Mariana Marcos Determinação de Medicamentos Antiepilépticos e Anticonvulsivantes por UPLC-MS/MS Dissertação apresentada para provas de Mestrado em Química Forense Orientadores: Mestre João Miguel Franco e Dra. Paula Proença e Cunha Co-orientadora: Professora Doutora Teresa Pinho e Melo Julho 2011 Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra Departamento de Química
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Mariana Marcos
Determinação de Medicamentos Antiepilépticos e Anticonvulsivantes por
UPLC-MS/MS
Dissertação apresentada para provas de Mestrado em Química Forense
Orientadores: Mestre João Miguel Franco e Dra. Paula Proença e Cunha
Co-orientadora: Professora Doutora Teresa Pinho e Melo
Julho 2011
Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra Departamento de Química
Determinação de Medicamentos Antiepilépticos e Anticonvulsivantes por UPLC-MS/MS
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RESUMO
Os fármacos antiepilépticos (AED’s) são um grupo de substâncias muito heterogéneo,
com mecanismos de acção distintos, ou uma combinação de vários mecanismos de
acção. Os AED’s são sobretudo utlizados numa combinação que conjuga quase
sempre dois ou mais fármacos deste grupo terapêutico. Este trabalho quis
desenvolver um método analítico onde se pudesse fazer a determinação simultânea
de doze AED’s (Carbamazepina, Felbamato, Fenobarbital, Fenitoína, Gabapentina,
Lamotrigina, Levetiracetam, Oxcarbazepina, Primidona, Rufinamida, Topiramato e
Zonisamida).
O desenvolvimento do método traduziu-se na fortificação de amostras de sangue
(0,1 mL) com um padrão interno, seguida de extracção em fase sólida com recurso a
colunas Oasis HLB (Waters). A análise foi feita através da injecção de 10 µL do
extracto num sistema UPLC-MS/MS (Waters) e nebulização por Electrospray. A
separação cromatográfica foi obtida com uma coluna ACQUITY UPLC® HSS T3 (2,1 x
100 mm I.D., 1,8 µm) (Waters), utilizando uma fase móvel composta por acetonitrilo
e ácido fórmico a 0,1 %, em gradiente, com um fluxo de 0,5 mL/min. As amostras
foram quantificadas após adição do padrão interno, monitorizando as respectivas
transições iónicas (MRM) para cada AED. O método foi validado de acordo com o
procedimento em vigor no serviço de toxicologia forense da delegação do centro do
Instituto Nacional de Medicina Legal, I.P..
Os parâmetros de validação estudados incluíram, entre outros, a linearidade,
precisão, exactidão, selectividade, limites de quantificação e detecção. O método
mostrou ser adequadamente sensível e selectivo para os 12 AED’s, obtendo-se
também um desempenho linear para a gama de trabalho compreendida entre 50 e
5000 ng/mL, sempre com um coeficiente de correlação superior a 0,9925. Não foi
detectado nenhum fenómeno de arrastamento ou efeito de matriz relevante.
Foi obtido um método rápido e que serve o propósito para que foi criado, capaz de
detectar, identificar e quantificar simultaneamente as doze substâncias estudadas.
Mariana Marcos Mestrado em Química Forense 2011
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ABSTRACT
Antiepileptic Drugs (AED’s) are a very heterogeneous group of compounds, with very
diverse mechanisms of action. Epilepsy therapy is mainly treated using a
combination of two, or more, drugs. The present work was elaborated with the
intention of developing a single method that allowed the simultaneous
determination of twelve AED’s (Carbamazepine, Felbamate, Phenobarbital,
Rufinamide, Topiramate e Zonisamide), considering the ones commercialized in
Portugal, and then validate the method.
The developed analytical method consisted of spiking 0.1 mL blood samples with the
internal standard (Promazine), pre-concentration and clean-up by solid phase
extraction (Oasis HLB 3cc, WatersTM) followed by ultra performance liquid
chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS), using electrospray
ionization (ESI). The separation was carried out on a Waters ACQUITY UPLC® HSS T3
column (2.1 x 100 mm I.D., 1.8 µm), with a mobile phase containing acetonitrile
and formic acid 0.1 % in gradient, at a flow rate of 0.5 mL/min, with a run time of
10 minutes. The samples were quantified by internal standard method detecting the
ion transitions by a multiple reaction monitoring (MRM), for each AED. The described
method was developed under the guidelines of Forensic Toxicology Laboratory
(INML, I.P. - Centre Branch).
The results were obtained using weighed regression to calculate the calibration
curves. The assay was validated in terms of linearity, accuracy and precision,
achieving a sensitive (limit of quantification ranges from 45 ng/mL to 233 ng/mL)
and selective method for quantification of the 12 AED’s. Calibration curves for all
AED’s were linear from 50 to 5000 ng/mL and showed correlation coefficients (r2)
better than 0.9925. No detectable carry-over and no relevant cross-talk and matrix
effect occurred.
This work describes a simple and validated method for the simultaneous
determination of 12 different AED’s in blood samples. Based on the analytical results
and short run time, the method is suitable to support routine analysis of
Antiepileptic Drugs in a forensic toxicology laboratory.
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AGRADECIMENTOS
À Dra. Paula Proença pela supervisão, orientação, pelo conhecimento
transmitido, pelo inestimável apoio, empenho e dedicação dispensados ao
longo de todo o estágio. Por toda a sua amizade, exigência e confiança que
em mim depositou. Muito obrigada por tudo.
Ao Dr. João Miguel Franco pela orientação, pela oportunidade de me deixar
participar activamente no funcionamento do serviço e também pela
confiança em mim depositada, desde o início do meu estágio.
À Professora Doutora Teresa Pinho e Melo, por todo o apoio e orientação
concedidos.
À Dra. Carla Mustra pela ajuda e disponibilidade no acompanhamento do
trabalho laboratorial, pela amizade e paciência.
Ao Instituto Nacional de Medicina Legal, por permitirem a realização do meu
trabalho no Serviço de Toxicologia Forense da Delegação Centro.
A todos os elementos do Serviço de Toxicologia Forense da Delegação do
Centro, pela hospitalidade e acompanhamento ao longo do meu trabalho.
Agradeço verdadeiramente o apoio, a paciência, a amizade e boa disposição
que sempre me transmitiram. Um especial agradecimento à equipa 3, que
tão bem me recebeu.
Ao departamento de Química da Faculdade de Ciência e Tecnologia da
Universidade de Coimbra por me conceder a oportunidade de aí realizar o
mestrado.
À minha família, amigos e a todos aqueles que, não estando aqui
mencionados, de alguma forma me apoiaram na realização deste mestrado,
e que sabem quem são, o meu mais sincero obrigada.
Mariana Marcos Mestrado em Química Forense 2011
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ABREVIATURAS: ACN – acetonitrilo;
AED’s – medicamentos antiepilépticos (do inglês antiepileptic drugs);
GABA – ácido γ-aminobutírico;
GC – cromatografia gasosa (do inglês gas chromatography);
H2O – água;
HPLC – cromatografia líquida de alta pressão (do inglês high pressure liquid
chromatography);
INML, I.P. – Instituto Nacional de Medicina Legal – Instituto Público;
LC-MS/MS - cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massa sequencial
(do inglês liquid chromatography – tandem mass spectrometry);
MeOH – metanol;
MRM – do inglês multiple recording monitoring;
MS – espectrometria de massa (do inglês mass spectrometry);
m/z – relação massa/carga
NMDA – N-metil-D-aspartato;
s/n – razão sinal/ruído (do inglês signal/noise)
SIR – do inglês selected ion recording;
STF - serviço de toxicologia forense;
TIAFT – do inglês International Association of Forensic Toxicologists;
TIC – do inglês total ion chromatogram;
TLC – cromatografia de camada fina (do inglês thin layer chromatography);
UPLC-MS/MS – cromatografia líquida de ultraperformance acoplada a espectrometria de massa sequencial (do inglês ultra performance liquid chromatography – tandem mass spectrometry).
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1.3.3. Farmacocinética e Farmacodinâmica dos AED’s em estudo
O conhecimento dos mecanismos de acção e da farmacocinética dos AED’s é
muito importante, tanto em toxicologia forense como em toxicologia clínica,
sobretudo quando são utilizados como co-medicação.
São muitas as estruturas e sistemas do organismo que estão envolvidos
durante uma crise epiléptica, como sejam os neurónios, os canais iónicos,
receptores, células da glia e sinapses inibitórias e excitatórias. Assim, os
AED’s foram desenvolvidos com o propósito de modificar estes processos no
sentido de favorecer a inibição em função da excitação, com a finalidade de
evitar e prevenir as crises epilépticas.
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Ainda que os doze fármacos antiepilépticos que se pretendeu estudar neste
trabalho tenham propriedades físico-químicas bastante distintas eles podem
agrupar-se em 7 grandes grupos: bloqueadores dos canais de sódio
dependentes da voltagem (Carbamazepina, Fenitoína, Oxcarbazepina,
Lamotrigina e Rufinamida), inibidores das correntes de cálcio, potenciadores
do ácido γ-aminobutírico, vulgarmente designado por GABA, (Gabapentina),
antagonistas do glutamato (Felbamato), inibidores da anidrase carbónica
(Zonisamida), agonistas do receptor GABAA (Fenobarbital e Primidona) e
fármacos com mecanismos de acção desconhecidos ou com mais do que um
mecanismo de acção (Levetiracetam e Topiramato) (3).
De seguida, são apresentadas as propriedades farmacocinéticas e modos de
acção mais relevantes para as substâncias com propriedades antiepilépticas
no âmbito deste trabalho.
Figura 9 - Canal de sódio dependente da voltagem. AED’s (Carbamazepina, Lamotrigina e
Fenitoína) ligam-se ao canal inactivando-o.
CARBAMAZEPINA
Desde 1968 que a Carbamazepina é utilizada como AED e como estabilizador
de humor. É o principal fármaco antiepiléptico de primeira linha utilizado no
tratamento de crises parciais e crises generalizadas tónico-clónicas (tabela
1). É um composto tricíclico, também utilizado no tratamento da doença
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bipolar, entre outras patologias, como por exemplo no tratamento da
hiperactividade e da esquizofrenia.
O principal modo de acção da Carbamazepina é através do bloqueio dos
canais de sódio dependentes da voltagem (figura 9) (6) (3) (18), uma vez que a
sua estrutura química lhe permite ligar-se, logo após a sua abertura,
impedindo o influxo de iões de sódio. Consequentemente, as membranas
neuronais excitadas são estabilizadas, as descargas neuronais repetitivas são
inibidas e a propagação sináptica dos impulsos excitatórios em neurónios
despolarizados é restringida, isto é, leva a que os neurónios exibam uma
menor frequência de disparo, diminuindo a sua actividade.
