classfictn of heterotrpic.pdf

7/30/2019 classfictn of heterotrpic.pdf

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V o l . 5 7 , N o . 8P P L I E D AND ENVIRONMENTAL M I C R O B I O L O G Y , A u g . 1 9 9 1 , p . 2 3 5 1 - 2 3 5 90 0 9 9 - 2 2 4 0 / 9 1 / 0 8 2 3 5 1 - 0 9 $ 0 2 . 0 0 / 0C o p y r i g h t 1 9 9 1 , A m e r i c a n S o c i e t y f o r M i c r o b i o l o g y

C l a s s i f i c a t i o n a n d C h a r a c t e r i z a t i o n o f H e t e r o t r o p h i c M i c r o b i a lC o m m u n i t i e s on t h e B a s i s o f P a t t e r n s o f C o m m u n i t y - L e v e lS o l e - C a r b o n - S o u r c e U t i l i z a t i o nJA Y L . GARLAND AND AARON L . M I L LS*

D e p a r t m e n t o f E n v i r o n m e n t a l S c i e n c e s , U n i v e r s i t y o f V i r g i n i a , C h a r l o t t e s v i l l e , V i r g i n i a 2 2 9 0 3R e c e i v e d 3 A p r i l 1 9 9 1 / A c c e p t e d 2 4 May 1 9 9 1

T h e B L O L OG r e d o x t e c h n o l o g y b a s e d on t e t r a z o l i u m d y e r e d u c t i o n as an i n d i c a t o r o f s o l e - c a r b o n - s o u r c eu t i l i z a t i o n was e v a l u a t e d as a r a p i d , c o m m u n i t y - l e v e l m e t h o d t o c h a r a c t e r i z e a n d c l a s s i f y h e t e r o t r o p h i cm i c r o b i a l c o m m u n i t i e s . D ir e c t i n cu b at i o n o f w h o l e e n v i r o n me n t a l s a m p l es ( a q u a t i c , s o i l , a n d r h i z o s p h e r e ) i nBIOLOG p l a t e s c o n t a i n i n g 9 5 s e p a r a t e c a r b o n sources p r o d u c e d c o m m u n i t y - d e p e n d e n t p a t t e r n s o f s o l e -c a r b o n - s o u r c e u t i l i z a t i o n . P r i n c i p a l - c o m p o n e n t a n a l y s i s o f c o l o r responses q u a n t i f i e d f r o m d i g i t i z e d i m a g e s o fp l a t e s r e v e a l e d d i s t i n c t i v e p a t t e r n s among m i c r o b i a l h a b i t a t s a n d s p a t i a l g r a d i e n t s w i t h i n s o i l and e s t u a r i n es i t e s . C o r r e l a t i o n o f t h e o r i g i n a l c a r b o n source v a r i a b l e s t o t h e p r i nc i pa l components g i v e s a f u n c t i o n a l b a s i st o d i s t i n c t i o n s among c o m m u n i t i e s . I n t e n s i v e s p a t i a l a n d t e m p o r a l a n a l y s i s o f m i c r o b i a l c o m m u n i t i e s w i t h t h i st e c h n i q u e can p r o d u c e e c o l o g i c a l l y r e l e v a n t c l a s s i f i c a t i o n s o f h e t e r o t r o p h i c m i c r o b i a l c o m m u n i t i e s .

T h e c l a s s i f i c a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f a n i m a l a n d p l a n tc o m m u n i t i e s h a v e h e l p e d d e f i n e t h e f a c t o r s t h a t r e g u l a t eb o t h t h e s t r u c t u r e a n d t h e f u n c t i o n o f s u c h c o m m u n i t i e s .M i c r o b i a l e c o l o g i s t s h a v e b e e n l e s s s u c c e s s f u l a t i d e n t i f y i n ga n d c l a s s i f y i n g m i c r o b i a l c o m m u n i t i e s d u e t o t h e s m a l l s i z ea n d m o r p h o l o g i c a l s i m i l a r i t y o f c o n s t i t u e n t m e m b e r s , p a r -t i c u l a r l y b a c t e r i a . H i g h l y s t r u c t u r e d c o m m u n i t i e s h a v e b e e nr e p o r t e d f o r c o m m u n i t i e s c o m p o s e d o f m i c r o o r g a n i s m s o fd i s t i n c t m o r p h o l o g y o r n u t r i t i o n a l s t r a t e g y o r b o t h ( 1 0 , 1 4 ) .D e l i n ea ti o n o f h e t e r o t r o p h i c c o m m u n i t i e s h a s b e e n v e r yl i m i t e d , y e t s u c h c o m m u n i t i e s d o m i n a t e m o s t a q u a t i c a n dt e r r e s t r i a l h a b i t a t s .M o s t s t u d i e s o f h e t er o t r o p h i c m i cr o b i a l c o m m u n i t y s t r u c -t u r e h a v e i n v o l v e d i s o l a t e - b a s e d m e t h o d s . N u m e r i c a l t a x o -n o m i c s t u d i e s u s e e i t h e r p r o f i l e s o f c e l l u l a r c o n s t i t u e n t s ( 1 2 ,1 3 ) o r p h e n e t i c c h a r a c t e r i s t i c s ( 1 1 ) o f i s o l a t e s t o d e f i n eo p e r a t i o n a l t a x o n o m i c u n i t s a s d e f i n e d b y S n e a t h a n d S o k a l( 2 0 ) . A n a l y s i s o f t h e p r e s e n c e a n d d i s t r i b u t i o n o f d i f f e r e n to p e r a t i o n a l t a x o n o m i c u n i t s w i t h i n a c o m m u n i t y ( e . g . , d i v e r -s i t y ) c a n p r o v i d e i n s i g h t i n t o t h e e c o l o g i c a l f u n c t i o n i n g o fc o m m u n i t i e s ( 1 ) . T h e a n a l y s i s o f t a x o n o m i c s t r u c t u r e o fc o m m u n i t i e s a l o n e , h o w e v e r , l i m i t s i n s i g h t i n t o t h e e c o l o g -i c a l r e l e v a n c e o f c o m m u n i t y s t r u c t u r e . T h e e x c l u s i o n o ra d d i t i o n o f d i f f e r e n t b a c t e r i a l t y p e s d o e s n o t n e c e s s a r i l yc h a n g e t h e r e s u l t a n t f u n c t i o n o f t h e c o m m u n i t y ( 2 4 ) . A n a l -y s i s o f p h e n e t i c c h a r a c t e r i s t i c s w h i c h d i r e c t l y r e l a t e t oi m p o r t a n t p r o c e s s e s i n t h e e n v i r o n m e n t u n d e r i n v e s t i g a t i o n( 1 5 ) a n d c o r r e l a t i o n o f s uc h c h a r a c t e r i s t i c s t o e n v i r o n m e n t a lp a r a m e t e r s ( 2 , 1 7 ) a l l o w f o r g r e a t e r i n s i g h t i n t o t h e f a c t o r sw h i c h r e g u l a t e c o m m u n i t y s t r u c t u r e . I s o l a t e - b a s e d m e t h o d s ,h o w e v e r , d e p e n d o n c u l t u r a l m e t h o d s , w h i c h c a n e x c l u d et h e m a j o r i t y o f e n d o g e n o u s m i c r o b e s f r o m s t u d y d u e t o t h es e l e c t i v e n a t u r e o f t h e m e d i a ( 2 2 ) . F u r t h e r m o r e , t h e t i m e -c o n s u m i n g n a t u r e o f i s o l a t e - b a s e d m e t h o d s s e v e r e l y l i m i t st h e s p a t i a l a n d t e m p o r a l i n t e n s i t y o f s a m p l i n g . F o r e x a m p l e ,u s i n g i s o l a t e - b a s e d m e t h o d s , B e l l e t a l . ( 2 ) w e r e r e s t r i c t e d t o1 2 s a m p l e s i n a n e va l ua t i o n o f s e a s o n a l t r e n d s i n m i c r o b i a lc o m m u n i t y s t r u c t u r e i n two r i v e r s .

* C o r r e s p o n d i n g a u t h o r .

W h i t e a n d F i n d l a y h a v e d e v e l o p e d a c o m m u n i t y - l e v e la p p r o a c h t o c h a r a c t e r i z e m i c r o b i a l c o m m u n i t y s t r u c t u r e b ye v a l u a t i n g s h i f t s i n f a t t y a c i d m e t h y l e s t e r s f r o m w h o l ee n v i r o n m e n t a l s a m p l e s ( 2 5 ) . T h i s m e t h o d h a s s u c c e s s f u l l yd e t e c t e d c h a n g e s i n b i o m a s s o f t o t a l b a c t e r i a ( 1 9 ) , d i a t o m s( 1 9 ) , a n a e r o b i c s u l f a t e - r e d u c i n g b a c t e r i a ( 7 ) , a n d m i c r o e u -k a r y o t e s ( 8 ) w i t h i n v ar i o u s m i c r o b i a l h a b i t a t s . W h i l e t h i sa p p r o a c h e l i mi n at e s t h e b i a s a s s o c i a t e d w i t h c u l t u r a l m e t h -o d s a n d i n c r e a s e s t h e p o t e n t i a l s c o p e o f s a m p l i n g , s t r u c t u r a lm a r k e r s f o r s h i f t s w i t h i n t h e h e t e r o t r o p h i c b a c t e r i a l commu-n i t y a r e s t i l l b e i n g d e v e l o p e d .T h e a p p l i c a t i o n o f t h e c o m m u n i t y - l e v e l a p p r o a c h t o a s -s a y s o f m i cr o b ia l f u nc t io n w o u l d p r o v i d e a more s e n s i t i v ea n d e c o l o g i c a l l y m e a n i n g f u l m e a s u r e o f h e t e r o t r o p h i c m i c r o -b i a l c o m m u n i t y s t r u c t u r e . R a t h e r t h a n r e l y i n g o n d et e r m in a-t i o n o f c h a n g e s i n i n d i v i d u a l a b un d a n c e s w h i c h may n o te q u a t e t o m e a n i n g f u l s h i f t s i n c o m m u n i t y f u n c t i o n , t h i sa p p r o a c h w o u l d p r o v i d e m e a s u r e s o f t h e m e t a b o l i c a b i l i t i e so f t h e c o m m u n i t y . S o l e - c a r b o n - s o u r c e u t i l i z a t i o n e x e r t s as t r o n g i n f l u e n c e o n t h e c l a s s i f i c a t i o n o f i s o l a t e s ( 1 3 ) a n d mayb e a u s e f u l , c o m m u n i t y - l e v e l , f u n c t i o n a l m e a s u r e i n t h ec h a r a c t e r i z a t i o n a n d c l a s s i f i c a t i o n o f h e t e r o t r o p h i c commu-n i t i e s .A c o m m u n i t y - l e v e l a s s a y o f m i c r o b i a l c o m m u n i t y s t r u c -

t u r e b a s e d o n c a r b o n s o u r c e c h a r a c t e r s r e q u i r e s r a p i d m u l -t i p l e a s s a y s o f c a r b o n s o u r c e u t i l i z a t i o n . A r e d o x - b a s e dt e c h n i q u e h a s b e e n d e v e l o p e d r e c e n t l y b y BIOLOG, I n c . ,f o r c a r b o n s o u r c e u t i l i z a t i o n t e s t i n g o f b a c t e r i a l i s o l a t e s f o rs t r a i n i d e n t i f i c a t i o n . C o l o r p r o d u c e d f r o m t h e r e d u c t i o n o ft e t r a z o l i u m v i o l e t i s u s e d a s a n i n d i c a t o r o f r e s p i r a t i o n o fs o l e c a r b o n s o u r c e s . C o m m e r c i a l l y a v a i l a b l e m i c r o p l a t e sa l l o w f o r s i m u l t a n e o u s t e s t i n g o f 9 5 s e p a r a t e c a r b o n s o u r c e s .D i r e c t i n c ub a t i o n o f w h o l e e n v i r o n m e n t a l s a m p l e s i n B I -OLOG p l a t e s , t h e r e f o r e , may p r o d u c e p a t t e r n s o f m e t a b o l i cr e s p o n s e s u i t a b l e f o r t h e r a p i d c l a s s i f i c a t i o n o f h e t e r o t r o p h i cm i c r o b i a l c o m m u n i t i e s .T h i s r e s e a r c h e x a m i n e d t h e p o t e n t i a l o f t h e p a t t e r n s o fc o l o r r e s p o n s e p r o d u c e d f r o m d i r e c t i n c u b a t i o n o f w h o l ee n v i r o n m e n t a l s a m p l e s i n BIOLOG p l a t e s t o r e s o l v e m i c r o -b i a l c o m m u n i t y s t r u c t u r e . C o l o r r e s p o n s e i n w e l l s w asq u a n t i f i e d f r o m d i g i t i z e d i m a g e s o f p l a t e s a f t e r s e l e c t e d

2 3 5 1


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2 3 5 2 GARLAND AND MILLSTABLE 1 . S o l e c a r b o n s o u r c e s i n BIOLOG GN m i c r o p l a t e s

C s o u r c e sC a r b o h y d r a t e sN - A c e t y l - D - g a l a c t o s a m i n eN - A c e t y l - D - g l u c o s a m i n eA d o n i t o lL - A r a b i n o s eD - A r a b i t o lC e l l o b i o s ei - E r y t h r i t o lD - F r u c t o s eL - F u c o s eD - G a l a c t o s eG e n t i o b i o s ea - D - G l u c o s em - I n o s i t o la - L a c t o s eL a c t u l o s eM a l t o s eD - M a n n i t o lD - M a n n o s eD - M e l i b i o s eP - M e t h y l g l u c o s i d eP s i c o s eD - R a f f i n o s eL - R h a m n o s eD - S o r b i t o lS u c r o s eD - T r e h a l o s eT u r a n o s eX y l i t o lE s t e r sM o n o - m e t h y l s u c c i n a t eM e t h y l p y r u v a t eP o l y m e r sG l y c o g e na - C y c l o d e x t r i nD e x t r i nTween 8 0Tween 4 0

