1966 Universita’ di Bari 1-3 gruppo A 4-5 gruppo B X-6-12 gruppo C 13-15 gruppo D 16-18 gruppo E 19-20 gruppo F Y-21-22 gruppo G by GP&NA Conferenza di Denver
Jan 02, 2016
1966
Universita’ di Bari
1-3 gruppo A 4-5 gruppo B
X-6-12 gruppo C
13-15 gruppo D 16-18 gruppo E
19-20 gruppo F Y-21-22 gruppo G
by GP&NA
Conferenza di Denver
Universita’ di Bari
by GP&NA
1-3 gruppo A 4-5 gruppo B
X-6-12 gruppo C
13-15 gruppo D 16-18 gruppo E
19-20 gruppo F Y-21-22 gruppo G
Cariotipi a confronto
Creano un’alternanza di bande chiare e scure lungo l’asse del cromosoma specifica per ogni coppia di omologhi.
Colorano una regione specifica di alcuni o di tutti i cromosomi
C-bande : tutti i centromeri e le regioni eterocromatiche variabilidei cromosomi 1,9,16,Y
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Metodi colorazione differenziale
utilizzando la mostarda di quinacrina......
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QM-banding pattern
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DAPI e QM
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G-bande
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R-bande
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Diagramma
46,XX - cariotipo normale Femminile
46,XY - cariotipo normale Maschile
Questo modo di scrivere ci da’ due informazioni:- numero totale dei cromosomi (46)- sesso dell’organismo
47,XY,+21Maschio con 47 cromosomi (invece di 46) ed un cromosoma 21 in piu’ (sindrome di Down)
46,XX,del(14)(q23) del=delezione
46,XY,dup(14)(q22q25) dup= duplicazione
46,XX,r(7)(p22q36) r=ring (cromosoma ad anello)
Terminologia
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doppia elicadi DNA
A T C G G T A T C C T AT A GG C A T A G G A T
osservazionedel vetrino
A T C G G T A T C C T A
T A GG C A T A G G A T
denaturazione
cromosomasul vetrino
sintesi di una sonda complementare marcata con un fluorocromo
ibridazione della sonda suicromosomi denaturati sul vetrino
ATC G G
TAT C C T A
A T C G G T A T C C T AT A GG C A T A G G A TTT A GG C A T A G G A
FISH
A T C G G T A T C C T AT A GG C A T A G G A T
A T C G G T A T C C T A
T A GG C A T A G G A T
denaturazione
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filtro di emissione
specchio dicroico
filtro
di e
ccitazio
ne
obiettivo/condensatore
fotografiaCCD camera
Lampada a vaporidi mercurio
Elaborazione alcomputer
FISH : microscopio a fluorescenza
Osservazioneal microscopio
Cromosomi 1. denaturati2. colorati con DAPI
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FISH: metafase in DAPI
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FISH: segnali
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FISH: merge
1) Allestimento della coltura
2) Preparazione dei vetrini
3) Colorazione del preparato con colorazioni differenziali di routine
4) Osservazione al microscopio, selezione delle metafasi e acquisizione delle immagini
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Analisi del cariotipo
sangueperiferico
terreno dicoltura
48-96h
proliferazione
colchicina(ultimi 30’)
centrifugazione
pelletrisospeso
Ipotonica (20’)
centrifugazione
pelletrisospeso
fissativo
centrifugazioni (2-3)
fissativorisospensionein poco fissativo
allestimento delpreparato
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Allestimento del preparato
fitoemoagglutinina(stimola la crescita)
1) Allestimento della coltura
2) Preparazione dei vetrini
3) Colorazione del preparato con colorazioni differenziali di routine
4) Osservazione al microscopio, selezione delle metafasi e acquisizione delle immagini
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Analisi del cariotipo
3) Colorazione del preparato con colorazioni differenziali di routine
Fluorocromi: QM, DAPI. Necessario un microscopio a flurescenza
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Colorazione QM
G-banding con Giemsa dopo trattamento con tripsina
3) Colorazione del preparato con colorazioni differenziali di routine
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Colorazione Giemsa
1) Allestimento della coltura
2) Preparazione dei vetrini
3) Colorazione del preparato con colorazioni differenziali di routine
4) Osservazione al microscopio, selezione delle metafasi e acquisizione delle immagini
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Analisi del cariotipo
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Selezione delle metafasi
Ottimama…..
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Selezione delle metafasi
Puo’essere anche cosi’..Cromosomi non ben riconoscibili, difficili anche dacontare.Scartare! (potendo)
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.. O cosi’
Selezione delle metafasi
Troppo contrattipero’ si puo’ usareper contarli.Scartare! (potendo)
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Selezione delle metafasi
Sufficiente Si possono contarePuo’ essere utile peranalizzare i cromosominon sovrapposti
Discreta
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Si possono contare, e anchese ci sono alcunesovrapposizioni,si possono analizzare
Selezione delle metafasi
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Selezione delle metafasi
Buona Si possono contare, e anchese ci sono alcunesovrapposizioni,la morfologia deicromosomi e’buona
1. SI CONTANO I CROMOSOMI : IMPORTANTE PER SOSPETTARE LA PRESENZA DI ALTERAZIONI NEL NUMERO CROMOSOMICO
2. SI APPAIANO GLI OMOLOGHI PER SIMILARITA’
3. SI METTONO IN ORDINE SECONDO LA CONVENZIONE
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Come si fa il cariotipo?
10
1611
9
46
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Fare il cariotipo
CARIOTIPO IN QM (specifico il bandeggio)
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Cariotipo ordinato