UNIVERSIDAD AGRARIA DEL ECUADOR FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS CARRERA DE INGENIERÍA AGRONÓMICA COMPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO EN LA MICROPROPAGACIÓN DE PIÑA (Ananas comosus L. Merr) A PARTIR DE YEMAS AXILARES E HIJOS BASALES TRABAJO EXPERIMENTAL Trabajo de titulación presentado como requisito para la obtención del título de INGENIERO AGRÓNOMO AUTOR BAQUE ANCHUNDIA LISBETH ALLISON TUTORA PhD. ARIADNE VEGAS GARCÍA GUAYAQUIL – ECUADOR 2019
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COMPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO EN LA MICROPROPAGACIÓN DE ...
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UNIVERSIDAD AGRARIA DEL ECUADOR FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS CARRERA DE INGENIERÍA AGRONÓMICA
COMPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO EN LA MICROPROPAGACIÓN DE PIÑA (Ananas comosus L.
Merr) A PARTIR DE YEMAS AXILARES E HIJOS BASALES
TRABAJO EXPERIMENTAL
Trabajo de titulación presentado como requisito para la obtención del título de
INGENIERO AGRÓNOMO
AUTOR BAQUE ANCHUNDIA LISBETH ALLISON
TUTORA PhD. ARIADNE VEGAS GARCÍA
GUAYAQUIL – ECUADOR
2019
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UNIVERSIDAD AGRARIA DEL ECUADOR
FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS
CARRERA DE INGENIERÍA AGRONÓMICA
APROBACIÓN DEL TUTOR
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UNIVERSIDAD AGRARIA DEL ECUADOR
FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS
CARRERA DE INGENIERÍA AGRONÓMICA
APROBACIÓN DEL TRIBUNAL DE SUSTENTACIÒN
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Dedicatoria
A Dios, principalmente por darme la oportunidad de
haber culminado esta etapa profesional, pese a toda
circunstancia nunca me abandonó, sin El nada de
esto hubiese sido posible por eso y mucho más esto
se lo dedico con todo el amor del mundo.
A mis padres, por estar y ser pilar fundamental en mi
vida y toda mi carrera, mi mamá Ana por darme sus
consejos cuando más lo he necesitado; mi papá
Orlando que sin duda alguna ha sido mi mejor
ejemplo y a pesar de las dificultades y obstáculos
me demuestra que puedo contar con el siempre.
A mis padrinos Mayra y Rodolfo, quienes han puesto
su granito de arena en absolutamente todo, por su
infinito apoyo.
Mi abuelita Julia por ser parte de mi meta alcanzada
y al resto de mis familiares.
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Agradecimiento
Mi eterno agradecimiento que nunca será suficiente
para la persona más importante en mi vida, Jesús.
Para aquellas personas que siempre estuvieron
apoyándome, ya sea con una palabra de aliento o
simplemente dándome ánimos y fuerzas para seguir
adelante y no rendirme en todo el arduo proceso.
Agradezco a mi tutor de tesis la Dra. Ariadne Vegas,
por su ayuda incondicional durante todo el trabajo,
por corregirme y guiarme hasta el último momento,
por su eterna disposición muchas gracias.
A mis compañeros Robin Vera, Angelo Toledo,
Milena Garcés, Karissa Otero y Bianca Macías por
su compañía en todo el trabajo realizado en
laboratorio.
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Autorización de autoría intelectual
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Índice general PORTADA ………………………………………………………………………………...1
APROBACIÓN DEL TUTOR ................................................................................. 2
APROBACIÓN DEL TRIBUNAL DE SUSTENTACIÒN ......................................... 3
En Ecuador, la producción de piña (Ananas comosus L. Merr) ha cobrado un
importante auge en los últimos años, debido a su demanda en los mercados
internacionales MAGAP, (2014). Razón por la cual, muchos productores se han
interesado en incursionar en este mercado; sin embargo, son varios los
problemas que deben superarse para obtener buenos rendimientos Pineda,
et.al., (2014). En primer lugar, se encuentra la alta inversión monetaria,
especialmente para evitar las plagas y enfermedades, en segundo lugar, el
largo tiempo (al menos dos años) que se requiere para la cosecha de los frutos
y la obtención de dividendos, y por último la falta de programación en las
cosechas (BANACOL, 2016a).