A Carbamazepina é extensivamente biotransformada no fígado e tem a
capacidade de induzir a sua própria biotransformação, bem como a de
outros fármacos antiepilépticos. A principal via metabólica ocorre por
epoxidação a 10,11-epóxido de Carbamazepina, que é um metabolito activo,
e a 10,11-trans-di-hidrodiol, um metabolito inactivo. A semivida de
eliminação varia entre 5-26 % e é afectada pelo facto de a Carbamazepina
induzir a sua própria biotransformação (3).
FELBAMATO
O Felbamato é considerado um potente anticonvulsivante, com uso em
diferentes tipos de crises (3). Possui, no entanto, muitos efeitos adversos que
limitam a sua utilização.
Este AED, actua modulando os canais de sódio dependentes da voltagem, os
canais de cálcio, actua nos receptores GABAA e bloqueia os receptores do
tipo NMDA (figura 11) (6) (19). Apesar do mecanismo de acção ser complexo
este composto não tem efeito sobre o GABA (3) (18).
O Felbamato sofre uma biotransformação extensa no fígado. Possui
interacções com alguns AED’s, como a Fenitoína, Carbamazepina e Valproato
de Sódio, alterando os seus níveis plasmáticos (3).
O Felbamato é bem absorvido por via oral e liga-se às proteínas plasmáticas
com uma extensão que vai dos 20 aos 25 %. É amplamente biotransformado
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no fígado (> 50 %), dando origem a metabolitos inactivos, e tem uma
semivida de 13 – 30 horas. A sua semivida de eliminação é fortemente
afectada pelos indutores enzimáticos (3) (20).
Devido aos efeitos secundários tóxicos e potencialmente fatais (anemia
aplástica e hepatotoxicidade) o uso deste AED está limitado a casos em que
os indivíduos não respondem ao tratamento com outros fármacos
antiepilépticos.
FENITOÍNA
A Fenitoína, ou Difenilhidantoína, foi introduzida no mercado em 1938 (3) e
tem sido utilizado desde então como um AED de primeira linha no
tratamento de crises parciais e generalizadas. A sua capacidade
anticonvulsivante foi descoberta em 1936 após ter sido desvendada a sua
capacidade protectora contra convulsões induzidas por electrochoques em
modelo animal (gato) (7). É dos fármacos antiepilépticos mais utilizados em
terapia coadjuvante, embora apresente um perfil de interacções
farmacológicas bastante problemático, em parte devido ao facto de se ligar
a proteínas plasmáticas (> 90 %) e também por sofrer biotransformação via
Citocromo P450 (3). A Fenitoína é uma substância lipofílica, o que lhe permite
atravessar as membranas plasmáticas com relativa facilidade e tem
características de um ácido fraco (pka entre 8,3 e 9,2), sendo por isso solúvel
em soluções alcalinas (3).
O alvo da Fenitoína são os canais de sódio dependentes da voltagem,
bloqueando-os de forma semelhante à Carbamazepina, tal como ilustrado
nas figuras 9 e 11 (3) (6) (18).
FENOBARBITAL
O Fenobarbital foi sintetizado pela Bayer em 1902 como hipnótico (Luminal®)
mas só em 1912, com a sua comercialização e com a descoberta das
propriedades antiepilépticas e anticonvulsivantes, deu início à era
farmacológica do tratamento da epilepsia (6).
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O Fenobarbital, o fármaco antiepiléptico mais vendido no século XX,
pertence ao grupo dos barbitúricos e é um potente anticonvulsivante, com
um largo espectro de acção (3). A sua acção é complexa e ocorre ao nível dos
canais de cálcio reduzindo o seu influxo, receptores GABAA, mais
especificamente ao nível dos canais de cloro onde se fixa no local específico
de ligação dos barbitúricos e, ainda, ao nível dos receptores do Glutamato,
deprimindo a excitabilidade glutaminérgica (3) (18).
O Fenobarbital é considerado um forte indutor das enzimas microssómicas do
fígado. A sua taxa de absorção é influenciada pelo consumo de álcool
(aumenta a taxa de absorção) e a sua distribuição é afectada pelas variações
de pH (em condições de pH ácido a concentração de Fenobarbital aumenta).
Este fármaco possui uma semivida de eliminação muito longa (entre 75 a 120
horas, podendo atingir as 400 horas em crianças) e sofre transformação
hepática, sendo o seu principal metabolito o p-hidroxifenobarbital. O
Fenobarbital está sujeito a uma intensa reabsorção renal, a qual poderá ser
reduzida pela alcalinização da urina (3).
Nos dias de hoje, a utilização do Fenobarbital encontra-se mais limitada
devido à intensidade e tipo de efeitos secundários, tal como acontece com
outros barbitúricos, e devido também às interacções farmacológicas que
possui com outros medicamentos antiepilépticos quando usados em
terapêutica conjunta (e.g. Valproato de sódio, Felbamato e Fenitoína). Este
AED pode ainda causar dependência física e agravar as crises com a sua
utilização crónica (3).
GABAPENTINA
Apesar de ser um análogo estrutural do GABA (figura 10) não possui
actividade sobre o seu receptor. Sabe-se que a Gabapentina actua
aumentando os níveis de GABA no cérebro, mas o mecanismo pelo qual isso
acontece não está ainda bem esclarecido (3) (20) (17) (21).
A Gabapentina actua também aumentando a actividade da descarboxílase do
glutamato, mas de forma pouco intensa. Actua nos canais de cálcio e é
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também um inibidor da transferase dos ácidos aminados ramificados –
mecanismo que reduz os níveis cerebrais de glutamato (6) (3) (18).
Figura 10 – Estrutura do GABA (A) e da Gabapentina (B) (22).
A Gabapentina foi desenvolvida para o tratamento de crises parciais, como
terapêutica de segunda linha. Apresenta algumas propriedades analgésicas (5)
(17) (21).
Tem particular importância para indivíduos mais idosos e crianças, devido ao
facto de não ser metabolizada no fígado, não induz as enzimas hepáticas
nem se liga a proteínas plasmáticas. Esta substância é excretada
exclusivamente por via renal (17).
A Gabapentina não possui interacções com outros fármacos, embora a sua
biodisponibilidade possa ser reduzida pelo uso de antiácidos.
LAMOTRIGINA
A Lamotrigina, sendo um composto triazínico, é quimicamente bastante
diferente de todos os outros AED’s. Apesar disso tem um mecanismo de
acção semelhante a outros fármacos antiepilépticos, actuando como agente
bloqueador dos canais de sódio dependentes da voltagem (6) (18).Tem também
uma acção despolarizante da membrana pré-sináptica glutaminérgica,
inibindo a libertação de glutamato (3). Está ainda descrita actividade
bloqueante ao nível dos canais de cálcio dependentes da voltagem (figura
11) (18) (19). É usada como antiepiléptico de primeira linha em crises parciais e
generalizadas (3).
A Lamotrigina é rápida e completamente absorvida pelo tracto
gastrointestinal e cerca de 50 a 60 % vai ligar-se a proteínas plasmáticas. A
sua semivida é de 24 a 41 horas (3) (20). É extensivamente metabolizada,
principalmente por glucuronização, num metabolito inactivo. De forma
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semelhante ao que acontece com a Carbamazepina, esta substância possui a
capacidade de auto-indução, por essa razão, o seu metabolismo é
fortemente afectado pela terapêutica conjunta com outros indutores
enzimáticos (20).
LEVETIRACETAM
O Levetiracetam é um fármaco bastante recente e possui um mecanismo de
acção ainda por desvendar, mas sabe-se que exerce actividade ao nível dos
canais de cálcio e também ao nível do sistema gabaminérgico apesar desses
não serem os seus alvos de acção directos (3) (6) (18) (19).
O Levetiracetam é fácil e rapidamente absorvido quando administrado por
via oral, com uma biodisponibilidade de 100 %. Não se liga a proteínas
plasmáticas e sofre biotransformação (27 %), principalmente por hidrólise do
grupo acetamida, sem implicação do Citocromo P450. Esta substância não dá
origem a metabolitos com o efeito terapêutico significativo (3) .
Apesar de ter uma semivida de eliminação de 6 a 8 horas a semivida
farmacocinética é mais extensa (3).
Não são conhecidas interacções medicamentosas relevantes e não possui
efeitos secundários significativos, estando apenas descrito que provoca
sonolência, vertigens, síndroma do tipo gripal e dores de cabeça, sendo que
estes sintomas tendem a desaparecer ao fim de quatro semanas de
tratamento (3) (19).
OXCARBAZEPINA
A Oxcarbazepina é um análogo estrutural da Carbamazepina (figura 8) e o
seu desenvolvimento teve como objectivo recriar o efeito benéfico da
Carbamazepina mas sem os efeitos secundários indesejados desta, como seja
a auto-indução enzimática hepática, ou o perfil de interacções
medicamentosas a ela associadas.
Porque é estruturalmente muito próxima da Carbamazepina, também o
efeito farmacológico é semelhante, actuando por bloqueio dos canais de
sódio dependentes da voltagem (figura 11) (3) (6) (18) (19).
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Sofre absorção quase total após administração oral sendo biotransformada
por via hepática e dando origem ao metabolito activo derivado 10-mono-
hidróxido (ou licarbazepina). Este metabolito é responsável pelos efeitos
farmacológicos da Oxcarbazepina, que é na realidade um pró-fármaco (20). A
licarbazepina liga-se às proteínas com uma extensão de cerca de 38 % e
atravessa com relativa facilidade a membrana hematoencefálica (3).
A Oxcarbazepina é indutora de algumas enzimas do Citocromo P450, embora
em menor grau do que a Carbamazepina. Possui uma semivida de 8 a 10
horas e é excretada por via renal (3) (20).
Este AED interactua com contraceptivos orais, reduzindo o seu efeito (3) (19).
PRIMIDONA
A Primidona é metabolizada em Fenobarbital e Fenilmetilmalonamida
(PEMA) e pensa-se que o seu efeito farmacológico depende da formação do
Fenobarbital (figura 3).
A Primidona é absorvida por via oral com uma biodisponibilidade de
praticamente 100 % e possui uma taxa de ligação a proteínas baixa (25 %).
