ComprovaçãO CientíFica

AVALIAÇÃO TOXICOLÓGICA E FARMACOLÓGICA DO EXTRATO SECO PADRONIZADO OBTIDOS DAS FOLHAS

DA Dicksonia sellowiana

Carl Nathan: Nature 420, 846-852(2002)

Gökhan S. Hotamisligil: Nature 444, 860-867(2006)

Toren Finkel and Nikki J. Holbrook: Nature 408, 239-247(2000)

Carl Nathan: Nature 420, 846-852(2002)

ASMA

A asma é uma doença grave que afeta pessoas de todas as idades, culturas e localizações geográficas. Embora cada pessoa possa apresentar sintomas, diferentes, a definição de asma é muito específica.

A asma é um distúrbio inflamatório crônico dos pulmões, caracterizada por chiado, falta de ar, opressão torácica e tosse, a qual estima-se afetar mais de 100 milhões de pessoas em todo o mundo.

Família: DicksoniaceaeEspécie: Dicksonia sellowianaNomes populares: xaxim ; samambaiaçúDefinição: em 1844 pelo cientista botânico Presl

Hook

Considerado verdadeiro fóssil vivo das florestas pré-históricas.

Objetivo Geral

Analisar a ação do extrato seco padronizado de Dicksonia sellowiana no controle da

nocicepção e inflamação através de estudos farmacológicos “in vivo”, utilizando diferentes protocolos experimentais em camundongos.

Analisar os eventuais efeitos toxicológicos do extrato seco padronizado em camundongos.

•Animais

Camundongos Swiss (25-40 g) machos e/ou fêmeas mantidos em ciclo

claro/escuro de 12 h, com ração e água ad libitum.

Os procedimentos realizados foram conduzidos de acordo com as normas éticas para o estudo de dor com

animais de laboratório (Zimmermann, 1983).

Materiais e Métodos

RESULTADOS DE TOXICIDADE

AGUDA

Efeito do tratamento agudo com o extrato seco padronizado da Dicksonia

sellowiana, administrado pela via oral, sobre o percentual de mortalidade em

camundongos.

Efeito do tratamento agudo dos camundongos machos (A) ou fêmeas (B) com o extrato seco padronizado das folhas da Dicksonia sellowiana (○ – 100 mg/kg; ▲- 500

mg/kg; ∆ - 1000 mg/kg; ■ - 5000 mg/kg) ou com o veículo (● – salina, 10 ml/kg) sobre a massa corporal

dos animais

1 3 6 9 12 15

0

10

20

30

40 A

Período após tratamento (Dias)

Peso

Cor

pora

l (g)

1 3 6 9 12 15

0

10

20

30

40 B

Período após tratamento (Dias)

Peso

Cor

pora

l (g)

Efeito do tratamento agudo dos camundongos machos (A) ou fêmeas (B) com o extrato seco

padronizado das folhas da Dicksonia sellowiana ou com o veículo sobre o peso do coração dos

animais

C 100 500 1000 50000

60

120

180 A

Dicksonia sellowiana (mg/kg, v.o.)

Peso

do

Cor

ação

(mg)

C 100 500 1000 50000

50

100

150 B


Peso

do

Cor

ação

(mg)


padronizado das folhas da Dicksonia sellowiana ou com o veículo sobre o peso do pulmão dos

animais

C 100 500 1000 50000

50

100

150

200 A


Peso

do

Pulm

ão (m

g)

C 100 500 1000 50000

50

100

150

200 B


Peso

do

Pulm

ão (m

g)


padronizado das folhas da Dicksonia sellowiana ou com o veículo sobre o peso do fígado dos

animais

C 100 500 1000 50000

400

800

1200

1600

A


Peso

do

Figa

do (m

g)

C 100 500 1000 50000

400

800

1200

B


Peso

do

Figa

do (m

g)


padronizado das folhas da Dicksonia sellowiana ou com o veículo sobre o peso do rim dos

animais

C 100 500 1000 50000

40

80

120

160

200

240 A


Peso

do

Rim

(mg)

