CellestokSkema2:Fordelingafcellelinjeri24-brøndspladentilimmunfluorescensfarvning.Densorteindramningindikererpladenmedden24brønde.DengrønnefarveviserdebrøndedererudsåetmedC16cellelinjenogdenorangefarveviserdebrøndedererudsåetmedU87MGcellelinjen.Brøndeudfyldtmed”EGF”indikereratcelleridennebrønderstimuleretmedEGF.Brøndeudfyldtmed”CTRL”indikereratcelleridennebrønderkontrolbrønde.”CTRL”-brønde,somogsåermarkeretmed”(neg)”,erbrøndsomeranvendtsomnegativkontrolvedimmunfluorescensfarvning.Brøndeudfyldtmed”cellestok”indikereratcelleridennebrøndercellestokafdenpågældendecellelinje.TilvisualiseringafimmunfluorescensenblevanvendtZeissAxioObserverZ.1.Mikroskopetbelyserdeimmunfluorescensfarvedecellergennemetfilter,somkuntilladerudvalgtebølgelængderaflys.Hervedkanlysettilpassesdeanvendteimmunfluorescenser,somvedbelysningenreflektererlysetogetbillededannes(Zeiss2006).Kernefarvningenbelysesmedultravioletlysogreflektererblåtved460-490nm(ThermoFisherScientific2016a).Detsekundæreantistofreflektererrødtlysved555-565nm(abcam2016b).5.3.4.2DotblotDerblevudførtdotblottilsemikvantitativverificeringafCx43-protein-udtrykkelseniU87MG-ogC16-cellelinjerne.Proteinicellelinjerneblevoprensetvedatinkuberedissemedradioimmunoprecipitationassay(RIPA)-buffer(ThermoScientific)tilsatproteinaseinhibitor(cOmpleteTabletsMini,Roche).Cellesuspentionerneblevherefterfaseopdeltvedcentrifugeringogsupernatanten,indeholdendeproteinetfracellelinjerne,blevanvendttildotblot-analysen.Fremgangsmådenforudførelseafdotblotsesiappendix5.DensemikvantitativeidentificeringafCx43-proteinudtryktiU87MG-ogC16-cellelinjerneblevudførtvedatdotte1,5µLprotein-supernatantpåennitrocellulosemembran.Påmembranenblevangivetetgittermed4kolonnerog2rækker.Rækkernerepræsenterededetocellelinjerogide4kolonnerblevdersatdotsmedenfaktor2.Antalletafdotssatisammeområdeigitteretsesitabel9.

27

Cellelinje Antaldots

8 6 4 2U87MG llllllll llllll llll llC16 llllllll llllll llll llTilvisualiseringafCx43-proteinetblevanvendtsammeprimærtantistofsomtilimmunfluorescensfarvningen,kaninpolyklonaltantistofspecifikforCx43(abcam2016a).Detsekundæreantistof,IRDye800CWgedanti-kaninpolyklonaltantistof(LI-COR2016),havdeen800nmfluorophor,somvarmedtilatøgespecificitetenognedbringebaggrundsstøj.

Tabel9:Skematiskangivelseafantaldotssatforhverpositionpånitrocellulosemembranen.Dengrønneindramningsymboliserernitrocellulosemembranen.

28

6.ResultaterIdetteafsnitopstillesresultaterneafanalyseranvendttilidentificeringafCx43iGBMcellelinjerneU87MGogC16.

6.1UndersøgelseafCx43mRNAiGBM-cellerinvitroTilstedeværelsenafCx43mRNAblevundersøgtvedRT-PCRpåbeggecellelinjer.RT-PCRblevforbeggecellelinjerudførtpåcDNAkonverteretfraudvundetmRNA.ForatvalideretilstedeværelsenaftilstrækkeligmRNA,blevmængdenafmRNAbestemtmedetnanophotometer(tabel3).Detfremgår,atU87MG-cellelinjenudtrykteCx43ideEGF-stimuleredecellerogikontrollen,dogserdetudtilatdeneneduplikatafkontrollenindeholdermereCx43mRNAenddeandreduplikaterforCx43-udtrykkelse(billede3).DetnederstebåndikolonnernemedCx43erprimerdimere.DererenstærkogensudtrykkelseafGAPDH-genet,deninternepositivekontrol,ogkunudtrykkelseafprimerdimereidennegativekontrol,dogmedsmearforGAPDH-genet.ForC16-cellelinjensesingenudtrykkelseafCx43,stærkudtrykkelseafGAPDH-genetogingenudtrykkelseidennegativekontrol(billede4).DogsessammesmearforGAPDH-genetidennegativekontrolvedC16somvedU87MG.U87MG:

Billede3:GelindeholdendeRT-PCRproduktfraU87MG-cellelinjen.DNAladder(L)indikereratCx43RT-PCR-produkterforbådeEGF-stimuleredeceller(EGFCx43)ogkontrol-celler(CTRLCx43)liggermellem100og200basepar(bp).GAPDHRT-PCR-produkterneforbådeEGF-stimuleredeceller(EGFGAPDH)ogkontrol-celler(CTRLGAPDH)liggerpå200bp.Dennegativekontrol(NEGCTRL)viserprimerdimer-dannelse,dogmedsmearvedGAPDH.

29

C16:

Billede4:GelindeholdendeRT-PCRproduktfraC16-cellelinjen.DNAladder(L)viser,atderikkevarCx43RT-PCR-produkterhverkenvedEGF-stimuleredeceller(EGFCx43)ellerkontrol-celler(CTRLCx43).GAPDHRT-PCR-produkterneforbådeEGF-stimuleredeceller(EGFGAPDH)ogkontrol-celler(CTRLGAPDH)liggerpå200basepar(bp).Dennegativekontrol(NEGCTRL)viserprimerdimer-dannelse,dogmedsmearvedGAPDH.

6.2EkspressionoglokaliseringafCx43-proteiniGBM-cellerinvitroForatidentificereCx43-proteinetudtryktiGBM-cellerblevcellerfraU87MGogC16farvetmedimmunfluorescens.U87MG-cellernevistetydeligresponspåimmunfluorescensfarvningenafCx43-proteinet,dogmedenanelsemindreudtrykkelseafCx43ideEGF-stimuleredecelleriforholdtilkontrollen.EksemplerpåudtrykkelsenafCx43-proteineterindikeretmedblåpileinedenståendebillede(Billede5).DeterikkemuligtatvurdereomCx43-proteinerneslokalisationicellerneerfortrinsviscytoplasmiskellermembranrelateret,formentligpågrundafatcellernekoloniseredeoglåilag,istedetforatdanneetmonolag.DersesogsåenvisuspecifikbaggrundsfarvningvedCx43immunfluorescensfarvningenafU87MG-cellerne,hvilketogsåerdenreaktion,dersesvedCx43-immunfluorescensfarvningenafC16-cellerne(Billede6).IC16-cellernesesikkespecifikCx43-respons.

30

U87MG EGF CTRL

Kerne-farvning

Cx43

Fusioneret

Billede5:ResultatetafimmunfluorescensafU87MG-celler(EFG-stimulerede(EGF)ogkontrol(CTRL))opdeltikernefarvning,Cx43ogfusionafkernefarvningogCx43.VedCx43erdermedblåpileangiveteksemplerpådentydeligeudtrykkelseafCx43-proteiniU87MG-cellerne.IfusionenafkernefarvningogCx43erdermedblåpileangivetdesammeeksemplerpåCx43-protein.Scalebar=40µm.

