Aplicaciones Biocataliticas en la Preparación de Ésteres de Halohidrinas Bajo Control Regioisomérico a Partir de Dioles Asimétricos Aplicaciones Biocataliticas en la Preparación de Ésteres de Halohidrinas Bajo Control Regioisomérico a Partir de Dioles Asimétricos UNIVERSITAT DE LLEIDA •Jonh Méndez 1, 3 Jordi Eras 1 , Mireia Oromi 1 , Merce Balcells 1 , •Jonh Méndez 1 , 3 Jordi Eras 1 , Mireia Oromi 1 , Merce Balcells 1 , Elizabeth Murillo 1 , Enrique Ortiz 1 Ramon Canela 1, 2 • 1 Departamento de Química, Universidad de Lleida, España, 3 Departamento de Química, Universidad del Tolima-Colombia •[email protected]UNIVERSIDAD DEL TOLIMA Tercer Simposio de Química Aplicada Universidad del Quindío
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Aplicaciones Biocataliticas en la Preparación de Ést eres de
Halohidrinas Bajo Control Regioisomérico a Partir de Dioles
Asimétricos
Aplicaciones Biocataliticas en la Preparación de Ést eres de
Halohidrinas Bajo Control Regioisomérico a Partir de Dioles
Son enzimas clasificadas como hidrolasas o triacilglicerol éster hidrolasas (EC 3.1.1.3) y actúan sobre el enlace
éster de varios compuestos, siendo los acilglicéridos sus mejores substratos.
Las aplicaciones de este tipo de enzimas han sido destacadasen numerosos procesos de interés industrial, experimentandoel mayor incremento de mercado de los últimos años.
REACCIONES CATALIZADAS POR LIPASAS
OO
O
R1
O
OH
OR1
OO
R3
OH
O
OHR2
O
OHR1
O
OHR3
OH
O
O R
R1
O
O R
R2
O
O R
R3
O
O O
O
O
OR2 R3
R4
O
OH
R1
H2O
ROH
Alco
hólis
is
O
OHR4
Hidrólisis
O OO
OR2 R3
OH
OH OH
OH
OH
O
O R2
O
O
O O
O
O
OR2 R4
R1
O
O O
O
O
OR5 R6
R4
O
O O
O
O
OR2 R6
R4
O
O O
O
O
OR5 R3
R1
O
OH
R3
GlicerólisisAcidólisis
Transesterificación
OH4
• Transformación de acilglicéridos.
O
OO
O
O
OH
O
+
Rhizomucor mieheiO
O
OO
O
O
O
O
OO
O
O
O
OH
O
+
+
Schmid, R. D.; Verger, R. Angew. Chem. Int. Ed. 1998, 37, 1609-1633.
OH
O
Aspergillus flavus
Hexano
+ OH
O
O
O
>90 % (72 h)
Torres, M.; Barbosa, E.; Loscos, V.; Canela, R. Biotech. Lett. 2000, 22, 1265-1268.
Uso de biocatalizadores
Caracterización cinética del biocatalizador
• Capítulo 1
• Capítulo 2
Uso de biocatalizadoresen transformación de acilglicéridos
Regio y enantioselectividad enzimática sobre ésteres de clorohidrinas
• Capítulo 3
Uso de biocatalizadores
Caracterización cinética del biocatalizador
“Resting cells” de Rhizopus oryzae
• Capítulo 1
Uso de biocatalizadoresen transformación de acilglicéridos
Regio y enantioselectividad enzimática de ésteres de clorohidrinas
Estudio Cinético de la Esterificación de Ácido Palmítico Catalizado por Palmítico Catalizado por
“Resting Cells” de Rhizopus oryzae
Kinetic Study of Palmitic Acid Esterification Catalyzed by Rhizopus oryzae Resting Cells. Méndez J. J, Ospina A. A.