C 100 500 1000 50000

40

80

120

160

200 B


Peso

do

Rim

(mg)


padronizado das folhas da Dicksonia sellowiana ou com o veículo sobre o peso do baço dos

animais

C 100 500 1000 50000

40

80

120

160 A


Peso

do

Baç

o (m

g)

C 100 500 1000 50000

40

80

120

160 B


Peso

do

Baç

o (m

g)

- O extrato seco padronizado obtido das folhas da Dicksonia sellowiana administrado agudamente por via oral para camundongos, tanto machos quanto fêmeas até a dose de 5.000 mg/kg, apresentou boa tolerabilidade e baixa toxicidade quando avaliado sobre diversos parâmetros comportamentais. Além disso, não foi observado morte nos animais até a maior dose utilizada (5.000 mg/kg).

Conclusão - I

- O extrato causou pequenas alterações comportamentais tais como diminuição da sensibilidade ao aperto de cauda, principalmente em doses mais elevadas. No entanto, estas alterações foram observadas somente nas primeiras 4 h após a administração do produto.

- O extrato não produziu nenhum sinal de toxicidade aguda, durante os 15 dias de observação, além de não alterar de forma significativa o peso de vários órgãos vitais tais como: coração, pulmão, fígado, baço e rim.

Conclusão - II

- Conclui-se, portanto que o extrato seco padronizado obtido das folhas da Dicksonia sellowiana quando administrado agudamente pela via oral para camundongos de ambos os sexos demonstrou boa tolerabilidade e ausência de efeitos tóxicos agudos importantes, justificando assim a continuação dos estudos toxicológicos crônicos

RESULTADOS DE TOXICIDADE

CRÔNICA

Efeito do tratamento crônico, durante 90 dias consecutivos, com o extrato seco padronizado de Dicksonia sellowiana,

administrado pela via oral, sobre o percentual de mortalidade em

camundongos. Extrato padronizado de Dicksonia sellowiana (mg/kg, v.o.)

Sexo N Morte (%)

0 Macho 10 20Fêmea 10 10

300 Macho 10 20Fêmea 10 10

600 Macho 10 20Fêmea 10 10

1000 Macho 10 40Fêmea 10 40

2000 Macho 10 65Fêmea 10 60

A dose letal 50 (DL50) calculada para o extrato da Dicksonia sellowiana foi de 1609,0 e 1461,0 mg/kg para os camundongos fêmeas e machos, respectivamente.

Efeito do tratamento crônico, durante 90 dias consecutivos com o extrato padronizado de Dicksonia sellowiana, administrado pela via oral, sobre a variação de ingesta média de comida e bebida

dos camundongos ao final de tratamento. Grupo(mg/kg,

v.o.)

Sexo Ração (g) H20 (mL)

0 Macho 6,05 ± 0,19 5,76 ± 0,15300 Macho 4,61 ± 0,15

***3,88 ± 0,13 ***

600 Macho 5,04 ± 0,25 **

4,42 ± 0,17 ***

1000 Macho 5,38 ± 0,18 * 4,42 ± 0,19 ***

2000 Macho 5,04 ± 0,24 **

4,45 ± 0,23 ***

0 Fêmea 4,77 ± 0,21 3,92 ± 0,27300 Fêmea 4,00 ± 0,14 * 3,35 ± 0,16600 Fêmea 4,14 ± 0,23 * 3,69 ± 0,251000 Fêmea 5,47 ± 0,21 * 4,45 ± 0,242000 Fêmea 3,78 ± 0,28** 2,94 ± 0,28*

- Os valores representam a média da variação da ingesta sólida (g/animal/dia) e liquida (ml/animal/dia) de 4 - 10 animais o erro padrão da média.- Difere significativamente do grupo controle (veículo, 0), * p<0,05; ** p<0,01 e *** p<0,001.

Efeito do tratamento crônico, durante 90 dias consecutivos, com o extrato padronizado de Dicksonia sellowiana, administrado pela

via oral, sobre a massa do baço, rim, coração, pulmão e fígado dos camundongos.

Grupo (mg/ kg,

v.o.)

