CLONADO - biotecnologiaindustrial.fcen.uba.arbiotecnologiaindustrial.fcen.uba.ar/wp-content/uploads/2010/04/... · El fago lambda como vector de clonación gt10 gt11 (bibliotecas

CLONADO

La clonación puede definirse como el proceso por el que se consiguen, de forma asexual, copias idénticas de un organismo, célula o molécula.

VECTORES DE CLONADO

Moléculas transportadoras que transfieren y replican fragmentos de ADN que llevan insertados.

Para que sirva de vector, una molécula debe ser capaz de replicarse junto con el fragmento de ADN que transporta.

También tiene que tener secuencias de reconocimiento que permitan la inserción del fragmento de ADN a clonar.

¿QUÉ VECTOR USO?

Tamaño del inserto

Número de copias

Incompatibilidad

Marcador de selección

Sitios de clonado

Funciones especializadas

VECTORES DE CLONADO EN E. coli

TIPO INSERTO

PLÁSMIDOS chico

BACTERIÓFAGOS medio

CÓSMIDOS medio/grande

BACs muy grande

PLÁSMIDO

Elemento genético extracromosomalque replica autonomamente

Tamaño: < 2 kb- > 1000 kb

linealesGeometría girasas circulares topología

topoisomerasas

FUNCIONES

Resistencia a antibióticos

Resistencia a metales : Pb, Zn, Hg

Funciones metabólicas para utilización de nutrientes: herbicidas, pesticidas, hidrocarburos

Sistemas de protección: restricción-anti restricción

DNA a clonar

Vector plasmídico

Digestión con endonucleasa yseparación de fragmentos

Digestión con endonucleasa

DNA ligasa

Vector recombinante

Transformación de célulasde E. coli competentes

Selección de clones positivos y recuperación del plásmido

Esquema clásicode clonado en un vector plasmídico

Placa de agar con medio LB + ampicilina

Selección de bacteriasque han incorporado el plásmido

MARCADOR DE SELECCIÓN

SITIO DE CLONADO MÚLTIPLE

ORIGEN DE REPLICACIÓN

MARCADORES DE SELECCIÓN

ANTIBIÓTICO INHIBICIÓN RESISTENCIA

Ampicilina síntesis de pared βlactamasa (usar en fase log)

Carbenicilina

Cloranfenicol síntesis proteica Cl. Acetil transferasa

Kanamicina síntesis proteica aminoglucósido fosfo transferasa

Tetraciclina síntesis proteica TetA (exportación del ATB)

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NÚMERO DE COPIAS

Está determinado por el control de la replicaciónAlto clonadoBajo genes letales, construcción de BACs

REPLICACIÓN PLASMÍDICA

Replicón: unidad genética constituída por el origen de replicación y sus elementos de control asociados

Replicón plasmídico: fragmento más pequeño de ADN plasmídico capaz de replicar autónomamente y mantener el Nº de copias.

ARN anti sentidoControl de la replicación iterones

Plásmido pMB1: casi todos los plásmidos usados en clonado derivan de él

Replicón pMB1/colE1: inicialmente 15-20 copias /célula. Modificaciones: >Nº de copias

Mutación TS

REGULACIÓN DEL NÚMERO DE COPIAS DEL PLÁSMIDO colE1 POR ARN ANTISENTIDO

Vida media corta

RNAsa H

No necesita síntesis proteica para replicarEn presencia de cloranfenicol aumenta el Nº de copias

Mutación en ARNII TS >Nº de copias al la temp.

Otros vectores tienen mutación en rop para aumentar el nº de copias

REGULACIÓN DEL NÚMERO DE COPIAS DEL PLÁSMIDO POR ITERONES

“esposar”

RepA: ATPasa helicasa

REGULACIÓN DEL NÚMERO DE COPIAS DEL PLÁSMIDO R1 POR ARN ANTISENTIDO

Control de la expresión de RepA

CopA and CopB

VECTORES RUNAWAY

Construídos a partir del plásmido R1

Un pequeño aumento en la formación del RNAm de RepA reduce drásticamente la síntesis de CopA debido a transcripción convergente, lo que lleva a la pérdida del control de nº de copias replicación “galopante”= runaway. Hasta 1000 copias de plásmido por genoma.