C a r b o x y l i c a c i d sA c e t i c a c i dc i s - A c o n i t i c a c i dC i t r i c a c i dF o r m i c a c i dD - G a l a c t o n i c a ci d l a ct o neD - G a l a c t u r o n i c a c i dD - G l u c o n i c a c i dD - G l u c o s a m i n i c a c i dD - G l u c o r o n i c a c i da o - H y d r o x y b u t y r i c a c i d, - H y d r o x y b u t y r i c a c i d- y - H y d r o x y b u t y r i c a c i dp - H y d r o x y p h e n y l a c e t i c a c i dI t a c o n i c a c i do a - K e t o b u t y r i c a c i dc s - K e t o g l u t a F i c a c i da - K e t o v a l e r i c a c i dD , L - L a c t i c a c i dM a l o n i c a c i dP r o p i o n i c a c i dQ u i n i c a c i dD - S a c c h a r i c a c i dS e b a c i c a c i dS u c c i n i c a c i d

Amino a c i d sD - A l a n i n eL - A l a n i n eL - A l a n y l - g l y c i n eL - A s p a r a g i n eL - A s p a r t i c a c i dL - G l u t a m i c a c i dG l y c y l - L - a s p a r t i c a c i dG l y c y l - L - g l u t a m i c a c i dL - H i s t i d i n eH y d r o x y - L - p r o l i n eL - L e u c i n eL - O r n i t h i n eL - P h e n y l a l a n i n eL - P r o l i n eL - P y r o g l u t a m i c a c i dD - S e r i n eL - S e r i n eL - T h r e o n i n eD , L - C a r n i t i n ey - A m i n o b u t y r i c a c i dA r o m a t i c c h e m i c a l sI n o s i n eU r o c a n i c a c i dT h y m i d i n eU r i d i n eA l c o h o l s2 , 3 - B u t a n e d i o lG l y c e r o l

A m i d e sS u c c i n a m i c a c i dG l u c u r o n a m i d eA l a n i n a m i d eP h o s p h o r y l a t e d c h e m i c a l sD , L - a - G l y c e r o l p h o s p h a t eG l u c o s e - i - p h o s p h a t eG l u c o s e - 6 - p h o s p h a t e

B r o m i n a t e d c h e m i c a l sB r o m o s u c c i n i c a c i dA m i n e sP h e n y l e t h y l a m i n e2 - A m i n o e t h a n o lP u t r e s c i n e

l e n g t h s o f i n c u b a t i o n . P r i n c i p a l - c o m p o n e n t a n a l y s i s ( P C A )o f t h e m u l t i v a r i a t e d a t a s e t ( 9 5 c o l o r r e s p o n s e s ) d i f f e r e n t i -a t e d s a m p l e s o n t h e r e l a t i v e l y g r o s s s c a l e o f m i c r o b i a lh a b i t a t t y p e a n d t h e f i n e r s c a l e o f s p a t i a l g r a d i e n t s w i t h i nh a b i t a t s .MATERIALS A N D METHODS

BIOLOG p l a t e s . T h e BIOLOG GN m i c r o p l a t e s ( B I -OLOG, I n c . ) u s e d i n t h i s r e s e a r c h r e l y o n t h e r e d o x d y et e t r a z o l i u m v i o l e t t o d e t e c t r e s p i r a t i o n ( a c t u a l l y , NADHf o r m a t i o n ) o f s o l e c a r b o n s o u r c e s . T h e 9 6 - w e l l GN m i -c r o p l a t e c o m p r i s e s 9 5 s u b s t r a t e - c o n t a i n i n g w e l l s a n d a c o n-t r o l w e l l w i t h o u t a c a r b o n s o u r c e ( T a b l e 1 ) . S u b s t r a t e , d y e ,a n d n u t r i e n t s a r e s u p p l i e d i n e a c h w e l l i n a d r i e d - f i l m f o r mw h i c h i s r e c o n s t i t u t e d u p o n a d d i t i o n o f s a m p l e ( 4 ) .D a t a c o l l e c t i o n . P o r t i o n s o f s a m p l e s ( p r e p a r e d a s d i s c u s s e db e l o w ) w e r e i n o c u l a t e d i n t o p l a t e s w i t h a m u l t i p i p e t t o r .A p p r o x i m a t e l y 1 7 m l o f s a m p l e w a s r e q u i r e d t o i n o c u l a t eo n e p l a t e ( 0 . 1 5 m l / w e l l p l u s r e s i d u a l s a m p l e i n p i p e t t e t i p s ) .D i g i t i z e d i m a g e s o f p l a t e s w e r e o b t a i n e d b y u s i n g a

d i g i t i z i n g v i d e o s c a n n e r ( E i k o n i x C o r p . ) , a n d t h e i m a g e sw e r e a n a l y z e d w i t h ERDAS s o f t w a r e (ERDAS, I n c . ) . T h i ss o f t w a r e i s i n t e n d e d f o r u s e a s a g e o g r a p h i c a l i n f o r m a t i o ns y s t e m , b u t i t s f l e x i b i l i t y i n r e a d i n g d i g i t i z e d i m a g e s made i ti d e a l f o r t h e p r e s e n t a p p l i c a t i o n . T h e i m a g e c o n s i s t e d o f a1 , 0 2 4 - b y - 1 , 0 2 4 m a t r i x o f p i x e l s ( t h e s m a l l e s t u n i t o f r e s o l u -t i o n ) . R e f l e c t a n c e i n t h e g r e e n s c a n n i n g b a n d f o r e a c h p i x e lw a s c o n v e r t e d t o a g r a y s c a l e v a l u e i n d i c a t i v e o f r e l a t i v ei n t e n s i t y . G r a y s c a l e v a l u e s f r o m a p p r o x i m a t e l y 1 6 0 f o rc o l o r l e s s w e l l s t o 3 0 f o r h i g h l y c o l o r e d w e l l s were o b s e r v e d .A T u r b o P a s c a l c o m p u t e r p r o g r a m was u s e d t o s a m p l e a3 - b y - 3 m a t r i x o f p i x e l s w i t h i n e a c h w e l l . T h e mean p i x e lv a l u e f o r e a c h m a t r i x w a s u s e d a s t h e m e a s u r e o f c o l o rr e s p o n s e i n e a c h w e l l .D a t a a n a l y s i s . O v er a l l c o l o r d e v e l o p m e n t i n BIOLOGp l a t e s was e x p r e s s e d a s a v e r a g e w e l l c o l o r d e v e l o p m e n t( A W C D ) . AWCD was d e r i v e d f r o m t h e mean d i f f e r e n c eamong g r a y s c a l e v a l u e s o f t h e 9 5 r e s p o n s e w e l l s ( c o n t a i n i n gs o l e c a r b o n s o u r c e s ) , R , a n d t h e g r a y s c a l e v a l u e o f t h ec o n t r o l w e l l ( w i t h o u t a c a r b o n s o u r c e ) , C : [ I ( C - R ) ] / 9 5 .C o l o r p r o d u c t i o n i n t h e c o n t r o l w e l l , w h i c h o c c u r r e d u p o n

A P P L . E N V I R O N . M I C R O B I O L .


3/9

CLASSIFICATION O F M IC RO BI A L C O M MUN I T I ES 2 3 5 3i n c u b a t i o n o f c e r t a i n s a m p l e s , y i e l de d c o l o r v a l u e s f o ri n d i v i d u a l w e l l s ( t e r m e d raw d i f f e r e n c e ) t h a t were 3 0 t o 4 0c o l o r u n i t s l o w e r t h a n v a l u e s o b t a i n e d a g a i n s t a c o l o r l e s sc o n t r o l w e l l . When c o l o r d e v e l o p m e n t was o b s e r v e d i n t h ec o n t r o l w e l l , r a w - d i f f e r e n c e v a l u e s w e r e c a l c u l a t e d on t h eb a s i s o f a r e f e r e n c e p o s i t i o n on t h e p l a t e o u t s i d e o f any w e l l .T h i s p r o c e d u r e r e s u l t e d i n v a l u e s t h a t were o n l y 4 or 5 c o l o ru n i t s d i f f e r e n t f r o m t h o s e o b t a i n e d w i t h a c o l o r l e s s c o n t r o lw e l l ( w h e n d i v i d e d b y 9 5 t o o b t a i n t h e AWCD, t h i s s m a l ld i f f e r e n c e was t r i v i a l ) .The p a t t e r n o f s o l e - ca r b o n -s o u r ce u t i l i z a t i o n o f e a c h p l a t ewas e x p r e s s e d i n tw o w ay s : ( i ) r a w -d i f f e r en c e d a t a o b t a i n e db y s u b t r a c t i n g t h e c o l o r response o f e a c h o f t h e responsew e l l s f r o m t h e c o l o r response o f t h e c on t r o l w el l ( o r r e f e r -ence p o s i t i o n ) [ C -R ] , a n d ( i i ) t r a n s f o r m e d d a t a c a l c u l a t e db y d i v i d i n g t h e raw d i f f e r e n c e v a l u e f o r e a c h w e l l b y t h eAWCD o f t h e p l a t e : ( C -R ) / { [ 1 ( C -R ) ] / 9 5 } . B o t h expres-s i o n s o f t h e p a t t e r n o f s o l e - ca r b o n -s o u r ce u t i l i z a t i o n gener-a t e a s e t o f 9 5 v a r i a b l e s f o r e ac h s a m p l e a t e a c h r e a d i n g .V a l u e s o f t h e r a w - d i f f e r e n c e d a t a r a n g e d f r o m 0 t o approx-i m a t e l y 1 3 0 a n d were g en er a l l y h i gh e r f o r most c a r b o nsources a t l a t e r i n c u b a t i o n s , as c o l o r p r o d u c t i o n i n c r e a s e dw i t h t i m e . V a l u e s o f t h e t r a n s f o r m e d d a t a r a n g e d f r o m 0 t oa p p r o x i m a t e l y 4 , w i t h v a l u e s o f 1 i n d i c a t i n g ac o l o r response g r e a t e r t h a n t h e AWCD.The r e l a t i o n s h i p s among d i f f e r e n t s a m p l e s on t h e b a s i s o fe i t h e r t h e r a w - d i f f e r e n c e d a t a or t h e t r a n s f o r m e d d a t a wered e t e r m i n e d b y PCA, u s i n g t h e PC-ORD s o f t w a r e p a c k a g e( H o l c o m b R e s e a r c h I n s t i t u t e , B u t l e r U n i v e r s i t y ) . T h i s t e c h -n i q u e p r o j e c t s t h e o r i g i n a l d a t a o n t o new axes ( p r i n c i p a lcomponents [ P C s ] ) w h i c h r e f l e c t any i n t r i n s i c p a t t e r n i n t h em u l t i d i m en s i o n al d a t a swarm ( 1 6 ) . E a c h PC e x t r a c t s ap o r t i o n o f t h e v a r i a n c e i n t h e o r i g i n a l d a t a , w i t h t h e g r e a t e s tamount o f v a r i a nc e e x t r a c t e d b y t h e f i r s t a x i s . R e l a t i o n s h i p samong s a m p l e s ar e r e a d i l y o b s e r v e d b y p l o t t i n g s a m p l e s i ntwo d i m e n s i o n s on t h e b as is o f t h e i r scores f o r t h e f i r s t tw oP C s . S u c h r e l a t i o n s h i p s are d i f f i c u l t t o o b s e r v e when exam-i n i n g t h e o r i g i n a l v a r i a b l e s i n m u l t i d i m e n s i o n a l space ( i n t h i sc a s e , 9 5 - d i m e n s i o n a l s p a c e ) . P CA a l s o c a l c u l a t e s t h e pro-p o r t i o n o f v a r i a nc e i n e a c h v a r i a b l e e x p l a i n e d b y a g i v e n P C .By c o r r e l a t i n g PCs w i t h t h e o r i g i n a l v a r i a b l e s , t h e axes canb e " l a b e l e d" w i t h a s u b s e t o f t h e o r i g i n a l v a r i a b l e s . I nsummary, P C A o f t h e BIOLOG c o l o r responses a l l o w s f o rc o m p a r i s o n o f m i cr o b i al s a m p l e s on t h e b a s i s o f d i f f e r e n c e si n t h e p a t t e r n o f s o l e - ca r b o n - so u r c e u t i l i z a t i o n . The compar-i s o n s are a p o s t e r i o r i i n n a t u r e ; P CA d e t e r m i n e s ho w t h es a m p l e s are d i f f e r e n t , b u t d o e s n o t t e s t among s a m p l e s f o rs p e c i f i c d i f f e r e n c e s s e l e c t e d a p r i o r i .S a m p l e sources a n d p r e p a r a t i o n . T h r e e d i s p a r a t e t y p e s o fc o m m u n i t i e s ( s a m p l e t y p e s ) were t e s t e d i n B I O L OG p l a t e s :( i ) water ( i n c l u d i n g s a m p l e s o f f r e s h w a t e r , e s t u a r i n e , seawa-t e r , a n d h y d r o p o n i c s o l u t i o n s u s e d f o r g r o w i n g w h e a t ) , ( i i )r h i z o s p h e r e s a m p l e s f r o m h y d r o p o n i c a l l y g r o w n w h e a t( T r i t i c u m a e s t i v u m cv . Y e c o r a r o j a ) , a n d ( i i i ) s o i l s a m p l e s .A l l w a t e r s a m p l e s were p i p e t t e d d i r e c t l y i n t o BIOLOGGN m i c r o p l a t e s . F r e s h w a t e r s a m p l e s were o b t a i n e d d u r i n gmid-March o f 1 9 9 0 f r o m p o n d s and s t r e a m s i n a w a t e r s h e dnear Shenandoah N a t i o n a l P a r k i n Green C o u n t y , V i r g i n i a .S a m p l e s were s i m i l a r i n pH ( 6 . 3 t o 7 . 0 ) , t e m p e r a t u r e ( 7 t o1 2 C ) , and c o n d u c t i v i t y ( 4 0 t o 6 0 , u S c m - ' ) . E s t u a r i n e an ds e a w a t e r s a m p l e s were c o l l e c t e d from a s a l t m a r s h - o c e a ni n l e t t r a n s e c t a t t h e V i r g i n i a C o a s t R e s e r v e Long TermE c o l o g i c a l R e s e a r c h s i t e ( T a b l e 2 ) d ur i ng m i d - J u l y 1 9 9 0 .S e p a r a t e p l a t e s were i n o c u l a t e d w i t h t wo r e p l i c a t e waters a m p l e s a t e a c h s a m p l e s i t e . R e p l i c a t e p l a t e s f o r t h r e e