31

C16 EGF CTRL

Kerne-farvning

Cx43

Fusioneret

Billede6:ResultatetafimmunfluorescensafC16-celler(EFG-stimulerede(EGF)ogkontrol(CTRL))opdeltikernefarvning,Cx43ogfusionafkernefarvningogCx43.HersesikkespecifikudtrykkelseafCx43-protein.Scalebar=40µm.

32

6.3Semi-kvantitativundersøgelseafCx43-proteinTilatverificereidentifikationenafCx43iU87MG-ogC16-cellelinjerne,blevproteinoprensetafcellelinjerneogetdotblotblevudførtmedantistofferspecifikforCx43.Udfradotblottet,billede7,sesdet,atprotein-expressionenstigerforbeggecellelinjeritaktmed,atantalletafdotsstiger.Cx43-proteinetsesdesudenatværetilstedeistørregradiU87MG-cellerneendiC16-cellerne.Cx43-dotblotAntaldots:

Cellelinjer:

Billede7:DotblotoverCx43-proteiniU87MG-ogC16-cellelinjerneudtryktpånitrocellulosemembranfordeltpåantaldots.

33

7.DiskussionDetteafsniteropdeltitodele,enmetodediskussionogenresultatdiskussion.Idenførstedeldiskuteresrelevantepunkterfradenanvendtemetodeogderefter,idelto,diskuteresprojektetsresultaterogderesanvendelighed.

7.1MetodediskussionIdetteafsnitdiskuteresdenanvendtemetodeudfrarelevantepunkter.

7.1.1ProjektopsætningDeanvendtecellelinjeridetteprojektblevudvalgtfordi,dettilvidereforskningsbrug,varnødvendigtatfåbekræftettilstedeværelsenellerfraværetafCx43iU87MG-ogC16-cellelinjerne.ForskningafCx43iGBMerstadigisinmegettidligestadie,hvorforidentificeringafCx43icellelinjerneblevudførtpåflereniveauer.DetteforatstyrkeevidensenafresultaterneogdermedværebedreistandtilatdrageenkorrektkonklusionpåemnetomCx43-udtrykkelseiGBM-cellelinjer.ForatundersøgeomDNA’etidevalgtecellelinjerindeholdtesekvenserforCx43-proteinet,blevdetvalgtatudføreRT-PCRpåcDNA,kopieretfracellelinjernesmRNA.mRNAeretudtrykfordetsomcellenerkodettilatudtrykke,hvorforRT-PCRvilgiveetudtrykforhvormegetmRNAfordetpågældendegenerudtrykticellerne(Buckingham&Flaws2007).ForderefteratundersøgeommRNA’etogsåblevudtryktiproteinetblevdettevisualiseretmedimmunfluorescensfarvningafproteinetoggennemsemikvantificeringveddotblot.

7.1.2.UndersøgelseafCx43mRNAVedoprensningafmRNA,syntesenafcDNAogtilselveRT-PCRanalysenblevderanvendtkitsfraBio-Rad,somerstandardiseredeogkontrollerede,hvilkethøjnervaliditetenogreproducerbarhedenafresultatet(Bio-Rad2016).Desudenerdobbeltbestemmelsen,anvendtvedRT-PCR,ligeledesmedtilathøjnevaliditetenafresultatet,dadetdermedsikres,atdetfundneresultatikkeertilfældigt(Kimberlin&Winterstein2008).DerudoverblevderudførttestkørslerafRT-PCRforatoptimereprocedureniforholdtilvalgafinternpositivkontrologinputafcDNA.Dissetestkørslergjordeogsåatprojektforfatterenblev

34

fortroligmedanalysemetoden,hvilketermedtilathøjnereliabiliteten(Kimberlin&Winterstein2008).SominternpositivkontrolfortilstedeværelsenafcDNA,ogdermedmRNA,iRT-PCR-analyserneblevGAPDH-genetanvendt.Housekeeping-genetGAPDHervurderettilatværedetoptimalevalgsompositivkontrolvedblandtandetRT-PCR(Saidetal.2007),hvorforidentificeringafGAPDHmRNAicellelinjerneanvendtidetteprojektvilgiveetpositivtresultat.Idennegativekontrolpånukleasefritvand,somikkeindeholdtecDNA,vardetforventetatresultatetafRT-PCRbliveprimer-dimer.DogsesdersmearafprimerneidennegativekontrolmedGAPDH-genetogikkereneprimer-dimer.Dettekanskyldeskontamineringelleratprimernebindertilhinandenibrudstykkerogdermeddannerforskelligelængderafprimer-dimere,hvorvedsmearforekommer.Vedprimerdannelseerderflereting,derskaltageshøjdefor,foratfåetgodtogspecifiktresultat.Deanvendteprimereskalhavetilnærmelsesvissammesmeltetemperaturfor,iRT-PCR-analysen,atkunneindstilleenideelannealingtemperatur,hvoralleprimerehybridisereroptimaltmedtarget.Desudenskalderværeopmærksomhedpårisikoenforprimer-dimer-dannelse,somkanopståhvisforward-ogreverse-primerneharinternehomologesekvenser.(Buckingham&Flaws2007)Dettekanværetilfældetveddensmear,dersesvedGAPDHidennegativekontrol,hvorprimernetilnærmelsesviskomplementererhinandenibrudstykkerogdervedskaberforskelligelængderafprimer-dimerer,somgiversmear.

7.1.3ExpressionafCx43-proteinDerfremkommerendelbaggrundsstøjveddetektionafCx43-proteinetmedimmunfluorescens.Stepsifremgangsmåden,somkanværeskyldibaggrundsstøjen,erfikseringsmetode,blokeringsmetodenogdeanvendteantistoffer.Idetteprojektblevcellernefikseretmed4%formaldehydi20minogblokeringforbaggrundsstøjsketemedPBS-buffertilsat5%BSA.Zhangetal.2010ogCottinetal.2011fiksererbeggemed4%paraformaldehyd,hvorZhangetal.2009blokerermedPBS-buffertilsat3%BSAogCottinetal.2011blokerermedPBS-buffertilsat10%gedeserum(Zhangetal.2010;Cottinetal.2011).Someksempelpåandrefikserings-ogblokeringsmetoderkanfremhævesShinouraetal.1996,derfikserermed100%acetonei2minogtørreti15min,menbeskriverikkeomdererudførtblokering(Shinouraetal.1996).Haoetal.2012fiksererved-20°Cimethanologblokerermed1%BSA,ogGaglianoetal.2009fikserermed4%paraformaldehydiPBSindeholdende2%sukrosei5minogpostfikserermedethanolved-20°C.Ingenaffremgangsmåderneresulteredei

35

baggrundsstøj.Detvilderforværerelevantatundersøgeomandrefikserings-ogblokeringsmetoder,enddemudførtidetteprojektsfremgangsmådeforimmunfluorescensfarvning,kanfjernebaggrundsstøjen.Veddotblot-analysenreagerededeanvendteantistoffermedproteinfraC16-cellerne,selvomRT-PCR-analysenviste,atderingenCx43-mRNAericellerne.TildotblotblevanvendtsammeprimæreantistofsomtilimmunfluorescensfarvningenafCx43,hvorfordetermuligt,atdeterdetprimæreantistofmodCx43-proteinet,derbinderuspecifiktogskaberbaggrundsstøjihenholdsvisimmunfluorescensfarvningenogdotblot-analysen,ogdermedgiveretfalskpositivtresultat.Detvilværerelevantatundersøgedettenærmerevedeventueltatudføreanalysenmedetandetprimærtantistof.DotblotblevidetteprojektanvendttilsemikvantitativbestemmelseafCx43-proteinetidetoanvendtecellelinjer.Westernbloterdenanalysemetodesomoftestanvendesvedkvantificeringafproteiner.Tilwesternblotanvendessammeantistof-tekniksomtildotblot,dogsepareresproteinerneiforholdtilmolekylevægtindenantistof-analysenvedwesternblot.EtstudieafGuilleminetal.2009sammenlignerwesternblottetmeddotblottetiforholdtilprotein-detektion.Definder,atdotblotteterligesåpålideligsomwesternblottet,dogmeddenmuligebegrænsning,atdetprimæreantistofharbegrænsetadgangtilproteinet,fordidettekanværemaskeretbagstørreproteiner.(Guilleminetal.2009)Idetteprojektblevdotblottetvalgt,daformåletmedanalysenvaratlaveenhurtigsemikvantitativverificeringsanalysefortilstedeværelsenafCx43-proteinicellelinjerne.