Amplificación runaway ocurre en presencia de síntesis proteica

Nature Biotechnology 1992, vol. 10, Nordstrom et al.

PλpRλcI857

cI( - )

T > 34ºC

Control de la transcripción de repA por el promotor del bacteriófago λpR

INCOMPATIBILIDAD

Los plásmidos que llevan el mismo replicón pertenecen al mismo grupo de incompatibilidad, por lo tanto no pueden coexistir en la misma bacteria

GRUPO DE ELEMENTO DE CONTROL COMENTARIOINCOMPATIBILIDAD NEGATIVO

colE1, pMB1 RNAI controla el procesamiento de pre-RNAII en primer

IncFII (RI), pT181 RNA controla la síntesis de RepA

PI, F, R6K, pSC101, p15A iterones secuestra RepA

VECTORES CON FUNCIONES ESPECIALIZADAS

VECTORES PLASMÍDICOS CON ORI DE BACTERIÓFAGO SIMPLE CADENA: FAGÉMIDOS

Además del ori bacteriano poseen un origen de replicación de bacteriófagos filamentosos simple cadena como M13 o f1.

El ADN sc se produce al infectar la bacteria con un bacteriófago helper que lleva los genes para generar ADN sc y empacar las partículas.

secuenciarViriones sondas mutagénesis

VECTORES SHUTTLE

Vector, generalmente plásmido, que puede propagarse en 2 especies diferentes

SEGREGACIÓN PLASMÍDICA

Plásmido con alto nº de copias: difusión pasivaPlásmidos con bajo nº de copias: sistema partición activo

Sistema de partición activoPlásmido P1: genes parA, parB, secuencia en cis parSComplejo nucleoproteico: ParA, ParB, IHF (integration host factor) y parS “guia y posiciona” al plásmido.

Recombinación sitio específicaRecombinasas sitio-específicas para resolver dímeros

Sistema toxina-anti toxinaElimina a la bacteria libre de plásmido

Recombinasas sitio-específicastoxina antitoxina

Toxina: proteínaAntitoxina: proteína o ARN (más inestable que toxina) Codificados por plásmido

"Hok sok system R1 plasmid present". Licensed under CC BY-SA 3.0 via Wikipedia - http://en.wikipedia.org/wiki/File:Hok_sok_system_R1_plasmid_present.gif

Sistema Hok/sok= host killing (toxin)/ suppression of toxin (RNA antitoxin)

TRANSFERENCIA PLASMÍDICA

Transformación

Transducción

Conjugación

CONJUGACIÓN

Transferencia de material genético entre bacterias a través del contacto directo entre células. Requiere muchos genes del mismo plásmido, en gral. plásmidos chicos no conjugan, salvo que estén con un plásmido “helper”

F+ F-

R. a ATB Información transferida Tolerancia a xenobióticospor la bacteria donante , ej. Uso de nuevos metabolitos

Plásmido F: episoma de aprox. 100 kb. Lleva oriV (replicación) y oriT (transferencia). Sólo 1 copia/célula. Locus tra y trb , aprox, 40 genes (para conjugación, gen pilin, etc.)

Plásmido libre :cepas F+

Plásmido integrado en cromosoma: cepas Hfr (high frequency recombination), cepas que transfieren ADN cromosómico.Sin plásmido: cepas F-

TRANSFORMACIÓN BACTERIANA

Electroporación

Transformación química

Tratamiento de las bacterias con cationes divalentes (CaCl2) y shock térmico

EFICIENCIA DE TRANSFORMACIÓN

Medida cuantitativa de cuantas células incorporaron el plásmido

Se expresa en Nº de transformantes por μg ADN plasmídico

Competencia (cfu/µg)