Tem uma semivida de eliminação de 5 a 18 horas sendo o seu efeito
prolongado pela metabolização em Fenobarbital, com uma semivida de
eliminação mais elevada (ver FENOBARBITAL).Tal como descrito na figura 3,
a Primidona é metabolizada pelo sistema do Citocromo P450 (3).
As reacções adversas atribuídas à Primidona são semelhantes às do
Fenobarbital.
RUFINAMIDA
A Rufinamida é um dos AED’s mais recentes no mercado, aprovado para uso
na Europa apenas em 2007. Esta substância tem actividade ao nível dos
canais de sódio dependentes da voltagem, inibindo-os.
A Rufinamida é facilmente absorvida, com uma extensão que ronda os 85 %,
quando administrada por via oral, sendo a sua absorção significativamente
aumentada pela ingestão concomitante de alimentos. Esta substância é
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extensivamente metabolizada via hidrólise enzimática mediada pela
carboxiesterase num metabolito inactivo, eliminado na urina (20).
O metabolismo da Rufinamida pode ser acelerado pela toma conjunta de
outros fármacos indutores da actividade enzimática, como a Carbamazepina
(20).
TOPIRAMATO
O Topiramato é talvez o mais singular de todos os AED’s porque é um
derivado estrutural da D-frutose e foi desenvolvido com o propósito de
actuar como fármaco antidiabético. O Topiramato tem uma actividade muito
diversa actuando ao nível dos canais de sódio dependentes da voltagem, dos
canais de cálcio e potenciando os níveis de GABA no organismo. Possui
também um efeito bloqueante nos receptores do glutamato do tipo AMPA.
Está também descrita uma ligeira inibição da anidrase carbónica (3).
O Topiramato é rapidamente absorvido após administração oral com uma
biodisponibilidade que se pode dizer próxima dos 100 %, ligando-se a
proteínas plasmáticas em cerca de 15 %. Entre 15 a 50 % da dose absorvida é
metabolizada por via hepática (Citocromo P450) sendo o seu metabolismo
potenciado pela toma conjunta de indutores enzimáticos. Nenhum dos seus
metabolitos possui actividade antiepiléptica. O Topiramato é praticamente
excretado na totalidade, inalterado, através da urina (85 %) (3) (20).
ZONISAMIDA
A Zonisamida é uma substância derivada das sulfonamidas e quimicamente
distinta de qualquer outro AED. Actua ao nível dos canais de sódio
dependentes da voltagem, bloqueando-os e influencia a actividade dos
canais de cálcio de tipo T (3) (18) (19). Está ainda descrita a actividade desta
substância ao nível da inibição da anidrase carbónica (23).
Este AED é usado na terapêutica de crises parciais, como coadjuvante, e a
sua utilização tem a vantagem de não apresentar interacções com outros
fármacos antiepilépticos, não alterando os níveis plasmáticos de outros
AED’s.
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A Zonisamida é rapidamente absorvida quando administrada por via oral e
tem uma semivida de cerca de 60 horas. Contudo, a Fenitoína, a
Carbamazepina e o Fenobarbital diminuem a semivida da Zonisamida (para
cerca de 27 a 46 horas) (3). Apresenta uma elevada taxa de ligação às
proteínas plasmáticas (40 %). Este fármaco é parcialmente biotransformado
pelo fígado (70 %), via Citocromo P450, seguido de glucuronoconjugação. A
Zonisamida utiliza o Citocromo P450 mas não o induz. Os seus metabolitos
são inactivos. Cerca de 35 % da Zonisamida é excretada na urina (3).
Figura 11 – Representação esquemática dos principais mecanismos de acção dos 12 AED’s. Adaptado (19).
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1.4. Interacções medicamentosas
Um outro aspecto importante para a interpretação dos dados toxicológicos
são as interacções entre diferentes substâncias, neste caso específico,
interacções medicamentosas, especialmente relevantes no caso dos AED’s
pois é bastante comum que o tratamento seja feito com recurso a mais do
que um medicamento.
Na grande parte dos casos, clínicos ou forenses, está presente mais do que
uma substância. Este factor associado a automedicação, com recurso a
medicamentos que podem ser adquiridos sem receita médica, ao consumo
de álcool e drogas ilícitas, contribui de forma activa para a ocorrência de
interacções.
Na teoria, os dados farmacocinéticos descritos na literatura são referentes
apenas a uma substância mas, na prática, dificilmente o toxicologista estará
na presença isolada de um composto. Os resultados analíticos devem, por
isso, ser cuidadosamente interpretados, sobretudo no que diz respeito aos
efeitos sinérgicos resultantes da combinação entre substâncias.
As interacções entre substâncias podem ser divididas em dois tipos (1):
- as que afectam a concentração da substância (isto é, alterações no
processo de absorção, distribuição e eliminação);
- as que afectam a resposta da substância (alterando a duração e
severidade da acção).
Outros mecanismos de interacção relevantes incluem:
- interferências na absorção de outras substâncias;
- modificação da via e/ou velocidade do metabolismo;
- alteração do acesso a receptores e tecido alvo.
As consequências de grande parte das interacções podem ser antecipadas
pelo conhecimento prévio dos efeitos das substâncias consideradas
individualmente. Substâncias com efeito farmacológico oposto têm um
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efeito antagonista. Pelo contrário, em duas substâncias cuja acção
farmacológica seja semelhante o seu efeito será aditivo.
1.5. Metabolitos activos
Existem numerosas substâncias que se tornam activas após serem
modificadas por um processo metabólico. Isto pode ser feito com o intuito
de facilitar o processo de absorção por via oral ou para reduzir a toxicidade.
Quando um metabolito activo contribui activamente para o efeito
farmacológico obtido, a interpretação dos resultados toxicológicos pode
ficar dificultada. Situações reais envolvendo estes metabolitos podem levar
a interpretações menos correctas se só é tido em conta o efeito da
substância mãe. Assim sendo, revela-se importante contabilizar também as
concentrações dos metabolitos activos.
1.6. Redistribuição Post-mortem
Uma distribuição desequilibrada das substâncias pelos tecidos pode conduzir
a alterações na concentração destas no sangue, após a morte. Este processo
designa-se por redistribuição post-mortem e ocorre sobretudo através de um
processo de difusão dos tecidos ou órgãos adjacentes para a corrente
sanguínea. Este processo adquire elevada importância para compostos com
grande solubilidade lipídica, pois esses tendem a apresentar concentrações
díspares em tecidos e sangue.
A redistribuição post-mortem é um processo de alguma complexidade e que,
possivelmente envolve pelo menos três mecanismos (1), o de libertação e
difusão da substância, para tecidos ou órgãos perto do coração e pulmões, o
de difusão simples da substância directamente do conteúdo gastrointestinal
para locais adjacentes e o de distribuição incompleta.
Até para substâncias que sofrem pouca, ou mesmo nenhuma, redistribuição
post-mortem podem existir grandes diferenças de concentração no sangue,
dependendo de onde é feita a recolha (sangue arterial versus sangue
periférico), especialmente em situações de overdose.
Determinação de Medicamentos Antiepilépticos e Anticonvulsivantes por UPLC-MS/MS
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A recolha de sangue periférico (artéria femoral ou subclávia) reduz
significativamente a extensão deste tipo de alterações post-mortem, pois
este encontra-se menos sujeito ao fenómeno de redistribuição. O sangue
periférico é, por isso, a matriz de eleição para análises toxicológicas,
sobretudo quando está em causa a quantificação de substâncias.
1.7. Interpretação de resultados
Na interpretação de resultados toxicológicos é preciso ter em conta as
diferenças entre concentração terapêutica, tóxica e fatal.
Atribui-se a designação de concentração terapêutica à concentração do
fármaco esperada, quando é seguida a dose recomendada (1). O termo
concentração terapêutica não é naturalmente aplicável a algumas
substâncias, como é o caso de drogas ilícitas ou álcool.
O conceito de concentração tóxica surge quando a dose de uma determinada
substância ingerida tem como consequência reacções adversas no organismo.
Já a concentração fatal está directamente relacionada com níveis da
substância, que possa por si conduzir à morte.
Existem alguns dados na literatura que têm à disposição as concentrações
terapêuticas, tóxicas e potencialmente fatais (e.g. TIAFT (24)). Este tipo de
informação constitui uma ferramenta valiosa na avaliação de resultados mas
deve ser utilizada com extrema precaução nos casos post-mortem.
A interpretação dos resultados analíticos pode ser feita comparando os
resultados obtidos com a informação disponível na literatura ou com
respostas clínicas obtidas em casos semelhantes.
Factores como sejam a tolerância, a variabilidade inter-individual da
resposta farmacológica, interacções, presença ou ausência de uma patologia
e as circunstâncias da morte são muito variáveis, dificultando a
interpretação de resultados. Os dados farmacocinéticos e toxicológicos
devem ser usados tendo em conta as circunstâncias específicas do caso
Mariana Marcos Mestrado em Química Forense 2011
42
examinado, pois existe sempre a possibilidade de se interpretar
incorrectamente por não se ter tido em atenção uma situação específica e
particular.
Infelizmente o que acontece em muitos casos forenses é que não existe
muita informação acerca do incidente, o que pode implicar que os
resultados obtidos possam ser incorrectamente interpretadas. Uma maneira
de contornar esta situação será determinar as concentrações na urina, bílis
ou fígado e relacioná-las com a concentração em sangue ou, em alternativa,
determinar a concentração da substância mãe e dos seus metabolitos,
relacionando-os.
A análise de vários órgãos e tecidos, e o confronto desses valores pode
constituir a resposta às perguntas que se pretendem respondidas.
Infelizmente o elevado número de casos a analisar impossibilita, regra geral,
esta prática.
Para a conclusão de uma causa de morte por intoxicação o médico
patologista deve fazer a integração dos vários elementos disponíveis, como
sejam, a informação da polícia, o exame do local, os achados autópticos e os
resultados dos exames toxicológicos e histopatológicos.
Compete pois ao patologista forense valorizar os resultados analíticos em
função de cada caso.
1.8. Amostras Biológicas
Existe uma grande diversidade de amostras que podem ser analisadas em
toxicologia forense (e.g. órgãos colhidos na autópsia, fluídos biológicos
obtidos do cadáver ou do vivo, produtos orgânicos e inorgânicos). Conforme
a especificidade do caso e o tipo de análise pretendida, procede-se assim à
selecção e colheita da amostra, ou amostras, mais apropriadas.