Aunado a lo antes citado, podemos mencionar la falta de capacitaciones
dirigidas a los productores, tanto en el manejo agronómico como en el manejo
de postcosecha con el fin de optimizar el rendimiento de este cultivo Moreira y
Uguña, (2018). Por tal motivo ha sido difícil obtener frutos con estándares
internacionales de comercialización, que en este rubro son determinados por
los grados Brix y la acidez, y se encuentran estrechamente relacionados con
una buena fertilización y manejo agronómico del cultivo (MAGAP-
AGROCALIDAD, 2016).
“Entre las alternativas disponibles para solventar los problemas del cultivo de
piña, se puede mencionar la micropropagación, la cual incrementa la
producción de plantas sanas libres de patógenos en grandes volúmenes en
corto tiempo y garantiza la estabilidad genética del cultivar a propagar” (Kessel,
2013).
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En Ecuador, existen precedentes de estudios en biotecnología aplicada al
cultivo de Ananas, especialmente a las variedades Champaka y Hawaiana
Saucedo et.al., (2007), y el híbrido MD-2 Suárez, (2011); sin embargo, aún
queda mucho por evaluar en el ámbito de la micropropagación, y es imperativo
lograr un protocolo estandarizado de excelentes resultados para la propagación
efectiva de este fruto.
1.2 Planteamiento y formulación del problema
1.2.1 Planteamiento del problema
La piña como muchas frutas, presenta un elevado valor nutricional además de
aportar otros elementos como fibra, por lo tanto, su consumo es de vital
importancia para el buen desarrollo del cuerpo humano Alves, et al., (2006).
Razón por la cual, incrementar la producción de este cultivo representa un reto
diario.
La micropropagación de piña a partir de yemas axilares in vitro es un método
para obtener plantas vigorosas y sanas libres de cualquier patógeno, como
Phythopthora parasitica y Pectobacterium carotovora. Este fruto se propaga
comercialmente de forma asexual a partir de hijos basales, lo cual genera una alta
tasa de transmisión de enfermedades Christianson y Warnick, (1983). De ahí la
importancia de producción de vitroplantas sanas. Adicionalmente, es necesario
realizar estudios para buscar frutos que no solo suplan las necesidades de
alimentación, sino que aporten con una alta cantidad de nutrientes, que llenen de
energía al organismo y que estén al alcance económico de un alto porcentaje de
la población y mejoren la calidad de vida de las personas.
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1.2.2 Formulación del problema
¿Mediante la micropropagación in vitro de piña (Ananas comosus L. Merr),
variedad Cayena a partir de yemas axilares de la corona e hijos basales se
logrará la producción de semilla asexual in vitro selectas y libres de
enfermedades?
1.3 Justificación
Las técnicas de cultivo in vitro en piña, se han utilizado con el fin de obtener
mayor cantidad de plantas, pese a ello, los informes que lo referencian son
escasos en el Ecuador y en dichos estudios se han utilizado otras variedades,
creando así la necesidad de profundizar en las investigaciones concernientes a
esta fruta de gran importancia tanto en la seguridad alimentaria, salud y
agricultura.
El presente trabajo de investigación se justifica por la incidencia de plagas y
enfermedades que constantemente presenta el cultivo de piña y la posible
infección de la semilla comercial (hijos basales) y con la perspectiva de obtener
plantas sanas de piña debido a los problemas fitosanitarios que presenta.
Realizar este trabajo es fundamental para lograr producir en un tiempo corto
plantas genéticamente idénticas, uniformes fisiológicamente, de desarrollo normal
y libre de patógenos que puedan ser aclimatadas en un período de tiempo
reducido.
1.4 Delimitación de la investigación
Espacio: El trabajo investigación se lo realizó en el laboratorio de la
Universidad Agraria del Ecuador.
Tiempo: Duración 6 meses.
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1.5 Objetivo general
Comparar medios de cultivo en la micropropagación de Ananas comosus var.
Cayena a partir de yemas axilares de la corona e hijos basales.
