Compendio Internacional de los métodos de análisis - … · o cromatografía de alta resolución en fase líquida acoplada a ... HPLC-IRMS: técnica de cromatografía de alta resolución
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La combinaciones posibles de los isótopos 18O, 17O, 16O y 13C, 12C se reflejan en la masa 44
correspondientes al isotopómero 12C16O2, la masa 45 que corresponde a las especies 13C16O2 y 12C17O16O y la masa 46 al isotopómero 12C16O18O. Las combinaciones 13C17O16O y 12C17O2 no se tienen en cuenta, pues aparecen en muy baja abundancia. Las corrientes
iónicas correspondientes se miden en tres detectores distintos. La corriente iónica
correspondiente a m/z = 45 se corrige para tener en cuenta el aporte de 12C17O16O, que se
calcula en función de la intensidad de la corriente de m/z = 46, considerando las
concentraciones relativas de 18O y 17O (corrección de Craig). El uso de un patrón interno
cotejado con el patrón internacional V-PDB permite calcular la concentración de carbono 13 en la escala relativa δ13C ‰.
4. REACTIVOS
Se deben utilizar los siguientes reactivos y patrones:
4.1. Etanol (anhidro) (Núm. CAS 64-17-5).
4.2. Glicerol puro ≥ 99 % (Núm. CAS 56-81-5).
4.3. 1,5-pentanodiol (Núm. CAS 111-29-5).
4.4. Disolución de 1,5-pentanodiol (4.3) en etanol (4.1), a una concentración determinada
(entre 0,5 y 1,0 g l-1). Se utiliza para disolver las muestras de vino.
4.5. Ácido ortofosfórico
4.6. Peroxodisulfato de sodio, que se utiliza como oxidante.
4.7. Helio (Núm. CAS 07440-59-7), que se utiliza como gas portador.
4.8. Oxígeno (Núm. CAS 07782-44-7), como gas regenerante para el reactor de
combustión.
4.9. Bala de dióxido de carbono (CAS 00124-38-9), que se utiliza como patrón secundario
para la medida de carbono-13.
4.10. Patrones de glicerol de relación isotópica (13C/12C) conocida y cotejadas con patrones
internacionales de referencia.
4.11. Patrones de 1,5-pentanodiol de relación isotópica (13C/12C) conocida y cotejadas con
patrones internacionales de referencia.
5. INSTRUMENTAL
5.1. Espectrómetro de masas de relaciones isotópicas
Espectrómetro de masas de relaciones isotópicas (IRMS), capaz de analizar la relación de 13C en CO2 con una precisión interna de 0,05 ‰ como mínimo (véase el apartado número
8). Por precisión interna entendemos la diferencia entre dos medidas de una misma
muestra de CO2. El espectrómetro de masas que se utiliza para medir relaciones isotópicas
dispone de un detector triple, lo que permite medir simultáneamente las intensidades de
los tres valores de m/z (44, 45 y 46). El espectrómetro consta también de un programa
informático que controla el análisis, gestiona los datos y procesa los resultados para
los patrones internacionales del IAEA. El CO2 patrón puede también calibrarse frente a
patrones internos.
Se realizan tres inyecciones de cada muestra de vino (6.1). Se deben incluir muestras de
control adecuadas en cada serie.
Ejemplo de una serie típica:
• Muestra de control
• Muestra de control
• Muestra 1
• Muestra 1
• Muestra 1
• Muestra 2
Cada muestra se analiza 3 veces
• …
• Muestra 6
• Muestra 6
• Muestra 6
• Muestra de control
• Muestra de control
La muestra de control es una disolución de glicerol en etanol cuya concentración de carbono 13 (δ13C) se ha determinado con mucha precisión (por medio de un analizador
elemental- IRMS, por ejemplo) y permite comprobar posibles desviaciones durante la serie
de medidas por revisar y la corrección de los resultados.