É da responsabilidade do laboratório definir o tipo e quantidades de amostra
necessária para as análises pretendidas pelos requisitantes, bem como o tipo
Determinação de Medicamentos Antiepilépticos e Anticonvulsivantes por UPLC-MS/MS
43
de preservantes. Cabe também ao laboratório que recebe as amostras dar as
indicações que achar necessárias para o seu correcto armazenamento.
O STF está a trabalhar no sentido da uniformização destas regras, com a
criação de uma norma procedimental que regulamenta a colheita e
acondicionamento de amostras em toxicologia forense.
Deverá ser tido em conta que a colheita determina a qualidade dos
resultados analíticos. O perito médico-legal deve assegurar-se de que a
colheita é feita de modo adequado, tendo sempre em mente a análise
pretendida.
Os frascos de amostra devem ser novos, hermeticamente fechados, sem
qualquer conservante e devem ainda ser selados e devidamente rotulados
(incluindo a entidade que solicita a análise, nome da vítima, designação do
conteúdo e assinatura do perito) e devem ser acondicionados em caixas
isotérmicas (5 - 10ºC). São excepção, as amostras de sangue enviadas para
determinação de etanol e monóxido de carbono. Esses tubos devem conter
0,1 g de fluoreto de sódio por cada 10 mL de sangue e deve encher-se o tubo
até à sua capacidade máxima.
Para a determinação de medicamentos, nomeadamente os medicamentos
antiepilépticos, a matriz de eleição é o sangue, se possível sangue femoral
ou, em alternativa, sangue da cavidade cardíaca (só em casos post-mortem).
Recomenda-se aos médicos patologistas que a recolha do sangue periférico
seja feita da veia femoral, antes de serem retirados os órgãos, num volume
de 10 mL (25).
Outras matrizes relevantes para a toxicologia forense são a urina,
importante para triagem (principal via de eliminação), o estômago e
conteúdo gástrico, em casos de intoxicação aguda por via oral e humor
vítreo, uma matriz alternativa na ausência de sangue e em cadáveres em
início de putrefacção (matriz mais protegida de infecções bacterianas).
Outras amostras podem ser colhidas, apesar de não fazer parte do
Mariana Marcos Mestrado em Química Forense 2011
44
procedimento de rotina. São elas a bílis, fígado, rim, pulmão, coração e
cérebro, estes podem ser particularmente importantes em situações de
suspeita de intoxicação. Poderão adicionalmente ser colhidas amostras de
cabelo e unhas (e.g. determinação de metais pesados).
No STF estão disponíveis tubos e contentores próprios para a colheita e
acondicionamento das amostras, bem como sacos de embalagem adequados
para o envio destas.
Deve ser sempre tido em atenção a manutenção da cadeia de custódia das
amostras, pois se esta for quebrada, a validade dos resultados será colocada
em causa.
A análise toxicológica pode ser prejudicada, ou mesmo inviabilizada, se as
amostras forem inadequadas à análise pretendida, se forem mal
acondicionadas, em recipientes e preservantes inadequados, se houver um
armazenamento incorrecto e se houver um atraso significativo no seu envio
para o STF. Assim, na conservação das amostras deve ser eliminado todo e
qualquer factor de contaminação. O acondicionamento deve ser feito tendo
em conta as condições de luz, humidade e calor - fontes prováveis de
reacções de oxidação ou hidrólise que podem acelerar a decomposição dos
produtos.
Quanto menor for o tempo decorrido entre a morte, ou qualquer outro
evento traumático, e a recolha das amostras, mais fidedignos serão os
resultados obtidos. Este aspecto é particularmente relevante no caso de
substâncias como o monóxido de carbono, etanol e alguns produtos
farmacêuticos (passíveis de alterações post-mortem).
1.9. Cromatografia Líquida acoplada à Espectrometria de Massa
1.9.1. Cromatografia Líquida
A cromatografia líquida sofreu uma grande evolução até ao HPLC, e mais
recentemente ao UPLC, permitindo separar e analisar amostras complexas.
Determinação de Medicamentos Antiepilépticos e Anticonvulsivantes por UPLC-MS/MS
45
As técnicas de separação por cromatografia líquida oferecem um enorme
poder de resolução, detecção, quantificação, bem como uma grande rapidez
e aplicabilidade a diferentes tipos de amostras.
A cromatografia líquida assenta no princípio de que uma determinada
substância, quando passa através de uma coluna com um determinado
enchimento e eluente (fase móvel), pode ser expressa como tempo de
retenção – dependente também do fluxo, do comprimento e diâmetro da
coluna.
Ao falar de cromatografia líquida é importante clarificar alguns termos.
Considera-se a resolução como o parâmetro que descreve o poder de
separação de todo o sistema cromatográfico em relação a determinados
componentes da mistura em análise. A sensibilidade de uma análise
cromatográfica é a medida do nível mais baixo detectado de um
determinado componente e é dependente da razão sinal-ruído para a
detecção (1). Considera-se normalmente que o limite de detecção é 3 vezes a
razão sinal/ruído, e que o limite de quantificação é 10 vezes esta razão.
A instrumentação de um LC inclui uma bomba, um injector, uma coluna, um
detector e um sistema de tratamento de dados (computador) onde ficam
armazenados os resultados (workstation).
A separação cromatográfica ocorre na coluna analítica, constituída por um
enchimento (fase estacionária) que deve ser adequado à análise a efectuar,
e que é composta por partículas microporosas com diâmetros da ordem dos
micrómetros.
É necessária uma bomba de alta pressão para fazer passar a fase móvel
através da coluna. O processo cromatográfico propriamente dito começa
com a injecção da amostra no início da coluna e a separação dos
componentes ocorre quando os analitos e a fase móvel são bombeados pela
coluna. Eventualmente, cada componente será eluido da coluna e será
registado na forma de um pico, a um determinado tempo de retenção. A
resposta do detector a cada componente é registada na forma de um
Mariana Marcos Mestrado em Química Forense 2011
46
cromatograma (intensidade relativa vs. tempo). Os dados são depois
processados com recurso a ferramentas informáticas específicas para o
efeito.
Na figura 12 encontra-se esquematizado um sistema de LC-MS típico.
Figura 12. Sistema HPLC-MS típico. Adaptado (1).
1.9.2. Espectrometria de Massa
Até aos dias de hoje os espectrómetros de massa provaram ser capazes de
funcionar tanto como instrumentos qualitativos, como quantitativos.
A unidade de medida da massa é o Dalton (Da) – um Dalton corresponde a
1/12 da massa de um único átomo do isótopo de carbono 12 (12C).
O espectrómetro de massa pode medir a massa de uma molécula apenas
depois de ter convertido a molécula num ião em fase gasosa, isto é, a
molécula tem de ser ionizada. Para tal é preciso aplicar uma carga eléctrica
e converter o fluxo de iões carregados resultante, numa corrente eléctrica
proporcional que o sistema de análise (software) consiga registar. O sistema
de análise converte a corrente criada em informação digital, traduzida na
forma de um espectro de massa (intensidade relativa vs. razão
massa/carga). Os iões são separados, detectados e medidos de acordo com a
razão massa-carga (m/z).
Determinação de Medicamentos Antiepilépticos e Anticonvulsivantes por UPLC-MS/MS
47
O sinal correspondente à corrente iónica relativa é expresso num espectro
de massa em função da razão m/z. Assim, a cada instante representado pelo
pico cromatográfico é possível fazer corresponder os iões presentes nesse
momento e passar a representar essa relação em função da razão m/z
(figura 13 – (b) e (c)).
Figura 13 – O aumento da abundância na corrente do ião total (TIC – Total Ion Cromatogram) está representada na figura pelo cromatograma (a). A cada ―fatia‖ do pico correspondem os iões presentes na corrente, àquele tempo de retenção. O eixo das abcissas, que no cromatograma representa o factor tempo, passa agora a ser a razão massa/carga (m/z) (b). O espectro pode ser depois reduzido a um ―stick plot‖, que é apenas a representação dos centroides de cada pico de massa, aumentando a resolução da informação obtida (26).
Existem vários métodos de ionização que podem ser utilizados em LC-MS,
incluindo ionização electrónica, ionização química, FAB (fast atom
bombardment), thermospray, electrospray e APCI (atmospheric-pressure
chemical ionization).
Vão apenas ser discutidas, brevemente, algumas das características da
ionização por electrospray (ESI), por ser o tipo de ionização utilizado na
execução deste trabalho, e a sua aplicação em espectrometria de massa.
Em contraste com outras técnicas de ionização, o electrospray funciona à
pressão atmosférica. Os espectros são produzidos por passagem de um feixe
Mariana Marcos Mestrado em Química Forense 2011
48
líquido por um capilar metálico mantido a voltagens elevadas (3 – 4 kV). É
esta voltagem que faz dispersar o feixe líquido, formando uma névoa de
gotas de iões carregados que sofrem desolvatação durante a sua passagem
pela fonte. À medida que vai diminuindo o tamanho das gotas atinge-se um
ponto em que as forças repulsivas entre as cargas à sua superfície é
suficientemente grande para ultrapassar a tensão superficial destas. Este
processo vai dar origem a gotas cada vez mais pequenas. Este processamento
é repetido até se obter iões dos analito de interesse, os quais são depois
transferidos através de uma série de lentes até ao espectrómetro de massa.
O triplo quadrupolo é talvez o sistema mais utilizado em MS/MS. Na prática,
é constituído por três quadrupolos em série (figura 14 – Q1, Q2 e Q3), onde o
segundo quadrupolo (Q2) não é utilizado para separação das massas, mas sim
como célula de colisão, onde os iões separados no primeiro quadrupolo são
fragmentados e encaminhados para o terceiro quadrupolo e, depois, para o
detector.
Figura 14 – Representação esquemática de uma análise de espectrometria de massa, com ionização por electrospray, passando por um triplo quadrupolo.
Determinação de Medicamentos Antiepilépticos e Anticonvulsivantes por UPLC-MS/MS
49
1.9.3. UPLC-MS/MS
O sistema ACQUITY UPLC®, utilizado neste trabalho, foi desenvolvido pela
Waters para permitir o uso de velocidades, fluxos e pressões mais elevadas
do que as obtidas com os sistemas HPLC comuns (26). Esta tecnologia pode ser
considerada como uma evolução do HPLC e foi aplicada com sucesso em
numerosos laboratórios a nível internacional, bem como no nosso país – este
sistema está presente nos três serviços de Toxicologia Forense do INML, nas
Delegações Centro, Norte e Sul.