1.6 Objetivos específicos
Determinar el mejor método de desinfección de yemas axilares de la corona
e hijos basales.
Establecer el mejor medio de cultivo para obtener la iniciación de yemas
axilares
Identificar el mejor medio de cultivo para la multiplicación de brotes
obtenidos en la fase de iniciación.
1.7 Hipótesis
Al menos uno de los tratamientos empleados resultará eficaz para la
micropropagación de piña a partir de yemas axilares de la corona e hijos basales.
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2. Marco teórico
2.1 Estado del arte
Según MAGAP (2014) la producción de piña en Ecuador ha venido en aumento
(3.66%) respecto al año anterior, a pesar de registrarse una disminución de
superficie cultivada. Esta tendencia se ha mantenido hasta el presente año. La
producción de este fruto presenta una serie de problemas de plagas y
enfermedades.
Carrillo y Burgos (2015) menciona que la piña es el segundo cultivo tropical de
importancia mundial después del banano, aportando más del 20% del volumen
mundial de frutos tropicales. Ecuador es uno de los países en vías de
desarrollo y con la mayor diversidad de clima tropical seco y húmedo, es muy
rico en su flora y fauna. Posee gran gama de variedades de piña, que son
apetecidas en los mercados americanos y europeos; debido a que es muy
reconocida por sus grandes propiedades nutritivas, sabor y aroma inigualable
Saucedo, et al., (2008).
Ecuador es un país privilegiado debido a que posee grandes extensiones de
tierra que cumplen con los requisitos edafoclimáticos requeridos para un cultivo
con calidad. Las zonas principales en donde se cultiva la piña son: Quevedo,
Santo Domingo de los Tsáchilas, Santa Elena, Yaguachi, Milagro, Huaquillas,
Arenillas, Pasaje, Buena Fe, Portoviejo, Chone, San Lorenzo, entre otras. Las
variedades más cultivadas son Española roja, Cabezona, Cayena Lisa,
Champaka, entre otras (Revista Lideres, 2015).
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2.2 Bases teóricas
2.2.1 Generalidades de la piña
“Ananas comosus L. Merr es una planta exuberante conocida más que por su
belleza, por el sabor del fruto al cual se le nombra comúnmente como piña,
pinneaple (inglés), ananá o matzatli” Asohofrucol, (2018).
Según Suárez (2011) “la piña es una fruta tropical originaria del sur de Brasil y
Paraguay, de gran importancia comercial, esto se debe a la gran aceptación del
fruto por parte de los consumidores a nivel mundial”.
Exactamente no se ha logrado determinar la fecha en que la fruta fue difundida
al resto de zonas tropicales de América, pero lo que sí se sabe con certeza es
que la piña fue cultivada en Europa a finales del siglo XVII y que entre los
siglos XVIII y XIX la productividad de la piña estaba totalmente desarrollada a
lo largo del continente y al resto del mundo. (Ramos, 2000).
2.2.2 Taxonomía de la piña
Fue descrita inicialmente en 1754 por Carl Von Linneo, de unos especímenes
cultivados, bajo el nombre de Bromelia comosa. Posteriormente, en 1917, Elmer
Merrill reinterpreta este género, determina que B. comosa pertenece al taxa
Ananas. Desde entonces hasta la fecha la clasificación taxonómica de la piña es
la siguiente:
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Tabla 1. Jerarquía nomenclatural de la piña
Clase Equisetopsida
Subclase Magnoliidae
Superorder Lilianae Takht.
Orden Poales Small
Familia Bromeliaceae Juss
Género Ananas Mill
Especie A. comosus
Tropicos (2018).
2.2.3 Descripción botánica de la piña
Según Sandoval y Torres (2011) Ananas comosus se caracteriza por presentar
las siguientes características organográficas de sus partes:
2.2.3.1. Raíz
Típicamente fasciculada, superficial se localiza entre los primeros 15 cm del
suelo.
2.2.3.2. Tallo
De apariencia acaule, el cual luego de 1 – 3 años crece en longitud,
presentándose un vástago rojizo completamente cubierto por las hojas, de
consistencia carnosa.
