Citometría de Flujo Principios y Aplicaciones Prof. Edwin Escobar [email protected] Universidad Central de Venezuela Facultad de Medicina Escuela de Medicina “José María Vargas” Cátedra de Inmunología 2017
Citometría de FlujoPrincipios y Aplicaciones
Prof. Edwin [email protected]
Universidad Central de Venezuela
Facultad de Medicina
Escuela de Medicina “José María Vargas”
Cátedra de Inmunología
2017
Esquema General
• Principios Generales de la Citometría de Flujo– Citómetro de Flujo
– Fluorescencia / Fluorocromos
– Anticuerpos Monoclonales
– Señales / Datos Generados
– Análisis
• Aplicaciones en Medicina– Inmunofenotipaje
– Sistema de Complemento
– Diagnóstico de Inmunodeficiencias
– Procesos Celulares Dinámicos
PRINCIPIOS GENERALESCitómetro de Flujo
CITOMETRÍA DE FLUJO
http://bcrf2.ucsd.edu
Citometría de Flujo• Metodología que permite analizar células (u otras
partículas: 0.2-50 µm) que se encuentran en un fluido, en base a sus características de dispersión de luz y fluorescencia, al interaccionar una a una con un rayo láser.
Enfoque Hidrodinámico
Fluido deArrastre
Flujo Laminar(Partículas avanzan una a una)
Canal Central(Muestra en Estudio)
http://www.abdserotec.com/flow-cytometry
Dispersión del Rayo de Luz
• Dispersión Frontal (FSC, forward scatter)
– Es una medida del tamaño de la célula o partícula evaluada
• Dispersión Lateral (SSC, side scatter)
– Es una medida de la granularidad y/o complejidad interna de la célula o partícula evaluada
SSC
FSC
http://www.bdbiosciences.com
Láser(Fuente de Luz) Dispersión Frontal
Dispersión Lateral
Célula
FSC
m
Población de LeucocitosSangre Periférica
Granulocitos
Linfocitos
Monocitos
Monocito
Laser(Fuente de
Luz)
SSC
FSC
Dispersión del Rayo de Luz
http://www.bdbiosciences.com
Dreamstime.com
PRINCIPIOS GENERALESFluorocromos y Fluorescencia
CITOMETRÍA DE FLUJO
http://www.abdserotec.com/flow-cytometry
Eexcitación(Energía de Excitación)
Eemisión(Energía de Emisión)
Estado Basal
Absorción
de LuzEmisión
de Luz
Liberación
de CalorEstado de Singlete
Excitado
Estado de Singlete
Relajado
Excitación(Longitud de onda 1)
Emisión(Longitud de onda 2)
nm
Fluorocromos
• Moléculas capaces de absorber energía (excitarse) a una determinada longitud de onda y emitir esa energía, en forma de fotones, a una longitud de onda mayor
FITC (Isotiocianato de Fluoresceína)
Máxima
Emisión
525 nm
Emisión
FuerteVerde
Emisión
DébilAnaranjado
Espectro de Emisión
490 nm
Máxima
Absorción
Laser de Argón488 nm
Luz Azul
Longitud de
Onda (nm)
Espectro
Espectro de Absorción
http://www.abdserotec.com/flow-cytometry
FluorocromosEspectros de Absorción y Emisión de Fotones
Láser de Argón488 nm
Isotiocianato de Fluoresceína
FITC
Ficoeritrina
PE
Ficoeritrina-Cy5
PE-Cy5
Compensación
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Longitud de Onda (nm)
La compensación se refiere a la
corrección matemática de la