A principal característica que diferencia este sistema de outros é o facto de
permitir o uso de colunas cromatográficas com uma fórmula patenteada que
possibilita o uso de partículas de 2 µm (em vez de 5 µm, mais comuns para
sistemas de HPLC). Este sistema permite também atingir pressões da ordem
dos 15000 psi, consideravelmente superiores às com conseguidas nos HPLC,
onde a pressão máxima ronda os 2000 – 6000 psi.
Em comparação com o HPLC, o sistema de UPLC® provou ser uma ferramenta
bastante valiosa, obtendo-se uma técnica de separação com maior
sensibilidade, resolução e tempos de análise reduzidos (27).
1.9.3.1. Tecnologia IntelliStartTM
Esta tecnologia foi desenvolvida pela Waters e funciona como um sistema
integrado e automatizado que permite ao utilizador injectar directamente
no detector de massa uma substância, ou uma solução contendo até 4
substância distintas, onde através de uma série de testes totalmente
automatizados, se obtêm informações acerca das condições mais adequadas
para a análise das substâncias. Esta tecnologia representa uma ferramenta
muito útil quando se está a lidar com compostos em que só é conhecido o
seu peso molecular, permitindo optimizar o método para a sua análise de
forma mais rápida e eficiente (26).
Mariana Marcos Mestrado em Química Forense 2011
50
Antes de ser feita a injecção directa no detector de massa é introduzido no
software apenas o peso molecular do composto e o equipamento faz a
determinação de parâmetros como a voltagem do cone, fragmentação da
molécula, energias de colisão mais adequadas para a fragmentação e ainda o
modo de ionização (positivo ou negativo).
Os resultados obtidos com o auxílio desta tecnologia devem contudo ser
considerados como meramente indicativos. O uso do IntelliStart só será útil
quando se está na presença de substâncias conhecidas, pois é necessário
fornecer o peso molecular da substância e não dispensa que sejam feitos
outros testes de optimização do método (Scan, SIR, estudo padrão
fragmentação (Daughter Scan), etc.).
1.10. Validação de Métodos
A validação de métodos analíticos, especialmente em casos forenses, é um
procedimento extremamente importante para provar que o método é
adequado ao fim a que se destina e tem como objectivo estimar a eficiência
do método na rotina de um laboratório. É importante referir que a qualidade
do método analítico depende maioritariamente de como é desenvolvido,
mais do que da validação propriamente dita. Assim, um laboratório deve
validar os métodos não normalizados, métodos criados ou desenvolvidos pelo
próprio laboratório ou modificações de métodos normalizados, com o
objectivo de confirmar a sua adequabilidade. Isto é particularmente
importante quando está em causa o controlo de qualidade e acreditação do
laboratório, o que está a ocorrer neste momento no STF.
Os parâmetros a estudar dependem das características do método, do tipo e
complexidade da amostra e da experiência que o laboratório possa ter na
utilização do método. Depende ainda do propósito do método, podendo
alguns dos parâmetros abaixo apresentados não serem avaliados, se tal for
adequado. Os parâmetros de validação de métodos analíticos incluem:
especificidade, selectividade, capacidade de identificação, gama de
Determinação de Medicamentos Antiepilépticos e Anticonvulsivantes por UPLC-MS/MS
51
precisão intermédia e reprodutibilidade), limite de detecção (LD), limite de
quantificação (LQ) e robustez. Deve salientar-se que o método pode ser
considerado validado mesmo que alguns parâmetros não se enquadrem nos
limites estabelecidos na literatura, desde que sejam conhecidos e também
adequados aos objectivos do estudo a ser realizado.
No âmbito deste trabalho foram cumpridos os critérios de validação em vigor
no STF para a validação de métodos de cromatografia líquida acoplada à
espectrometria de massa, os quais serão apresentados em maior pormenor
no capítulo 4 (resultados e discussão).
Mariana Marcos Mestrado em Química Forense 2011
52
2. OBJECTIVOS
Determinação de Medicamentos Antiepilépticos e Anticonvulsivantes por UPLC-MS/MS
53
Este trabalho teve como propósito o desenvolvimento de um método
analítico que permitisse, com recurso à cromatografia líquida acoplada à
espectrometria de massa sequencial (ULPC-MS/MS), a identificação e
quantificação simultânea de fármacos com propriedades antiepilépticas e
anticonvulsivantes, tendo em consideração os AED’s disponíveis no mercado
português e os padrões disponíveis no serviço de toxicologia forense da
delegação do Centro do INML, I.P..
O método será devidamente validado de acordo com as normas do STF, que
se encontra neste momento em processo de acreditação do laboratório, de
acordo com a norma NP EN ISO/IEC 17025:2005.
Pretende-se que este método seja posteriormente inserido na rotina do STF,
e aplicado a casos forenses reais.
Mariana Marcos Mestrado em Química Forense 2011
54
3. MATERIAIS E MÉTODOS
Determinação de Medicamentos Antiepilépticos e Anticonvulsivantes por UPLC-MS/MS
55
3.1. Etapas do desenvolvimento de um método de LC-MS
O desenvolvimento de um método de LC-MS envolve essencialmente 6 etapas
(28).
Tabela 2 – Descrição das etapas envolvidas no desenvolvimento de um método LC-MS.
Etapa Parâmetro
1 Geral Definir quais os analitos, a matriz, procurar literatura, seleccionar PI
2 Espectrometria de Massa Modo ionização, optimização parâmetros ionização (voltagem ESI, fluxo gás), estudar efeito pH na ionização, estudo da fragmentação e optimização da energia de colisão
3 Cromatografia Escolha da coluna, optimização da composição da fase móvel, optimização do fluxo, testar a estabilidade do sistema após várias injecções de analito e PI
4 Preparação de amostras Escolher um método de preparação adequado, preparar extractos na matriz de interesse, optimizar a preparação das amostras para melhor recuperação do analito
5 Validação preliminar Estabelecer e testar uma curva de calibração e aplicação a amostras controlo
6 Validação completa Estudo dos parâmetros especificidade, selectividade, capacidade de identificação, gama de trabalho, linearidade, sensibilidade, exactidão, precisão (repetibilidade, precisão intermediária e reprodutibilidade), limite de detecção (LD), limite de quantificação (LQ) e robustez.
3.1.1. Geral
Actualmente, o LC-MS/MS é considerado uma técnica de referência em
toxicologia, uma vez que a elevada selectividade da espectrometria de
massa sequencial (MS/MS) conduz praticamente à inexistência de
interferências, mesmo na presença de concentrações relativamente elevadas
de compostos co-eluídos, permitindo identificações com elevado, se não
total, grau de confiança (28). Na generalidade, a quantificação de compostos
envolve seis etapas (tabela 2) mas, dada a interdependência destas etapas,
sobretudo no que se refere a interligação entre o LC e o MS, o processo de
desenvolvimento de um método LC-MS/MS é considerado um processo
Mariana Marcos Mestrado em Química Forense 2011
56
iterativo, pois, com frequência, quando uma determinada etapa está
optimizada torna-se necessário reavaliar a anterior (28).
Para a concretização deste trabalho pretendeu-se fazer a determinação por
UPLC-MS/MS de doze AED’s em amostras de sangue, usando um volume de
0,1 mL.
A curva de calibração e os controlos devem ser preparados numa matriz o
mais semelhante possível à das amostras e a regra é fortificar esses
calibradores e controlos com padrões, numa concentração conhecida. Aos
calibradores, controlos e amostras deverá ser também adicionado um padrão
interno, estruturalmente semelhante às substâncias a detectar, idealmente
deuterado.
É importante referir que, tal como acontece para os padrões, também às
fases móveis foi atribuído um código que as identifica, de cada vez que esta
é preparada de novo, e onde consta o operador, os solventes utilizados, uma
data de preparação e uma data de validade.
3.1.2. Espectrometria de massa
A vasta maioria dos fármacos e seus metabolitos são geralmente
quantificados por GC ou LC, tendencialmente acoplados a detectores de
massa.
Em LC, começa a ser cada vez mais comum o uso de espectrometria de
massa sequencial (MS/MS), que confere maior sensibilidade e especificidade
assentando principalmente na monitorização das transições obtidas por
fragmentação do ião principal. Por natureza, o uso de detectores de massa
resulta numa maior especificidade e sensibilidade que outros detectores
mais tradicionais (fotodiodos (Diode Array), UV-VIS, fluorescência, etc.).
Este factor é particularmente significativo quando se lida com amostras
post-mortem, por estas estarem mais sujeitas à presença de interferentes
(e.g. produtos de putrefacção).
Determinação de Medicamentos Antiepilépticos e Anticonvulsivantes por UPLC-MS/MS
57
Assim, foi usado um espectrómetro de massa triplo quadrupolo com
capacidade de adquirir espectros de massa sequenciais (MS/MS), com uma
fonte de ionização ESI, em modo positivo e negativo, com um potencial
capilar de 3,50 kV. As temperaturas da fonte e fluxos de gás do cone e de
desolvatação foram 150ºC e 0 L/hora, e 450ºC e 750 L/hora,
respectivamente. O gás de colisão utilizado foi o Árgon, a um fluxo de 0,15
mL/min.
Os espectros de massa foram adquiridos em modo MRM, de acordo com os
parâmetros estabelecidos na tabela 3.
Tabela 3 – Parâmetros de espectrometria de massa e iões monitorizados, na determinação dos doze fármacos estudados.
AED's Parent Daughter Daughter Cone (V)
Energia Col (eV)
Energia Col (eV)
Modo ESI
Carbamazepina 237.2 178.9 193.9 35 20 15 +
Felbamato 239.2 117.0 178.0 20 18 7 +
Fenitoína 253.0 104.2 182.2 24 32 18 +
Fenobarbital 231.2 41.9 188.0 28 18 11 -
Gabapentina 172.2 95.2 137.2 35 20 20 +
Lamotrigina 256.2 159.0 210.9 35 28 28 +
Levetiracetam 171.2 126.2 154.0 22 15 20 +
Oxcarbazepina 253.2 208.2 236.2 20 18 15 +
Primidona 219.0 91.2 162.2 26 24 12 +
Rufinamida 238.9 127.0 100.8 24 20 42 +
Topiramato 340.2 264.2 ------- 26 8 ------- +
Zonisamida 210.9 146.8 118.7 28 10 16 -
3.1.3. Cromatografia
Segundo as guidelines internacionais (29), a identificação forense deve ser
feita com recurso a duas técnicas que empreguem princípios físicos e
Mariana Marcos Mestrado em Química Forense 2011
58
químicos distintos, como GC-MS e LC-MS, por exemplo, procedimento que é
seguido no STF. Este trabalho pretendeu, contudo, apenas contemplar a
determinação por LC-MS, tal como será descrito seguidamente.