TABLE 2 . S i t e d e s c r i p t i o n s f o r c o a s t a l m a r i n e s a m p l e sW a t e r W a t e r . D i s s o l v e dS t a t i o n " d e p t h pH t e m p S a l i n i t y o x y g e n( f t ) b ( O C ) ( ( m g / l i t e r )

UP C 3 7 . 8 9 2 4 . 2 3 2 . 1 5 . 5LPC 3 7 . 9 2 2 6 . 5 3 2 . 0 6 . 0M3 5 8 . 0 6 2 7 . 0 3 1 . 8 6 . 41 7 6 2 1 8 . 0 5 2 5 . 0 3 2 . 5 7 . 2Hl 3 0 8 . 0 2 2 4 . 0 3 3 . 0 7 . 4UC C 3 ND" ND ND NDLCC 5 7 . 9 2 2 5 . 5 3 4 . 5 6 . 2SC 1 8 7 . 9 3 2 5 . 0 3 3 . 5 7 . 2PI 3 7 . 8 7 2 6 . 0 3 5 . 0 6 . 8Q I 6 2 7 . 9 7 2 5 . 0 3 3 . 5 7 . 1a U P C , u p p e r r e a c h e s o f m a i n l a n d s a l t m a r s h c r e e k ; L P C , l o w e r r e ac h es o fm a i n l a n d s a l t m a r s h c r e e k ; M 3 , mud f l a t a r e a a d j ac e nt t o m a i n l a n d s a l t m a r s hc r e e k ; 1 7 6 , o p e n c h a n n e l ; H i , o p e n c h a n n e l ; UCC, u p p e r r e a c h e s o f b a r r i e ri s l a n d s a l t m a r s h c r e e k ; LCC, l o w e r r e ac h es o f b a r r i e r i s l a n d s a l t m a r s h c r e e k ;S C , o p e n c h a n n e l t h r o u g h p e r c h e d m a r s h ; P I , s w a s h z o n e b e h i nd a g g r a d i n gs p i t o n b a r r i e r i s l a n d ; Q I, o c e a n i n l e t .b 1 f t = 3 0 . 4 8 c m .' ND, n o t d e t e r m i n e d .

s a m p l e s i t e s w e r e l o s t d u e t o a c c i d e n t a l s p i l l a g e d u r i n gt r a n s p o r t .R h i z o s p h e r e s am p l e s w e r e o b t a i n e d b y s h a k i n g r o o t s i ns t e r i l e s a l i n e s o l u t i o n ( 0 . 8 5 % N a C l ) c o n t a i n i n g g l a s s b e a d s( 5 - m m d i a m e t e r ) . The r e s u l t i n g s u s p e n s i o n was f i l t e r e dt h r o u g h a 1 0 - , u m - p o r e - d i a m e t e r p o l y c a r b o n a t e f i l t e r t o r e -move p l a n t c e l l s p r i o r t o i n o c u l a t i o n .A i r - d r i e d s a m p l e s o f e a c h o f t h r e e s o i l s a m p l e s ( T a b l e 3 )w e r e i n c u b a t e d i n d i l u t e m e d i a t o p r e p a r e a c e l l s u s p e n s i o nw i t h o u t t h e i n t e r f e r i n g c o l o r o f s o i l e x t r a c t s . To d e t e r m i n et h e p o t e n t i a l e f f e c t s o f s e l e c t i v e e n r i c h m en t , s us p en s i o n sw e r e p r e p a r e d w it h t h r e e s e p a r a t e d i l u t e m e d i a : ( i ) 0 . 0 0 2 5 %y e a s t e x t r a c t ( Y E m e d i u m ) , ( i i ) 0 . 0 0 2 5 % y e a s t e x t r a c t a n d0 . 0 2 5 % B a c t o - P e p t o n e ( Y P m e d i u m ) , a n d ( i i i ) 0 . 0 0 2 5 % y e a s te x t r a c t a n d 0 . 0 0 5 % e a c h f r u c t o s e , x y l o s e , d e x t r o s e , l a c t o s e ,a n d m a n n i t o l ( Y S m e d i u m ) . A l l p r e p a r e d medium c o m p o -n e n t s w e r e p u r c h a s e d f r o m D i f c o L a b o r a t o r i e s . P o r t i o n s o ft h e s u s p e n s i o n f r o m t h e s h a k e n f l a s k c u l t u r e s w e r e w i t h -d r a w n a f t e r i n c u b a t i o n f o r 1 8 h a t 2 5 C o n a r o t a r y s h a k e r( m o de l G 2 ; New B r u n s w i c k S c i e n t i f i c ) o p e r a t e d a t 1 0 0 r p m ,t h u s a v o i d i n g t h e s o i l m a t e r i a l , a n d w e r e i n o c u l a t e d d i r e c t l yi n t o BIOLOG p l a t e s . Tw o r e p l i c a t e s u s p e n s i o n s w e r e p r e -p a r e d f o r e a c h s o i l - m e d i u m c o m b i n a t i o n .

TABLE 3 . P h y s i o c h e m i c a l c h a r a c t e r i s t i c s o f s o i l s aS o i l n o .F a c t o r 2 2 2 3 3 5

O r g a n i c m a t t e r ( % ) 9 . 6 5 1 5 . 8 1 6 . 2 8pH 6 . 1 5 . 4 7 . 0S a n d ( % ) 3 5 . 8 5 6 . 4 8 . 0S i l t ( % ) 5 6 . 2 2 6 . 1 1 5 . 0C l ay ( % ) 8 . 0 5 4 . 2 6 3M o i s t u r e ( % o f d r y w t ) 1 1 9 8 0 3 7P ( m g / k g ) 1 9 7 1 3Mg ( m e q / g ) 1 . 1 6 0 . 6 3 3 . 1 0K ( m e q / g ) 0 . 3 3 0 . 5 1 0 . 8 5C a ( m e q / g ) 8 . 2 6 1 . 0 5 1 1 . 6 0F e ( m g / k g ) 1 0 6 1 7 4 1 2 2Cu ( m g / k g ) 6 8 1 9A c i d i t y ( m e q / g ) 0 . 3 0 . 5 0 . 2

a D a t a o b t a i n e d f r o m S o t o a n d Blum ( 2 1 ) .

VOL. 5 7 , 1 9 9 1


4/9

2 3 5 4 GARLAND AND MILLS1 4 0

1 2 0

100

8 0 +

6 0 t

4 0 20-

V L - A S P A R A G I N E4 > 2 , 3 - B U T A N E D I O L

L - L E U C I N EA T WE E N 4 0o-GALACTOSE*WCD

/

/

0 1 0 20 3 0INCUBATION ( h

FIG. 1 . Color d e v e l o p m e n t w i t h i n c u b a t i cc o l o r r e s p o n s e i n f i v e i n d i v i d u a l r e s p o n s e w e l lc o n t r o l w e l l minus g r a y s c a l e v a l u e o f r e s p o nAWCD r e p r e s e n t s t h e mean c o l o r r e s p o n s e f o r

A l l p l a t e s were incubated a t 2 5 C w i ti n i t i a l scan was p e r f o r m e d when s i g n i f i c a iwas p r e s e n t i n a number o f w e l l s , u s u a l ]d e p e n d i n g on t h e s a m p l e . A second sp e r f o r m e d on t h e p l a t e s 1 6 t o 2 4 h l a t e r .

RESULTSBehavior o f c o n t r o l w e l l s . Color d e v e l o pw e l l was minimal ( g r a y s c a l e v a l u e s o fi n c u b a t i o n ) f o r a l l f r e s h w a t e r , e s t u a r i ns a m p l e s a n a l y z e d i n t h i s s t u d y . Reduction

i n t h e c o n t r o l w e l l was more p r o n o u n c e das low as 1 1 0 a f t e r 50 h o f i n c u b a t i o n ) i rr h i z o s p h e r e an d h y d r o p o n i c s o l u t i o n s t iconcentrations of o r g a n i c m a t e r i a l . R e s it h e c o n t r o l w e l l , i . e . , c o l o r p r o d u c t i o n ,r e s u l t o f carbon added with t h e i n o c u l u rp l e s p r i o r t o i n o c u l a t i o n a l w a y s reducedt h e c o n t r o l w e l l .

Rate o f c o l o r d e v e l o p m e n t . ( i ) . AWCD.( e x p r e s s e d as AWCD) f o l l o w e d a s i g ri n c u b a t i o n t i m e . I n t h e s a m p l e shown ip r o d u c t i o n occurred i n t h e c o n t r o l w e l l ,v a l u e s w ere c a l c u l a t e d b y u s i n g e i t h e r t h et h e c o n t r o l w e l l . The s i m p l e s t e s t i m a t ecolor d e v e l o p m e n t i n a p l a t e i s o b t a i n eAWCD v a l u e f o r an e a r l y i n c u b a t i o ni n c r e a s e i n c o l o r d e v e l o p m e n t b y t h e l e( e . g . , between 20 an d 26 h i n F i g . 1 ) . ReAWCD v a l u e s f o r l a t e r i n c u b a t i o n s w o u lbecause o f t h e a s y m p t o t i c n a t u r e o f c o l oTo determine t h e r e l a t i v e i m p o r t a n c eversus c o m m u n i t y a c t i v i t y on t h e r a t e ad e v e l o p m e n t , c e l l numbers were d e t e r r rp o n i c s o l u t i o n s a m p l e s , u s i n g t h e a c r i d iwith e p i f l u o r e s c e n c e m i c r o s c o p y ( 9 ) . Tsame s a m p l e s was determined as t h e tl a b e l e d amino a c i d m i x t u r e ( 0 . 5 n g / m l orthe s p e c i f i c methods of W i l l i a m s an d A s k is a m p l e s , c o l o r d e v e l o p m e n t r a t e s e s t i m ,v a l u e s c a l c u l a t e d from r e f e r e n c e p o i n to p p o s e d t o from t h e c o n t r o l w e l l were i

l a t e d w i t h t h e i n o c u l u m c e l l d e n s i t y ( l o g 1 o o f t h e AODC) ( r =0 . 6 7 7 ) t h a n w i t h t h e a m i n o a c i d t u r n o v e r r a t e c o n s t a n t o f t h ec o m m u n i t y ( r = - 0 . 4 7 0 ) . T h e s e r e s u l t s s u g g e s t t h a t c o l o rp r o d u c t i o n i n t h e BIOLOG c o m m u n i t y - l e v e l a s s a y i s c a u s e db y g r o w t h o f b a c t e r i a w i t h i n w e l l s a f t e r i n o c u l a t i o n r a t h e rt h a n r e s p i r a t i o n o f t h e i n o c ul a t e d c o m m u n i t y . O b s e r v a t i o no f d e n s e m a t s o f s t a i n e d b a c t e r i a i n h i g h l y c o l o r e d w e l l s a l s oi n d i c a t e s t h e i m p o r t a n c e o f b a c t e r i a l g r o w t h i n c o l o r f o r m a -t i o n .C o r r e l a t i o n o f AWCD v a l u e s , u s i n g t h e c o n t r o l w e l l f o ro - 0thea m e s e t o f 2 3 h y d r o p o n i c s o l u t i o n s , w e r e much morep o o r l y c o r r e l a t e d t o e i t h e r i n o c u l u m d e n s i t y ( 0 . 1 8 4 ) o ra c t i v i t y ( - 0 . 1 7 3 ) t h a n t h e AWCD v a l u e s c a l c u l a t e d b y u s i n ga r e f e r e n c e c e l l . S i g n i f i c a n t c o l o r p r o d u c t i o n i n t h e c o n t r o lI w e l l w a s r e c o r d e d f o r o n l y a b o u t h a l f o f t h e h y d r o p o n i c4 0 5 0 6 0 s o l u t i o n s a m p l e s . C o l o r p r o d uc t i o n i n t h e c o n t r o l w e l l d i d