7.2ResultatdiskussionResultaterneafdeudførteforsøgviser,atiU87MG-cellerneerCx43udtryktvedmRNAogprotein.DesudenerCx43-proteinetsudtrykkelseiU87MG-cellernevistvedimmunfluorescensfarvning.Cx43-proteinetslokalisationvarikkemuligatbestemme.VedEGF-stimuleringafU87MG-cellerneerresultatet,atdetladertil,atCx43-udtrykkelsenfalder.IC16-cellelinjenerCx43-mRNAog-proteinikkeblevetfundetudtrykt.HvordandisseresultaterkanværegrobundforCx43sombiomarkørfordenterapeutiskeresistens,afhængerafdefinitionenpåenbiomarkør.Diskussionenafdetteforetagesefterdiskussionenafprojektetsresultater.

36

7.2.1EffektenafEGFpåU87MG-cellelinjenIdetnærværendeprojektsynesdetumiddelbart,atCx43-udtrykkelsenerstørreideikkeEGF-stimuleredeU87MG-cellerendideEGF-stimulerede.EGF-stimuleringenseffektpåCx43-udtrykkelseniU87MGGBM-cellererikkefundetundersøgtilitteraturen,menietstudieafUekietal.2001finderde,atvedEGF-stimuleringafastrocytternedsættesudtrykkelsenafCx43-mRNAog–protein(Uekietal.2001).ModsatfinderChenetal.2012,atiC6-celler,rottegliom,stigerCx43-udtrykkelsenvedEGF-stimulering(Chenetal.2012).EtandetstudieafMcDonoughetal.1999,hvordeundersøgertrehjerneområder(tumorkerne,gråoghvidsubstans)ienhundmedastrocytomforcellernesmigrationsevne,finderde,atEGF-stimuleringresulteredeiøgetmigrationsamtidigmednedsatCx43-udtrykkelseidestimuleredeceller(Mcdonoughetal.1999).DerudoverfinderLund-Johansenetal.1992ogBrockmannetal.2003også,atEGFkanstimulereGBM-cellertilatmigrere(Lund-Johansenetal.1992).DennemuligeegenskabvedU87MG-cellerneskaldogverificeresgennemyderligereundersøgelser,dadetkanværeettilfælde,atdetkunvardetenebåndiU87MG-kontrollen,dervisteøgetCx43-udtrykkelse.

7.2.2UdtrykkelsenafCx43iU87MG-ogC16-celellinjerneC16erencellelinje,somerudledtpåAalborgUniversitetogikkekommercielttilgængelig,hvorfordetikkeermuligtatfindeandreundersøgelser/resultateratsammenlignemed.Somdetbelysesimetodediskussionen,menesdetatdetCx43-udtryk,dersesiC16-cellelinjenvedimmunfluorescensfarvningogdotblot,kanværebaggrundsstøj.ErdetteikketilfældetvildetværerelevantatundersøgeC16-cellelinjennærmereiforholdtiludtrykkelseafCx43.Eventueltmedyderligereanalyser,somfxetwesternblot.U87MG-cellelinjenbliverofteanvendtiforskningenafGBM,hvorforudtrykketafCx43iU87MG-cellererundersøgtitidligerestudier,mengradenafekspressionenerderikkeenighedom.BådeMurphyetal.2016ogShinouraetal.1996finder,atU87MG-cellerudtrykkerethøjtniveauafCx43(Murphyetal.2016;Shinouraetal.1996).TilgengældfinderGaglianoetal.2009ogUhletal.2005ennæstenikkedetekterbarudtrykkelseafCx43iU87MG-celler(Gaglianoetal.2009;Uhletal.2005).SomtidligerebeskreveterGBM-tumorerheterogene,hvilketogsåafspejlersigideresudtrykkelseafCx43.StudietafShinouraetal.1996findervedundersøgelseafforskelligegraderafastrocytomer,atsærligtihøjgrads-astrocytomererudtrykkelsenafCx43megetvarieret(Shinouraetal.1996).Murphyetal.2016undersøgerCx43-niveauetihumaneGBM-

37

tumorerogfinder,atCx43-niveaueter6-14gangehøjereendinormalthjernevæv(Murphyetal.2016).IenundersøgelseafYeetal.2015finderdelignenderesultatervedundersøgelseaf4x20GBM-tumorerfrahvertumorgradl-lV.Resultateter,atCx43-udtrykkelseneromvendtkorreleretmedGBM-tumorgrad.(Yeetal.2015)DerimodfinderetstudieafHuangetal.1999blandtandet,vedundersøgelseaf6GBM-tumorer,atCx43-udtrykkelsenidissenæstenikkeermålbar(Huangetal.1999).Cottinetal.2011,findervedundersøgelseaf74humaneGBM-tumorer,atCx43-proteinetertilstedei77%aftumorerne.DeunderbyggerGBM-tumorersheterogeneudtrykved,atCx43-udtrykkelsenideresundersøgelseentenvaruændret,nedsatellerikketilstede.(Cottinetal.2011)DetheterogeneudtrykafCx43iGBMkanskyldestumorersgenereltcellulæreheterogenesammensætning.DerervistsammenhængmellemøgetcelleproliferationoglavCx43-udtrykkelse(Huang,1999),ogøgetmigrationsevneerkorreleretmedøgetCx43-udtrykkelse.Detteåbneropforenhypoteseom,atCx43-udtrykkelseniGBMkanværerelaterettiltumorcellensoverordnedefunktionitumor.

7.2.3Cx43-proteinetsfunktioneriforholdtiløgetterapeutiskresistensvedGBM7.2.3.1Funktion:IntercellulærkommunikationVedidentificeringafCx43-proteinetslokaliteticellelinjernemedimmunfluorescensvarformåletatfindeudafomCx43-proteinetkunnelokaliserestilmembranenellercytoplasmaeticellerne,hvilketdogikkevarmuligt.IetstudieafCottinetal.2011finderdei4udaf8GBM-cellekulturer,atCx43hovedsageligerlokalisereticellernescytoplasma.Ideresterende4GBM-cellekulturerudvistetreafdemmembranrelateretCx43-udtrykkelseogdensidsteudvistenæsteningenCx43-udtrykkelse.CytoplasmisklokalisationafCx43-proteinetreducerede,istudiet,GJ-intercellulærkommunikationmed50-75%sammenlignetmedGBM-cellekulturermedmembranrelateretCx43-udtrykkelse.(Cottinetal.2011)Cx43-medieretGJ-intercellulærkommunikationerblandtandetundersøgtistudietafOsswaldetal.2015,hvordennefunktionharstorbetydningforbeskyttelseaftumorcellermodapoptosevedstråleterapi,dadenøgedekoncentrationafCa2+,induceretafstråleterapien,fordelesmellemcellerneviaGJogdermedmistersineffekt(Osswaldetal.2015).DesudenviserChenetal.2015,atastrocyttervedhjælpafCx43-GJintercellulærkommunikationreduceredeapoptoseafgliomacellerieninvitroco-kulturafastrocytterog