7.1.3. Relación de 13C/12C del glicerol y cuantificación
Cuando además de medir la relación isotópica también sea necesario cuantificar el glicerol,
se aplicará a las muestras, preparadas según se indica en el apartado 6.2, el procedimiento
descrito en el apartado anterior (7.1.2).
El 1,5-pentanodiol (4.3) permite determinar la concentración de glicerol. Además, pueden utilizarse los valores de δ13C del patrón interno para corregir las inyecciones y controlar de
calidad del análisis isotópico y de la etapa de combustión.
Para obtener la concentración de glicerol de las muestras de vino se utiliza el método del
patrón interno. Se prepara una curva de calibrado usando una concentración constante y
conocida de patrón interno (1,5-pentanodiol) y serie de 5 disoluciones de glicerol de
concentraciones distintas conocidas, de 0,50 a 10 g l-1. Estas disoluciones se preparan en
matraces aforados: se pesan el glicerol (4.2) y el 1,5-pentanodiol en una balanza y se
disuelven en etanol (4.1). Se analizan sucesivamente y por triplicado cada una de las
disoluciones de la serie, para asegurarse de que la respuesta es lineal.
7.2. HPLC-IRMS
La siguiente descripción se refiere a los métodos que se suelen utilizar para determinar la
relación isotópica 13C/12C del glicerol con los sistemas automatizados de HPLC-IRMS
Los distintos procedimientos pueden adaptarse en función de los cambios que introduzcan
los fabricantes. Los volúmenes, la temperatura, los caudales y los tiempos indicados son
orientativos y se deben ajustar los valores según las recomendaciones del fabricante.
7.2.1. Condiciones analíticas
Si se utilizan la columna y el sistema descritos en el ejemplo (5.3), se pueden aplicar los
parámetros siguientes:
A. Ajustar el caudal del eluyente a 400 μl min-1.
B. Ajustar el caudal del ácido y del oxidante en la interfase LC a 40 μl min-1 y 30 μl min-1,
respectivamente.
C. Ajustar la temperatura del reactor de la interfase a 99,9 °C y la de la columna a 65 °C.
D. Ajustar el caudal de helio de la unidad de separación a 1 μl min-1.
Hay que desgasificar las botellas de reactivos con helio a lo largo de todo el proceso de
separación cromatográfica.
7.2.2. Relación de 13C/12C del glicerol
Con cada análisis 13C/12C se introducen al menos dos pulsos de CO2 patrón (4.9) de la bala
(véase ejemplo de cromatograma en 11.2). Existe una cadena ininterrumpida de
calibraciones entre este patrón, los patrones V-PDB y los patrones internacionales del OIEA.
El CO2 patrón puede también calibrarse con patrones internos.
Se realizan tres inyecciones de cada muestra de vino (6.3). Se deben incluir muestras de
control adecuadas en cada serie.
Ejemplo de una serie típica:
• Muestra de control
• Muestra de control
• Muestra 1
• Muestra 1
• Muestra 1
• Muestra 2
Cada muestra se mide 3 veces
• …
• Muestra 6
• Muestra 6
• Muestra 6
• Muestra de control
• Muestra de control
La muestra de control es una disolución de glicerol cuya concentración de carbono-13 (δ13C) se ha determinado previamente con mucha precisión (por ejemplo, mediante un
analizador elemental-IRMS) y que permite comprobar posibles desviaciones a lo largo de la
La relación isotópica 13C/12C puede expresarse a partir de la desviación que presenta con respecto a un patrón interno. La desviación isotópica del carbono-13 (δ13C) se calcula en
una escala delta por mil ( δ ‰), comparando los resultados obtenidos para la muestra
analizada con los de un patrón interno previamente calibrado con el patrón primario
internacional (V-PDB). Durante el análisis isotópico, se introduce CO2 patrón, existiendo una
cadena de calibraciones entre este patrón y los patrones V-PDB.
Los valores de δ
13C se expresan en función del patrón interno como se explica a
continuación:
13Cmuestra/ref ‰= (Rmuestra / Rref - 1) × 1000
donde Rmuestra y Rref son respectivamente las relaciones isotópicas (13C/12C) de la muestra y
del dióxido de carbono utilizado como patrón (4.9).