Para tal, foi utilizado um sistema UPLC-MS/MS (Waters (figura 15)). A
separação cromatográfica foi obtida com uma coluna ACQUITY® UPLC HSS
T3, 2,1 x 100 mm, 1,7 µm (figura 16) a 40ºC, seguindo um gradiente com
acetonitrilo e acido fórmico 0,1 %, com um tempo de corrida de 10 minutos
(figura 17). As amostras encontram-se refrigeradas a 15ºC. Para preparação
das fases móveis foi utilizado um sistema de filtração de eluentes e filtros de
membrana, e posteriormente sujeitas a desgaseificação por ultra-sons.
Figura 15 - Sistema UPLC, Waters Corp (26).
Figura 16 – Coluna HSS T3 (2,1 x 100 mm, 1,7 µm),
Waters (26).
Figura 17 – Gradiente e fases móveis usadas.
Todos os solventes utilizados na composição das fases móveis possuem um
grau de pureza adequado a análises por UPLC-MS/MS, e foram adquiridos à
Merck.
Determinação de Medicamentos Antiepilépticos e Anticonvulsivantes por UPLC-MS/MS
59
O software utilizado no tratamento dos dados foi o MassLynxTM. Este
software controla todo o sistema de UPLC-MS/MS
3.1.4. Preparação de Amostras
A injecção de amostras biológicas em sistemas de cromatografia, quer
gasosa quer líquida, exige um passo de extracção que tem como propósito a
purificação da amostra ao máximo e concentração dos analitos de interesse,
para que seja minimizado o efeito de matriz. No caso de amostras biológicas
este traduz-se maioritariamente por proteínas e outros constituintes
celulares, que apenas interferem diminuindo a sensibilidade dos aparelhos,
podendo mesmo tornar impossível a detecção dos analitos de interesse,
sobretudo quando se utilizam sistemas altamente sensíveis.
Extracções do tipo líquido-líquido ou por fase sólida (SPE) são ambas
adequadas para amostras biológicas como sangue ou urina (1). Outros
métodos de extracção foram descritos na literatura, como a precipitação de
proteínas, promovida pelo uso de agentes, como é o caso do acetonitrilo (30)
(31) (32) (33), mas estes são pouco adequados para técnicas que exijam
quantificação de substâncias, pois há sempre a possibilidade de perda de
analito que pode ficar co-precipitado com as proteínas.
Neste trabalho experimental as amostras foram purificadas através de
extracção SPE, com colunas Oasis® HLB 3cc (Waters Corporation), um
extractor VacElut SPE 24 (Varian), com uma bomba de vácuo (figura 18). As
amostras foram evaporadas num evaporador TurboVap (figura 19). O
fornecimento de azoto para a evaporação bem como para o detector de
massa foi feito através de um gerador de azoto.
Mariana Marcos Mestrado em Química Forense 2011
60
Figura 18 – Sistema de Extração VacElut SPE 24 (Varian), com colunas Oasis HLB 3cc (Waters), e bomba de Vácuo.
Figura 19 – Evaporador de amostras TurboVap. As amostras são evaporadas por submersão num banho a 40ºC e ao mesmo tempo são pulverizadas com azoto.
Para a execução deste trabalho foram adquiridos padrões dos seguintes
medicamentos: Carbamazepina (Cerilliant, a 1 mg/mL, em Metanol),
Determinação de Medicamentos Antiepilépticos e Anticonvulsivantes por UPLC-MS/MS
87
A percentagem de falsos negativos calculada numa primeira análise, apenas
com base nos valores numéricos das áreas relativas, foi de 13,3 %, situando-
se ligeiramente acima do estabelecido pelo STF, que determina que deve ser
inferior a 10%. Isto pode ser justificado pelo facto de ter sido escolhida como
amostra controlo a amostra SC002-01, que talvez não fosse a mais adequada
para algumas amostras (Oxcarbazepina foi negativa nas amostras SC010-01,
SC011-01, SC037-01, SC039-01, SC040-01, SC041-01 e SC042-01, mas positiva
para as restantes), apesar de estar dentro dos parâmetros para outras. Por
outro lado, pequenas variações no tempo de retenção do analito, e/ou do
padrão interno, podem fazer com que deixem de estar dentro dos
parâmetros estabelecidos, apresentando-se na forma de falsos negativos. O
resultado poderá ainda ser afectado pela extracção SPE, onde pequenas
variações no tempo de secagem das colunas, por exemplo, pode ter grande
influência na sensibilidade do aparelho, fazendo com as razões das áreas
relativas caiam fora dos parâmetros (que foi o caso das Oxcarbazepina),
especialmente se estiver a ser confrontada com uma amostra controlo que já
contêm algum erro como os que já foram descritos. Este estudo foi feito
confrontando as amostras com entre elas, de modo a escolher o controlo
mais adequado, mas o resultado foi sempre superior a 10 % de falsos
negativos.
É importante mencionar a relevância da determinação ser feita sempre com
base em duplicados, ou mesmo triplicados, pois pode haver um problema
numa das amostras e assim há sempre outra(s) que podem ser usada(s) para
obter o resultado, quer de confirmação, quer de quantificação. Isto é válido
para amostras e também para controlos.
Existem contudo autores (56) que defendem que o teste de selectividade, no
âmbito da toxicologia forense, deve ser feito apenas com base no critério de
ausência de sinais interferentes nas amostras não fortificadas, e que este é o
factor determinante na selectividade da amostra. Tendo isto em
consideração, as amostras usadas para o estudo da selectividade foram
analisadas para pesquisa de possíveis interferentes, por cálculo da razão
Mariana Marcos Mestrado em Química Forense 2011
88
sinal/ruído, que deverá ser sempre inferior a 3 para se considerar a ausência
de interferências. Estes cálculos foram efectuados para as amostras que
demostraram falsos negativos, com base no critério da área relativa (13,3
%), para permitir a comparação e daí concluir qual é a percentagem de
falsos negativos efectivamente presente.
Na amostra SC005-01, não há de facto evidências de interferências (figura
42). Mesmo após calcular a razão sinal/ruído, esta mostrou-se menor que 3
(s/n=2,33), no caso da Primidona o software nem conseguiu fazer este
cálculo, pois o ruído sobrepõe em grande parte o sinal obtido ao tempo de
retenção desta substância (1,06 minutos).
Figura 42 – (a) Cromatogramas da amostra SC005-01, para a amostra não fortificada. Cálculo da razão s/n para a transição MRM principal, para a Zonisamida (em cima) e para a Primidona (em baixo). (b) Cromatograma da amostra SC005-01 fortificada, com as duas transições MRM para a Zonisamida (em cima) e para a Primidona (em baixo).
A amostra SC007-01 mostra presença de interferentes, como pode ser
visualizada na figura 43, onde está apresentado o cromatograma desta
amostra não fortificada e onde é possível ver o resultado do cálculo da razão
s/n, com o valor de 8,29.
(a) (b)
Determinação de Medicamentos Antiepilépticos e Anticonvulsivantes por UPLC-MS/MS
89
Figura 43 – Cromatograma da amostra SC007-01 não fortificada para a transição MRM principal do Felbamato (em baixo) e o cálculo da razão s/n para a mesma transição.
A amostra SC010-01 não apresenta falsos negativos uma vez que, tal como
para as amostras anteriores, foi calculada a razão s/n na amostra branca não
fortificada (figura 44), tendo-se demonstrado menor que 3 para a
Oxcarbazepina (ruído muito mais intenso que o sinal) e para o Felbamato
(s/n=1,29).
Figura 44 - Cromatograma da amostra SC010-01 não fortificada para a transição MRM principal do Felbamato (em baixo) e para a Oxcarbazepina (em cima), e o cálculo da razão
s/n para as transições.
Na amostra SC011-01 também se demostrou a ausência de interferentes para
a Oxcarbazepina, pelo cálculo da razão s/n (0,73), tal como é apresentado
na figura 45. O mesmo se verificou para o Felbamato.
Mariana Marcos Mestrado em Química Forense 2011
90
Figura 45 – Cálculo da razão s/n para a Oxcarbazepina (em cima), na amostra SC011-01, e
para o Felbamato (em baixo), para a amostra não fortificada.
A amostra SC037-01 demonstrou a presença de interferentes para a
Oxcarbazepina (s/n = 5,74) mas não para a Primidona (Figura 46).
Figura 46 – Cromatogramas onde se encontra evidenciado o cálculo da razão s/n para o
Felbamato (em cima) e para a Oxcarbazepina (em baixo), na amostra SC037-01, não fortificada.
A amostra SC040-01 mostrou também presença de interferências para
Zonisamida (figura 47), contudo nas restantes amostras (SC039-01, SC041-01
e SC042-01) não existem evidências de sinais que interfiram com a detecção
e quantificação das amostras fortificadas (figuras 48, 49 e 50).
Determinação de Medicamentos Antiepilépticos e Anticonvulsivantes por UPLC-MS/MS
91
Figura 47 – Cálculo da razão s/n, para a amostra SC040-01, onde se evidencia a presença de interferentes no cromatograma da transição principal da Zonisamida (em cima). Para a
Oxcarbazepina não foi considerada a presença de substâncias interferentes.
Figura 48 – Cromatogramas da Oxcarbazepina e Gabapentina, para a amostra SC039-01, onde se apresenta o cálculo da razão s/n, que evidencia a ausência de interferentes.
Figura 49 – Cromatogramas da Oxcarbazepina, para a amostra SC041-01. Não há sinal de presença de interferentes.
Mariana Marcos Mestrado em Química Forense 2011
92
Figura 50 – Cálculo da razão s/n para a Oxcarbazepina e para a Zonisamida, para a amostra SC042-01. Também nesta amostra se demonstra a ausência de interferentes.
Contudo, após usar o critério da presença de interferentes, pelo cálculo da
razão sinal/ruído, pode concluir-se que existem interferentes nas amostras
não fortificadas SC007-01 (Felbamato), SC037-01 (Oxcarbazepina) e SC040-01
(Zonisamida), que podem contribuir para a não confirmação destas
substâncias nas amostras fortificadas.
Com base nos dois critérios, das áreas relativas e do cálculo da razão
sinal/ruído, a percentagem de falsos positivos é de 0 %. Algumas amostras
não fortificadas mostraram positividade para o Topiramato, Rufinamida e
Zonisamida, usando o critério da área relativa, no entanto, esses resultados
foram excluídos após o cálculo da razão sinal/ruído (s/n), que deverá ser
maior que 3, para se considerar a detecção de um pico cromatográfico.