38

gliomacellerbehandletmedTMZogvincristin.VedundersøgelseafhumaneGBM-tumorerfinderdeogså,ataktiveastrocytterinfiltrererrundtomtumor,hvilketbekræfterinvitroforsøget.(Chenetal.2015)VedenmembranrelateretpositionafCx43-proteinetviltumorcellernehaveøgetresistensoverforstråle-ogkemoterapi,hvorforinformationomCx43-proteinetslokalisationiGBM-cellerneerenvigtigvideniforholdtilvurderingafdenterapeutiskeresistens.7.2.3.2Funktion:migration/invasionOsswaldetal.2015viser,atvedGBM-tumorprogressionstigerantalletaflangemembran-rør,somblandtandetbliverbrugttilatflyttecellekernervedfxmitose.Langsdissemembran-rørviserartiklendesuden,atGJkandannes.(Osswaldetal.2015)IetstudieafHongetal.2015vises,atenhøjGJ-dannelsemellemU87MG-cellerogastrocytterøgergliomacelleinvasionen(Hongetal.2015).Dettetilsammenmuliggørøgettumorcelleinvasiongennemmembran-rørmedGJtilastrocytterihjerneparenkymet.DaCx43eretudtrykforGJ,kanenøgetCx43-udtrykkelseniGBMværeenindikatorforøgetGJ-dannelseogdermedøgetmigration.VedennedsatCx43-udtrykkelseviserBatesetal.2007desuden,atgliomcellersmobilitetblivernedsatogatC-terminalenpåCx43-proteinetkanhaveenvigtigrolleiglioma-mobiliteten(Batesetal.2007).Sinetal.2015viserideresstudie,atglioma-invasionikkeerGJ-afhængig,menatdetderimoderenfunktionelC-terminalpåCx43,dererinvolveretimigrationudihjerneparenkymet(Sinetal.2015).EtandetstudieafCrespinetal.2010harfundet,atC-teminalenalenekanfremmemotilitet,menogså,atCx43kanøgemigrationudenC-terminalen(Crespinetal.2010).FunktionenafcellemigrationiGBMkanværeenkombinationafdannelsenafGJmellemmembran-rørogastrocytterogenfuldfunktionelC-terminalpåCx43-proteinet.TilsammenkanenøgetCx43-udtrykkelseværerelaterettilenøgetgradaftumorinvasionihjerneparenkymet.Tumorinvasionafhjerneparenkymetøgerpatientensrisikoforrecidiv,dademigrerendecellerikkekanfjernesvedoperation.Yderligerebehandlesmigrerendetumorcellerihjerneparenkymetikkeveddenefterfølgendestråleterapi,dadenneerlokaliserettilselvetumoren,foratbestrålesålidtnormalthjernevævsommuligt.(DanskNeuroOnkologiskGruppe2014b)Cx43-udtrykkelseiforholdtilGJ-intercellulærkommunikationogmigrationkanbetyde,atdeGBM-tumorer,derharenhøjudtrykkelseafCx43,ermereinfiltrerendeogmodstandsdygtigeoverforstråleterapiendGBM-tumorermedlavCx43-udtrykkelse.Hermederdermulighedfor,

39

atenhøjCx43-udtrykkelsekanbrugessomenbiomarkørforøgetterapeutiskresistensiGBM-tumorer.Vedøgetterapeutiskresistensviltumorværemindremodtageligoverfordenbehandling,dergivestilGBM-patienteridag.Dettekanværeenrelevantinformationforonkologeniforbindelsemedformidlingafsygdommensaggressivitetogplanlægningafpatientensbehandlingsforløb.Iforholdtilenmuligændringafbehandlingenhosdenenkeltepatientvedøgetterapeutiskeresistens,sesdetteikkesomenmulighedudfradenvidendererpånuværendetidspunktomdenbehandlingdergives.PrimærtbehandlesGBM-patientermedstråleterapiogændringidosisafstråleterapierblevetundersøgtietfase3ogerikkeblevetfundettilatforbedreudfaldethosGBM-patienter.Dogbeskrivesdet,atdervedforventetkortrestlevetidkangiveshypofraktioneretstrålebehandlingsometalternativ.Særligtdeældrepatienter(>60år)kanhavegavnafenbehandling,hvortoxiciteteneropvejetmodoutcomeoglivskvalitet.(DanskNeuroOnkologiskGruppe2014b)HerkanenbiomarkørsomCx43kommerindibilledet.DaøgetCx43-udtrykkelseharindikationerforatværerelaterettiløgetterapeutiskeresistens,kandenneinformationværetilgavnforonkologeniplanlægningenafbehandlingenafældrepatienter.

7.2.4Cx43sombiomarkørifremtidenForatkunnevurdereCx43sompotentialbiomarkørerdetnødvendigtatdefinere,hvadenbiomarkører.Derfindesikkeenuniverseldefinitionpå,hvadenbiomarkører.SomtidligerebeskrevetharWHOogStrimbuogTavel2010frembragtdefinitionerpåhvadenbiomarkører(WHO1993;Strimbu&Tavel2010).ForatskabeklarhedomemnetblevdernedsatenBiomarkersDefinitionWorkingGroup(BDWG),beståendeaf8lægerog4Ph.D’erfraNationalInstitutesofHealth,USFoodandDrugAdministration(FDA)oguniversiteteriUSA.I2001fremlagdedeendefinitionpåenbiomarkørogetkliniskendpoint.(BiomarkersDefinitionsWorkingGroup2001)Dissekansesitabel10.

40

Biomarkør Kliniskendpoint

Enkarakteristika,dererobjektivtmåltogevalueretsomenindikatorforennormalbiologiskproces,patogeniskprocesellerfarmakologiskresponstilenterapeutiskintervention.

Enkarakteristikaellervariabel,derreflektererhvordanenpatientfølerellerfungerer,ellerhvorlangtidenpatientoverlever.

Tabel10:BiomarkersDefinitionWorkingGroupdefinitionerpåhhv.enbiomarkørogetkliniskendpoint.(BiomarkersDefinitionsWorkingGroup2001)UdfradennedefinitionvilCx43-proteinetværeenbiomarkørpåbaggrundaf,atCx43-proteineterenindikatorforennormalbiologiskellerpatologiskproces.IdettetilfældeviletøgetCx43-niveauogmembranlokalisationitumorcellenværeenindikatorforøgetterapeutiskresistensvedGBM,enpatologiskproces.DetkliniskeendpointvilidettetilfældeværekortereoverlevelsepågrundaføgetterapeutiskresistensvedøgetCx43-udtrykkelse.Dennesammenhængerstadighypotetiskogskalvalideresindenderkandragesnogleendeligekonklusioner.VedanvendelseafCx43sombiomarkøriforskningsregierhensigtenatundersøgeCx43-proteinetsegenskaberogfunktioneribiologiskeprocesser.Detteadskillersigfraanvendelsenidetkliniskeregi,hvorformåleteratrelaterebiomarkørensudtryktilensygdomssværhedsgrad,enforudsigelseafsygdomsforekomstellerenreaktionpåenintervention(Mayeux2004).Fællesforforsknings-ogkliniskanvendelsesregimåvære,atderkanudføresinterventionerpåbaggrundafbiomarkørensresultat.VedenfremtidigimplementeringafCx43sombiomarkørfordenterapeutiskeresistens,vildetværenærliggendeatforetagedenneundersøgelseiforbindelsemeddiagnosticeringogklassificeringafdenresekteredetumorpåpatologiskafdeling.UndersøgelsenforCx43itumorvævetvilkunneudføresmedimmunhistokemiskfarvning.Dennemetodeanvendespånuværendetidspunktvedforskningsmæssigidentificeringafproteinet(Osswaldetal.2015).Desudenanvendesimmunhistokemiskfarvningibredudstrækningirutinearbejdetpåpatologiskeafdelinger,hvorforenimplementeringafCx43vilværelettilgængeligogikkeværeforbundetmedstoreøkonomiskeudgifteridetaltudstyrogprocedureertilgængeligogpersonaleteroplærtidensanvendelse.