2.2.3.3. Hojas
Hojas simples, rígidas, en roseta basal, sésiles, lanceoladas de 30 a 100 cm
largo, estrechamente imbricadas, ligeramente cóncavas, con márgenes con
espinas de puntas cortas o enteras, según la variedad.
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2.2.3.4. Inflorescencia
Las inflorescencias aparecen en el ápice del tallo, en forma de espiga
fusionada, la cual alberga entre 100 y 200 flores. Las flores son hermafroditas,
trímeras, sésiles, con brácteas inconspicuas, los sépalos externos apenas
asimétricos y libres, de ovario súpero.
2.2.3.5. Frutos
Es una infrutescencia o sincarpio, de forma entre cilíndrica hasta piramidal,
dependiendo de la variedad. Su centro es fibroso, se forma a partir del tallo axial
engrosado, y las paredes del ovario, la base de la bráctea y los sépalos se
transforman en una pulpa amarilla, apenas fibrosa, dulce y ácida, muy fragante.
La flor se transforma en un escudete octogonal de cubierta dura, formada por la
fusión del ápice de la bráctea y los tres sépalos, que formarán la dura piel cerúlea
y espinosa del fruto. La cavidad de la flor endurece sus paredes.
2.2.4 Variedades de piña cultivadas en el Ecuador
Entre las Ananas más cultivadas en el Ecuador encontramos:
2.2.4.1. Variedad Perolera
Es la mayormente cultivada para el consumo en fresco del Ecuador. Este cultivar posee hijos sin espinas. El fruto maduro es cilíndrico de color amarillo anaranjado y con pulpa de color amarillo cremosa, con ojos profundos, predomina una sola corona; dependiendo del manejo del cultivo pueden pesar entre 600 y más de 3000 g. (Jiménez, 2005, p.62). La pulpa es medianamente fibrosa, altamente apetecible suculenta y refrescante, con 13 a 16º Brix, por tal razón es preferida para su consumo en fresco; además es resistente al manipuleo y transporte, por lo que es la mayormente cultivada para el consumo nacional. Además, se considera resistente a Phytophthora (Moreira y Uguña, 2018, p.3). 2.2.4.2. Variedad Cayena Lisa
No posee espinas, se cultiva en menor proporción que la Perolera; el fruto es cilíndrico y alargado de color amarillo naranja con un peso promedio de 2,5 Kg, sin embargo, eso depende del manejo del cultivo, en la realidad se observan tamaños desde 500 hasta más de 3000 g. El contenido de fibra es bajo y el
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porcentaje de jugo alto; la pulpa tiene un color amarillento a dorado y posee un alto contenido de azucares, es firme y resistente, con una buena duración postcosecha. La desventaja de este cultivar es que emite un bajo número de hijos o retoños (Consejo Nacional de Producción, 2014).
2.2.4.3. Variedad MD-2 (Golden Sweet)
Pertenece al grupo Cayena, es cultivada exclusivamente con fines de
exportación, aunque aquella fruta que no cumple con los estándares de calidad
se la comercializa para mercado local. Este híbrido se caracteriza por alcanzar
aproximadamente cinco veces más de contenido de ácido ascórbico (Vitamina
C) que las demás variedades. En el mundo se la conoce con varios nombres
comerciales, el más difundido es Golden Sweet; otros son Premium Select; Sun
Ripe; Supersweet Pineapple, entre otros (Alatorre, 2012, p.86).
2.2.5 Requerimientos edafoclimatológicos del cultivo de piña
Entre las buenas prácticas agrícolas para el cultivo de piña se recomienda las
siguientes condiciones edafoclimáticas:
2.2.5.1. Clima
“La piña se puede sembrar desde el nivel del mar hasta los 800 m de altitud,
con un rango de temperatura entre 20 y 30 ºC. Se ha registrado que a mayores
altitudes se ve afectada la acidez de la fruta” (Sandoval y Torres, 2011).
2.2.5.2. Precipitación
El óptimo de precipitación debe encontrarse entre 1200 – 2000 mm por año,
siendo los requerimientos mínimos diarios de aproximadamente 50 mm. De
presentarse una precipitación anual menor a 1200 mm, se debe pensar en la
necesidad de riego (García y Rodríguez, 2016).