1 ) n o t a p p e a r t o b e a b a c k g r o u n d c o l o r p r e s e n t i n a l l w e l l s .) n . P l o t s p r e s e n t t h e R ap i d g r o wt h o f s p e c i f i c g u i l d s i n t h e r e s p o n s e w e l l s a t h i g hI s ( g r a y s c a l e v a l u e o f s u b s t r a t e c o n c e n t r a t i o n s may o v e r w h e l m t h e r e s p i r a t i o ns e w e l l ) . T h e p l o t o f o b s e r v e d i n t h e c o n t r o l w e l l a t t h e e x p e n s e o f t h e l o w e ra l l 9 5 r e s p o n s e w e l l s . c o n c e n t r a t i o n s o f o r g a n i c s p r e s e n t i n t h e i n o c u l u m .C l e a r l y , f u r t h e r w o r k i s r e q u i r e d t o a d d r e s s b e t t e r t h er e l a t i o n s h i p b e t w e e n c o n t r o l w e l l a n d r e s p o n s e w e l l c o l o r; h o u t a g i t a t i o n . An f o r m a t i o n . A t p r e s e n t , e l i m i n a t i o n o f t h e c o n t r o l w e l l c o l o rn t c o l o r p r o d u c t i o n r e s p o n s e b y d i l u t i n g s a m p l e s c o n t a i n i n g h i g h c o n c e n t r a t i o n sl y a f t e r 2 0 t o 4 0 h , o f o r g a n i c s p r i o r t o i n o c u l a t i o n i s a d v i s a b l e . I n o u r e x p e r i -; c a n t y p i c a l l y w a s m e n t s t h e d e g r ee o f d i l u t i o n n e c e s s a r y t o m i n i m i z e c o l o rd e v e l o p m e n t i n t h e c o n t r o l w e l l n e v e r d i l u t e d t h e c e l ln u m b e r s t o a l e v e l u n a c c e p t a b l e f o r c o l o r p r o d u c t i o n i n t h er e s p o n s e w e l l s .( i i ) I n d i v i d u a l w e l l s . C o l o r d e v e l o p m e n t v a r i e d g r e a t l y) m e n t i n t h e c o n t r o l among r e s p o n s e w e l l s ( F i g . 1 ) . I n some o f t h e r e s p o n s e w e l l s> 1 4 0 a f t e r 5 0 h o f c o l o r d e v e l o p e d r a p i d l y a n d r e a c h e d a maximum v a l u ei e w a t e r , a n d s o i l w i t h i n 2 0 t o 3 0 h . C o l o r d e v e l o p m e n t i n o t h e r w e l l s s h o w e do f t e t r a z o l i u m d y e a l a g p h a s e f o r t h e f i r s t 2 4 h f o l l o w e d b y a l i n e a r i n c r e a s e( g r a y s c a l e v a l u e s d u r i n g t h e s e c o n d 2 4 h o f i n c u b a t i o n . T h e l a g p h a s e i ni s a m p l e s f r o m t h e AWCD i s s h o r t e r t h a n t h a t o b s e r v e d f o r t h e l e s s r e s p o n s i v eh a t c o n t a i n e d h i g h w e l l s b e c a u s e o f t h e i m m e d i a t e c o l o r p r o d u c t i o n i n t h e m o r ep i r a t o r y a c t i v i t y i n r e s p o n s i v e w e l l s . I n a l l o f t h e s a m p l e s a na l yz e d, o n l y a f e wI p p e a r e d t o b e a w e l l s s h o w e d n o c o l o r r e s p o n s e a f t e r 5 0 h o f i n c u b a t i o n .m ; d i l u t i o n o f s a m - P a t t e r n s o f s o l e c a r b o n s o u r c e u t i l i z a t i o n . ( i ) I n f l u e n c e o fc o l o r p r o d u c t i o n i n r a t e o f c o l o r d e v e l o p m e n t . T h e o b s e r v e d r e l a t i o n s h i p b e -t w e e n i n o c u l u m d e n s i t y a n d AWCD i n d i c a t e s t h a t d i f f e r -C o l o r d e v e l o p m e n t e n c e s i n t h e m u l t i v a r i a t e p a t t e r n o f c o l o r r e s p o n s e amongn o i d a l c u r v e w i t h s a m p l e s a s d e t e r m i n e d b y P CA a l s o may b e s t r o n g l y i n f l u -i n F i g . 1 , n o c o l o r e n c e d b y t h e r e l a t i v e a b u n d a n c e o f b a c t e r i a i n s am p l e s. T h i ss o s i m i l a r AWCD r e l a t i o n s h i p w a s f o u n d f o r t h e r a w - d i f f e r e n c e c o l o r r e s p o n s er e f e r e n c e p o i n t o r o f p l a t e s f r o m e a r l y i n cu ba t i o n s o f f r e sh w at e r s am p l es , a so f o v e r a l l r a t e o f i n d i c a t e d b y t h e s t r o n g c o r r e l a t i o n ( r 2 = 0 . 8 9 ) b e t w e e nI d b y d i v i d i n g t h e c o o r d i n a t e s o f s a m p l e s f o r t h e f i r s t PC a n d AWCD v a l u e sd u r i n g t h e l i n e a r ( F i g . 2 ) . I n o t h e r w o r d s , P CA e x t r a c t e d a p a t t e r n i n t h en g t h o f i n c u b a t i o n s t r u c t u r e o f t h e d a t a w h i c h c a n b e e x p l a i n e d , i n l a r g e p a r t ,a t e e s t i m a t e s u s i n g b y d i f f e r e n c e s i n t h e r a t e o f c o l o r d e v e l o p m e n t a m o n g p l a t e s .I d b e l e s s a c c u r a t e T r a n s f o r m a t i o n o f t h e d a t a b y d i v i d i n g e a c h r a w d i f f e r e n c er d e v e l o p m e n t . b y t h e AWCD o f t h e p l a t e s i g n i f i c a n t l y r e d u c e d t h e i n f l u e n c eo f i n o c u l u m s i z e o f r a t e o f c o l o r d e v e l o p m e n t o n c l a s s i f i c a t i o n o f s a m p l e s .t n d e x t e n t o f c o l o r C o r r e l a t i o n o f c o o r d i n a t e s o f s a m p l e s f o r t h e f i r s t PC w i t hn i n e d i n 2 3 h y d r o - AWCD v a l u e s w a s m u c h l o w e r ( r 2 = 0 . 2 8 ) t h a n f o u n d w i t hi n e o r a n g e m e t h o d t h e r a w - d i f f e r e n c e d a t a ( F i g . 2 ) . T h e a m o u n t o f v a r i a n c e i n' h e a c t i v i t y o f t h e t h e d a t a s e t e x t r a c t e d b y t h e f i r s t PC w a s s i m i l a r f o r a n a l y s i st u r n o v e r o f a 1 4 C - o f t h e r a w - d i f f e r e n c e a n d t r a n s f o r m e d d a t a ( 2 5 a n d 2 1 . 5 % ,0 . 2 n C i / m l ) , u s i n g r e s p e c t i v e l y ) . T h i s r e s u l t i n d i c a t e s t h a t P CA o f t r a n s f o r m e d: e w ( 2 6 ) . F o r t h e 2 3 d a t a e x p l a i n e d a s i g n i f i c a n t s t r u c t u r e i n t h e d a t a s e t a s aa t e d u s i n g AWCD r e s u l t o f d i f f e r e n c e s i n t h e r e l a t i v e u t i l i z a t i o n o f s o l e c a r b o ns o n t h e p l a t e a s s o u r c e s a m o n g s a m p l e s .m o r e h i g h l y c o r r e - I t w a s c o n c l u d e d t h a t t r a n s f o r m e d d a t a s e t s w o u l d b e

- J

C l )c)

U L J

c cc n0- J00



5/9

CLASSIFICATION O F MICROBIAL C O M MUN I T I ES 2 3 5 5- 2 0 0

- 3 0 0

o ) - 4 0 0- 5 0 0

5

0

0 L - 5-1 0 F

( 900

r = 0 . 8 9

0 4 0 5 0 EB

o0 0 % q ) 0

0 0 0 00 . 2 800

3 0 4 0 5 0AWCD (GRAY SCALE U N I T S )F I G . 2 . C o m p a r i s o n o f AWCD w i t h s c o r e s f o r t h eb a s i s o f PCA o f ( A ) r a w - d i f f e r e n c e a n d ( B ) t r a n s f o r m ci n c u b a t i o n o f f r e s h w a t e r s a m p l e s i n BIOLOG p l a t e :s e n t t h e l e a s t - s q u a r e r e g r e s s i o n s ( n = 2 6 ) . r 2 v a l u e so f c o r r e l a t i o n c o e f f i c i e n t s .

m o r e u s e f u l t h a n r a w - di f f e r e nc e d a t a f o r c l a s s i tamong a n d w i t hi n m i cr o b i al h a b i t a t s b y P C A . :a n a l y s e s w e r e p e r f o r m e d o n p l a t e s f r o m l a t e r i rt h a t d i f f e r e n c e s among s a m p l e s i n c o l o r p r o d ir e s p o n s i v e w e l l s ( w h i c h may s h o w n o c o l o r r e s jr e a d i n g s ) c o u l d b e e v a l u a t e d .( i i ) D i f f e r e n c e s among m i c r o b i a l h a b i t a t s . St h r e e d i f f e r e n t m i c r o b i a l h a b i t a t s ( s o i l , f r e s h wd r o p o n i c s y s t e m s ) h a d d i s t i n c t i v e p a t t e r n s o fs o u r c e u t i l i z a t i o n o n t h e b a s i s o f P CA o f t r a n sr e s p o n s e d a t a ( F i g . 3 ) . P CA w a s p e r f o r m e d )f r o m a l l s a m p l e s f r o m e a c h h a b i t a t ( i . e . , a l l t h rl a k e a n d s t r e a m s a m p l e s , h y d r o p o n i c s o l u t i o is p h e r e ) . S o i l s a m p l e s h a d much l o w e r c o o r d i n as c o r e s ) f o r t h e f i r s t P C , w h i c h e x p l a i n e d 34 % o ri n t h e d a t a , t h a n e i t h e r t h e f r e s h w a t e r o r h y dp l e s . S a m p l e s f r o m t h e l a t t e r t w o m i c r o b i a l

1 0 0 0

8 0 0

6 0 0

4 0 0

2 0 0

o -1--1500 - 1 0 0 0 - 5 0 0PC 1F I G . 3 . O r d i n a t i o n p r o d u c e d f r o m P CA o f a l l s (an d h y d r o p o n i c s a m p l e s . S c o r e s o f e a c h s a m p l e f tsecond PCs are p l o t t e d .

s i m i l a r v a l u e s f o r PC 1 , b u t h a d d i f f e r e n t PC s c o r e s a l o n g t h es e c o n d P C , w i t h t h e f r e s h w a t e r s a m p l e s p o s s e s s i n g h i g h e rc o o r d i n at e v a l ue s ( w i t h t h e e x c e p t i o n o f a s i n g l e h y d r o p o n i cs y s t e m s a m p l e ) . T h e s e c o n d PC e x p l a i n e d 15% o f t h ev a r i a n c e i n t h e d a t a .T h e s ep a ra t i o n o f s a m p l e s i n PC s p a c e c a n b e r e l a t e d t od i f f e r e n c e s i n c a r b o n s o u r c e u t i l i z a t i o n b y e x a m i n i n g t h ec o r r e l a t i o n o f t h e o r i g i n a l v a r i a b l e s t o t h e P C s . T h e most6 0 i m p o r t a n t c a r b o n s o u r c e s i n d i f f e r e n t i a t i n g among t h e com-m u n i t i e s w e r e d e f i n e d a s t h o s e w h i c h h a d a t l e a s t h a l f o ft h e i r v a r i a n c e e x p l a i n e d b y PC 1 o r PC 2 ( T a b l e 4 ) . T h ed e g r e e t o w h i c h a PC e x p l a i n s t h e v a r i a n c e i n t h e c o l o r