Aplicación

>1×109 Construcción de biblioteca genómica

1×106 Clonado/ subclonado

1×103 Transformación con plásmido

circular

IDENTIFICACIÓN DE COLONIAS BACTERIANAS QUE CONTIENEN PLÁSMIDO RECOMBINANTE

1) Análisis del ADN plasmídico: restricción y PCR

2) Complementación α

3) Inserción con inactivación

4) Hibridación

RESTRICCIÓN Y/O PCR

Complementación α

X-GAL: 5-bromo-4-cloro-3-indolil- beta-D-galactopiranosido

IPTG: Isopropil β-D-1-tiogalactopiranosido

Β galactosidasa

inactiva

βGalactosidasa inactiva

βGalactosidasa activa

Represor Lac inactivo unido a IPTG

Producto azulX-gal

Complementación α

Inactivación por inserción

Resistencia a Kanamicina

Resistencia a ampicilina

Origen de replicación

HIBRIDACIÓN

In situ colony

BACTERIÓFAGOS

Fago lambda

* Genoma de unos 45.000 bp

* Fragmento central de unas 15 kbp no es esencial para la replicación y

puede ser eliminado

* Ligación del inserto (unas 5-25 Kbp)

* Empaquetamiento del DNA “in vitro” en partículas de fago.

* Transfección de células y propagación.

lítico (clonación)Bacteriófago λ 2 ciclos de vida lisogénico: MI, Nut.

El ciclo lisogénico-lítico del bacteriofago

Unión del fago, penetración y liberación del DNA

Integración y replicación conel genoma bacteriano

Circularización delgenoma del fago(secuencias cos)

Inducción delciclo lítico

Lisis y liberación de partículas víricas

E. coli

INFECCIÓN VIRAL

1- Adsorción: producto del genJ del fago reconoce al receptor de maltosa LamB

2- Inyección del ADN: requiere el producto del gen pstM

3- Circularización del ADN: sitios cos + ligasa

CICLO LÍTICO

círculo rodante

El fago lambda como vector de clonación

gt10 gt11 (bibliotecas de expresión)

EMBL4

Vectores de inserción:

Vectores de sustitución

El fago lambda como vector de clonación

Extracto 2: cabezas vacías

Extracto 1: partes del fago sin cabeza

+

+

ADN

FAGO

Encapsidación

Screening de genoteca en fago λ

CICLO LISOGÉNICO

Sólo se expresa la proteína del gen cI: represor de los genes del ciclo lítico

INTEGRASAHOST INTEG. F.

TECNOLOGÍA GATEWAY

INTEGRASAHOST INTEG. F.EXCISIONASA Xis

TECNOLOGÍA GATEWAY

Emplea el sistema de recombinación del fago λ para “mover” fragmentos entre vectores que contienen los sitios para la maquinaria recombinante de λ

Reacción BP: producto de PCR con sitios flanqueantes + vector donante + clonasa BP => entry vector (este paso puede ser reemplazado por otro método de clonado)

Reacción LR: entry Vector + destination Vector + LR clonasa => expression vector

VENTAJAS DESVENTAJAS

Eficiente ¿Precio?Diseño simple de primers Secuencias attNo ligasa ¿molestan? No enzimas de restricciónNo purificación por gelOrientación No fosfatasa

Cósmidos

* Pequeñas moléculas de ADN circular (5-7 Kbp)

* Secuencia ori

* Marcadores de selección

* Secuencia COS: permite el empaquetamiento como

bacteriófago para la infección en E. coli pero se mantiene

en la célula como un plásmido.

*Permite clonar fragmentos de hasta 45 Kb.

*Apropiados como vectores en fases iniciales de

proyectos de secuenciación

BACs: CROMOSOMAS BACTERIANOS ARTIFICIALES

Basado en el plásmido F (fertilidad).

Contiene oriS, repE (helicasa) y genes de partición: parA, parB y parC

Inserto: 150-350 kb. Puede llegar a 700 kb.