señal de fluorescencia detectada
en un canal determinado,
“restando” el porcentaje de señal
introducido (solapado) por otro
fluorocromo
Longitud de Onda (nm)
12% 5%
PRINCIPIOS GENERALESAnticuerpos Monoclonales
CITOMETRÍA DE FLUJO
Epitopos
Anticuerpos Monoclonales
CélulasPlasmáticas
CélulasEsplénicas
Células deMieloma
+Hibridación
Hibridomas
Separación de
Clones
AnticuerposMonoclones
Kohler & Milstein, 1975
Conjugar
Ac. Monoclonal+
Fluorocromo
Inmunología de Kuby
PRINCIPIOS GENERALESAnálisis de Datos
CITOMETRÍA DE FLUJO
Procesamiento de Señales
http://www.abdserotec.com/flow-cytometry
Pantallade
Computadora
Rayos Laser
Lentes
Sistema deFluidos
Detectores
Filtros
Detector
Filtros
Fluorescencia 1
Fluorescencia 2
Fluorescencia 3
Fluorescencia 4
Dispersión Lateral(Complejidad)
Dispersión Frontal(Tamaño)
Fluorescencia
FL1 – FL4
Dispersióndel Rayo de Luz
FSC / SSC
Análisis de DatosSelección de Regiones
Histograma
CD3Intensidad de Fluorescencia (FL1 Log)
Análisis de DatosIntensidad de Fluorescencia
72%
Células Positivas para FL-1 (CD3)
Linfocitos T
Análisis de Datos
Intensidad de FluorescenciaGráficos de Intensidad (Intensity Plot): Dos Parámetros
CD4 Vs. CD3
CD8 Vs. CD3
Subpoblaciones de Linfocitos T
Porcentaje (%)
Recuento (Cél./µL)
Valores de Referencia
Leucocitos 7.400 4.100 – 10.900
Linfocitos Totales 25 1.850 2.200 – 4.200
Linfocitos T Totales 72 1.332 1.500 – 3.000
Linfocitos T CD4+ 12 222 800 – 1.900
Linfocitos T CD8+ 57 1.055 500 – 1.000
Relación CD4/CD8 0.21 1.5 – 2.4
IL-2
IFN
-γ
Vírgenes Memoria
CD45RO
CD
8
Linfocitos T CD8+Histograma
CD3Intensidad de Fluorescencia (FL1 Log)
Análisis de Datos
Selección de Regiones (“Gating”)
Linfocitos
Linfocitos T(CD3+)
CD4
CD
8CD45RO
CD
4
Linfocitos T CD4+
IL-2
Vírgenes Memoria
APLICACIONESInmunofenotipos
CITOMETRÍA DE FLUJO
Hematopoyesis
Célula Madre
Hematopoyética
Progenitor Mieloide Común Progenitor Linfoide Común
GM-CFU
Linfocito
Pre-BLinfocito
Pre-T
Linfocito
Pre-NK
Granulocitos
Monocitos
Eosinófilos
Neutrófilos
Basófilos
Monocitos
Glóbulos Blancos
Células HematopoyéticasMarcadores de Linaje
CD19 ++
CD20 ++
CD22 ++
HLA-Dr ++
CD79 α, β ++
CD2 ++
CD3 ++
CD7 ++
CD4 +++
CD8 +++
CD16 ++
CD56 ++
CD3 –
CD4 +
CD11b +
CD11c +
CD14 ++
HLA-Dr ++
CD41 ++
CD61 ++
Glicoforina A ++
CD36 ++
CD45 – (ó Débil)
CD45
Débil
CD34 ++
CD13 +++
CD15 +++
CD33 +++
MPO +++
Linfocitos B
Linfocitos T Células Citotóxicas Naturales
(NK)
Células Madre
(Stem Cells)
Granulocitos
Monocitos
Plaquetas
Eritrocitos
Célula
Madre
Gen de Ig
Sin Reordenar
Pre-BCRµ+
Cadena
Liviana
Sustituta
Linfocito
Pre-B
Cad. Pesada µPre-BCR
IgM
Linfocito B
Inmaduro
IgM
IgM
IgD
Linfocito B
Maduro
IgM e IgD
Linfocito B
Activado
Expansión Clonal
Cambio de Isotipo
Mad. de Afinidad
Célula
Plasmática
Ig Secretadas
Gran Producción
CD45 Débil
CD34
CD45
CD34 Débil
CD10
CD19
Igα-Igβ
TdT
RAG1, RAG2
CD45
CD10 Débil
CD19
CD20 Débil
Igα-Igβ
CD45