Sexo Baço (%) Rim (%) Coração (%) Pulmão (%) Fígado (%)

0 Macho 0,30 (0,26 – 0,33)

0,64 (0,61 – 0,68)

0,55 (0,52 – 0,58)

0,58 (0,48 – 0,68)

3,88 (3,32 – 4,44)

300 Macho 0,30 (0,27 – 0,32)

0,59 (0,54 – 0,63)

0,43*** (0,39 – 0,46)

0,51 (0,45 – 0,56)

4,35 (4,10 – 4,60)

500 Macho 0,29 (0,27 – 0,31)

0,59 (0,55 – 0,63)

0,44*** (0,40 – 0,48)

0,51 (0,43 – 0,59)

3,86 (3,60 – 4,12)

1000 Macho 0,26 (0,24 – 0,29)

0,60 (0,56 – 0,64)

0,44*** (0,41 – 0,47)

0,50 (0,47 – 0,53)

4,35 (3,88 – 4,82)

2000 0,37** (0,32 – 0,41)

0,68 (0,59 – 0,77)

0,47 * (0,41 – 0,54)

0,55 (0,50 – 0,59)

4,56 (4,25 – 4,87)

0 Fêmea 0,38 (0,34 – 0,42)

0,46 (0,43 – 0,49)

0,39 (0,36 – 0,42)

0,52 (0,47 – 0,57)

3,84 (3,68 – 4,01)

300 Fêmea 0,35 (0,32 – 0,38)

0,48 (0,46 – 0,50)

0,42 (0,40 – 0,45)

0,58 (0,53 – 0,62)

3,91 (3,74 – 4,08)

500 Fêmea 0,40 (0,36 – 0,43)

0,47 (0,45 – 0,49)

0,39 (0,37 – 0,41)

0,56 (0,51 – 0,62)

3,84 (3,60 – 4,08)

1000 Fêmea 0,38 (0,34 – 0,42)

0,42 (0,39 – 0,45)

0,38 (0,34 – 0,43)

0,48 (0,44 – 0,51)

3,93 (3,50 – 4,35)

2000 Fêmea 0,30* (0,25 – 0,34)

0,47 (0,43 – 0,51)

0,39 (0,33 – 0,45)

0,58 (0,54 – 0,63)

4,24 (3,92 – 4,56)

Os valores representam a média de peso dos órgãos de 4 - 10 animais juntamente com o intervalo de confiança de 95%.Os valores foram obtidos através da relação (em percentagem) do peso dos órgãos pela massa corpórea dos animais (através da seguinte formula: peso do órgão/peso do animal x 100)

- O extrato seco padronizado das folhas da Dicksonia sellowiana administrado por via oral para camundongos durante 90 dias, tanto em machos quanto em fêmeas nas doses de 300, 600, 1000 e 2000 mg/kg, apresentou de maneira geral boa tolerabilidade e relativa toxicidade quando avaliado sobre diversos parâmetros bioquímicos, hematológicos e histopatológicos.

Conclusão - III

- O extrato seco padronizado de Dicksonia sellowiana administrado por via oral para camundongos durante 90 dias provocou a letalidade de 65 e 60% dos camundongos machos e fêmeas na dose de 2000 mg/kg, respectivamente. As DL50s calculadas foram 1609,0 e 1461,0 mg/kg para os camundongos fêmeas e machos, respectivamente

- Foram observadas alterações importantes no consumo de ração e água nos camundongos machos e redução da ingesta de ração nos camundongos fêmeas em todas as doses analisadas e de água somente na dose de 2000 mg/kg nos camundongos fêmeas, contudo ocorreu redução do peso corporal nos camundongos machos e fêmeas somente na dose de 2000 mg/kg.

Conclusão - IV

- O extrato causou em camundongos machos aumento significativo dos níveis plasmáticos de glicose em todas as doses analisadas e de colesterol e triglicérides nas maiores doses utilizadas, enquanto que nas fêmeas ocorreu apenas aumento de albumina, globulina, glicose e colesterol nas doses de 600, 1000 e 2000 mg/kg.