- r e s p o n s e o f a n i n d i v i d u a l c a r b o n s o u r c e i s r e l a t e d t o d i f f e r -e n c e s i n t h e r e s p o n s e i n s a m p l e s w i t h d i f f e r e n t c o o r d i n a t ev a l u e s f o r t h a t P C . F o r e x a m p l e , s a m p l e s w i t h h i g h e rc o o r d i n a t e v a l u e s f o r PC 1 s h o w e d a g r e a t e r r e s p o n s e f o rc a r b o n s o u r c e s p o s i t i v e l y c o r r e l a t e d t o PC 1 a s c o m p a r e dw i t h s am p l e s w it h l o w PC s c o r e s . P o o r c o r r e l a t i o n o f a6 0 c a r b o n s o u r c e t o a PC ( t h e m a j o r i t y o f c a r b o n s o u r c e s i nm o s t c a s e s ) d o e s n o t n e c e s s a r i l y mean t h a t i t was p o o r l yf i r s t P C o n t h e u t i l i z e d b y s a m p l e s , b u t r a t h e r t h a t i t s u t i l i z a t i o n w as n o te d d a t a f o r 4 0 - h d i f f e r e n t among s a m p l e s w i t h h i g h e r a n d l o w e r c o o r d i n a t es . L i n e s r e p r e - v a l u e s f o r t h a t PC ( i . e . , i t c o u l d n o t h e l p d i f f e r e n t i a t ea r e t h e s q u a r e s s a m p l e s ) .A n a l y s i s o f PC 1 ( F i g . 3 ) i n d i c a t e s t h a t s o i l m i c r o b i a lc o m m u n i t i e s u t i l i z e d a n u m b e r o f c a r b o h y d r a t e s ( g l y c o g e n ,N - a c e t y l - D - g a l a c t o s a m i n e , D - a r a b i t o l , g e n t i o b i o s e , D - m e l i b i -f y i n g s a m p l e s o s e , a n d , 3 - m e t h y l g l u c o s i d e ) a n d p h e n y l e t h y l a m i n e , t o aF u r t h e r m o r e , r e l a t i v e l y l e s s e r d e g r e e , a n d s e v e r a l c a r b o x y l i c a c i d s ( - y -n c u b a t i o n s s o h y d r o x y b u t y r i c a c i d , q u i n i c a c i d , a n d s e b a c i c a c i d ) , g l u c o r o -u c t i o n i n l e s s n a m i d e , y - a m i n o b u t y r i c a c i d , a n d m o n o - m e t h y l s u c c i n a t e , t op o n s e i n e a r l y a r e l a t i v e l y g r e a t e r d e g r e e , t h a n m i cr o b i a l c o m m u n i t i e sa s s o c i a t e d w i t h e i t h e r t h e f r e s h w a t e r o r t h e h y d r o p o n i cs a m p l e s f r o m s a m p l e s e x a m i n e d . On t h e b a s i s o f PC 2 a n a l y s i s , m i c r o b i a lr a t e r , a n d h y - c o m m u n i t i e s a s s o c i a t e d w i t h f r e s h w a t e r s i t e s s h o w e d as o l e - c a r b o n - g r e a t e r r e l a t i v e u t i l i z a t i o n o f t h r e e c a r b o h y d r a t e s ( a r a b i n o s e ,i f o r m e d c o l o r g a l a c t o s e , a n d t r e h a l o s e ) , f o u r c a r b o x y l i c a c i d s ( c i t r i c a c i d ,w i t h t h e d a t a f o r m i c a c i d , D - g l u c o s a m i n i c a c i d , a n d a - h y d r o x y b u t y r i ce e s o i l t y p e s , a c i d ) , a n d t h r e e a m i n o a c i d s ( g l u t a m i c a c i d , g l y c y l - L - a s p a r t i cn , a n d r h i z o - a c i d , a n d g l y c y l - L - g l u t a m i c a c i d ) a n d a l e s s e r r e l a t i v e u t i l i -t e v a l u e s ( P C z a t i o n o f P - h y d r o x y b u t y r i c a c i d c o m p a r e d w i t h m i c r o b i a lf t h e v a r i a n c e c o m m u n i t y s a m p l e s f r o m h y d r o p o n i c s y s t e m s .I r o p o n i c s a m - ( i i i ) D i f f e r e n c e s a m o n g s a m p l e s f r o m c o a s t a l l a g o o nh a b i t a t s h a d t r a n s e c t . PCA o f t h e c o a s t a l l a g o o n - o c e a n i n l e t g r a d i e n tr e v e a l e d a s e p a r a t i o n o f s a m p l e s f r o m o p e n - w a t e r a n d m a r s hc r e e k s i t e s a l o n g t h e f i r s t P C , w h i c h e x p l a i n e d 21% o f t h ev a r i a n c e i n t h e d a t a ( F i g . 4 ) . O p e n - w a t e r s a m p l e s h a d h i g h e rr e s p o n s e s f o r w e l l s c o n t a i n i n g g l y c o g e n , s e v e r a l a m i n o a c i d s( L - a l a n y l - g l y c i n e , g l y c y l - L - a s p a r t i c a c i d , a n d g l y c y l - L - g l u -t a m i c a c i d ) , two c a r b o x y l i c a c i d s ( c i s - a c o n i t i c a c i d a n dg l u c o n i c a c i d ) , a n d g l u c o s e - 6 - p h o s p h a t e ( T a b l e 5 ) . I n c l u d e di n t h e m a r s h c r e e k g r o u p i n g a r e s i t e s f r o m b o t h t h e i n l a n d -* a n d b a r r i e r i s l a n d - a s s o c i a t e d m a r s h e s a n d a mud f l a t s t a t i o n .R e p l i c a t e p l a t e s o f o n e o f t h e b a r r i e r i s l a n d - a s s o c i a t e d m a r s h1 c r e e k s i t e s s h o w e d w i d e d i v e r g e n c e , w i t h on e o f t h e r e p l i -c a t e s f a l l i n g i n t h e o p e n - w a t e r g r o u p i n g . T h e v a r i a b i l i t ya m o n g t h e s e r e p l i c a t e s may h a v e b e e n d u e t o c r o s s - w e l lc o n t a m i n a t i o n c a u s e d b y v i b r a t i o n o f p l a t e s d u r i n g t h e b o a tr i d e a c r o s s r o u g h w a t e r . I n g e n e r a l , r e p l i c a t e p l a t e s ( a sd e n o t e d b y l e t t e r ) p o s s e s s e d s i m i l a r d a t a p a t t e r n s , a s r e p r e -- + - - - - - - - - s e n t e d b y s i m i l a r c o o r d i n a t e v a l u e s . The s e c o n d P C , w h i c h5 0 0 1 0 0 0 e x p l a i n e d 1 3 . 6 % o f t h e v a r i a n c e i n t h e d a t a , d i s t i n g u i s h e dt h e o c e a n i n l e t s i t e f r o m a l l l a g o o n o r m a r s h c r e e k s i t e s . T h i s

o i l , f r e s h w a t e r , s i t e s h o w e d g r e a t e r r e l a t i v e r e s p o n s e i n w e l l s c o n t a i n i n go r t h e f i r s t a n d m - i n o s i t o l , a - l a c t o s e , a s p a r a g i n e , a n d L - p h e n y l a l a n i n e ( T a -b l e 5 ) .

c \ J0 -

VOL. 5 7 , 1 9 9 1

- 0 0


6/9

2 3 5 6 GARLAND AND MILLSTABLE 4 . C o r r e l a t i o n o f c a r b o n s o u r c e v a r i a b l e s t o P C s f o r a n a l y s i s o f s o i l , f r e s h w a t e r , a n d h y d r o p o n i c s a m p l e s

P C 1 P C 2C a r b o n s o u r c e K C a r b o n s o u r c e r

C a r b o h y d r a t e s C a r b o h y d r a t e sG l y c o g e n 0 . 7 9 6 A r a b i n o s e 0 . 7 4 7N - A c e t y l - D - g a l a c t o s a m i n e 0 . 8 9 4 G a l a c t o s e 0 . 6 7 6D - A r a b i t o l 0 . 9 1 6 T r e h a l o s e 0 . 6 7 6, - M e t h y l g l u c o s i d e 0 . 9 4 3D - M e l i b i o s e 0 . 8 8 4 C a r b o x y l i c a c i d sG e n t i o b i o s e 0 . 7 7 0 C i t r i c a c i d 0 . 7 0 2D - M e l i b i o s e 0 . 8 8 4 F o r m i c a c i d 0 . 6 9 9, - M e t h y l g l u c o s i d e 0 . 9 4 3 D - G l u c o s a m i n i c a c i d 0 . 7 0 2a - H y d r o x y b u t y r i c a c i d 0 . 7 4 3M e t h y l e s t e r s y - H y d r o x y b u t y r i c a c i d - 0 . 8 0 3M o n o - m e t h y l s u c c i n a t e - 0 . 7 5 5 Amino a c i d sC a r b o x y l i c a c i d s G l y c y l - L - g l u t a m i c a c i d 0 . 6 7 3y - H y d r o x y b u t y r i c a c i d - 0 . 7 4 0 G l y c y l - L - a s p a r t i c a c i d 0 . 6 6 4Q u i n i c a c i d - 0 . 7 1 9 G l u t a m i c a c i d 0 . 6 6 2S e b a c i c a c i d - 0 . 7 3 9

A m i d e sG l u c u r o n a m i d e - 0 . 8 1 0A m i n o a c i d s- y - A m i n o b u t y r i c a c i d - 0 . 7 0 8A r o m a t i c sU r i d i n e - 0 . 7 2 6A m i n e sP h e n y l e t h y l a m i n e 0 . 8 8 7

a r , P e a r s o n ' s r e g r e s s i o n c o e f f i c i e n t .

( i v ) D i f f e r e n c e s a m o n g s o i l s a m p l e s . PCA o f t h e p r e i n c u -b a t e d s o i l s a m p l e s r e v e a l e d d i s t i n c t i v e p a t t e r n s a m o n g b o t hs o i l t y p e s a n d i n c u b a t i o n m e d i a ( F i g . 5 ) . D i f f e r e n c e s a m o n gs o i l t y p e s , h o w e v e r , w e r e a l w a y s g r e a t e r t h a n d i f f e r e n c e sw i t h i n s o i l t y p e s d u e t o i n c u b a t i o n m e d i a . T h e f i r s t P C ,w h i c h e x p l a i n e d 2 7 . 9 % o f t h e v a r i a n c e , s e p a r a t e d s a m p l e s

4

2

0

- 2

- 4- 6

0 -OPEN WATER1 7 6 H i A - MARSH CREEKS@ 0

@ 1 7 6 AUCCL0 A Av A L C C A M3*5SC M3 A A U P O*S C AC L P C LCL C L

0I

- 1 4 - 1 2 - 1 0 - 8 - 6 - 4PC 1

F I G . 4 . O r d i n a t i o n p r o d u c e d f r o m P CA o f c o a s t a l m a r i n e waters am p l es . S c o r es o f e a c h s a m p l e f o r t h e f i r s t a n d s e c o n d PCs ar ep l o t t e d . S y m b o l t y p e d i s t i n g u i s h e s s a m p l e s i t e s a s s o c i a t e d w i t hi n l a n d or b a r r i e r i s l a n d m a r s h e s ( m a r s h c r e e k ) f r o m t h o s e l o c at e d i nc h a n n e l s or t h e ocean i n l e t ( o p e n w a t e r ) . L e t t e r s d e n o t e s a m p l i n gs i t e ( s e e T a b l e 2 f o r s i t e d e s c r i p t i o n s ) . I d e n t i c a l l e t t e r s r e p r e s e n tscores f o r p l a t e s t a k e n o f r e p l i c a t e w a t e r s a m p l e s a t a s i t e .

f r o m a l l i n c u b a t i o n m e d i a o f s o i l 2 3 f r o m s a m p l e s o f s o i l s 2 2a n d 3 5 . S e p a r a t i o n was l a r g e l y a r e s u l t o f g r e a t e r u t i l i z a t i o no f a n u m b e r o f c a r b o h y d r a t e s ( m - i n o s i t o l , D - m a n n i t o l ,D - r a f f i n o s e , L - r h a m n o s e , a n d D - s o r b i t o l ) a n d l e s s e r u t i l i z a -t i o n o f a n u m b e r o f a m i n o a c i d s ( D - a l a n i n e , L - a l a n i n e ,L - o r n i t h i n e , L - p r o l i n e , a n d L - s e r i n e ) , s u c c i n a m i c a c i d , a n dp h e n y l e t h y l a m i n e b y s a m p l e s o f s o i l 2 3 ( T a b l e 6 ) . T h es e c o n d P C , w h i c h e x p l a i n e d 2 6 . 7 % o f t h e v a r i a n c e , s e p a -r a t e d s a m p l e s o f s o i l 2 3 i n c u b a t e d i n YE medium f r o m t h o s ei n c u b a t e d i n YS a n d YP m e d i a . T h e s e c o n d PC a l s o s e p a -r a t e d s o i l 2 2 s a m p l e s ( p a r t i c u l a r l y t h o s e i n c u b a t e d i n YE a n dYP m e d i a ) f r o m s a m p l e s o f s o i l 3 5 . PC 2 w a s p o s i t i v e l yc o r r e l a t e d t o f o u r a m i n o a c i d s ( D , L - a s p a r t i c a c i d , L - a s p a r a -g i n e , L - a s p a r t i c a c i d , a n d L - g l u t a m i c a c i d ) a n d t h r e e c a r b o x -y l i c a c i d s ( c i s - a c o n i t i c a c i d , c i t r i c a c i d , a n d D - g l u c o n i c a c i d )a n d n e g a t i v e l y c o r r e l a t e d t o s i x c a r b o h y d r a t e s ( a d o n i t o l ,a - D - g l u c o s e , a - D - m e l i b i o s e , , B - m e t h y l g l u c o s i d e , a n d p s i -c o s e ) . AWCD o f s a m p l e s w a s h i g h l y c o r r e l a t e d ( r 2 = 0 . 7 7 5 )t o t h e c o o r d i n a t e s o f P CA 2 , b u t w a s u n c o r r e l a t e d ( r 2 =0 . 0 4 4 ) t o c o o r d i n a t e s f o r a x i s 1 . R e p l i c a t e p l a t e s o f s a m p l e sh a d v e r y s i m i l a r c o o r d i n a t e v a l u e s .

DISCUSSIONT h e i n o c u l a t i o n o f s a m p l e s c o n t a i n i n g i n t a c t m i c r o b i a lc o m m u n i t i e s i n t o BIOLOG p l a t e s p r o d u c e d r e s p o n s e p a t -t e r n s t h a t d i s t i n g u i s h e d a m o n g w i d e l y d i s p a r a t e s a m p l e s a n damong d i s s i m i l a r s a m p l e t y p e s w i t h i n l a r g e r c a t e g o r i e s .D i f f e r e n t i a t i o n o f s a m p l e s f r o m d i f f e r e n t h a b i t a t s w a s au s e f u l p r e l i m i n a r y t e s t o f t h e a s s a y . T h e a b i l i t y t o d i s t i n g u i s ha m o n g s a m p l e s w i t h i n s i m i l a r h a b i t a t s , h o w e v e r , w a s amuch m o r e p o w e r f u l t e s t o f t h e r e s o l v i n g p o w e r o f t h e a s s a y .

