1 Fundamentos y aplicaciones de la citometría de flujo José M. Pérez de la Lastra
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Fundamentos y aplicaciones de la citometría de flujo
José M. Pérez de la Lastra
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Dar a conocer el principio de la técnica
-Funcionamiento del citómetro
-Ventajas y limitaciones
Mencionar algunas aplicaciones interesantes para
Objetivos
Mencionar algunas aplicaciones interesantes para la sanidad animal
-Análisis de heterogeneidad celular
-Análisis del ciclo celular
-Linfoproliferación
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� Flow ~ cells in motion
� Cyto ~ cell
� Metry ~ measure� Metry ~ measure
� Measuring properties of cells while in a fluid stream
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Muestras biológicas usadas en citometría de flujo
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Genómica Proteómica Citómica
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Citómetro de flujo
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Fundamentos de la citometría
Analiza células u otras particulas en suspensión.
Procedimiento rápido, objetivo y cuantitativo.
Se basa en la interacción de las celulas con un haz luminoso, esto genera una serie de señales que se recogen en unos detectores.
Estas señales son transformadas en impulsos electricos que se pueden amplificar y convertirse en señales digitales.
Las señales digitales se procesan en un ordenador donde se realiza el análisis cualitativo y cuantitativo
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Microscopía óptica y citometría de flujo
Laser monocromático
Las señales se procesan digitalmente
El análisis es más objetivo
CD2CD2CD4CD4
?
Realiza medidas cuantitativas
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Microscopy
� Localization of antigen is possible
� Poor enumeration of cell subtypes
� Limiting number of simultaneous
Flow Cytometry
� Cannot tell you where antigen is.
� Can analyze many cells in a short time frame.
� Can look at numerous parameters at once.simultaneous
measurementsparameters at once.
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Sistema
informáticoSistema óptico-
electrónico
Sistema
de
fluidos
Componentes de un citómetro de flujo
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El citómetro de flujo
Consta de cuatro componentes: sistema de fluídos, sistemas óptico, electrónico e informático.
El sistema de fluídos permite que las células sean analizadas de una en una.
El sistema óptico analiza las células mediante su interacción El sistema óptico analiza las células mediante su interacción con el haz luminoso (laser).
El sistema electrónico filtra y procesa las señales generadas por el sistema óptico
El sistema informático almacena la información y permite el análisis de los datos de manera interactiva con el operador
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THE FLOW CELL
Laser focusing and hydrodynamic focusing
LASER
SheathTank
WasteTank
Line PressureVacuum
Sample PressureSheath
Pressure(Constant)
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El sistema de fluidos
Constituido por el líquido que contiene la suspensión celular y un fluido móvil que rodea al líquido que contiene la muestra.
Las células son inyectadas a presión variable en el fluido móvil o líquido envolvente.
El líquido envolvente es impulsado continuamente a salir por un orificio estrecho y se mantiene a presión constante.estrecho y se mantiene a presión constante.
Durante el trayecto, se consigue que las células permanezcan en el centro del caudal del líquido envolvente alineadas y de una en una (enfoque hidrodinámico).
La presión con la que se introduce la muestra en el fluido influye sobre la resolución de la adquisición de la muestra.
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Notice how the ink is focused into a tight stream as it is drawn into the tube under laminar flow conditions.
V. Kachel, H. Fellner-Feldegg & E. Menke - MLM Chapt. 3
laminar flow conditions.
Notice also how the position of the inner ink stream is influenced by the position of the ink source.
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Presión de la muestra y resolución
Baja presión (12 µl/min) Alta presión (60 µl/min)
Análisis de contenido en ADN Inmunofenotipaje
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Sistema ópticoLa luz, al incidir sobre las células se dispersa en dos direcciones: horizontal y verticalmente.
Esta dispersión proporciona información relativa sobre el tamaño de las células y la granulosidad.
La luz incidente puede, además, excitar una serie de La luz incidente puede, además, excitar una serie de fluorocromos presentes en las células.
La presencia de fluorocromos proporciona información adicional sobre las células.
En principo, el citómetro puede detectar cualquier propiedad celular o bioquímica que se acople a un fluorocromo.
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Sistema óptico
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El sistema óptico
Consta de una fuente luminosa y de dispositivos colectores y discriminadores de las señales producidas.
La fuente luminosa es un láser azul (488 nm) de 15 mW, monocromática y unidireccional.
La señal óptica generada tras la interacción con las células es La señal óptica generada tras la interacción con las células es filtrada por espejos dicroicos y lentes colectoras que conducen las señales hacia los detectores.
La señal recogida por los detectores puede ser de dos tipos: luz dispersa (por la presencia de células o partículas) y luz emitida (por fluorocromos).
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DETECCION DE LUZ DISPERSADA HACIA DELANTE DETECCION DE LUZ DISPERSADA HACIA DELANTE (FORWARD SCATTERED LIGHT, FSC)(FORWARD SCATTERED LIGHT, FSC)
SSCSSC
FSCFSC
El detector de FSC convierte luz dispersada hacia El detector de FSC convierte luz dispersada hacia delante en un pulso de voltaje proporcional al tamaño delante en un pulso de voltaje proporcional al tamaño
de la célula/particulade la célula/particula
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DETECCION DE LUZ DISPERSADA DETECCION DE LUZ DISPERSADA LATERALMENTE (SIDE SCATTERED LIGHT, LATERALMENTE (SIDE SCATTERED LIGHT,
SSC)SSC)
SSCSSC
FSCFSC
El detector de SSC convierte la luz dispersada El detector de SSC convierte la luz dispersada lateralmente en un pulso de voltaje proporcional al lateralmente en un pulso de voltaje proporcional al
contenido en orgánulos membranosos (granularidad)contenido en orgánulos membranosos (granularidad)
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Fluorescencia
FLFL--11
FLFL--22
FSCFSC
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Emisión de luz (Fluorescencia)
Los fluorocromos son sustancias que absorben energía luminosa de una determinada longitud de onda.