Torres M. and Canela R. Enzyme Microb. Tecnol. Enviado
METODOLOGÍA
Obtención del micelio
Aislado de Aislado de Aislado de Aislado de Foeniculum Foeniculum Foeniculum Foeniculum vulgarevulgarevulgarevulgare (Hinojo)(Hinojo)(Hinojo)(Hinojo)
Influencia de la temperatura en la velocidad inicia l de esterificación
Influencia del pH en la velocidad inicial de esteri ficación
Influencia de la cantidad de agua adicionada en la velocidad inicial
0
1
2
3
4
0 10 20 30 40 50Tiempo (min)
Con
cent
raci
ón
de ë
ster
(m
M)
20 mg/ml
40 mg/ml
60 mg/ml
90 mg/ml
120 mg/ml
Influencia de la cantidad de micelio en la velocida d inicial de esterificación
Influencia de la cantidad de micelio en la reacción en función del tiempo
• Las condiciones óptimas para la producción de palmitato de propiloa partir de ácido palmítico y n-propanol, mediada por la lipasa dede Rhizopus oryzae son 250 mM de cada uno de los reactantes,60 mg/ml de catalizador, pH 7, temperatura 40 ºC y sin adición deagua
• El proceso catalítico para la obtención de palmitato de propiloobedece la cinética de Michaelis-Menten con inhibición por sustratoobedece la cinética de Michaelis-Menten con inhibición por sustrato
Extracción Reactiva de Triacilglicéridos Usando un Biorreactor en Columna y Rhizopus oryzae
Méndez,J.J López ,J. Canela,R and Torres ,M. Reactive Extraction of Acylglycerides Using a Column Bioreactor Containing Rhizopus oryzae Resting–Cells
, Biocatalysis and Biotransformation , 2006
REACCIÓN GENERAL
CH2
CHCH2
OH
O
OCR1
OCH2
OR2
R C
OBiocatalizadorBiocatalitzador
CH2
O
CO
R1
CH O
OH
CH2
CH3+
CH2
CHCH2
OH
O
OH
OCR1
R C
OH
CH
CH2
O
O
C
CH3
CH3
OCH2
CCH3
(1)
(3)
+
EXTRACCIÓN
HIDRÓLISIS
ESTERIFICACIÓN
Caracterización cinética delbiocatalizador
Uso de biocatalizadores en transformación de acilglicéridos
Regio y enantioselectividad enzimática de ésteres de
clorohidrinas
transformación de acilglicéridos
• Capítulo 3
DIAGRAMA GENERAL
R
O
OH
CH3OH
OH
+
R
O
O CH3
ClR
O
O
ClCH3
CTMS
+
Ácido 1,3-butanodiolOBTENCIÓN
Ester de 4-cloro-2-butanol Ester de 3-cloro-1-butanol
R
O
O
ClCH3
+ R
O
OH
+ OH CH3
Cl
3-cloro-1-butanol
Éster de 4-cloro-2-butanolÁcido
OH
ClCH3
OH
ClCH3+
(R)-4-cloro-2-butanol (S)-4-cloro-2-butanol
HIDRÓLISISREGIOSELECTIVA
HIDRÓLISISENANTIOSELECTIVA
Influencia de los Reactivos en la Síntesis de Ésteres Clorohidrinas de 1,3-butanodiol
Méndez, J.J,Eras,J.Balcells,M.Canela, R. Influence of the reagents on the synthesis of chlorohydrin esters from 1,3-butanediol. Synthetic Communicationsw, 36: 1167–1175, 2006
a Exceso molar. b Determinado por GC usando tridecano como standard interno. tR = 5.01 min para 5, tR = 5.70 min para 6, tR = 32.60 min para 3m y tR = 32.87 min para 4m.
a Exceso molar con relación al ácido palmítico. Las reacciones fueron llevadas a cabo usando exceso molar de CTMS. b Rendimientos en % (3m+4m) fueron determinados por GC usando tridecano como standard interno. La posición secundaria y primaria de (3m:4m) es indicada por el uso de paréntesis.
Influencia del acido sobre la relación regioisomérica
Rendimiento (%) b
R 3 4
a CCl3 23.8 76.2
b CHCl2 31.0 69.0
c CH2Cl 42.4 57.6
d CH3 46.8 53.3
e CH2C(CH3)3 60.1 39.0
f C H 62.2 37.8
OH
OHRCOOH+
CTMSOCOR
+OCOR
f C3H7 62.2 37.8
g C5H9 63.0 36.4
h C7H13 68.6 31.5
i C9H17 65.7 34.3
j C(CH 3)3 69.9 30.1
k C11H21 69.5 30.5
l C13H25 71.6 28.4
m C15H29 74.7 25.3
n C17H33 79.7 20.3
OH
1 2a-n 3a-nCl
4a-n
+Cl
b Determinado por GC usando tridecano
como standard interno .
• Los resultados descritos permiten determinar que la cantidad de CTMSañadido no influyó de una manera significativa en la proporción de losregioisómeros formados.
• La cantidad de diol empleado influye en el rendimiento de lareacción y en larelación regioisomérica obtenida dependiendo del tiempo de reacción.