C mc L



7/9

CLASSIFICATION OF MICROBIAL COMMUNITIES 2 3 5 7TABLE 5 . C o r r e l a t i o n o f c a r b o n s o u r c e v a r i a b l e s t o PCs f o ra n a l y s i s o f s a l t m a r s h - o c e a n i n l e t t r a n s e c t s a m p l e s

P C 1 P C 2C a r b o n s o u r c e C a r b o n s o u r c e r

P o l y m e r s C a r b o h y d r a t e sG l y c o g e n - 0 . 8 1 1 m - I n o s i t o l - 0 . 8 0 6a - L a c t o s e - 0 . 7 2 7C a r b o h y d r a t e sT u r a n o s e 0 . 7 7 0 Amino a c i d sX y l i t o l 0 . 7 4 3 A s p a r a g i n e - 0 . 7 4 5L - P h e n y l a l a n i n e - 0 . 8 4 6C a r b o x y l i c a c i d sc i s - A c o n i t i c a c i d - 0 . 7 5 1G l u c o n i c a c i d - 0 . 9 1 7G l u c o s a m i c a c i d 0 . 7 3 8, - H y d r o x y b u t y r i c a c i d 0 . 7 1 4

Amino a c i d sL - A l a n y l - g l y c i n e - 0 . 8 0 8G l y c y l - > _ - a s p a r t i c a c i d - 0 . 8 0 2G l y c y l - L - g l u t a m i c a c i d - 0 . 8 5 3S e r i n e - 0 . 7 7 7P h o s p h o r y l a t e d c h e m i c a l sG l u c o s e - 6 - p h o s p h a t e - 0 . 7 2 1


T h i s l e v e l o f r e s o l u t i o n a l l o w s f o r t h e e x a m i n a t i o n o f t h es t r u c t u r i n g a g e n t s w i t h i n s p e c i f i c t y p e s o f m i c r o b i a l commu-n i t i e s ( s o i l , p l a n k t o n i c , e t c . ) .T h e r e s o l u t i o n o f a l l t h r e e s o i l s a m p l e s a n a l y z e d o n t h eb a s i s o f p a t t e r n s o f s o l e - c a r b o n - s o u r c e u t i l i z a t i o n i n d i c a t e st h a t t h e BIOLOG c o m m u n i t y a s s a y c a n b e a u s e f u l t o o l f o rc l a s s i f y i n g s o i l m i c r o b i a l c o m m u n i t i e s . I t w o u l d b e p a r t i c u -l a r l y i n t e r e s t i n g t o s t u d y t h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n c l a s s i f i c a -

TABLE 6 . C o r r e l a t i o n o f c a r b o n s o u r c e v a r i a b l e s t o P C s f o ra n a l y s i s o f s o i l s a m p l e sPC1 PC2

C a r b o n s o u r c e C a r b o n s o u r c e rC a r b o h y d r a t e s C a r b o h y d r a t e sG e n t i o b i o s e 0 . 7 4 1 A d o n i t o l - 0 . 8 0 4m - I n o s i t o l - 0 . 8 1 2 a - D - G l u c o s e 0 . 9 3 2D - M a n n i t o l - 0 . 7 6 5 a - L a c t o s e - 0 . 8 6 4D - R a f f i n o s e - 0 . 7 1 9 D - M e l i b i o s e - 0 . 8 5 5L - R h a m n o s e - 0 . 7 2 4 3 - M e t h y l g l u c o s i d e - 0 . 7 6 9D - S o r b i t o l - 0 . 9 7 7 P s i c o s e - 0 . 8 5 0C a r b o x y l i c a c i d s C a r b o x y l i c a c i d sa - K e t o v a l e r i c a c i d - 0 . 7 4 6 c i s - A c o n i t i c a c i d 0 . 8 5 4S u c c i n a m i c a c i d 0 . 8 9 4 C i t r i c a c i d 0 . 8 4 0

D - G l u c o n i c a c i d 0 . 8 2 7Amino a c i d s D , L - L a c t i c a c i d 0 . 8 1 1D - A l a n i n e 0 . 9 0 4L - A l a n i n e 0 . 8 6 1 Amino a c i d sL - A l a n y l - g l y c i n e - 0 . 7 0 4 L - A s p a r a g i n e 0 . 8 3 7L - L e u c i n e - 0 . 7 0 5 L - A s p a r t i c a c i d 0 . 8 5 1L - O r n i t h i n e 0 . 8 6 9 L - G l u t a m i c a c i d 0 . 8 1 0L - P r o l i n e 0 . 8 1 7L - S e r i n e 0 . 7 6 4A m i n eP h e n y l e t h y l a m i n e 0 . 9 0 9


8 0 07 0 0

6 0 0 +C \ jC ) 5 0 0

4 0 0 +3 0 0 +2 0 0 W -

- 2 0 0 - 1 0 0 0 1 0 0PC 1

2 0 0 3 0 0 4 0 0

F I G . 5 . O r d i n a t i o n p r o d u c e d f r o m P CA o f s o i l s a m p l e s . S c o r e so f e a c h s a m p l e s f o r t h e f i r s t a n d s e c o n d PCs ar e p l o t t e d . S y m b o lt y p e i n d i c a t e s s o i l s a m p l e ( s e e T a b l e 3 f o r p h y s i o c h e m i c a l d e s c r i p -t i o n s ) . L e t t e r s r e f e r t o t h e medium in w h i c h s o i l s were i n c u b a t e dp r i o r t o i n o c u l a t i o n i n t o BIOLOG p l a t e s . I d e n t i c a l s y m b o l - l e t t e rc o m b i n a t i o n r e p r e s e n t r e p l i c a t e s h a k e f l a s k c u l t u r e s .

t i o n o f s o i l s b a s e d on m i c r o b i a l c o m m u n i t y s t r u c t u r e a n d t h ew e l l - e s t a b l i s h e d c l a s s i f i c a t i o n b a s e d on p h y s i o c h e m i c a l f a c -t o r s . T h e i n t e n s i v e s a m p l i n g r e q u i r e d f o r s u c h a s t u d y i sf e a s i b l e g i v e n t h e r a p i d p r o c e s s i n g Q f s a m p l e s b y t h e B I -OLOG c o m m u n i t y assay. R e c e n t r e s e a r c h i n our l a b o r a t o r ys u g g e s t s t h a t p r e i n c u b a t i o n o f s o i l s may b e unnecessary,f u r t h e r d e c r e a s i n g t h e t i m e r e q u i r e d f o r ' s a m p l e p r o c e s s i n g .B l e n d i n g s o i l s , w i t h s u b s e q u e n t f l o c c u l a t i o n o f s o i l p a r t i c l e s( 5 ) , p r o d u c e s c o l o r l e s s s u s p e n s i o i i s s u i t a b l e f o r d i r e c t i n o c -u l a t i o p i n t o BIOLOG p l a t e s , a n d t h i s p r o c e d u r e i s now ou rm e t h o d o f c h o i c e . T h e d i f f e r e n c e s o b s e r v e d among r e p l i c a t es o i l s a m p l e s i n o c u l a t e d i n d i f f e r e n t m e d i a s u g g e s t t h a t r e l a -t i v e l y s h o r t - t e r m ( 1 8 - h ) responses o f s o i l m i c r o b i a l commu-n i t i e s t o c h a n g e s i n c a r b o n sources are d i s c e r n i b l e w i t h t h eBIOLOG assay. T h i s l e v e l o f r e s o l u t i o n w o u l d a l l o w f o r t h ee x a m i n a t i o n o f c h a n g e s over t i m e ( s u c c e s s i o n ) i n s o i l m i c r o -b i a l c o m m u n i t i e s e x p o s e d t o b o t h n a t u r a l ( r o o t e x u d a t e s )a n d a n t h r o p o g e n i c ( i n d u s t r i a l w a s t e s ) sources o f c a r b o n .T h r e e t y p e s o f s u s p e n d e d a q u a t i c m i c r o b i a l c o m m u n i t i e sw i t h i n an e s t i a r i n e s y s t e m were i d e n t i f i e d : open w a t e r ,m a r s h c r e e k , a n d o c e a n i i n l e t . The o p e n - w a t e r a n d m a r s hc r e e k s i t e s i n c l u d e d s a m p l e s f r o m s p a t i a l l y d i s t i n c t s i t e s .S u c h s p a t i a l h o m o g e n e i t y i s n o t s u r p r i s i n g f o r s u s p e n d e dm i c r o b i a l c o m m u n i t i e s i n a t i d a l l y m i x e d sysfem. I n f a c t ,t i d a l i n f l u x o f ocean water appears t o b e a m a j o r i n f l u e n c e ont h e s t r u c t u r e o f t h e s u s p e n d e d m i c r o b i a l c o m m u n i t y ; t h er e l a t i v e l y s h a l L o w w a t e r s i t e s c l o s e t o t h e ocean i n l e t b u tr e m o v e d f r o m t h e m a r s h ( o p e n c h a n n e l t h r o u g h p e r c h e dm a r s h a n d s w a s h zone b e h i n d a g g r a d i n g s p i t on b a r r i e ri s l a n d ) were s i m i l a r t o t h e o p e n - w a t e r s i t e s . The BIOLOGc o m m u n i t y assay i s r a p i d a n d , i t a p p e a r s , s e n s i t i v e e n o u g ht o c o n d u c t t h e i n t en si ve s a m p l i n g r e q u i r e d t o examine t h em e c h a n i s m s c o u p l i n g sources o f b a c t e r i a l s u b s t r a t e s t od y n a m i c s i n t h e b a c t e r i o p l a n k t o n i c c o m m u n i t y i n a q u a t i cs y s t e m s . Ducklow ( 6 ) s u g g e s t s t h a t t h e c o l l e c t i o n o f waters a m p l e s every 1 5 m i n f o r 5 t o 7 d a y s i n a s h i p a v e r a g i n g 8k n o t s w o u l d b e necessary t o m o n i t o r c h a n g e s e f f e c t i v e l y i nm a r i n e b a c t e r i o p l a n k t o n i c c o m m u n i t i e s . A s i n g l e workerc o u l d use t h e BIOLOG c o m m u n i t y a s s a y a t t h i s r a t e ( 1 m i nt o i n o c u l a t e p l a t e s , 2 t o 3 m i n t o r e a d p l a t e s ) t o p r o d u c ee s t i m a t e s o f c o m m u n i t y s t r u c t u r e and a p p r o x i m a t e o v e r a l l