1-2 copias por célula

VECTORES DE CLONADO USADOS COMUNMENTE

Plásmido Características Fuente comercial

pUC18, pUC19 Pequeño (2,7 kb) NEB Alto nº de copias MCS, R a ampi Selección blanco/azul

pBluescript idem pUC Stratagene ori SS promotores T7 y SP6 flanq. MCS

pACYC Bajo nº de copias (15) NEB ori p15A

Supercos Cósmido Stratagene 2 sitios cos Inserto 30-42 kb R a ampi promotores T3 y T7 flanq. MCS

VECTORES DE CLONADO USADOS COMUNMENTE

Plásmido Características Fuente comercial

EMBL3 vector λ de reemplazo Promega MCS: SalI, BamHI y EcoRI

λ ZAP vector λ Stratagene Excisión in vivo en pBluescript Inserto hasta 10 kb Selección azul/blanco

pBeloBAC11 vector BAC NEB Inserto hasta 1 Mb Promotores T7 y SP6 flanq. MCS Sitios cos Sitio LoxP

Escherichia coli

Aislada por el pediatra y bacteriólogo Theodor Escherich en 1885

NOMENCLATURA DEL GENOTIPO

Propuesta por Demerec et al., 1966

GENES: 3 letras en minúscula itálica. Sugiere en gral la función:

trp síntesis de triptofano.

Si la misma función es afectada por varios genes, se agregan letras itálicas en mayúscula:

recA, recB, recC y recD recombinación

Por convención, en el genotipo de E. coli sólo se mencionan los genes defectuosos

A veces se usan los superíndices + o – para aclarar o para enfatizar el locus WT

Fenotipos: 3 letras, empieza en mayúscula, seguidas por superíndice + o –, a veces r (resistente) o s (sensible).

En ciertas ocasiones se incluye el fenotipo en el genotipo

rpsL (Strr): mutación en el gen de la ribosomal protein small subunit 12 que da resistencia a streptomycin

MUTACIONES ESPECÍFICAS

Alelo: número del alelo en itálica: hsdR17

Si no se conoce el locus exacto se reemplaza la letra por un guión : arg-3

Mutación:

ámbar: am depués del gen

Sensible a la temperatura (gen inactivo a alta temperatura): ts Constitutiva: superíndice q. lacIq

Deleción: Δ. Δ(lac-pro)

Inserción: “::” trpC22::Tn10.

La posición de la inserción se puede dar con 3 letras, la 1ª siempre es z, la 2ª 10 min, la 3ª 1 min (letras a - i): zhg::Tn10 inserción de Tn10 a 87 min.

Fusión: Φ seguido por los genes fusionados en paréntesis. “ ´ ” gen fusionado incompleto (antes del gen: deleción en 5´, después del gen: deleción en 3´) Superíndice +: la fusión involucra a un operón.

Φ (ompC´-lacZ+): fusión entre ompC (delecionado en 3´) y el operón lac.

F+ cepa de coli que lleva el episoma F o factor de fertilidad (plásmido de 1 copia).F´ : plásmido F con genes adicionales. Al final del genotipo con los genes del plásmido entre corchetes.

Plásmidos que se transmiten a células F-El factor F se necesita para infección con vectores basados en fagos filamentosos.

Si no está indicado se asume que la cepa es F-.

Cepas Hfr (high frequency chromosome donation): el factor F está integrado en el cromosoma bacteriano y puede causar transferencia de cromosoma.

Mutaciones sin sentido: codones de terminación

AMBAR: UAG

OCRE: UAA

OPALO: UGA

Vectores con mutaciones sin sentido en genes esenciales para prevenir la diseminación en bacterias.

Esos vectores sólo pueden propagarse en cepas de E. coli que contengan el supresor adecuado.

Supresor ambar

Hay varios sistemas de restricción y modificación que deben ser eliminados de las cepas de E.coli K12 para que puedan ser usadas para clonar

SISTEMAS DE RESTRICCIÓN Y MODIFICACIÓN

Para reconocer y destruir ADN “extranjero”

Muchas cepas de E. coli de laboratorio son deficientes en 1 o más de los sistemas de restricción-modificación .

METILACIÓN Dam y Dcm

E. coli K-12 metilasas: Dam, Dcm y EcoK

Dam: DNA adenina metilasa, gen dam, metila GATC

Dcm: DNA citosina metilasa, gen dcm, metila CC(A/T)GG

La mayoría de las cepas que se usan para clonar son Dam+ Dcm+. Las cepas recA- son siempre dam+

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Cepas Dam- Dcm- son mutagénicas

(sistema de reparación mismatch)

SISTEMA EcoK

EcoK metilasa: AACN6GTGC y GCACN6GTT

EcoK endonucleasa: AACN6GTGC y GCACN6GTT NO metilado

Locus hsdRMS: hsdR…endonucleasa hsdM…metilasa hsdS…subunidad de reconocimiento del sitio

En gral. se usan cepas hsdR- (rk-mk

+) o hsdS- (rk-mk

-)

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RESTRICCIÓN McrA, McrBC y Mrr

McrA y McrBC: corta en metil C

Mrr: corta en metil A

Cuando se clona ADN muy metilado mejor usar cepas mutantes.