CD19
CD20
Igα-Igβ
CD45
CD19
CD20
CD38
Igα-Igβ
CD45 Débil
CD38
CD56
CD138
Citometría de Flujo
Inmunofenotipo
Ontogenia del Linfocito B
Inmunología Celular y Molecular - Abbas
InmunofenotiposDiagnóstico de Neoplasias Hematológicas
Célula
Madre
Pre-BCRµ+
Cadena
Liviana
Sustituta
Linfocito
Pre-B
IgM
Linfocito B
Inmaduro
IgM
IgD
Linfocito B
Maduro
Linfocito B
ActivadoCélula
Plasmática
Leucemias Linfomas Mieloma
Dependiendo del estadío de maduración ontogénica en que se encuentre una célula que
sufra una transformación neoplásica, el cuadro resultante será distinto
Inmunología Celular y Molecular - Abbas
Diagnóstico Hemato-oncológico
LLA Común
SS
C
HL
A-D
R-F
ITC
CD
10
-FIT
C
CD
79
α-P
E
FSC CD19-PerCPCD22-PE
SS
C
CD34-PE TdT-FITC
Blood 2008;111(8):3941-3967
Linfoma del Manto
APLICACIONESSistema del Complemento
CITOMETRÍA DE FLUJO
Proteínas Reguladoras del Complemento
C3bBb
Convertasa
de C5
CAMComplejo de Ataque a
Membrana
CD55 (DAF)
C4BP, CR1, Factor H
Disociación de
Convertasa de C3
C4b2a
Vía Clásica
Vía de lasLectinas
VíaAlterna
Convertasas
de C3
C5b67
C8
C5b678
C5b678
C9
Poli-C9
CAMComplejo de Ataque a Membrana
CD59(Protectina)
Regulación: Convertasa de C3
Regulación:
Complejo de Ataque a Membrana
X
X
Inmunología de Kuby
III
III
CD59-FITC
8%54% 38%
Hemoglobinuria Paroxística Nocturna
Blood 2005;106:3699-3709
Defecto en la expresión de CD55 y CD59 (dos proteínas reguladoras del
Complemento), asociado con hemolisis importante y trombosis
Evaluación de Eritrocitos
FSC FSC CD59-FITC
I
II
III
Paciente (HPN)
CD235a es una molécula expresada en eritrocitos
CD24-PE
Paciente 3HPN Clásica
98.8%
Evaluación de Granulocitos
FSCSSC
Hemoglobinuria Paroxística Nocturna
Blood 2005;106:3699-3709
La causa es un defecto genético que afecta a las proteínas que se unen a la
membrana celular a través de puentes con GPI (Glucofosfatidilinositol)
CD24-PE
Paciente 2Anemia Aplásica
8.7%
CD24-PE
Paciente 1Anemia Aplásica
0.18%
Granulocitos
Normales
Defectos en
la expresión
Eosinófilos
CD16 y CD24 se anclan a la membrana de PMN por puentes de GPI
CD15 se expresa en Granulocitos
APLICACIONESDiagnóstico de Inmunodeficiencias
CITOMETRÍA DE FLUJO
Citometría de Flujo
Diagnóstico de Inmunodeficiencias Primarias
Célula
Madre
Pre-BCRµ+
Cadena
Liviana
Sustituta
Linfocito
Pre-B
IgM
Linfocito B
Inmaduro
IgM
IgD
Linfocito B
Maduro
Linfocito B
ActivadoCélula
Plasmática
Tirosinquinasa
de Bruton (Btk)
Requerida para reordenamiento
genético y expresión de
cadenas ligeras
Defectos
en Btk Agammaglobulinemia
Ligada a X (XLA)
Inmunodeficiencia Primaria
Ontogenia del Linfocito B
Inmunología Celular y Molecular - Abbas
CD20
Control Paciente (XLA)
Determinar Subtipos Celulares:
–XLA (Agammaglobulinemia Ligada al Cromosoma X)
Citometría de Flujo: Usos Clínicos
Diagnóstico de Inmunodeficiencias Primarias
Oliveira J et al; Curr Opin Allergy Clin Immunol. 2008; 8:499-509.
