Citometria de Flux

CITOMETRIA DE FLUX

CE ESTE CITOMETRIA DE FLUX?Metod de msurare a caracteristicilor fizice i/sau biochimice ale particulelor (celule, nuclei, organite celulare):MrimeaGranularitateaCantitatea de ADNAntigene de suprafa

Metod de sortare a celulelor

ETAPEPrepararea suspensiei de celule

Marcarea celulelor

Achiziia datelor

Stocarea datelor

Interpretarea datelor

PRODUCEREA ANTICORPILOR MONOCLONALIPlasmocite producatoare de AcAntigenFuzionarea celulelor HIBRIDOMMielomAnticorpii monoclonali sunt purificatiClonele dorite se cultiva sau se congeleazaTestarea clonelorHibridoamele se separa si se cultivaCultivarea hibridoamelorMentinerea hibridoamelor in soareci

FLUOROCROMIIAcM sunt conjugai cu fluorocromiSpectru de absorbie (excitaie)Spectru de emisiePentru 2 parametri 2 AcM cuplai cu 2 fluorocromi cu spectre de emisie diferite:Izotiocianat de fluorescein (FITC)Phycoeritrin (PE)

IMUNOFLUORESCENA101104103102Intensitatea fluoresceneiNumar de evenimente

COMPONENTELE CITOMETRULUI DE FLUXSistem fluidic

Sistem optic

Sistem electronic

SISTEMUL FLUIDICCelule aflate n suspensie:SngeLichid sinovialLCRGanglioni limfaticiTumori solideLichid de nveli Curent intern unicelular ir indianIntersectare cu un fascicul de lumin

SISTEMUL FLUIDICLichid denveliCamer descurgereFluxlaminar

SISTEMUL OPTIC DE EXCITAIESursa laser (Ar =488 nm)Fascicul luminos dispersie i stimularea fluorocromilorDispersia luminii:=0 Forward Scatter (FS) dimensiunea=90 Side Scatter (SS) granularitateaEmisia luminii fluorescente:~ cantitatea de fluorocromi info calitative i cantitativeElemente optice de focalizare (lentile)

FS I SS

SISTEMUL OPTIC DE COLECTAREConversie semnal optic semnal electronic

Detectori pentru:Lumina dispersat: n fa, lateralEmisia de fluorescenFiltre optice

CITOMETRUL DE FLUX

SISTEMUL ELECTRONICRecepionarea impulsurilor detectorilorPrelucrarea semnaluluiPrezentarea rezultatelor: Histograme 1 parametruGrafice 2 parametri: 1 punct = 1 particul (dot-plot)

ELEMENTE FIGURATE

GRAFIC DOT-PLOT PENTRUFITC I PEFITC FLPE FLFITC- / PE-FITC+PE+FITC+ / PE+

FITC / PE

SORTAREA CELULELORSepararea unei (sub)populaii celulare dintr-un amestec:MrimeGranularitateAntigene de suprafa

SORTAREA CELULELOR - ETAPEIdentificarea criteriuluiMarcarea cu AcM+fluorocromiIdentificarea celulei e de interes?ncrcare cu sarcini pozitive/negative/frCmp magnetic deflectare spre tuburi colectoareCentrifugare

SORTAREA CELULELORLASER 488 nm-Plci ncrcatemagneticTuburi de colectareSenzor FSDetector de fluorescen+--

APLICAIIAnaliza subpopulaiilor limfocitareDiagnosticul hemopatiilor maligneBiologie celularIdentificarea unor molecule HLADeterminarea unor autoanticorpiStudiul ciclului i al funciilor celulareDiagnosticul, evoluia, prognosticul tumorilor maligne solideMicrobiologie

ANALIZA ADNG2MG0G1s0 200 400 600 8001000sCantitatea de ADNEvenimente

ANALIZA ADN0 200 400 600 8001000Fluorescen PE2N4NEvenimente

ANALIZA ADN0 200 400 600 8001000Fluorescen PEPeak aneuploidEvenimente