Deleción simple: Δ(mcrCB-hsdSMR-mrr) “immigration control locus”

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RECOMBINACIÓN

Problema cuando se clona ADN con secuencias repetidas. Sensibilidad a agentes que dañan al ADNCepas Rec- Problemas en reparar roturas en las 2 hebras Taza de crecimiento

Dependiendo de la aplicación es preferible usar cepas Rec+

Cepas recA- tienen bloqueada la recombinación casi completamente.

Genotype Description Benefit

endA

Knock-out mutation in non-specific endonuclease (Endonuclease I). Eliminates non-specific endonuclease activity.

Improved plasmid yield/quality

hsdRMutations in hsdR prevents restriction of unmethylated EcoKI sites

Efficient transformation of DNA generated from PCR reactions

dam/dcm

Mutations in dam/dam abolish adenine and cytosine methylation at specific recognition sequences.

Propagation of DNA for cleavage with methylation-sensitive restriction enzymes e.g. Ava II, Bcl I

mcrA, mcrBC,or mrr

Mutations in these genes prevents methylated DNA from other organisms from being recognized as foreign

Allows cloning of genomic DNA or methylated cDNA

MANTENIMIENTO DE LA INTEGRIDAD DEL PLÁSMIDO TRANSFORMADO

recA Mutation in recA reduces DNA recombinationIncreased plasmid DNA stability

recBCD

recBCD encodes exonuclease V. Mutation in RecB or RecC reduces DNA recombination by a factor of 100.

Increased plasmid DNA stability

recJ/sbcC

Also involved in DNA recombination. Inactivation increases plasmid DNA stability

Increased plasmid DNA stability

uvcR/umuC

Involved in the UV and SOS DNA repair systems respectively. The inactivation of these genes increases the stability of plasmids carrying inverted repeats

Increased plasmid DNA stability

MANTENIMIENTO DE LA INTEGRIDAD DEL PLÁSMIDO TRANSFORMADO

Genotype Description Benefit

lacZ-delta-M15

Deletion of the N-terminal alpha-fragment from the LacZ gene, making β-galactosidase function dependent on expresion for the lacZ-α fragment from another source (e.g. a plasmid)

Used for blue/white screening of recombinant plasmids carrying the lacZ-α fragment

lacI

The lac repressor. Inhibits expression from the Lac promoter in the absence of lactose/IPTG

A functional lacI is required for blue/white screening

IDENTIFICACIÓN DE CLONES POSITIVOS

Genotype Description Benefit

deoRDeletion of a regulatory gene, allowing constitutive expression of deoxyribose synthesis gene

Increases the transformation efficiency for large plasmids

hee

Stands for “high electroporation efficiency”. Increases survival rate of cells during electroporation, leading to higher transformation efficiency.

High transformation efficiency

hteStands for “high transformation efficiency”.

High transformation efficiency.

AUMENTO DE LA EFICIENCIA DE TRANSFORMACIÓN

Application Strain

Routine Cloning/Sub-cloning, Blue/white screeningXLI-Blue, DH5-alpha, top10

Very high efficiency cloning e.g. for library construction

XL10-Gold, MegaX DH10b

Cloning of unmethylated DNA XL1-Blue MR

Production of unmethylated DNA JM110, INV110

Cloning of unstable plasmids Sure, Stbl4

Expression from T7 promoter BL21 (DE3)

Expression from T7 promoter, tight regulation BL21 (DE3) pLysS

Expression from T7 promoter with codon bias correction

BL21 codon plus, Rosetta

Improved disulphide bond formation Origami

Fast cloning (due to quick cell growth) Mach1

ALGUNAS CEPAS MUY USADAS