Pela rápida observação dos cromatogramas é possível depreender que o sinal
detectado é apenas ruído e, mesmo depois de ser determinada a razão s/n,
esta é sempre inferior a 3 e, em alguns casos, o software nem consegue
fazer o cálculo, devido ao valor ser muito baixo. Os cromatogramas
seguintes (figuras 51, 52 e 53) demonstram que, apesar de cumprirem os
critérios de áreas relativas das transições iónicas, se está na presença de
uma falsa positividade, confirmada pelo cálculo da razão s/n.
Determinação de Medicamentos Antiepilépticos e Anticonvulsivantes por UPLC-MS/MS
93
Figura 51 – Cromatogramas do Topiramato (b) e do cálculo da razão s/n (a). A razão s/n é 0,54. O Topiramato tem um tempo de retenção de 2,76 minutos.
Figura 52 – Cromatogramas da Zonisamida para as duas transições e cálculo da razão s/n para ambas (a e c). O tempo de retenção da Zonisamida é 1,51 minutos.
Figura 53 - Cromatogramas da Rufinamida para as duas transições e cálculo da razão s/n para ambas (b e d). O tempo de retenção da Rufinamida é 1,52 minutos.
(a)
(b)
(a)
(b)
(c)
(d)
(a)
(b)
(c)
(d)
Mariana Marcos Mestrado em Química Forense 2011
94
Tabela 11 – Tabela Resumo dos resultados obtidos no estudo da
especificidade/selectividade, para as amostras não fortificadas (a) e fortificadas (b).
Código da
amostraResultado
SC002-01 Negativo
SC005-01 Negativo
SC007-01 Negativo
SC010-01 Negativo
SC011-01 Negativo
SC037-01 Negativo
SC039-01 Negativo
SC040-01 Negativo
SC041-01 Negativo
SC042-01 Negativo
0%
Código da
amostraResultado
SC002-01 Positivo
SC005-01 Positivo
SC007-01 Positivo/Negativo
SC010-01 Positivo
SC011-01 Positivo
SC037-01 Positivo/Negativo
SC039-01 Positivo
SC040-01 Positivo/Negativo
SC041-01 Positivo
SC042-01 Positivo
Negativo para Zonisamida
_______
_______
Percentagem de Falsos Negativos 2,5%
_______
Negativo para Felbamato
_______
_______
Negativo para Oxcarbazepina
_______
_______
_______
Percentagem de Falsos Positivos
Tabela 11b - Análise das Amostras Fortificadas
Observações
_______
_______
_______
_______
_______
_______
_______
Tabela 11a - Análise das Amostras Não Fortificadas
Observações
_______
_______
Determinação de Medicamentos Antiepilépticos e Anticonvulsivantes por UPLC-MS/MS
95
4.2.4.1. Limite de Detecção (LD) e Limite de Quantificação
(LQ)
O limite de detecção é considerado a menor quantidade do analito presente
na amostra que pode ser detectado, mas não necessariamente quantificado,
sob as condições experimentais estabelecidas para o método analítico
utlizado. A sensibilidade do método é o limite de detecção do mesmo.
Para o caso de métodos cromatográficos a estimativa do limite de detecção
(LD) pode ser feita tendo em conta a seguinte relação:
LD=(3,3 x Sy/x) / b (Equação 3)
onde:
Sy/x é o desvio residual da curva de calibração
b é o declive da recta
O limite de quantificação (LQ) é a menor quantidade do analito que pode ser
determinada numa amostra, com precisão e exactidão aceitáveis sob as
condições experimentais estabelecidas, de acordo com a seguinte equação:
LQ=(10 x Sy/x) / b (Equação 4)
O LQ pode também ser determinado pela relação sinal/ruído. Neste caso é
determinado o ruído da linha de base e considera-se o limite de
quantificação a concentração para a qual a razão sinal/ruído é de 10:1.
O cálculo do coeficiente de variação (CV) foi feito de acordo com a equação
5.
CV (%) = Desvio Padrão x 100 (Equação 5)
Concentração média
Assim, para estabelecer os limites de detecção e de quantificação das
substâncias em estudo, foi preparada uma curva de calibração com 15
pontos para cada AED, distribuídos uniformemente e perto do limite de
detecção esperado, por fortificação de um branco de sangue a partir de duas
Mariana Marcos Mestrado em Química Forense 2011
96
misturas padrão preparadas em metanol a 0,1 µg/mL e 1 µg/mL. Na tabela
12 estão apresentadas as soluções utilizadas na fortificação das amostras.
Tabela 12 - Misturas-padrão utilizadas na fortificação das amostras de sangue no estudo do limite de detecção e quantificação.
Uma vez obtida a curva de calibração, os limites de detecção (LD) e de
quantificação (LQ) são calculados aplicando as equações 1 e 2, já descritas
acima.
Apresenta-se de seguida, sob a forma de um gráfico de barras, o resultado
do tratamento estatístico dos valores LD e LQ obtidos para os diferentes
AED’s.
Determinação de Medicamentos Antiepilépticos e Anticonvulsivantes por UPLC-MS/MS
97
Gráfico 1 – Resultados obtidos no estudo do parâmetro de validação dos limites de Quantificação e Detecção para os 12 AED’s.
Os cálculos efectuados com o auxílio do Excel estão apresentados no Anexo I
(Limites de Detecção e Quantificação). Os limites de quantificação e
detecção mostraram-se adequados à determinação dos 12 AED’s.
Pela rápida observação da tabela 14 pode verificar-se que os limites se
encontram todos abaixo da dose terapêutica, o que na prática representa
que cada substância poderá ser quantificada sempre que presente, dentro
das suas doses terapêuticas e abaixo das mesmas, que é o objectivo da
aplicação do método na rotina do STF.
0 50 100 150 200 250
Carbamazepina
Felbamato
Fenitoína
Fenobarbital
Gabapentina
Lamotrigina
Levetiracetam
Oxcarbazepina
Primidona
Rufinamida
Topiramato
Zonisamida
Concentração (ng/mL)
Limite deQuantificação
Limite deDetecção
Mariana Marcos Mestrado em Química Forense 2011
98
Tabela 14 – Limites de Detecção, de Quantificação e dose terapêutica para cada AED. As doses terapêuticas citadas baseiam-se em informação da TIAFT (24).
4.2.4.3. Eficiência da Extracção
As amostras biológicas devido à sua composição complexa são submetidas a
processos de extracção que visam eliminar possíveis interferências e extrair
os analitos em condições adequadas à análise instrumental. No entanto,
todas estas etapas conduzem a perda inevitável de analitos, sendo por isso
importante estimar a capacidade de recuperação destes a partir da matriz
biológica. A eficiência da extracção do processo analítico é a recuperação,
expressa como a percentagem da quantidade conhecida de um analito,
obtida da comparação dos resultados analíticos de amostras fortificadas com
padrão, com os resultados analíticos de amostras não fortificadas, ambas
submetidas ao processo de extracção.
Os ensaios de recuperação consistem em sujeitar ao procedimento analítico
global, amostras fortificadas com quantidades conhecidas do analito, sendo
o processo tanto mais exacto quanto mais próximo de 100% se situar a
relação entre a quantidade de analito adicionada e a quantidade de analito
Substância LD
(ng/mL) LQ
(ng/mL) Dose Terapêutica
(ng/mL)
Carbamazepina 53,72 162,79 4000 - 12000
Felbamato 73,06 221,39 30000 - 60000
Fenitoína 38,70 117,26 8000 - 20000
Fenobarbital 24,41 73,97 2000 - 30000 (40000)
Gabapentina 42,08 127,52 2000 - 20000
Lamotrigina 74,01 224,26 2000 - 15000
Levetiracetam 76,92 233,11 6000 - 20000 (40000)
Oxcarbazepina 31,54 95,57 sem informação
Primidona 51,30 155,45 10000 - 20000
Rufinamida 62,68 189,95 sem informação
Topiramato 59,97 181,72 4000 - 10000 (20000)
Zonisamida 14,96 45,33 10000 - 40000
Determinação de Medicamentos Antiepilépticos e Anticonvulsivantes por UPLC-MS/MS
99
recuperada. Pode, no entanto, considerar-se que recuperações acima dos 50
% são suficientes para proporcionar uma boa sensibilidade e precisão do
método (28).
Para o estudo da eficiência de extracção foram seleccionados dois níveis de
concentração: baixa e alta, a 100 ng/mL e 500 ng/mL, respectivamente.
Para cada uma destas gamas foram preparados dois conjuntos de amostras
de sangue, um primeiro conjunto que foi fortificado antes da extracção, e
um segundo que foi fortificado antes do passo de evaporação do extracto
eluido na extracção SPE. As fortificações foram feitas a partir de soluções
metanólicas a 1 µg/mL e a 10 µg/mL da mistura padrão dos 12 AED’s em
estudo. O volume de sangue utilizado foi de 0,1 mL. O padrão interno
utilizado foi a Promazina, numa solução metanólica a 10 µg/mL, e foi
adicionado um volume de 5 µL (concentração final nas amostras: 500
ng/mL). O padrão interno só foi adicionado a todas as amostras
imediatamente antes do passo da secagem por evaporação do extracto
eluido.
A eficiência da extracção foi calculada com base na aplicação da equação 6.
% Recuperação do método = ArelEnsaio x 100 (Equação 6) ArelSemExtracção
Onde:
ArelEnsaio - Razão das áreas (analito/padrão interno) obtidas após a aplicação do procedimento
extractivo
ArelSemExtracção - Razão das áreas (analito/padrão interno) obtidas sem a aplicação do
procedimento extractivo
Na tabela 15 e gráfico 2 estão os resultados relativos ao estudo da eficiência
de extracção.
Mariana Marcos Mestrado em Química Forense 2011
100
Tabela 15 – Tabela Resumo dos resultados obtidos para a recuperação (%) obtida pela extracção SPE de dois controlos, Alto a 5000 ng/mL e Baixo a 500 ng/mL.