2.2.5.3. Luminosidad
Este factor afecta directamente el rendimiento del cultivo, una deficiencia de luz
genera frutos opacos, un exceso de luz por su parte quema la planta. Por lo tanto,
requiere medio mensual, entre 1200 y 1500 horas de luz al año (Valverde, 2014).
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2.2.5.4. Viento
La piña es susceptible a períodos largos de viento, disminuyendo su talla hasta
un 25%. Cuando se acompaña de lluvias abundantes los hongos penetran por las
heridas o roturas causadas por el frotamiento entre las hojas (Morales, 2005).
2.2.5.5. Suelo
Es recomendable suelos con alto contenido de materia orgánica con buen
drenaje, el pH entre 5 a 6. En el caso de suelos arcillosos, se debe hacer énfasis
en un buen drenaje, ya que estos tienden a retener mayor cantidad de agua,
situación que propicia el desarrollo de enfermedades fungosas (BANACOL,
2016b).
2.2.6 Requerimientos agronómicos del cultivo de piña
2.2.6.1. Fertilización
Según Asohofrucol (2018) el nitrógeno y potasio son los elementos más
importantes dentro del cultivo de piña influyen sustancialmente en la calidad del
fruto. Deben establecerse planes anuales de riego con estos componentes,
especialmente en el primer año, donde se recomienda adicionar fosforo para
contribuir a un buen desarrollo radicular.
2.2.6.2. Riego
Según Agrocalidad (2016) la piña a pesar de ser una monocotiledónea con
metabolismo CAM, altamente adaptada a la sequía, requiere de al menos 15 a 35
mm de riego por semana, el cual puede proporcionarse a la planta bien sea por
goteo o aspersión.
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2.2.6.3. Control de plagas y enfermedades
Según Agrocalidad (2016) entre las plagas y enfermedades más comunes que
atacan los cultivos de piña podemos mencionar las siguientes:
naftalenoacético), IBA (ácidoindolbutírico), 2,4 D (2,4- diclorofenoxiacético).
Citocininas: Estas promueven la división celular, regulan el crecimiento y el
desarrollo de los tejidos vegetales. Ejemplos: cinetina, 2iP (2-
isopentiladenina), BAP (benzilaminopurina), zeatina. Otros compuestos.
Ejemplos: giberelinas y ácido abcísico.
Mezclas de compuestos poco definidos: Extracto de levadura, extractos
vegetales, hidrolizados de caseína, peptona y triptona. La tendencia actual
en investigación es la de sustituirlos por medios de composición definida.
Materiales inertes: Utilizados como soporte. Ejemplos: agar, agarosa, otros
polisacáridos (Gelrite, Phytagel), lana de vidrio, papel de filtro, arena,
esponjas de poliestireno.
Sin embargo, uno de los medios más utilizados es el de Murashige & Skoog
(M&S), este es una mezcla compleja de sales complementadas con vitaminas, a
la cual se agrega sacarosa y agar.
2.2.7 Mantenimiento de la asepsia
Como es conocido generalmente, las técnicas de cultivo in vitro necesitan
conservar un control estricto de la asepsia para mantener el adecuado
desarrollo y producción de plántulas y, las técnicas de cultivo en medios
líquidos como el Sistema de Inmersión Temporal no son la excepción (Zamora
y Juárez 2008). Es así que, en este tipo de sistemas, la probabilidad de
contaminación se puede desplegar más rápidamente y dispersar con mayor
facilidad en el medio líquido y puede acarrear perdidas hasta del 100% del
cultivo (Senamhi, 2009). Por ello, el material vegetal a ser inoculado en el
Sistema de Inmersión Temporal debe estar sometido previamente a subcultivos
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que permitan asegurar su asepsia en fin de controlar el crecimiento indeseado
de microorganismos patógenos (Albarracín, 2012).