Los valores de δ 13C se expresan en función del patrón V-PDB como se explica a
13Cref/V-PDB es la desviación isotópica del patrón interno con respecto del V-PDB
determinada anteriormente.
Al efectuar las mediciones en serie pueden observarse ligeras variaciones debidas a cambios en las condiciones instrumentales. En ese caso, los valores de δ 13C de las
muestras se deben corregir en función de la diferencia entre el valor de δ 13C medido en el
patrón y su valor real, calibrado previamente con respecto al V-PDB mediante algún
material de referencia internacional. Se puede considerar que la variación entre dos
mediciones del patrón y, por consiguiente, la corrección que hay que aplicar a los
resultados obtenidos de las muestras, son lineales. El patrón debe medirse al principio y al
final de las series, de modo que pueda calcularse la corrección para cada muestra por
interpolación lineal.
8.2. Concentración de glicerol mediante GC-IRMS
Al elaborar la curva de calibración, para cada inyección, el parámetro medido que es tenido
en cuenta es el área S (en V*s) dado por el espectrómetro. Calcular la relación R tal como
se muestra en la ecuación 1 que aparece a continuación y dibujar la gráfica de R frente a la
concentración de glicerol respecto al patrón interno (IS) C glicmuestra. La gráfica ha de ser
lineal y el coeficiente de correlación, al menos 0,99.
Para comprobar si las medidas son correctas se utiliza una corriente iónica m/z = 44, que
es proporcional a la cantidad de carbono que se inyecta en el sistema. En condiciones
normales, la corriente iónica debería ser prácticamente constante en las muestras
analizadas. Una desviación importante podría deberse a un problema de separación y
oxidación del glicerol, o a la inestabilidad del espectrómetro de masas.
9.2. HPLC-IRMS
Comprobar el valor de 13C del patrón interno: si difiere en más del 0,5 ‰ del valor
admisible, se debe verificar que el espectrómetro esté correctamente ajustado y, en caso
necesario, reajustarlo.
Para cada muestra se deben medir tres viales consecutivamente y comprobar que la
desviación típica (SD) sea inferior a 0,6 ‰. El resultado final para una muestra dada es la
media de las tres medidas. Si la desviación es superior a 0,6 ‰, se debe repetir la
medida.
Para comprobar si las medidas son correctas se utiliza una corriente iónica m/z = 44, que
es proporcional a la cantidad de carbono que se inyecta en el sistema. En condiciones
normales, la corriente iónica debería ser prácticamente constante en las muestras
analizadas. Una desviación importante podría deberse a un problema de separación y
oxidación del glicerol, o a la inestabilidad del espectrómetro de masas.
10. CRITERIOS DE EFICACIA
10.1. GC-C-IRMS
10.1.1. Precisión
Se han llevado a cabo varios estudios preliminares con 4 disoluciones sintéticas de vino (agua-etanol-glicerol), con muestras de glicerol de distintos orígenes y cuyo valor δ 13C se
ha determinado mediante EA-IRMS. Para la GC-C-IRMS se aceptó una desviación estándar
≤ 0,6 ‰ para las 3 repeticiones (n = 3).
En los vinos dulces la precisión puede verse afectada debido al solapamiento entre el 1,5-
pentanodiol y otros componentes o subproductos del vino.
10.1.2. Determinación de la concentración de glicerol
Se han usado 2 disoluciones de glicerol para validar el método. Dado que la concentración
de glicerol del vino seco está normalmente entre 4 y 10 g l-1, las concentraciones de las dos
disoluciones están comprendidas en este intervalo. Para la primera disolución (4,0 g l-1) se
obtuvo un valor experimental de 3,6 g l-1 (SD = 0,2, n = 8). Para la segunda disolución
(8,0 g l-1) se obtuvo un valor experimental de 7,9 g l-1 (SD = 0,3, n = 8).