• La longitud de cadena del ácido, influye sobre la relación de regioisómeros, ya que se presenta un aumento de la concentración del éster de clorohidrinacon el cloro en la posición secundaria, hasta alcanzar una proporción 1:1 parael caso del ácido acético, mientras en ácidos con longitud decadena superior a14 se ve favorecida la formación del éster con el átomo de cloro en posición primaria
Combinación Regio y Esteroselectiva de Lipasas Para la
Preparación de (R)-4-cloro-2-butanol
Combining Regio- and Enantioselectivity of Lipases for the Preparation of (R)-4-Chloro-2-butanolJONH J. MENDEZ, MIREIA OROMI, MARIA CERVERO, MERCE BALCELLS,MERCE TORRES, AND RAMON CANELA
Influencia del solvente y la lipasa en la hidrólisis regioselectiva depalmitato de 4-cloro-2-butilo (1) y palmitato de 3-cloro-1-butilo (2),empleando Rhizopus oryzae y Aspergillus flavus y diversas enzimascomerciales. Condiciones de reacción 40ºC y 24 h, 5 µL de agua.
Influencia de la longitud de cadena en la hidrólisis regioselectiva depalmitato de 4-cloro-2-butilo (1) y palmitato 3-cloro-1-butilo (2) empleandoRhizopus oryzae y Aspergillus flavus y diversas enzimas comerciales.Condiciones de reacción 40ºC y 24h, 5µL de agua
Influencia de la temperatura en la hidrólisis regioselectiva de palmitato de4-cloro-2-butilo(1) y palmitato de 3-cloro-1-butilo (2), empleando Rhizopusoryzae y diversas enzimas comerciales. Condiciones de reacción 40ºC ,24h, 5µL de agua
Hidrólisis enantioselectiva
ClOHR-COOH OCO-RCl
3-clorobutan-1-butanol
OH
+ +
Resolución enantioselectiva
Novozyme
Éster de 4-cloro-2-butilo
CH3
OH
Cl
CH3
OCO-R
Cl
R-COOH+(R)-4-cloro-2-butanol
(S)- Éster de 4-cloro-2-butilo
3
HIDRÓLISIS ENANTIOSELECTIVA
% conv. % eeR % conv. % eeR E- rat io % conv. % eeR E- rat io % conv. % eeR E- rat io
1a: % conversión del acetato de 3-cloro-1-butilo y % eeR del 4-cloro-2-butanol. 1b: % conversión del octanoatode 3-cloro-1-butilo y % eeR del 4-cloro-2-butanol. 1c: % conversión del palmitato de 3-cloro-1-butilo y % eeR del4-cloro-2-butanol. 1d: % conversión del estearato de 3-cloro-1-butilo y % eeR del 4-cloro-2-butanol.
• Novozyme® no presenta enantioselectividad para este tipode sustrato.Sin embargo las velocidades de hidrólisis de uno de los ésteres de la mezclaracémica es mayor, para ésteres de cadena larga, permitiendo obtener porresolución cinética el (R)-4-cloro-2-butanol con unee>98%.Cuando lareaccióndehidrólisisse llevaacaboa30ºCy sedetieneentreun tiempodereaccióndehidrólisisse llevaacaboa30ºCy sedetieneentreun tiempode15 y 30 minutos, con porcentajes de hidrólisis >49.5%
La transformación enzimática de ésteres de clorohidrinas permite lapreparación de (R)-4-cloro-2-butanol con un ee del 98%. En un primerpaso el empleo de micelio deRhizopus oryzae y Aspergillus flavus, asícomo de distintas enzimas comerciales, permite obtener a partir de lamezclade regioisómeros,uno de los regioisómerosiniciales con una
CONCLUSIONES
mezclade regioisómeros,uno de los regioisómerosiniciales con unapureza >98%. Dicha reacción es afectada por el tipo de solvente,mostrando los mejores resultados en terc-butanol. El producto asíobtenido, mediante resolución cinética con Novozyme® 435,rinde elcorrespondiente cloroalcohol enantiomérico. El coeficiente E delproceso optimizado es 194.
Por lo que respecta a la preparación de ésteres de clorohidrinas seobserva que la concentración de clorotrimetilsilano y 1,3-butanodioltienen poco efecto sobre la regioselectividad de la reacción.
CONCLUSIONES
tienen poco efecto sobre la regioselectividad de la reacción.Sin embargo, la regioselectividad de la reacción, que permite el uso dediferentes tipos de ácidos carboxílicos, esta claramente afectada por elpKa de dichos ácidos.
UNIVERSITAT DE LLEIDA
Aplicaciones Biocataliticas en la Preparación de Ès teres
de Halohidrinas Bajo Control Regioisomérico a Parti r de