2.2.8 Latencia
Para el cultivo in vitro de piña, se debe de cumplir con una fase inicial de
rompimiento de la latencia de las yemas, lo cual puede lograrse con la adicion
de reguladores de crecimiento al medio de cultivo (Saucedo, 2008). En el caso
de yemas provenientes de hijos basales de piña, se puede lograr romper la
latencia en aproximadamente 40%, adicionando 1 mg.L-1
de ácido
naftalenacético, 0.001 mg.L-1 de benzilaminopurina y 0.0001 mg.L-1 de ácido
giberélico, al medio MS-62, semisolidificado con 4 g.L-1 de agar. Las
condiciones de cultivo son: fotoperiodo de 16 horas/luz, con una intensidad
entre 3000 y 4000 lux y temperatura promedio de 26°C Tapia, et.al., (2005).
2.3 Marco Legal
2.3.1 Constitución de la República del Ecuador (2008)
Como fundamento legal se considera lo establecido en la Constitución de la República del Ecuador 2008 – Derechos del Buen Vivir. Donde uno de los objetivos del plan nacional del Buen Vivir es garantizar los derechos de la naturaleza y promover un ambiente sano y sustentable. Sección primera: Agua y alimentación y sección segunda: Ambiente sano. Art. 13.- Las personas y colectividades tienen derecho al acceso seguro y permanente a alimentos sanos, suficientes y nutritivos; preferentemente producidos a nivel local y en correspondencia con sus diversas identidades y tradiciones culturales. El Estado ecuatoriano promoverá la soberanía alimentaria. Art. 14.- Se reconoce el derecho de la población a vivir en un ambiente sano y ecológicamente equilibrado, que garantice la sostenibilidad y el Buen Vivir, Sumak Kawsay. Se declara de interés público la preservación del ambiente, la conservación de los ecosistemas, la biodiversidad y la integridad del patrimonio genético del país, la prevención del daño ambiental y la recuperación de los espacios naturales degradados (Ley Organica de Biodiversidad, Semillas y Fomento de la Agricultura Sostenible, 2017).
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Art. 21.- Los parámetros de calidad de piña dependen del mercado, los mismos que, si bien varían, tienen condiciones generales: - Cantidad de sólidos solubles o grados brix mínimo de 12° hasta 14° y aumenta un grado cada tres días. - Translucidez de 0,8-1. – Porosidad 1, en una escala de 1-4. - Las condiciones de luminosidad son importantes para el color de la fruta. Art 23.- Dentro de los parámetros de empaque, se debe contar con especificaciones documentadas de lo siguiente como mínimo: grados Brix, traslucidez, color, tamaño, forma, variedad, peso con o sin corona, y temperatura de almacenamiento. Estos datos deben ser obtenidos de los requerimientos del cliente, el mercado o especificaciones internas de la empresa. Art. 73.- EI Estado aplicará medidas de precaución y restricción para las actividades que puedan conducir a la extinción de especies, la destrucción de ecosistemas o la alteración permanente de los ciclos naturales. Se prohíbe la introducción de organismos y material orgánico e inorgánico que puedan alterar de manera definitiva el patrimonio genético nacional. Art. 400.- El Estado ejercerá la soberanía sobre la biodiversidad, cuya administración y gestión se realizará con responsabilidad intergeneracional. Se declara de interés público la conservación de la biodiversidad y todos sus componentes, en particular la biodiversidad agrícola y silvestre y el patrimonio genético del país. Art. 406.- El Estado regulará la conservación, manejo y uso sustentable, recuperación, y limitaciones de dominio de los ecosistemas frágiles y amenazados; entre otros, los páramos, humedales, bosques nublados, bosques tropicales secos y húmedos y manglares, ecosistemas marinos y marinos-costeros (Constitucion del Ecuador 2015).
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3. Materiales y métodos
3.1 Enfoque de la investigación
Se detalla el tipo, nivel de conocimiento y diseño de investigación.
3.1.1 Tipo de investigación
La presente investigación es de carácter inductivo con características
aplicadas y por el movimiento de las variables de concepción experimental,
mediante la recolección de datos que permitió probar la hipótesis mediante el
análisis estadístico.
3.1.2 Diseño de investigación
3.1.2.1. Investigación experimental
Este tipo de investigación permitió manipular las variables y medir su efecto
sobre las variables dependientes.