- Em conjunto, as análises bioquímicas, hematológicas, e anatomo-patológicas (macroscópica e microscópica) realizadas nos animais tratados com salina (controle) ou com as diversas doses do extrato seco padronizado de Dicksonia sellowiana (300, 600, 1000 e 2000 mg/kg) por via oral durante 90 dias, detectaram alterações pontuais em alguns desses parâmetros, demonstrando que o extrato seco padronizado das folhas da Dicksonia sellowiana quando administrado cronicamente para camundongos de ambos os sexos demonstrou média tolerabilidade e razoáveis sinais toxicicidade, principalmente em relação à letalidade.

Conclusão - V

RESULTADOS DE DOR

NOCICEPÇÃO INDUZIDA PELO ÁCIDO ACÉTICONOCICEPÇÃO INDUZIDA PELO ÁCIDO ACÉTICO

• Modelo de nocicepção simples, rápido e de observação inequívoca;

• Substâncias que atuam tanto no SNC quanto SNP;

• Liberação de mediadores endógenos da dor (bradicinina, serotonina, histamina, citocinas (IL-1, TNF, entre outras), PG’s...);

• Injeção i.p. de ácido acético (0,6%, 10 ml/kg);

• Contração da musculatura abdominal e extensão de uma das patas posteriores (COLLIER

et al., 1968; BENTLEY et al., 1981).

• Quantificado cumulativamente (0 a 20 min), considerado como índice de nocicepção.

Características:Características:

Método:Método:Azul de Evans (2,5%, 100l, intra-orbital)

C 30 100 300 10000

10

20

30

40

50

***

***

**

DI50: 187,7 (172,3 - 204,6)Inibição: 74 7

D. sellowiana (mg/kg, v.o.)

Núm

ero

de C

onto

rçõe

s

S C 30 100 300 10000

5

10

15

20

25

*

**

DI50: 64,1 (34,5 - 119,0)Inibição: 93 6


Azu

l de

Evan

s (

g/m

l)

0 0,5 1 2 4 6

0

10

20

30

40

50

60

70

ControleD. sellowiana (300 mg/kg,v.o.)

***

****

2811% 436%

334%

Tempo (h)

Núm

ero

de C

onto

rçõe

s

Efeito antinociceptivo (analgésico) da D. Efeito antinociceptivo (analgésico) da D. sellowiana na nocicepção causada pelo sellowiana na nocicepção causada pelo

ácido acético em camundongosácido acético em camundongos

V C Indo L-Noarg0

10

20

30

40

50

(100mg/Kg, i.p) (10mg/kg, i.p)

Acetic acid (0,6%, 450 l/i.p.)

*** ***98±2%944%

#

Num

ber

of W

rith

es

V C Indo L-Noarg0

5

10

15

20

#

***

***932%

665%

(100mg/Kg, i.p) (10mg/kg, i.p)

Acetic acid (0,6%, 450 l/i.p.)Ev

ans

Blu

e (

g/m

l)

Efeito antinociceptivo (analgésico) da Efeito antinociceptivo (analgésico) da Indometacina e da L-NOARG na Indometacina e da L-NOARG na

nocicepção causada pelo ácido acético nocicepção causada pelo ácido acético em camundongosem camundongos

Efeito antinociceptivo (analgésico) do Efeito antinociceptivo (analgésico) do extrato e de frações obtidas da D. extrato e de frações obtidas da D.

sellowiana na nocicepção causada pelo sellowiana na nocicepção causada pelo ácido acético em camundongosácido acético em camundongos

C 30 100 3000

10

20

30

40

50

*****

***

Fr. Alcoloídica (mg/kg, v.o.)

Núm

ero

de C

onto

rçõe

s

DI50= 88,6 (28,3-252,8)Inibição= 75+1%

C 30 100 300 10000

10

20

30

40

50

**

***

*

DI50= 143.5 (117.3-175.5)Inibição= 74+9%

Núm

ero

de C

onto

rçõe

s


C 30 100 3000

10

20

30

40

50

**

***

*

Fr. Clorofórmica (mg/kg, v.o.)

Núm

ero

de C

onto

rçõe

s DI50= 92,5 (53,3-160,6)Inibição= 74+4%

C 10 30 100 3000

10

20

30

40

50

***

*** ***

DI50= 50,1 (41,9-59,8)Inibição= 77+10%

Fr. Acet. Etila (mg/kg, v.o.)