AED's Recuperação (%)
Controlo Baixo Controlo Alto
Carbamazepina 51,1 77,9
Felbamato 65,6 93,8
Fenitoína 64,9 102,1
Fenobarbital 60,8 105,7
Lamotrigina 57,4 96,6
Oxcarbazepina 67,3 97,2
Primidona 63,0 103,2
Topiramato 47,6 91,1
Gabapentina 3,8 5,1
Levetiracetam 60,3 105,8
Rufinamida 57,6 99,6
Zonisamida 62,0 103,4
Pela observação do gráfico 2 pode ver-se que a recuperação para a
Gabapentina é extremamente baixa (3 a 5 %), contudo no que respeita às
restantes substâncias os valores são satisfatórios. É de notar a diferença
entre os valores de recuperação para os controlos baixos versus os controlos
altos. A perda de substância é mais notória no controlo baixo, uma vez que a
quantidade de padrão adicionada é menor (5 µL) que no controlo alto (50
µL), a perda de substância vai ser mais evidente, isto é, uma perda de 10 %
de padrão adicionado em 5 µL será muito mais acentuada que uma perda de
10 % em 5 µL, naturalmente.
Relativamente à Gabapentina, apesar das grandes perdas verificadas, essas
ínfimas quantidades foram detectadas pelo equipamento. Decidiu-se então
uma extracção ácida, já usada no laboratório para determinação de outros
medicamentos (Ácido Valpróico) e tendo também em conta o que está
descrito na literatura (57).
Determinação de Medicamentos Antiepilépticos e Anticonvulsivantes por UPLC-MS/MS
101
Gráfico 2 – Resultados da Eficiência da Extracção SPE.
Depois de testar a extracção com adição de ácido fosfórico (20 µL, a 8,5 %,
em seguida do passo de fortificação das amostras, imediatamente antes de
diluir com 1mL de água ultrapura) os valores de recuperação da extracção
para a Gabapentina foram: 26,7 % para o controlo baixo (500 ng/mL) e 9,1 %
para o controlo alto (5000 ng/mL), tal como é apresentado no gráfico 3.
Gráfico 3 – Comparação entre a recuperação da extracção SPE, em percentagem, para a Gabapentina, nas duas extracções testadas, com e sem adição de ácido, a 500 ng/mL e a 5000
ng/mL.
0,0
10,0
20,0
30,0
40,0
50,0
60,0
70,0
80,0
90,0
100,0
Recupera
ção d
a E
xtr
acção S
PE (
%)
Controlo Baixo(500 ng/mL)
Controlo Alto(5000 ng/mL)
Mariana Marcos Mestrado em Química Forense 2011
102
Verificou-se um aumento significativo da recuperação. Apesar de não estar
ainda de acordo com os valores calculados para as outras substâncias, há, de
facto, uma melhoria significativa o que leva a concluir que talvez para a
quantificação da Gabapentina esta extracção seja mais adequada. Contudo
este facto necessita de um estudo mais aprofundado, que já não se encontra
no âmbito deste trabalho. Após o estudo, o novo método poderá ser ajustado
ao procedimento de determinação de medicamentos do laboratório,
permitindo fazer um procedimento de triagem onde é apenas detectada a
presença de Gabapentina, seguindo-se um procedimento de quantificação
que pode ter uma extracção distinta e mais adequada que a primeira.
O Topiramato possui também uma recuperação abaixo dos 50 % (47,6 %) para
o controlo baixo e, que poderá ser justificada pelo facto de 100 ng/mL ser
uma concentração abaixo do seu LQ, tal como acontece para a Gabapentina.
À excepção da Gabapentina e do Topiramato no controlo baixo, todos os
outros AED’s cumprem o requisito de uma recuperação superior a 50 %.
4.2.4.4. Arrastamento (carryover):
Foi estudada a existência de fenómenos de arrastamento em conjunto com a
eficiência de extracção. Juntamente com as amostras fortificadas para o
estudo da eficiência da extracção foram preparadas duas amostras de
brancos de sangue, que foram injectados entre as amostras correspondentes
á gama alta – amostras a 5000 ng/mL – para detectar uma possível
contaminação.
A análise destas amostras foi feita por observação dos cromatogramas das
amostras brancas injectadas.
Os cromatogramas resultantes do estudo de arrastamento entre amostras
numa mesma corrida de LC-MS/MS estão na figura 54, e pela sua observação
é possível concluir que não está presente qualquer fenómeno de
arrastamento entre amostras.
Determinação de Medicamentos Antiepilépticos e Anticonvulsivantes por UPLC-MS/MS
103
Figura 54 - Cromatogramas TIC dos 12 AED’s nas Amostra Branca 1 (esquerda) e Amostra Branca 2 (direita).
Mariana Marcos Mestrado em Química Forense 2011
104
4.2.4.5. Linearidade/Gama de Trabalho
A linearidade de um método corresponde à capacidade deste demostrar que
os sinais analíticos obtidos são directamente proporcionais à concentração
do analito na amostra, dentro do intervalo especificado. É recomendável que
este estudo seja feito com pelo menos 5 concentrações distintas. A análise
do ajuste dos dados ao modelo seleccionado foi elaborada através do
coeficiente de determinação (r2), que deverá ser próximo de 1, e do gráfico
de resíduos, no qual os resíduos deverão ter uma distribuição aleatória.
Assim, para a determinação da linearidade foi preparada uma curva de
calibração com 15 pontos de concentrações de 50 a 5000 ng/mL, por
fortificação de alíquotas de 0,1 mL sangue branco, a partir de soluções
padrão dos 12 AED’s em metanol, a 1 µg/mL e 10 µg/mL.
A tabela 16 resume os volumes utilizados de cada solução padrão para a
preparação dos calibradores. Foi utilizado um volume de 5 µL de Promazina
(padrão interno), em solução metanólica a 10 µg/mL (concentração final nas
amostras 500 ng/mL).
Tabela 16 – Curva de calibração para o estudo da Linearidade e volumes adicionados de cada mistura padrão, a 1 e a 10 µg/mL.
Depois de injectadas as amostras procedeu-se à análise das curvas de
calibração. Verificou-se que havia uma relação linear e os resultados foram
sujeitos a um tratamento estatístico.
Em seguida, na tabela 17, encontram-se os coeficientes de correlação
obtidos no estudo da linearidade.
Determinação de Medicamentos Antiepilépticos e Anticonvulsivantes por UPLC-MS/MS
105
Tabela 17 – Coeficientes de correlação para os 12 medicamentos antiepilépticos, as equações da recta e respectivos coeficientes de correlação para a gama de linearidade obtida.
AED’s Linearidade
(ng/mL) Equação da recta
Coeficiente de
correlação (r2)
Carbamazepina 50 - 5000 y = 0,0018x - 0,0138 0,9925
Felbamato 50 - 5000 y = 0,0004x - 0,0281 0,9943
Fenitoína 50 - 5000 y = 6E-05x - 0,0023 0,9944
Fenobarbital 50 - 5000 y = 1E-05x + 0,0007 0,9949
Gabapentina 50 - 5000 y = 2E-05x + 0,0047 0,9930
Lamotrigina 50 - 5000 y = 0,0002x - 0,0159 0,9947
Levetiracetam 50 - 5000 y = 0,0005x + 0,0208 0,9945
Oxcarbazepina 50 - 5000 y = 0,0005x + 0,0235 0,9941
Primidona 50 - 5000 y = 0,0002x - 0,0047 0,9988
Rufinamida 50 - 5000 y = 0,001x - 0,0495 0,9943
Topiramato 50 - 5000 y = 2E-05x - 0,0018 0,9952
Zonisamida 50 - 5000 y = 2E-05x + 0,0003 0,9966
Os critérios de aceitação das curvas de calibração, no que diz respeito à
linearidade foram: inclusão do valor zero na intersecção da curva com o eixo
das ordenadas, um intervalo de confiança de 95%, um coeficiente de
correlação (r2) superior a 0,99 e a análise dos gráficos de valores residuais,
considerando aberrantes os pontos cujo desvio seja superior ao dobro do
erro padrão estimado no estudo da regressão para a curva de calibração.
Para todos os doze AED’s verificou-se linearidade de 50 a 5000 ng/mL,
sempre com um coeficiente de correlação maior que 0,9925, o que cumpre
os critérios de aceitação, com a excepção da Gabapentina que não inclui o
valor zero na intersecção, o que pode ser justificado pela baixa intensidade
dos picos registada no equipamento, que se traduz num declive da recta de
calibração muito baixo, não permitindo a intersecção com o zero.
Mariana Marcos Mestrado em Química Forense 2011
106
No que diz respeito à gama de trabalho, para alguns destes AED’s uma
concentração de 5000 ng/mL pode ainda não estar dentro da sua dose
terapêutica e possivelmente será necessário que seja criada uma curva de
calibração que abranja valores mais elevados, da ordem dos microgramas
por mililitro. Este estudo compreendeu apenas o estudo da linearidade de 50
a 5000 ng/mL, pois abarca parte das concentrações terapêuticas destes
fármacos e para evitar um grande gasto de padrões. A curva de linearidade
poderá mais tarde vir a ser adaptada à rotina do laboratório, permitindo
fazer um primeiro estudo de triagem com a mesma e depois proceder a uma
quantificação já com uma curva mais adequada à concentração presente nas
amostras.
Em anexo (7.1. Linearidade) apresentam-se, sob a forma de tabelas e
gráficos, os valores obtidos para as áreas, a curva de calibração, o
tratamento estatístico da regressão e os valores de linearidade obtidos para
os 12 AED’s, por ordem alfabética.
4.2.4.6. Repetibilidade
A avaliação da repetibilidade de um método é feita pela variação de
operador, equipamentos e ao longo do tempo. Este parâmetro foi estudado
em conjunto com a precisão intermédia.
A repetibilidade do método foi estudada pela da injecção de 5 replicados
independentes, preparados por fortificação de amostras de sangue branco a
2 gamas de concentração (100 ng/mL e 500 ng/mL). Foi utilizada uma
alíquota de 0,1 mL de sangue, tal como para os ensaios anteriores, e o
padrão interno utilizado 5 µL uma solução metanólica de Promazina a 10
µg/mL (concentração final nas amostras 500 ng/mL).
Depois de aplicado o método foram obtidas as áreas e os tempos de retenção
relativos (TRR) para cada AED em replicado, e calculou-se a média, desvio
padrão, e o coeficiente de variação.
Determinação de Medicamentos Antiepilépticos e Anticonvulsivantes por UPLC-MS/MS
107
As tabelas 18 e 19 resumem os valores de TRR, a média, o desvio padrão e o
coeficiente de variação relativos às 12 substâncias em estudo. Os cálculos e
os valores utilizados para efectuar esses mesmos cálculos encontram-se
explicitados em Anexo (7.3. Repetibilidade).
Tabela 18 - Tabela resumo resultados controlo baixo a 100 ng/mL.