41

Førenbiomarkørkanbrugesklinisk,erdetnødvendigtatvalideredenne.VigtigtforvaliditetenerifølgeMayeux2004,athaveetklartoggrundigtevidensgrundlagforhvadbiomarkørenrelaterertil(Mayeux2004).Colburn2000beskriver,atvalideringenafenbiomarkørhandlerom,athensigtenmedbiomarkørenskalklarlæggesforsåatudviklestandardoperatingprocedures(SOP)forproceduren,hvorGoodLaboratoryPractice(GLP)-kriterierskalværeopfyldt.Detteskalsikrefastsættelsenafgrænserfordetektionogkvantifikation,forudenkørslenafkontrolprøver.Meddennevalideringsprocesevalueres,ifølgeColburn2000,stabilitet,linaritet,præcision,akkuratesse,specificitetogreproducerbarhed.(Colburn2000)UdfordringeniforholdtilatanvendeCx43-proteinetsombiomarkørfordenterapeutiskeresistenser,atderendnuikkeerbevistendefinitivsammenhængmellemCx43ogdenterapeutiskeresistens,hvormedevidensgrundlagetendnuikkefindes.Trodsindikationer,fremførtidetteprojekt,foratdererenmuligsammenhæng,erderfortsatmangeubekendtefaktorersomspillerindogGBM-tumorersheterogenecellulæreudtrykeretsærligfokuspunktderskaltageshøjdeforibeskrivelsenafenmuligsammenhæng.HeterogenitetenkanværemedtilatstyrkeCx43sombiomarkørfordenterapeutiskeresistens,vedatforskelleiCx43-udtrykogderessammenhængmedsygdommenkanhøjneCx43-proteinetsrelevanssombiomarkør,dadergennemCx43-udtrykketermulighedforinddelepatienterneigrupper.Enstorforskelpågrupperneviløgeanvendelighedenafbiomarkøren(Mayeux2004).Viserfremtidigforskning,atdereretevidensgrundlagstærknoktilatbeviseensammenhængmellemCx43ogdenterapeutiskeresistensvedGBM,erCx43sombiomarkørkommetetlangtstykkeafvejen.

Dernæsterreliabilitetogreproducerbarhedaltafgørendevedanalyseringafenbiomarkør(Mayeux2004).VedeneventuelfremtidigimplementeringafCx43sombiomarkør,skalderderforværeklare,valideredeprocedurerforfremgangsmådenafanalyseringafbiomarkøren,somskalanvendespunktligtvedhveranalyse.Desudenskalpersonaletværegrundigtoplærtianvendelseafsådanneanalyserforatmindskefejl(Hollenseadetal.2004).Ligeledesskalpersonaletsomvurdereranalysesvaretværeoplærtidetteogkendebiomarkørensegenskaberogreferenceramme,foratkunnelaveenvalidvurderingogundgåfejlfortolkningogbias(Mayeux2004).Idenforbindelseskalderværefokuspårisiciforfalskpositiveogfalsknegativesvar.ForCx43sombiomarkør,implementeretpåenpatologisk

42

afdelingoganalyseretvedimmunhistokemiskfarvning,vilderkunneopståfejlsomfalsknegativeogfalskpositivesvar,sompatologerneogonkologenskalværeopmærksommepå:Falsknegativtsvar:

- DadeterdemigrerendeGBM-celler,derharethøjtudtrykafCx43,erdetmuligt,atdeteritumorkantenogihjerneparenkymet,dervilværestørstmulighedforatdetektereCx43-proteinet.VedklassificeringogCx43-undersøgelseafGBM-tumorerdetderforvigtigtatundersøgebådetumorkernenogtumorkanten,pådenresekteredetumor,foratfåetsåpræcistanalysesvarpåCx43-udtrykkelsensommuligt.Hvisdendiagnosticerendepatologikkeeropmærksompådette,erderrisikoforetfalsknegativtanalysesvarogdermedfejlvurderingafdenterapeutiskeresistens.

Falskpositivtsvar:- DaCx43ogsåerudtryktiastrocytterogendotelceller(Larsonetal.1990)kandettegive

risikoforfalskpositivtsvar.Dettekandervisueltsikresimodvedanvendelseafimmunhistokemiskfarvning.

- DesudenskalderværeopmærksomhedpåGJ-dannelsenmellemgliomceller,dadennekoblinghæmmerinvasion(Hongetal.2015)ogerdermedikkerelaterettiløgetterapeutiskresistens.Dettekanmuligvisundersøgesvedimmunhistokemiskfarvning.

43

8.KonklusionFormåletmeddetteprojektvarattesteførsteskridtiennybiomarkør-drevet-teknologigennemafdækningenaftilstedeværelsenafCx43icellelinjerneC16ogU87MG.PåbaggrundafdenteoretiskeforudsætningenatCx43erenpålideligbiomarkørfordenterapeutiskeresistens,blevdennesanvendelighedbelyst.Projektetsproblemformulering:

TrodsuenighedomCx43-udtrykkelseniGBMogU87MG-cellelinjenkandetidetteprojektkonkluderes,atU87MG-cellelinjenudtrykkerCx43.Desudenkandetkonkluderes,atCx43ikkeerudtryktiC16-cellelinjen.EGF-stimuleringvisteatdennemuligviskannedsætteCx43-udtrykkelseniU87MG-celler.DetkomfrematmembranlokalisationafCx43errelaterettiløgetterapeutiskresistensafstråle-ogkemoterapipågrundafGJ-medieretintercellulærkommunikation.DesudenkanøgetCx43-udtrykkelseværerelaterettiløgettumorinvasionafhjerneparenkymet.PånuværendetidspunktkaninformationomøgetterapeutiskresistensværerelevantforældreGBM-patienteriforholdtilplanlægningderesbehandlingsforløb.VedenmuligfremtidiganvendelseafCx43sombiomarkørfordenterapeutiskeresistensiGBM,skaldennegrundigtvalideres,førstogfremmestiforholdtilevidensgrundlag.VedvaliditetafCx43sombiomarkøridennekontekstkandenneimplementerespåpatologiskeafdelingeroganalyseresmedimmunhistokemiskfarvning,hvorfokuspåfalskpositiveogfalsknegativeanalysesvarervigtigt.Hermedkonkluderesdet,atenøgetCx43-udtrykkelseifremtidenharmulighedforatbliveanvendtsombiomarkørfordenterapeutiskeresistensiGBM-tumorer

ErCx43udtrykicellelinjerneC16ogU87MGoghvordankanCx43-ekspressionenanvendessombiomarkørfordenterapeutiskeresistensvedbehandlingenafglioblastomifremtiden?