Esta absorción de luz provoca el ascenso de electrones a niveles energéticos superiores.
Los electrones excitados regresan rápidamente a su estado normal Los electrones excitados regresan rápidamente a su estado normal emitiendo un fotón y desprendiendo energía radiante.
La energía consumida en la absorción de luz es mayor que la liberada y, por lo tanto, la longitud de onda que se desprende es mayor que la que se absorbe (salto de Stokes).
E=ch/ λλλλ
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Fluorocromos usados en citometría
Los más usados deben absorber a una misma longitud de onda de 488 nm (luz azul).
Para que dos o más fluorocromos se puedan usar simultáneamente, sus longitudes de onda de emisión deben simultáneamente, sus longitudes de onda de emisión deben ser diferentes.
La intensidad de fluorescencia que se recoge en los detectores es proporcional al número de moléculas de fluorocromo presentes en las células.
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Espectro de longitudes de onda de la luz
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� Espectro de Absorción
� Representación de la intensidad de absorción de luz dedistintas las longitudes de onda por una sustancia.
� Espectro de Emisión
� Representación de la intensidad de emisión de una sustanciaexcitada con luz de una determinada longitud de onda.
λ (nm)
excitaciónexcitaciónmedidamedida
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DETECCIÓN DE FLUORESCENCIADETECCIÓN DE FLUORESCENCIATC
PerCPQR
Cy5APC
FluorocromosFluorocromos
FL-1 FL-2 FL-3 FL-4DetectoresDetectores
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Isotiocianato de fluoresceína (FITC)
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Ficoeritrina (PE)
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Los citómetros actuales pueden detectar la presencia de hasta 18 fluorocromos en cada célula.
Algunos citómetros pueden incluso separar células de interés de una suspensión heterogénea (sorting)-
El uso del citómetro de flujo no está restringido a ningún área de la biología, aunque su uso está muy extendido en medicina clínica.
La citometría de flujo en biología
biología, aunque su uso está muy extendido en medicina clínica.
La citometría es una tecnología multidisciplinar, comprende áreas como la óptica, electrónica, química e informática.
Es una técnica de gran sensibilidad, objetividad y rápidez
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Cuando un fluorocromo se conjuga a un anticuerpo monoclonal, éste se puede usar para identificar un determinado tipo de células que portan el antígeno correspondiente.
Combinado con otros parámetros, como FSC (tamaño) y
Ventajas de los fluorocromos
Combinado con otros parámetros, como FSC (tamaño) y SSC (complejidad) se pueden identificar las células presentes en una muestra y cuantificarse en forma de porcentaje.
En algunos citómetros incluso pueden separse estas células (sorting)
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Sistema informático
La información sobre cada célula se recoge y se almacena en un ordenador.
Los resultados de todas las medidas obtenidas se conservan en forma de listado numérico.conservan en forma de listado numérico.
El uso de software adecuados permite el análisis de las propiedades de las células de modo interactivo, mediante la combinación de varios parámetros.
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DIGITALIZACION Y ALMACENAMIENTO DIGITALIZACION Y ALMACENAMIENTO DE INFORMACIÓNDE INFORMACIÓN
NN
1122334455
FSCFSC
2222334433
SSCSSC
1111222211
FLFL--11
1111334411
FLFL--22
1122331122
FLFL--33
1133334411
FLFL--44
2222333355
TIEMPOTIEMPO
1111111122
667788......
1000010000
33442222......
11223388......
11112211......
22331122......
11113344......
55551122......
222222......
Los pulsos de“Voltaje”(señales analógicas) son transformadas en Los pulsos de“Voltaje”(señales analógicas) son transformadas en señales digitalesseñales digitalesLas señales digitales almacenan en un soporte informático en Las señales digitales almacenan en un soporte informático en modo listado (almacenamiento multiparamétrico).modo listado (almacenamiento multiparamétrico).
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Sorting
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Diagramas de representación
Dot plot o citograma. Representa dos parámetros en los ejes horizontal y vertical.
Histograma. Un sólo parámetro en el eje horizontal frente al número de células.
Diagramas de contorno. Dos parámetros, similar al dot plot pero Diagramas de contorno. Dos parámetros, similar al dot plot pero con líneas de contorno que conienen igual número de células.
Diagaramas de densidad. Dos parámetros, representa el número de células en gradiente de colores.
Diagramas 3-D. Dos parámetros en un plano y número de células en vertical.
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Event
#
Param 1
FSC
Param2
SSC
Param
3
FITC
Param
4
PE
Param
5
APC
1 100 500 10 650 4
2 110 505 700 700 62 110 505 700 700 6
3 90 480 720 670 10
4 95 490 15 720 15
0………10………100………1000…….10000
41
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STACK:
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