Núm

ero

de C

onto

rçõe

s

C 10 30 100 3000

10

20

30

40

50

******

***

DI50= 50,8 (43,2-59,8)Inibição= 81+8%

Fr. Hexânica (mg/kg, v.o.)

Núm

ero

de C

onto

rçõe

s

C 30 100 200 3000

10

20

30

40

50

***

**

Fr. Aquosa (mg/kg, v.o.)

Núm

ero

de C

onto

rçõe

s

**

DI50= 69,8 (58,8-82,9)Inibição= 75+3%

NOCICEPÇÃO INDUZIDA PELA FORMALINANOCICEPÇÃO INDUZIDA PELA FORMALINA

• Modelo de nocicepção que mais se aproxima da dor clínica (TJOLSEN e HOLE, 1997) ;

• Apresenta 2 fases distintas de nocicepção, envolvendo diferentes mediadores químicos;

• 1ª fase (0 a 5 min, neurogênica), estimulação direta dos nociceptores (fibras C e A), associada a liberação de AAE, neuropeptídeos, HIST e 5-HT.

• Interfase (5 a 15 min, silenciosa), atuação das vias inibitórias.

• 2ª fase (15 a 30 min, inflamatória), liberação de mediadores pró-inflamatórios (BK, HIST, PG’s, 5-HT e adenosina).

• Injeção de 20 µl de formalina (2,5%), na pata posterior direita de camundongos;

• Contato do animal, lambendo ou mordendo a pata injetada com formalina;

• Quantificado cumulativamente (0-5 e 15-30 min), considerado como índice de nocicepção.


Método:Método:

Efeito antinociceptivo (analgésico) da D. Efeito antinociceptivo (analgésico) da D. sellowiana na nocicepção causada pela sellowiana na nocicepção causada pela

formalina em camundongosformalina em camundongos

C 30 100 300 10000

25

50

75

100

***

****

DI50: 391,8 (209,5-732,9)Inibição: 613%

A

Tem

po d

e R

eaçã

o (s

)


C 30 100 300 10000

100

200

300

400

***

**

DI50: 574.1 (422.9-779.3)Inibição: 628%

B

Tem

po d

e R

eaçã

o (s

)


XXXXXX

XXXXXX

Comportamento de “biting” induzido por diferentes agentes flogísticos

SP 0,1 nmol/sítio

D. sellowiana(10-1000 mg/kg, v.o.)

60’

5 e 15’

IL-11 pg/sítio

TNF-0,1 pg/sítio


substância P em camundongossubstância P em camundongos

Sal C 30 100 3000

25

50

75

100

***

*


Tem

po d

e R

eaçã

o (s

)

DI50: 115,1 (72,2 - 183,6)Inibição: 95 6


Interleucina 1Interleucina 1ββ em camundongos em camundongos

Sal C 30 100 3000

50

100

150

200

250

***

*


DI50: 90,0 (55,5 - 145,9)Inibição: 78 8

Tem

po d

e R

eaçã

o (s

)

**


TNF-TNF-αα em camundongos em camundongos

Sal C 100 300 10000

50

100

150

200

250

**


DI50: 473,7 (347,6 - 645,7)Inibição: 69 8

Tem

po d

e R

eaçã

o (s

)

*

- Esses resultados analisados em conjunto, indicam que o extrato obtidos da D. sellowiana apresenta significativo efeito antinociceptivo em camundongos.

- Além disso, os nossos dados também mostram que o extrato foi efetivo em reduzir a nocicepção induzida por diferentes agentes flogísticos (IL-1beta, TNF-alfa e SP) envolvidos na gênese da inflamação e na dor.

Conclusão - VI

RESULTADOS NAINFLAMAÇÃO

Lavagem da cavidade

Aplicação

Contagem Total de Células

Diferencial

Exsudato

Câmera de Neubauer

PLEURISIA

C CAR 3 10 30 100 3000.0

2.5

5.0

7.5

10.0

#

**

************

Dicksonia selowiana (mg/kg, v.o.)