44

9.PerspektiveringPåbaggrundafdetteprojektsresultatervildetnæsteskridtiudviklingenværeennærmereundersøgelseafCx43iU87MG-cellelinjeniforholdtilmigration,lokalisationicellenogGJ-medieretintercellulærkommunikation.IforholdtilC16-cellelinjenskaldennesCx43-udtrykvalideres,hvoreftercellelinjenkananvendestilsammenligningvedCx43-undersøgelsermedU87MG.DettevilværerelevantiforholdtilbestemmelseafCx43’segenskabervedmigration,lokalisationicellenogGJ-medieretintercellulærkommunikation.UdtrykkerC16-cellerneikkeCx43,menharnogleafdesammeegenskabersomU87MG,derudtrykkerCx43,kandersåstvivlomCx43’sforbindelsetildenterapeutiskeresistensvedGBM.Modsatkanforbindelsenogsåbekræftes,hvilketvilværegrobundforyderligereundersøgelsermedandreGBM-cellelinjerogseneresammenlignesmedundersøgelserpåfriskeGBM-tumorer.Detvilefterfølgendeværeinteressantatudføreenretrospektivundersøgelsepåenpatologiskafdeling,hvorderudføresundersøgelserafCx43-udtrykkelsenitumorvævfraGBM-patientermedkortoverlevelse,foratseomderkanværeensammenhængmellemCx43-udtrykkelsen,denterapeutiskeresistensogpatienterneskortelevetidmedGBM.DetultimativemålforanvendelsenafCx43sombiomarkørfordenterapeutiskeresistensvedGBMer,atdenkanforudsigeombehandlingenvilhaveeneffektpådenpågældendepatientsGBM-tumor.Dettevil,somtidligerebeskrevetidiskussionen,krævegrundigvalideringogblandtandetklarlæggelseafbiomarkørensspecificitetogsensitivitet.KulasingamogDiamandis2008beskriver,atsensitiviteterandelenafpatientermedbekræftetdiagnose,somtestespositivforbiomarkørenogspecificitetenerdenandelafraskemennesker(kontrol)dertestesnegativeforbiomarkøren(Kulasingam&Diamandis2008).Detstoreproblemhervilværeatbestemmespecificiteten,daadgangtilanalysematerialet(hjernevæv)tilforskningsbrugeryderstbegrænsetforraskemennesker.Derudovererderrisikoforbiasiforbindelsemedbestemmelseafsensitiviteten,daCx43erudtryktiraskhjernevævgennemblandtandetastrocytter,hvorforenbiomarkørforCx43nemtkantillæggesetfalskpositivtresultat.DertilerderproblematikkenomGBM-tumorersheterogeneudtryk,hvilketskalvalideresogsættesirelationtilCx43-udtrykkelseogterapeutiskeresistens.

45

10.Referencelisteabcam, 2016a. Anti-Connexin 43/ GJA1 antibody ab11370. Available at:

http://www.abcam.com/connexin-43--gja1-antibody-ab11370.html. abcam, 2016b. Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor(R) 555) (ab150074). Available at:

http://www.abcam.com/donkey-rabbit-igg-hl-alexa-fluor-555-ab150074.html. Athanassiou, H., Synodinou, M., Maragoudakis, E., Paraskevaidis, M., Verigos, C., Misailidou, D.,

Antonadou, D., Saris, G., Beroukas, K. & Karageorgis, P., 2005. Randomized phase II study of temozolomide and radiotherapy compared with radiotherapy alone in newly diagnosed glioblastoma multiforme. Journal of Clinical Oncology, 23(10), s.2372–2377.

Bates, D.C., Sin, W.C., Aftab, Q. & Naus, C.C., 2007. Connexin43 enhances glioma invasion by a mechanism involving the carboxy terminus. Glia, 55(15), s.1554–64.

Beier, D., Schulz, J.B. & Beier, C.P., 2011. Chemoresistance of glioblastoma cancer stem cells - much more complex than expected. Molecular Cancer, 10(1), s.128.

Bio-Rad, 2016. Certificate of Analysis. Available at: http://www.bio-rad.com/en-dk/life-science-research/support/certificate-of-analysis.

Biomarkers Definitions Working Group, 2001. Biomarkers and surrogate endpoints: Preferred definitions and conceptual framework. Clinical Pharmacology & Therapeutics, 69(3), s.89–95.

Bleau, A., Huse, J.T. & Holland, E.C., 2009. The ABCG2 resistance network of glioblastoma. Cell Cycle, 8(September), s.2937–2945.

Buckingham, L. & Flaws, M.L., 2007. Molecular Diagnostica; Fundamentals, Methods, & Clinical Applications L. Buckingham & M. L. Flaws, red., Philadelphia: F. A. Davis Company.

Caltabiano, R., Torrisi, A., Condorelli, D., Albanese, V. & Lanzafame, S., 2010. High levels of connexin 43 mRNA in high grade astrocytomas. Study of 32 cases with in situ hybridization. Acta histochemica, 112, s.529–35.

Cancerregisteret, 2014. Nye kræfttilfælde i Danmark - 2014. , s.1–51. Chen, V.C., Kristensen, A.R., Foster, L.J. & Naus, C.C., 2012. Association of Connexin43 with E3

Ubiquitin Ligase TRIM21 Reveals a Mechanism for Gap Junction Phosphodegron Control. Journal of Proteome Research, 11, s.6134–6146.

Chen, W., Wang, D., Du, X., He, Y., Chen, S., Shao, Q., Ma, C., Huang, B., Chen, A., Zhao, P., Qu, X. & Li, X., 2015. Glioma cells escaped from cytotoxicity of temozolomide and vincristine by communicating with human astrocytes. Medical oncology (Northwood, London, England), 32(43), s.1–13.

Cheng, J.-C., Chang, H.-M., Fang, L., Sun, Y.-P. & Leung, P.C.K., 2015. TGF- b 1 Up-Regulates Connexin43 Expression : A Potential Mechanism for Human Trophoblast Cell Differentiation. Journal of Cellular Physiology, (January), s.1558–1566.

Colburn, W. a, 2000. Optimizing the use of biomarkers, surrogate endpoints, and clinical endpoints for more efficient drug development. Journal of clinical pharmacology, 40, s.1419–1427.

Costa, B.M., Caeiro, C., Guimarães, I., Martinho, O., Jaraquemada, T., Augusto, I., Castro, L., Osório, L., Linhares, P., Honavar, M., Resende, M., Braga, F., Silva, A., Pardal, F., Amorim, J., Nabiço, R., Almeida, R., Alegria, C., Pires, M., Pinheiro, C., Carvalho, E., Lopes, J.M., Costa, P., Damasceno, M. & Reis, R.M., 2010. Prognostic value of MGMT promoter methylation in glioblastoma patients treated with temozolomide-based chemoradiation : A Portuguese multicentre study. Oncology reports, 23, s.1655–1662.

Cottin, S., Gould, P. V, Cantin, L. & Caruso, M., 2011. Gap junctions in human glioblastomas: implications for suicide gene therapy. Cancer gene therapy, 18(9), s.674–81.

Crespin, S., Bechberger, J., Mesnil, M., Naus, C.C. & Sin, W., 2010. The Carboxy-Terminal Tail of Connexin43 Gap Junction Protein Is Sufficient to Mediate Cytoskeleton Changes in Human Glioma Cells. Journal of Cellular Biochemistry, 110, s.589–597.

46

Crocetti, E., Trama, A., Stiller, C., Caldarella, A., Soffietti, R., Jaal, J., Weber, D.C., Ricardi, U., Slowinski, J. & Brandes, A., 2012. Epidemiology of glial and non-glial brain tumours in Europe. European Journal of Cancer, 48(10), s.1532–1542.

Dansk Neuro Onkologisk Gruppe, 2014a. Dansk Neuro Onkologisk Register - Årsrapport 2014, Dansk Neuro Onkologisk Gruppe, 2014b. Retningslinjer for behandling af interkranielle gliomer hos

voksne, Fu, C.T., Bechberger, J.F., Ozog, M.A., Perbal, B. & Naus, C.C., 2004. CCN3 ( NOV ) Interacts

with Connexin43 in C6 Glioma Cells. Journal of Biological Chemistry, 279(35), s.36943–36950.