Linfocitos T (CD3+)
Linfocitos T (CD3+)
15.8%
Linfocitos B (CD20+)
0.39%
Linfocitos B (CD20+)
Ausencia de
Linfocitos B
Activación del Linfocitos BInteracción CD40/CD40L
Antígeno
MHC-II TCR
CD4
Ausencia de CD40L
XSíndrome de
Hiper-IgMLigado al
Cromosoma X
Inmunodeficiencia
Inmunología de Kuby
Control Paciente
CD40L
Con Síndrome de Hiper-IgM Ligado a XIndividuo Sano
Síndrome de Hiper-IgM Ligado a X
Citometría de Flujo: Usos Clínicos
Diagnóstico de Inmunodeficiencias Primarias
Expresión normal de
CD40LAusencia de Expresión
de CD40L
Oliveira J et al; Curr Opin Allergy Clin Immunol. 2008; 8:499-509.
APLICACIONESSeparación de Poblaciones Celulares
CITOMETRÍA DE FLUJO
Fluorescence Activated Cell Sorter (FACS)
Células en
FluidoLASER de
Excitación
Separación de Poblaciones CelularesFluorescence Activated Cell Sorter (FACS)
Placas Metálicas
Cargadas
Células Clasificadas
(Separadas)
J Immunol 2012; 188:4715-4719
OTRAS APLICACIONESCITOMETRÍA DE FLUJO
Parámetros Evaluables por Citometría de Flujo
Estructurales Funcionales
•Tamaño Celular•Granularidad Citoplasma
•Antígenos membrana, intracelular
•Contenido de ADN, ARN
•Apoptosis•Endocitosis•Producción de Citoquinas
•Proliferación•Calcio movilización
Aplicaciones
Procesos Celulares Dinámicos• Proliferación Celular
•Incorporación de Fluorocromos en Fosfolípidos de Membrana
•Detección de Disminución de Fluorescencia en Progenie Celular
• Apoptosis•Disminución del contenido de ADN
•Disminución de tamaño y aumento de Complejidad Interna
•Pérdida de Asimetría de Fosfolípidos de Membrana
•Reducción del Potencial de Membrana Mitocondrial
• Fagocitosis•Ingestión de Bacterias marcadas con FITC
• Estallido Oxidativo•Transformación de Fluorocromos por Metabolitos del Oxígeno
• Producción de Citoquinas•Inhibición de la secresión
•Detección Citoplasmática de Citoquinas
Ensayos de ProliferaciónCFSE (Diacetato de Éster de Caboxifluoresceincarboxilo)
Una Población Celular
Progenitora se colorea con el
pigmento de membrana CFSE, y
se somete a determinadas
condiciones experimentales. A
medida que la población prolifera,
las células se dividen, por lo que el
contenido de CFSE en cada nueva
generación disminuye a la mitad, lo
que permite hacer un seguimiento
de la proliferación celular
Población ProgenitoraMáxima Fluorescencia
2ºGen.
3ºGen.
4ºGen.
5ºGen.
6ºGen.
7ºGen.
8ºGen.9º
Gen.10ºGen.
Generaciones SucesivasMenos Fluorescencia Progresiva
Determinación de ApoptosisTUNEL
Apoptosis:
•Fragmentación de ADN
•Extremos OH 3’ disponibles
•TdT añade BrdU
•Detección con anti-BrdU
Citometría de Flujo
Cuantificación de CitoquinasEn Sobrenadantes de Cultivos
(CBA-BD)
MuestraSobrenadantes de Cultivos
Perlas de CapturaPoblaciones con Fluorescencia discreta (FL3)
Anticuerpos DetectoresMarcados con Fluorescencia (FL2)
Sándwich InmunitarioPerlas + Citoquinas + Anticuerpos Detectores
Varias Citoquinas SimultáneamenteCombinando Diferentes Poblaciones de Perlas de Captura
Flexibilidad y EficienciaEnsayos “Personalizados”, Ahorro de Tiempo y Muestra
Citometría de Flujo
Cuantificación de CitoquinasEn Sobrenadantes de Cultivos
(CBA-BD)
Perlas de Captura: Poblaciones con Fluorescencia discreta (FL3)
Determinación de Citoquinas: análisis de las señales de fluorescencia FL3 (Perlas) y FL2 (Anticuerpos Detectores)
¡GRACIAS!
Espectro Electromagnético
Espectro Visible
500 nm 600 nm400 nm 700 nm
MayorEnergía
MenorEnergía
http://www.abdserotec.com/flow-cytometry