DI50: 4,8 (3,5-6,5)Inibição: 902%

Leuc

ócito

s to

tais

(x 1

06 )

C CAR 3 10 30 100 3000.0

2.5

5.0

7.5

10.0

#

******

*********


DI50: 5,0 (4,0 - 6,3)Inibição: 87 2%

Neut

rófil

os (x

106 )

C CAR 3 10 30 100 3000

1

2 #

******

******


DI50: 17,9 (15,9 - 20,2)Inibição: 100%

Mon

ócito

s (x

106 )

C CAR 3 10 30 100 3000

5

10

15


Azu

l de

Evan

s (

g/m

l)

***

#

*

DI50: 69,0 (58,1 - 82,1)Inibição: 70 13%

EFEITO DA D. sellowiana NA PLEURISIA INDUZIDA PELA CARRAGENINA EM CAMUNDONGOS

Leuc

ócito

s (x

106 )

C CAR Indo Dexa0

1

2

3

4

5###

*** ***

A

5,0 0,5 mg/kg, i.p.

Azul

de

Evan

s (

g/m

l)

C CAR Indo Dexa0

1

2

3

4

###

******

B

5,0 0,5 mg/kg, i.p.

Neu

tróf

ilos

(x10

6 )

C CAR Indo Dexa0

1

2

3

4

###

*** ***

C

5,0 0,5 mg/kg, i.p.

Mon

onuc

lear

es (x

106 )

C CAR Indo Dexa0

1

2 D

5,0 0,5 mg/kg, i.p.

EFEITO DA INDOMETACINA E DA DEXAMETASONA NA PLEURISIA INDUZIDA PELA CARRAGENINA EM CAMUNDONGOS

- Esses resultados analisados em conjunto, indicam que o extrato obtidos da D. sellowiana apresenta significativo efeito antiinflamatório em camundongos.

- Além disso, os nossos dados também mostram que o extrato foi efetivo em reduzir tanto a migração quando a extravasamento de plasmático induzida pelo agente flogístico (Carragenina) em camundongos.

Conclusão - VII

- Esses resultados parcial do presente estudo analisados em conjunto, indicam que o extrato seco padronizado obtidos da folhas da D. sellowiana apresenta significativo efeito antiinflamatório e antinociceptivo em camundongos.

- Além disso, os nossos dados também mostram que o extrato apresenta reduzidos efeitos toxicológicos tanto agudo quanto crônico, justificando a continuidade dos estudos. Fornecendo portanto subsídios científicos para a sua utilização popular, bem como na produção de um fitoterápico.

Conclusão - VIII

NOCICEPÇÃO INDUZIDA PELO ÁCIDO ACÉTICONOCICEPÇÃO INDUZIDA PELO ÁCIDO ACÉTICO

• Modelo de nocicepção simples, rápido e de observação inequívoca;

• Substâncias que atuam tanto no SNC quanto SNP;

• Liberação de mediadores endógenos da dor (bradicinina, serotonina, histamina, citocinas (IL-1, TNF, entre outras), PG’s...);

• Injeção i.p. de ácido acético (0,6%, 10 ml/kg);

• Contração da musculatura abdominal e extensão de uma das patas posteriores (COLLIER

et al., 1968; BENTLEY et al., 1981).

• Quantificado cumulativamente (0 a 20 min), considerado como índice de nocicepção.


Método:Método:Azul de Evans (2,5%, 100l, intra-orbital)

C 30 100 300 10000

10

20

30

40

50

***

***

**

DI50: 187,7 (172,3 - 204,6)Inibição: 74 7


Núm

ero

de C

onto

rçõe

s

S C 30 100 300 10000

5

10

15

20

25

*

**

DI50: 64,1 (34,5 - 119,0)Inibição: 93 6


Azu

l de

Evan

s (

g/m

l)

0 0,5 1 2 4 6

0

10

20

30

40

50

60

70

ControleD. sellowiana (300 mg/kg,v.o.)

***

****

2811% 436%

334%

Tempo (h)

Núm

ero

de C

onto

rçõe

s


ácido acético em camundongosácido acético em camundongos

Extrato hidroalcoólico Xaxim

ComprovaçãO CientíFica

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