Gagliano, N., Costa, F., Cossetti, C., Pettinari, L., Bassi, R., Chiriva-Internati, M., Cobos, E., Gioia, M. & Pluchino, S., 2009. Glioma-astrocyte interaction modifies the astrocyte phenotype in a co-culture experimental model. Oncology Reports, 22(06), s.1349–1356.

Goldberg, G.S., Lampe, P.D. & Nicholson, B.J., 1999. Selective transfer of endogenous metabolites through gap junctions composed of different connexins. Nature Cell Biology, 1(November), s.457–459.

Goldberg, G.S., Moreno, A.P. & Lampe, P.D., 2002. Gap Junctions between Cells Expressing Connexin 43 or 32 Show Inverse Permselectivity to Adenosine and ATP *. The Journal of Biological Chemistry, 277(39), s.36725–36730.

Gorlia, T., Stupp, R., Brandes, A.A., Rampling, R.R., Fumoleau, P., Dittrich, C., Campone, M.M., Twelves, C.C., Raymond, E., Hegi, M.E., Lacombe, D. & Van Den Bent, M.J., 2012. New prognostic factors and calculators for outcome prediction in patients with recurrent glioblastoma : A pooled analysis of EORTC Brain Tumour Group phase I and II clinical trials. European Journal of Cancer, 48, s.1176–1184.

Guillemin, N., Meunier, B., Jurie, C., Cassar-Malek, I., Hocquette, J.-F., Leveziel, H. & Picard, B., 2009. Validation of a dot-blot quantitative technique for large scale analysis of beef tenderness biomarkers. Journal of Physiology and Pharmacology, 60(3), s.91–97.

Hanahan, D. & Weinberg, R. a, 2000. The Hallmarks of Cancer Review University of California at San Francisco. Cell, 100, s.57–70.

Hegi, M.E., Diserens, A.-C., Gorlia, T., Hamou, M., Tribolet, N. De, Weller, M., Kros, J.M., Hainfellner, J.A., Mason, W., Mariani, L., Bromberg, J.E.C., Hau, P., Mirimanoff, R.O., Cairncross, G., Janzer, R.C. & Stupp, R., 2005. MGMT Gene Silencing and Benefit from Temozolomide in Glioblastoma. The New England Journal of Medicine, 352(10), s.997–1003.

Herrero-gonzález, S., Valle-casuso, J.C., Sánchez-alvarez, R., Giaume, C., Medina, J.M. & Tabernero, A., 2009. Connexin43 Is Involved in the Effect of Endothelin-1 on Astrocyte Proliferation and Glucose Uptake. Glia, 57, s.222–233.

Hollensead, S.C., Lockwood, W.B. & Elin, R.J., 2004. Errors in pathology and laboratory medicine: Consequences and prevention. Journal of Surgical Oncology, 88, s.161–181.

Hong, X., Sin, W.C., Harris, A.L. & Naus, C.C., 2015. Gap junctions modulate glioma invasion by direct transfer of microRNA. Oncotarget, 6(17), s.15566–15577.

Huang, R.P., Hossain, M.Z., Sehgal, A. & Boynton, A.L., 1999. Reduced connexin43 expression in high-grade human brain glioma cells. Journal of surgical oncology, 70(1), s.21–4.

InterPro, 2016. Gap Junction alpha-1 protein (Cx43). Available at: http://www.ebi.ac.uk/interpro/entry/IPR002261.

Kiebert, G.M., Curran, D., Aaronson, N.K., Bolla, M., Menten, J., Rutten, E.H., Nordman, E., Silvestre, M.E., Pierart, M. & Karim, A.B., 1998. Quality of life after radiation therapy of cerebral low-grade gliomas of the adult: results of a randomised phase III trial on dose response (EORTC trial 22844). EORTC Radiotherapy Co-operative Group. European journal of cancer (Oxford, England : 1990), 34(12), s.1902–9.

Kimberlin, C.L. & Winterstein, A.G., 2008. Validity and reliability of measurement instruments used in research. American Journal of Health-System Pharmacy, 65, s.2276–2284.

47

Kulasingam, V. & Diamandis, E. p, 2008. Strategies for discovering novel cancer biomarkers through utilization of emerging technologies. Nature Clinical Practice Oncology, 5, s.588–599.

Kumar, V., Abbas, A.K., Fausto, N. & Aster, J., 2010. Robbins and Cotran Pathologic Basis of Disease 8th udg., Saunders, Elsevier Inc.

Larson, D.M., Haudenschild, C.C. & Beyer, E.C., 1990. Gap junction messenger RNA expression by vascular wall cells. Circulation research, 66(4), s.1074–1080.

LI-COR, 2016. IRDye 800CW Secondary Antibodies. Available at: https://www.licor.com/bio/products/reagents/secondary_antibodies/irdye_800cw.html.

Lin, J.H.C., Takano, T., Cotrina, M.L., Arcuino, G., Kang, J., Liu, S., Gao, Q., Jiang, L., Li, F., Lichtenberg-Frate, H., Haubrich, S., Willecke, K., Goldman, S.A. & Nedergaard, M., 2002. Connexin 43 Enhances the Adhesivity and Mediates the Invasion of Malignant Glioma Cells. Journal of Neuroscience, 22(11), s.4302–4311.

Lund-Johansen, M., Forsberg, K., Bjerkvig, R. & Laerum, O.D., 1992. Effects of growth factors on a human glioma cell line during invasion into rat brain aggregates in culture *. Acta Neuropathologica, 84, s.190–197.

Mayeux, R., 2004. Biomarkers: potential uses and limitations. NeuroRx : the journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics, 1, s.182–188.

Mcdonough, W.S., Johansson, A., Joffee, H., Giese, A. & Berens, M.E., 1999. GAP JUNCTION INTERCELLULAR COMMUNICATION IN GLIOMAS IS INVERSELY RELATED TO CELL MOTILITY. International Journal of Developmental Neuroscience, 17, s.601–611.

Mcferrin, M.B., Turner, K.L., Cuddapah, V.A. & Sontheimer, H., 2012. Differential role of IK and BK potassium channels as mediators of intrinsic and extrinsic apoptotic cell death. American Journal Physiol Cell Physiol, 303, s.1070–1078.

Murphy, S.F., Varghese, R.T., Lamouille, S., Guo, S., Pridham, K.J., Kanabur, P., Osimani, A.M., Sharma, S., Jourdan, J., Rodgers, C.M., Simonds, G.R., Gourdie, R.G. & Sheng, Z., 2016. Connexin 43 Inhibition Sensitizes Chemoresistant Glioblastoma Cells to Temozolomide. Cancer research, 76(1), s.139–49.

Osswald, M., Jung, E., Sahm, F., Solecki, G., Venkataramani, V., Blaes, J., Weil, S., Horstmann, H., Wiestler, B., Syed, M., Huang, L., Ratliff, M., Karimian Jazi, K., Kurz, F.T., Schmenger, T., Lemke, D., Gömmel, M., Pauli, M., Liao, Y., Häring, P., Pusch, S., Herl, V., Steinhäuser, C., Krunic, D., Jarahian, M., Miletic, H., Berghoff, A.S., Griesbeck, O., Kalamakis, G., Garaschuk, O., Preusser, M., Weiss, S., Liu, H., Heiland, S., Platten, M., Huber, P.E., Kuner, T., von Deimling, A., Wick, W. & Winkler, F., 2015. Brain tumour cells interconnect to a functional and resistant network. Nature, 528(7580), s.93–98.