A - S O I L 2 2* - S O I L 3 5o - S O I L 2 3 AYE

VEVE ~ ~ ~ ~ A Y EE YE yYY S , Y P a, As Y( D Y S 0

.0 Y E , Y S , Y P

V O L . 5 7 , 1 9 9 1


8/9

2 3 5 8 GARLAND AND MILLSd e n s i t y . S i m i l a r l y , i n t e n s i v e s a m p l i n g r e g i m e n s w o u l d b eu s e f u l i n t h e c o n t i n u o u s m o n i t o r i n g o f t h e e f f e c t s o f p o l l u t e de f f l u e n t s on a q u a t i c m i c r o b i a l c o m m u n i t i e s .W h i l e t h e a b i l i t y t o d i s t i n g u i s h among s a m p l e s may b e o fi m p o r t a n c e i n i t s e l f , a n u n d e r s t a n d i n g o f t h e b a s i s f o rc l a s s i f i c a t i o n o f s a m p l e s i s n e c e s s a r y t o u n d e r s t a n d t h ef a c t o r s w h i c h r e g u l a t e m i c r o b i a l c o m m u n i t y s t r u c t u r e . T h eu s e o f f u n c t i o n a l c h a r a c t e r i s t i c s ( i . e . , s o l e - c a r b o n - s o u r c eu t i l i z a t i o n ) g i v e s e c o l o g i c a l m e a n i n g t o c l a s s i f i c a t i o n o fs a m p l e s w i t h t h e BIOLOG c o m m u n i t y - l e v e l a s s a y . S e p a r a -t i o n o f s a m p l e s a l o n g PC a x e s c a n b e d i r e c t l y r e l a t e d t od i f f e r e n c e s i n u t i l i z a t i o n o f s o l e c a r b o n s o u r c e s amongs a m p l e s . D i s c u s s i o n o f t h e p o t e n t i a l c a u s e s f o r t h e d i f f e r -e n c e s i n c a r b o n s o u r c e u t i l i z a t i o n among s a m p l e s o b s e r v e di n t h i s r e s e a r c h i s b e y o n d t h e s c o p e o f t h e p r e s e n t s t u d y , b u ts h o u l d b e o f p r i m a r y i m p o r t a n c e i n s u b s e q u e n t s t u d i e s t h a tu s e t h i s t e c h n i q u e . S e v e r a l a p p r o a c h e s may a i d i n t h ei n t e r p r e t a t i o n o f f u n c t i o n a l d i f f e r e n c e s among c o m m u n i t i e s :( i ) r e p l i c a t i o n o f s t u d i e s t o o b s e r v e r e c u r r i n g p a t t e r n s o fc a r b o n s o u r c e u t i l i z a t i o n , ( i i ) r e d u c t i o n o f t h e n u m b e r o fc a r b o n s o u r c e v a r i a b l e s b y s u m m i n g t h e c o l o r r e s p o n s e s f o rd i f f e r e n t t y p e s o f s u b s t r a t e s ( e . g . , h e x o s e s , p e n t o s e s , a r o -m a t i c s , e t c . ) , ( i i i ) u s e o f c a r b o n s o u r c e s n o t f o u n d i n t h e GNm i c r o p l a t e t o f i t s p e c i f i c r e s e a r c h q u e s t i o n s , a n d ( i v ) r o t a t i o no f a x e s t o m a x i m i z e h i g h c o r r e l a t i o n s a n d m i n i m i z e l o w o n e s( e . g . , v i a t h e v a r i m a x t e c h n i q u e [ 1 6 ] ) .T h e s p e c i f i c m e a n i n g o f d i f f e r e n c e s i n c a r b o n s o u r c eu t i l i z a t i o n i s r e l a t e d t o t h e m e c h a n i s m o f c o l o r d e v e l o p m e n t .T h e c o l o r r e s p o n s e i n a g i v e n w e l l a p p e a r s t o b e r e l a t e d t ot h e n u m b e r o f m i c r o o r g a n i s m s w h i c h a r e a b l e t o u s e t h es u b s t r a t e w i t h i n t h e w e l l a s a s o l e c a r b o n s o u r c e a n d a r ec o n c o m i t a n t l y s t a i n e d w i t h t e t r a z o l i u m v i o l e t . T h i s c o n c l u -s i o n i s b a s e d on m i c r o s c o p i c e x a m i n a t i o n o f c o l o r e d w e l l sa n d on t h e o b s e r v e d c o r r e l a t i o n o f AWCD w i t h i n o c u l u md e n s i t y r a t h e r t h a n a c t i v i t y . T h e n u m b e r o f s t a i n e d c e l l s a t ag i v e n i n c u b a t i o n a p p e a r s t o b e a f u n c t i o n o f t h e n u m b e r o fc e l l s i n t h e o r i g i n a l i n o c u l u m a b l e t o u t i l i z e t h e s u b s t r a t e a sa s o l e c a r b o n s o u r c e a n d t h e g r o w t h o f t h e s e c e l l s d u r i n gi n c u b a t i o n . T h e i m m e d i a t e d e v e l o p m e n t o f c o l o r i n c e r t a i nr e s p o n s e w e l l s ( F i g . 1 ) s u g g e s t s t h a t t h e i n o c u l u m c o n t a i n e da l a r g e f r a c t i o n o f m i c r o o r g a n i s m s a b l e t o u t i l i z e t h e s u b -s t r a t e a n d t h a t s t a i n i n g o f t h e s e c e l l s w a s s u f f i c i e n t t op r o d u c e d e t e c t a b l e c o l o r . T h e l a g p h a s e i n c o l o r d e v e l o p -ment i n o t h e r w e l l s i n d i c a t e s t h a t a l o n g er p e r i o d o f g r o w t hw as n e c e s s a r y t o p r o d u c e a s u f f i c i e n t d e n s i t y o f s t a i n e dc e l l s , r e f l e c t i n g a s m a l l e r p e r c e n t a g e o f m i c r o o r g a n i s m s i nt h e i n o c u l u m a b l e t o u t i l i z e t h e s u b s t r a t e a s a s o l e c a r b o ns o u r c e . D e s p i t e t h e s e s t r o n g s u g g e s t i o n s , we c a n n o t c u r -r e n t l y d i s c o u n t t h e p o s s i b i l i t y t h a t r a p i d c o l o r d e v e l o p m e n tmay b e d u e , i n some c a s e s , t o a f e w c e l l s w i t h h i g h s p e c i f i ca c t i v i t i e s a n d g r o w t h r a t e s o n t h e c a r b o n s o u r c e i n c l u d e d i nan i n d i v i d u a l w e l l .T h e i m p o r t a n c e o f g r o w t h i n d i c a t e s t h a t t h e c o l o r r e -s p o n s e s p r o d u c e d i n t h e BIOLOG c o m m u n i t y a s s a y a r e ar e f l e c t i o n o f f u n c t i o n a l p o t e n t i a l r a t h e r t h a n i n s i t u f u n c t i o n a la b i l i t y . I n a s t r i c t s e n s e , t h e r o l e o f g r o w t h a l s o s u g g e s t s t h a tt h e a s s a y i s a c u l t u r a l m e t h o d ( i . e . , i t r e q u i r e s t h e g r o w t h o fm i c r o o r g a n i s m s o n m e d i a ) . T h i s m e t h o d , h o w e v e r , d o e s n o tc o n t a i n t h e b i a s a s s o c i a t e d w i t h i s o l a t e - b a s e d m e t h o d s b e -cause f u n c t i o n a l t e s t s a r e p e r f o r m e d o n t h e o r i g i n a l commu-n i t y r a t h e r t h a n o n some s ub se t o f t h e c o m m u n i t y .G i v e n t h e c o r r e l a t i o n b e t w e e n i n o c u l u m d e n s i t y a n dAWCD, a m o n g - s a m p l e c o m p a r i s o n s o f t h e c o l o r p r o d u c t i o ni n a g i v e n w e l l a r e d e p e n d e n t o n b o t h t h e d e n s i t y a n d t h ec o m p o s i t i o n o f t h e i n o c u l u m . A s a m p l e w i t h a g r e a t e rd e n s i t y o f m i c r o o r g a n i s m s w o u l d p r o d u c e a d i f f e r e n t p a t t e r n

o f c o l o r r e s p o n s e d a t a t h a n a s a m p l e o f i d e n t i c a l c o m p o s i t i o nb u t l o w e r d e n s i t y o f m i c r o o r g a n i s m s f o r s i m i l a r i n c u b a t i o nt i m e s . D i f f e r e n c e s c a u s e d b y d e n s i t y may b e o f i n t e r e s twhen c o m p a r i n g s a m p l e s o n a u n i t b a s i s ( e . g . , d i f f e r e n c e sb e t w e e n r e s p o n se p e r m i l l i l i t e r o f w a t e r o r m i l l i g r a m s o i l ) .H o w e v e r , t h e i n f l u e n c e o f d e n s i t y i s a c o n f o u n d i n g f a c t o rw h e n t h e r e s e a r c h q u e s t i o n s t h e r e l a t i v e c o m p o s i t i o n o fc o m m u n i t i e s o r c o m p a r i s o n o f s a m p l e s f r o m d i f f e r e n t h a b i -t a t s .S e v e r a l m e t h o d s may b e u s e d t o o v e r c o m e t h i s p o t e n t i a li n f l u e n c e o f i n o c u l u m d e n s i t y o n c o l o r r e s p o n s e d a t a : ( i )d i l u t i o n o r c o n c e n t r a t i o n o f s a m p l e s t o a c h i e v e e q u i v a l e n ti n o c u l u m d e n s i t i e s , ( i i ) u s e o f m u l t i p l e r e a d i n g s o v e r a t i m ec o u r s e o f i n c u b a t i o n , o r ( i i i ) t r a n s f o r m a t i o n o f t h e d a t a t oa c c o u n t f o r d i f f e r e n t i n o c u l u m d e n s i t i e s . T h e l a s t m e t h o dn o r m a l i z e d t h e r a w c o l o r r e s p o n s e d a t a t o t h e AWCD a n dg r e a t l y r e d u c e d t h e c o r r e l a t i o n o f PC s c o r e s t o t h e o v e r a l lr a t e o f c o l o r d e v e l o p m e n t . I n o c u l u m d e n s i t y may s t i l l i n f l u -e n c e t h e s t r u c t u r e o f t r a n s f o r m e d d a t a s e t s , a s i n d i c a t e d b yt h e h i g h c o r r e l a t i o n b e t w e e n AWCD a n d t h e s e c o n d PCp r o d u c ed f r o m PCA o f t h e s o i l s a m p l e s . W h i l e t h e c o r r e l a -t i o n d o e s n o t n e c e s s a r i l y r e f l e c t c a u s a t i o n , i t i n d i c a t e s t h a tt h e s t r u c t u r e i n t h e d a t a s e t e x t r a c t e d b y P CA may r e f l e c td i f f e r e n c e s i n t h e r a t e o f c o l o r p r o d u c t i o n . T h e n o n l i n e a rn a t u r e o f c o l o r p r o du ct i o n c o mp l i c a t e s a t t e m p t s t o u s e as i n g l e p l a t e r e a d i n g t o c o m p a r e m u l t i p l e s a m p l e s o f d i f f e r e n td e n s i t i e s . F o r o p t i m a l c h a r a c t e r i z a t i o n o f e n v i r o n m e n t a ls a m p l e s u s i n g t h i s m e t h o d , s a m p l e s o f a p p r o x i m a t e l y e q u i v -a l e n t d e n s i t y s h o u l d b e u s e d a n d c o l o r p r o d u c t i o n s h o u l d b ec l o s e l y m o n i t o r e d . O u r r e s e a r c h h a s i n d i c a t e d t h a t t h e m o s te f f i c i e n t m e t h o d o l o g y i n v o l v e s t w o p l a t e r e a d i n g s : a n i n i t i a lr e a d i n g u p o n c o l o r d e v e l o p m e n t u s e d f o r t h e c a l c u l a t i o n o fAWCD a s a n i n d i c a t o r o f m i c r o b i a l d e n s i t y a n d a s u b s e q u e n tr e a d i n g 1 2 t o 2 4 h l a t e r u s e d f o r m u l t i v a r i a t e a n a l y s i s . Whenm o r e i n t e n s i v e s a m p l i n g i s f e a s i b l e , a t i m e c o u r s e o f c o l o rd e v e l o p m e n t c o u l d b e p r o d u c e d f o r e a c h w e l l . T h i s a p -p r o a ch , w h i l e t i m e - c o n s u m i n g a n d d a t a i n t e n s i v e , w o u l da l l o w f o r t h e p r e c i s e d e f i n i t i o n o f , i n e f f e c t , 9 5 s e p a r a t eg r o w t h c u r v e s f o r e a c h s a m p l e .T h e s t r u c t u r e i n t h e t r a n s f o r m e d d a t a s e t m o r e l i k e l yr e f l e c t s d i f f e r e n c e s among s a m p l e s i n t h e f r a c t i o n , r a t h e rt h a n a b s o l u t e d e n s i ty o f m i c r o o r g a n i s m s i n t h e i n o c u l u ma b l e t o u t i l i z e s u b s t r a t e s a s s o l e c a r b o n s o u r c e s . I n t h i s w a y ,t h e t r a n s f o r m e d d a t a s e t r e f l e c t s t h e e v e n n e s s i n d i s t r i b u t i o no f f u n c t i o n a l a b i l i t i e s w i t h i n t h e c o m m u n i t y . An i n d e x o ff u n c t i o n a l e v e n n e s s s i m i l a r t o t h a t o f T r o u s s e l l i e r a n d L e g -e n d r e ( 2 3 ) c o u l d b e c a l c u l a t e d f r o m t h e c o l o r r e s p o n s e d a t a .We b e l i e v e t h a t t h e a p p r o a c h u t i l i z e d i n t h i s s t u d y , w h i c he m p h a s i z e s d i f f e r e n c e s among s a m p l e s i n s p e c i f i c f u n c t i o n a lt e s t s r a t h e r t h a n a g e n e r a l i n d e x o f f u n c t i o n a l e v e n n e s s ,m a x i m i z e s ( i ) t h e r e s o l v i n g p o w e r o f t h e a s s a y a n d ( i i ) t h ei d e n t i f i c a t i o n o f e c o l o g i c a l l y r e l e v a n t d i f f e r e n c e s amongc o m m u n i t i e s . H o w e v e r , e v a l u a t i o n o f a n o v e r a l l i n d e x o ff u n c t i o n a l e v e n n e s s may b e u s e f u l f o r c e r t a i n r e s e a r c hq u e s t i o n s .Q u a nt i t a ti ve s co r es o f c o l o r r e s p o n s e p r o d u c e d f r o md i g i t i z e d i m a g e s w e r e c o n s i d e r e d s u p e r i o r t o q u a l i t a t i v es c o r e s ( p r e s e n c e o r a b s e n c e o f c o l o r ) f o r t h e r e s o l u t i o n o fc o m mu n i t i e s d u e t o o u r i n i t i a l o b s e r v a t i o n o f c o l o r p r o d u c -t i o n i n a l m o s t a l l w e l l s w i t h i n cu b at i o n o f m o s t e n v i r o n m e n -t a l s a m p l e s . A l t e r n a t i v e a p p r o a c h e s may b e f e a s i b l e f o rr e s e a r c h e r s w i t h o u t a c c e s s t o m i c r o p l a t e r e a d e r s t h a t w i l lg e n e r a t e c o l o r v a l u e s . S a m p l e s c o u l d b e c l a s s i f i e d o n t h eb a s i s o f d o m i n a n t f u n c t i o n a l t e s t s ( e . g . , t h e f i r s t 2 0 o r 3 0w e l l s t o s h o w t h e p r e s e n c e o f c o l o r ) . W h i l e t h e r e s o l v i n gp o w e r o f t h e m e t h o d m i g h t b e e x p e ct e d t o d e c l i n e w i t h t h e