3.1.2.2. Investigación descriptiva
Permitió recolectar los datos sobre la base de la hipótesis, exponiendo y
resumiendo la información para analizar minuciosamente los resultados a fin de
extraer generalizaciones significativas que contribuyeron en la relación que
existen entre dos o más variables.
3.1.2.3. Investigación explicativa
Permitió explicar el porqué de un fenómeno o hecho determinado.
3.2 Metodología
Para la iniciación de las siembras se implementó el siguiente procedimiento: a
las coronas e hijuelos basales se les eliminó totalmente las hojas para exponer las
yemas.
Al material vegetal (piña) se procedió a quitarle las hojas tanto de la corona
como de los hijos basales, quedando pequeñas porciones para extraer las yemas.
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Una vez eliminada las hojas a los brotes se lavaron con detergente líquido
transferidos a una solución diluida al 1.8 y 4 % i.a. de cloro comercial por 20 min,
para después lavarlos con agua del grifo eliminando todo el jabón, luego lavados
tres veces en agua destilada estéril en una cabina de flujo laminar (Daquinta
et.al., 1995; Dolgov et.al., 1998), y así se obtuvo los explantes primarios: yemas
de la corona e hijuelos (Fitchet-Purnell, 1993).
El proceso de siembra se llevó a cabo en la cámara de flujo laminar, donde se
desinfectaron todas las superficies de contacto y el material utilizado para la
siembra utilizando un aspersor que contenía isopropanol al 70%.
Primera siembra
La desinfección con cloro se hizo en la cámara de flujo laminar, una vez lista
los brotes se colocaron cloro al 1.8% por 10min y luego se los lavaron tres veces
con agua destilada estéril.
Para el proceso de siembra se colocaron explantes con yemas en servilletas
esterilizadas para que se sequen 10 minutos aproximadamente. Luego se
procedió a realizar pequeños cortes de los hijos basales para sembrarlos en los
medios de cultivos.
Así mismo con la corona se hizo pequeños cortes de 0.5 cm de y se los colocó
en los medios de cultivos MS BAP (0.5mg.L-1). Fueron en total 10 ápices de
corona y 10 de Hijos. Los explantes implantados se colocaron en condiciones de
luz (8 h luz/16 h de oscuridad.
Segunda siembra
En la segunda siembra se lavó los brotes y se dejaron por 30 minutos en cloro
al 3%, para después ponerlos a secar en servilletas esterilizadas. Se sembraron
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en 20 frascos de vidrio, (10) ápices de corona y (10) ápices de hijos, y se
colocaron en condiciones de luz.
Tercera siembra
En esta siembra se procedió a hacer la desinfección de los explantes con cloro
al 3 %. Se sembraron las yemas axilares de coronas (12) e hijos (18) en medios
de cultivo BAP 1 mg y se realizaron cortes de 1 cm aproximadamente para cada
frasco de medio de cultivo. Una vez finalizada la siembra se procedió a dejar los
explantes iniciados en condiciones de oscuridad.
Cuarta siembra
En esta siembra se procedió a hacer la desinfección de los explantes con
cloro al 4 %. Se implantaron yemas axilares de corona (8) y yemas de hijuelos (8)
en medios de cultivo Ms suplementados con BAP (1mg.L-1). Se colocaron una
semana en oscuridad y luego se pasaron a las condiciones de luz.
Quinta siembra
En esta siembra se procedió a hacer la desinfección de los explantes con cloro
al 4 %. Se implantaron yemas axilares puentes de Heller, en tubos de ensayos
contentivos de cuatro medios de cultivo MS líquidos suplementados con
diferentes concentraciones de ANA y BAP en tubos de ensayo, con 20
repeticiones por tratamiento haciendo un total de 80 unidades:
T1: MS BAP (1 mg.L-1); ANA (0,5mg.L-1)
T2: MS BAP (1mg.L-1); ANA (0,01mg.L-1)
T3: MS BAP(1mg.L-1); ANA (2mg.L-1)
T4: MS BAP (2mg.L-1); ANA (0,5mg.L-1)
Los explantes sembrados se dejaron una semana en la oscuridad.
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Después de 3 semanas se realizó una resiembra de los ápices de piña no
contaminados en medios de cultivo sólidos MS con dosis de BAP (0,5 mg.L-1),