Ostrom, Q.T., Gittleman, H., Farah, P., Ondracek, A., Chen, Y., Wolinsky, Y., Stroup, N.E., Kruchko, C. & Barnholtz-sloan, J.S., 2013. N E U RO - O N CO LO GY CBTRUS Statistical Report : Primary Brain and Central Nervous System Tumors Diagnosed in the United States in 2006-2010.

Ostrom, Q.T., Gittleman, H., Stetson, L., Virk, S.M. & Barnholtz-sloan, J.S., 2015. Epidemiology of Gliomas. I Current Understanding and Treatment of Gliomas. s. 1–14.

Park, C., Park, S., Lee, S., Kim, C., Kim, D., Paek, S.H., Kim, D.G., Heo, D.S., Kim, I.H. & Jung, H., 2009. Methylation status of the MGMT gene promoter fails to predict the clinical outcome of glioblastoma patients treated with ACNU plus cisplatin. Neuropathology, 29, s.443–449.

Pu, P., Xia, Z., Yu, S. & Huang, Q., 2004. Altered expression of Cx43 in astrocytic tumors. Clinical Neurology and Neorusurgery, 107, s.49–54.

Reya, T., Morrison, S.J., Clarke, M.F. & Weissman, I.L., 2001. Stem cells, cancer , and cancer stem cells. Nature, 414, s.105–111.

Rienecke, L. & Jørgensen, P.., 2006. Den gode opgave 3th udg., København: Samfundslitteratur. Rouach, N., Koulakoff, A., Abudara, V., Willecke, K. & Giaume, C., 2008. Astroglial Metabolic

Networks Sustain Hippocampal Synaptic Transmission. Science, 322(December), s.1551–1556.

48

Said, H.M., Hagemann, C., Stojic, J., Schoemig, B., Vince, G.H., Flentje, M., Roosen, K. & Vordermark, D., 2007. GAPDH is not regulated in human glioblastoma under hypoxic conditions. BMC Molecular Biology, 8(55), s.1–13.

Shinoura, N., Chen, L., Wani, M.A., Kim, Y.G., Larson, J.J., Warnick, R.E., Simon, M., Menon, A.G., Bi, W.L. & Stambrook, P.J., 1996. Protein and messenger RNA expression of connexin43 in astrocytomas: Implications in brain tumor gene therapy. Journal of Neurosurgery, 84(5), s.839–846.

Sin, W.C., Aftab, Q., Bechberger, J.F., Leung, J.H., Chen, H. & Naus, C.C., 2015. Astrocytes promote glioma invasion via the gap junction protein connexin43. Oncogene, 35, s.1504–1516.

Sin, W.C., Bechberger, J.F., Rushlow, W.J. & Naus, C.C., 2008. Dose-Dependent Differential Upregulation of CCN1 / Cyr61 and CCN3 / NOV by the Gap Junction Protein Connexin43 in Glioma Cells. Journal of Cellular Biochemistry, 103, s.1772–1782.

Sin, W.C., Crespin, S. & Mesnil, M., 2012. Opposing roles of connexin43 in glioma progression. Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes, 1818(8), s.2058–2067.

Singh, S.K., Clarke, I.D., Terasaki, M., Bonn, V.E., Hawkins, C., Squire, J. & Dirks, P.B., 2003. Identification of a Cancer Stem Cell in Human Brain Tumors. CANCER RESEARCH, 63, s.5821–5828.

Sonoda, Y., Kumabe, T., Watanabe, M., Nakazato, Y., Inoue, T., Kanamori, M. & Tominaga, T., 2009. Long-term survivors of glioblastoma : clinical features and molecular analysis. Acta Neurochir, 151, s.1349–1358.

Soroceanu, L., Manning, T.J. & Sontheimer, H., 2001. Reduced expression of connexin-43 and functional gap junction coupling in human gliomas. Glia, 33(2), s.107–117.

Strimbu, K. & Tavel, J.A., 2010. What are Biomarkers? current Opinion in HIV and AIDS, 5(6), s.463–466.

Stupp, R., Mason, W.P., van den Bent, M.J., Weller, M., Fisher, B., Taphoorn, M.J., Belanger, K., Brandes, A.A., Marosi, C., Bogdahn, U., Curschmann, J., Janzer, R.C., Ludwin, S.K., Gorlia, T., Allgeier, A., Lacombe, D., Cairncross, J.G., Eisenhauer, E., Mirimanoff, R.O., European Organisation for, R., Treatment of Cancer Brain, T., Radiotherapy, G. & National Cancer Institute of Canada Clinical Trials, G., 2005. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. N Engl J Med, 352(10), s.987–996.

Thermo Fisher Scientific, 2016a. Hoechst 33342 Solution(20 mM). Available at: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/62249.

Thermo Fisher Scientific, 2016b. Tm Calculator. Available at: https://www.thermofisher.com/dk/en/home/brands/thermo-scientific/molecular-biology/molecular-biology-learning-center/molecular-biology-resource-library/thermo-scientific-web-tools/tm-calculator.html.

Tombal, B., Denmeade, S.R., Gillis, J. & Isaacs, J.T., 2002. A supramicromolar elevation of intracellular free calcium ([ Ca 2 + ] i ) is consistently required to induce the execution phase of apoptosis. Cell Death and Differentiation, 9, s.561–573.

Tran, B. & Rosenthal, M.A., 2010. Survival comparison between glioblastoma multiforme and other incurable cancers. Journal of Clinical Neuroscience, 17(4), s.417–421.

Ueki, T., Fujita, M., Sato, K., Asai, K., Yamada, K. & Kato, T., 2001. Epidermal growth factor down-regulates connexin-43 expression in cultured rat cortical astrocytes. Neuroscience Letters, 313, s.53–56.

Uhl, M., Weiler, M., Wick, W., Jacobs, A.H., Weller, M. & Herrlinger, U., 2005. Migratory neural stem cells for improved thymidine kinase-based gene therapy of malignant gliomas. Biochemical and biophysical research communications, 328(1), s.125–9.

Weinberg, R.A., 2014. The Biology of Cancer 2nd udg., Garland Science. WHO, 1993. Biomarkers and Risk Assessment: Concepts and Principles. WHO International

Programme on Chemical Safety. Available at:

49

http://www.inchem.org/documents/ehc/ehc/ehc155.htm. Xu, X., Francis, R., Wei, C.J., Linask, K.L. & Lo, C.W., 2006. Connexin 43-mediated modulation of

polarized cell movement and the directional migration of cardiac neural crest cells. Development, 133, s.3629–3639.

Ye, X., Jiang, Q., Hong, T., Zhang, Z., Yang, R.-J., Huang, J., Hu, K. & Peng, Y.-P., 2015. Altered expression of connexin43 and phosphorylation connexin43 in glioma tumors. International Journal of Clinical and Experimental Pathology, 8(5), s.4296–4306.

Zeiss, C., 2006. Operating Manual Axio Observer Inverted microscope, Zhang, B., Feng, X., Wang, J., Xu, X., Liu, H. & Lin, N., 2010. Adenovirus-mediated delivery of

bFGF small interfering RNA increases levels of connexin 43 in the glioma cell line, U251. Journal of experimental clinical cancer research CR, 29(1), s.3.

Zhang, G., Cui, X., Sui, D., Ren, X., Zhang, Z., Wang, Z. & Lin, S., 2013. Differential molecular genetic analysis in glioblastoma multiforme of long- and short-term survivors : a clinical study in Chinese patients. Journal of Neuro-Oncology, 113, s.251–258.