9/9

CLASSIFICATION O F MICROBIAL C O M MUN I T I ES 2 3 5 9us e o f a r e d u c e d n u m b e r o f b i n a r y t e s t scores, s e v e r a lw o r k e r s h a v e f o u n d t h a t a l i m i t e d number ( 2 0 t o 3 0 ) o f t e s t swere s u f f i c i e n t t o d e s c r i b e t h e d i v e r s i t y o f m i c r o b i a l com-m u n i t i e s u s i n g t h e n u m e r i c a l t a x o n o m i c a p p r o a c h ( 3 , 1 5 ) .S i n c e m i c r o b i a l c o m m u n i t i e s may b e d o m i n a t e d b y o n l y af e w t y p e s o f i n d i v i d u a l s ( 1 2 ) , e v a l u a t i o n o f d o m i n a n t f u n c -t i o n a l c h a r a c t e r i s t i c s may b e s u f f i c i e n t t o c l a s s i f y a n d c h a r -a c t e r i z e m i c r o b i a l c o m m u n i t y s t r u c t u r e . F u r t h e r m o r e , b ye m p h a s i z i n g w e l l s w i t h v ery r a p i d c o l o r p r o d u c t i o n , c l a s s i -f i c a t i o n s b a s e d on d o m i n a n t f u n c t i o n a l c h a r a c t e r i s t i c s morea c c u r a t e l y r e p r e s e n t i n s i t u f u n c t i o n a l a b i l i t i e s c o m p a r e dw i t h c l a s s i f i c a t i o n s d e s c r i b e d a b o v e .T h e r e s u l t s o f t h i s r e s e a r c h i n d i c a t e t h a t t h e d i r e c t i n c u -b a t i o n o f e nv i r o n m en t al s a m p l e s i n BIOLOG p l a t e s pro-d u c e s p a t t e r n s o f m e t a b o l i c response u s e f u l i n t h e c l a s s i f i -c a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f m i c r o b i a l c o m m u n i t i e s . T h ea b i l i t y t o r a p i d l y v i s u a l i z e c o m m u n i t y s t r u c t u r e as a com-p o s i t e o f f u n c t i o n a l a b i l i t i e s ( o r p o t e n t i a l s ) e n a b l e s b o t h t h ei n t e n s i v e c o m p a r i s o n o f m i c r o b i a l c o m m u n i t i e s across aw i d e range o f s p a t i a l a n d t e m p o r a l s c a l e s a n d t h e i d e n t i f i c a -t i o n o f e c o l o g i c a l l y r e l e v a n t f u n c t i o n a l d i f f e r e n c e s amongc o m m u n i t i e s . W i d e s p r e a d us e o f t h i s t e c h n i q u e s h o u l d pro-v i d e a more r o b u s t a n d e c o l o g i c a l l y r e l e v a n t c l a s s i f i c a t i o n o fh e t er o t r o p h i c m i cr o b i a l c o m m u n i t i e s t h a n p r e s e n t l y e x i s t s .

ACKNOWLEDGMENTSWe are i n d e b t e d t o P a t t y M c C l e l l a n d f o r p r o c e s s i n g many o f t h e s es a m p l e s a n d t o J o h n P o r t e r a n d J o h n W e i s h e m p e l f o r a s s i s t i n g w i t h

i m a g e processing.T h is r e se a rc h was s u p p o r t e d b y g r a n t B O I - 1 3 4 - 8 0 6 - 5 - 2 f r o m t h eNASA-Kennedy S p a c e C e n t e r B i o me d i c al O f f i c e a n d a F r e d H .Moore R e se a r c h F e l l o w sh i p f r o m t h e D e p a r t m e n t o f E n v i r o n m e n t a lS c i e n c e s a t t h e U n i v e r s i t y o f V i r g i n i a . S u p p o r t f o r t h e c o l l e c t i o n a n dp r o c e s s i n g o f t h e e s t u a r i n e s a m p l e s was p r o v i d e d b y N a t i o n a lS c i e n c e F o u n d a t i o n g r a n t B R S 8 7 - 0 2 3 3 3 - 0 4 t o t h e V i r gi ni a C o a s tR e s e r v e Long Term E c o l o g i c a l R e s e a r c h P r o g r a m .REFERENCES

1 . A t l a s , R . M. 1 9 8 4 . D i v e r s i t y o f m i c r o b i a l c o m m u n i t i e s . A d v .M i c r o b . E c o l . 7 : 1 - 4 7 .2 . B e l l , C . R . , M. A . H o l d e r - F r a n k l i n , a n d M. F r a n k l i n . 1 9 8 2 .C o r r e l a t i o n s b e t w e e n p r e d o m i n a n t h e t e r o t r o p h i c a n d p h y s i o -c h e m i c a l w a t e r q u a l i t y f a c t o r s i n t wo C a n a d i a n r i v e r s . A p p l .E n v i r o n . M i c r o b i o l . 4 3 : 2 6 9 - 2 8 3 .3 . B i a n c h i , M. A . , a n d A . J . B i a n c h i . 1 9 8 2 . S t a t i s t i c a l s a m p l i n g o fb a c t e r i a l s t r a i n s a n d i t s us e i n b a c t e r i a l d i v e r s i t y measurement.M i c r o b . E co l . 8 : 6 1 - 6 9 .4 . B o c h n e r , B . 1 9 8 9 . B r e a t h p r i n t s a t t h e m i c r o b i a l l e v e l . ASMNews 5 5 : 5 3 6 - 5 3 9 .5 . D e m a z a s , D . H . , a n d P . J . B o t t o m l e y . 1 9 8 6 . A u t e c o l o g y i nr h i z o s p h e r e a n d n o d u l a t i n g b e h a v i o r o f i n d i g e n o u s R h i z o b i u mt r i f o l i i . A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i o l . 5 2 : 1 0 1 4 - 1 0 1 9 .6 . D u c k l o w , H . W. 1 9 8 4 . G e o g r a p h i c a l e c o l o g y o f m a r i n e b a c t e r i a :p h y s i c a l a n d b i o l o g i c a l v a r i a b i l i t y a t t h e m e s o s c a l e , p . 2 2 - 3 1 . I nM. J . K l u g a n d C . A . R e d d y ( e d . ) , C u r r e n t p e r s p e c t i v e s i nm i c r o b i a l e c o l o g y . A m e r i c a n S o c i e t y f o r M i c r o b i o l o g y , Wash-i n g t o n , D . C .7 . F e d e r l e , T . W . , M. A . H u l i a r , R . J . L i v i n g s t o n , D . A . M e e t e r ,a n d D . C . W h i t e . 1 9 8 3 . S p a t i a l d i s t r i b u t i o n o f b i o c h e m i c a l

p a r a m e t e r s i n d i c a t i n g b i o m a s s a n d c o m m u n i t y c o m p o s i t i o n o fm i c r o b i a l a s s e m b l i e s i n e s t u a r i n e mud f l a t s e d i m e n t s . A p p i .E n v i r o n . M i c r o b i o l . 4 5 : 5 5 - 6 3 .8 . F i n d l a y , R . H . , a n d D . C . W h i t e . 1 9 8 3 . T h e e f f e c t s o f f e e d i n g b yt h e s a n d d o l l a r M e l l i t a q u i n q u i e s p e r f o r a t a ( L e s k ) o n t h e b e n t h i cm i c r o b i a l c o m m u n i t y . J . E x p . M a r . B i o l . E c o l . 7 2 : 2 5 - 4 1 .9 . H o b b i e , J . E . , R . J . D a l e y , a n d S . J a s p e r . 1 9 7 7 . U s e o fN u c l e p o r e f i l t e r s f o r c o u n t i n g b a c t e r i a f o r f l u o r e s c e n t m i c r o s -c o p y . A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i o l . 3 3 : 1 2 2 5 - 1 2 2 8 .1 0 . H u n g a t e , R . E . 1 9 7 5 . T h e r u m e n m i c r o b i a l e c o s y s t e m . A n n u .R e v . M i c r o b i o l . 2 9 : 3 9 - 6 6 .1 1 . K a n e k o , T . , R . M. A t l a s , a n d M. K r i c h e v s k y . 1 9 7 7 . D i v e r s i t y o fb a c t e r i a l p o p u l a t i o n s i n t h e B e a u f o r t S e a . N a t u r e ( L o n d o n )2 7 0 : 5 9 6 - 5 9 9 .1 2 . L a m b e r t , B . , P . M e i r e , H . J o o s , P . L e n s , a n d J . S w i n g s . 1 9 9 0 .F a s t - g r o w i n g , a e r o b i c , h e t e r o t r o p h i c b a c t e r i a f r o m t h e r h i z o -s p h er e o f y o u n g s u g a r b e e t p l a n t s . A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i o l .5 6 : 3 3 7 5 - 3 3 8 1 .1 3 . M a l l o r y , L . M . , a n d G . S . S a y l o r . 1 9 8 4 . A p p l i c a t i o n o f FAME( f a t t y a c i d m e t h y l e s t e r ) a n a l y s i s i n t h e n u m e r i c a l t a x o n o m i cd et e rm i na t io n o f b a c t e r i a l g u i l d s t r u c t u r e . M i c r o b . E c o l . 1 0 :2 8 3 - 2 9 6 .1 4 . M a r g u l i s , L . , D . C h a s e , a n d R . G u e r r e r o . 1 9 8 6 . M i c r o b i a lc o m m u n i t i e s . B i o S c i e n c e 3 6 : 1 6 0 - 1 7 0 .1 5 . M i l l s , A . L . , a n d R . A . W a s s e l . 1 9 8 0 . A s p e c t s o f d i v e r s i t ym e a s u r e m e n t o f m i c r o b i a l c o m m u n i t i e s . A p p l . E n v i r o n . M i c r o -b i o l . 4 0 : 5 7 8 - 5 8 6 .1 6 . P i e l o u , E . C . 1 9 8 4 . T h e i n t e r p r e t a t i o n o f e c o l o g i c a l d a t a . J o h nW i l e y & S o n s , I n c . , N ew Y o r k .1 7 . R o s s w a l l , T . , a n d E . K v i l l n e r . 1 9 7 8 . P r i n c i p a l c o m p o n e n t s a n df a c t o r a n a l y s i s f o r t h e d e s c r i p t i o n o f m i c r o b i a l p o p u l a t i o n s .A d v . M i c r o b . E c o l . 2 : 1 - 4 8 .1 8 . S m i t h , G . A . , J . S . N i c k e l s , W. M. D a v i s , R . F . M a r t x , R . H .F i n d l a y , a n d D . C . W h i t e . 1 9 8 2 . P e r t u r b a t i o n s o f t h e b i o m a s s ,m e t a b o l i c a c t i v i t y , a n d c o m m u n i t y s t r u c t u r e o f t h e e s t u a r i n ed e t r i t a l m i cr o b i o ta : r e s o u r c e p a r t i t i o n i n g b y a m p h i p o d g r a z i n g .J . E x p . M a r . B i o l . E co l . 6 4 : 1 2 5- 1 4 3 .1 9 . S n e a t h , P . H . A . , a n d R . R . S o k a l . 1 9 7 3 . N u m e r i c a l taxonomy-t h e p r i n c i p l e s a n d p r a c t i c e s o f n u m e r i c a l c l a s s i f i c a t i o n . W. H .F r e e m a n & C o . , S a n F r a n c i s c o .2 0 . S o t o , G . , a n d L . K . B l u m . 1 9 9 0 . G e o g r a p h i c a l d i s t r i b u t i o n a n de n v i r o n m e n t a l i n t e r a c t i o n s t h a t a f f e c t t h e a b u n d a n c e o f R h i z o -b i u m l e g u m i n o s a r u m b i o v a r p h a s e o l i i n C o s t a R i c a , p . 4 3 4 . I nP . G r e s s h o f t , L . E . R o t h , G . S t a c e y , a n d W. E . Newton ( e d . ) ,N i t r o g e n f i x a t i o n : a c h i e v e m e n t s a n d o b j e c t i v e s . P r o c e e d i n g s o ft h e 8 t h I n t e r n a t i o n a l C o ng r es s o n N i t r o ge n F i x a t i o n . C h a p m a na n d H a l l , N ew Y o r k .2 1 . S t a l e y , J . T . 1 9 8 0 . D i v e r s i t y o f a q u a t i c h e t e r o t r o p h i c b a c t e r i a lc o m m u n i t i e s , p . 3 2 1 - 3 2 2 . I n D . S c h l e s s i n g e r ( e d . ) , M i c r o b i o l -o g y - 1 9 8 0 . A m e r i c a n S o c i e t y f o r M i c r o b i o l o g y , W a s h i n g t o n ,D . C .2 2 . T r o u s s e i l i e r , M . , a n d P . L e g e n d r e . 1 9 8 1 . A f u n c t i o n a l e v e n n e s si n d e x . M i c r o b . E c o l . 7 : 2 8 3 - 2 9 6 .2 3 . W a s s e l l , R . A . , a n d A . L . M i l l s . 1 9 8 3 . C h a n g e s i n w a t e r a n ds e d i m e n t b a c t e r i a l c o m m u n i t y s t r u c t u r e i n a l a k e r e c e i v i n g a c i dm i n e d r a i n a g e . M i c r o b . E c o l . 9 : 1 5 5 - 1 6 9 .2 4 . W h i t e , D . C . , a n d R . H . F i n d l a y . 1 9 8 8 . B i o c h e m i c a l m a r k e r s f o rm e a s u r e m e n t o f p r e d a t i o n e f f e c t s o n t h e b i o m a s s , c o m m u n i t ys t r u c t u r e , n u t r i t i o n a l s t a t u s , a n d m e t a b o l i c a c t i v i t y o f m i c r o b i a lb i o f i l m s . H y d r o b i o l o g i a 1 5 9 : 1 1 9 - 1 3 2 .2 5 . W i l l i a m s , P . J . L . , a n d C . A s k e w . 1 9 6 8 . A m e t h o d o f m e a s u r i n gt h e m i n e r a l i z a t i o n b y m i c r o o r g a n i s m s o f o r g a n i c c o m p o u n d s i ns e a w a t e r . D e e p S e a R e s . 1 5 : 3 6 5 - 3 7 5 .

VOL. 5 7 , 1 9 9 1

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