CICLO CELULAR Burke & Ellenberger, Nature Rev. MCB 2002
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CICLO CELULAR
Burke & Ellenberger, Nature Rev. MCB 2002
El ciclo celular consiste en una secuencia de eventos organizados en fases, G1, S, G2 y M, que se repiten en cada generación celular
Las células tienen una capacidad proliferativa limitada (“Hayflick limit”). El arresto permanente del
ciclo celular inducido por el acortamiento telomérico se denomina senescencia replicativa.
El período comprendido por las fases G1-S-G2 se conoce como interfase, en el cual la célula adquiere
el estado para distribuir el material genético y citoplasmático, que ocurre durante la fase M o mitosis.
Las células pueden detener el ciclo
celular temporalmente (quiescencia),
o permanentemente (p. ej. neuronas y
células del cristalino) en un estado
dentro de la fase G1 denominado G0.
G1 G2
S
M
El ciclo celular es regulado por señales extracelulares
Experimentos con levaduras demostraron que el crecimiento y la división celular están coordinados. Si el ciclo celular ocurriera
en tiempos prefijados y no estuviera coordinado con el crecimiento de la célula (panel A), se esperaría que en ausencia o
restricción de nutrientes el tamaño de las células disminuyera en cada división. Sin embargo, esto no sucede, las células
mantienen su tamaño a lo largo de las generaciones (panel B) debido a su capacidad de modular la duración del ciclo celular.
Alberts et al., BMC 2002
La restricción de nutrientes inducen el alargamiento de la fase G1 y en casos extremos el arresto en una
fase G0 (quiescencia). En condiciones medioambientales óptimas las células crecen hasta un cierto
tamaño antes de dividirse. Se ha propuesto que el tamaño diluye proteínas inhibidoras del ciclo celular.
En organismos multicelulares múltiples señales extracelulares regulan la proliferación y apoptosis celular
Hormonas (ej. prolactina), factores paracrinos (ej. HGF, Wnt, EGF,
etc) y la matriz extracelular estimulan la proliferación y diferenciación en
la glándula mamaria durante la pubertad, embarazo y la lactancia. Al
finalizar la lactancia, el epitelio alveolar involuciona por apoptosis. El
TGFb es un factor que inhibe la tubulogénesis y promueve la apoptosis.
Secciones de glándula mamaria de ratones
en el período de lactancia. En marrón se
visualiza la expresión de TGFb. A: normal;
B y C: animal donde se previene la succión.
Las flechas en C indican células apoptóticas.
La prolactina activa la vía de JAKSTATs e induce la transcripción
del gen de b-caseína, una de las principales proteínas de la leche.
A
B
C
prolactina,
Wnts, EGF,
HGF, etc
oxitocina
En los epitelios la proliferación es restringida a células madre
Beachy et al., Nature 2004
En epitelios, las células madre alternan estados de quiescencia en G0 (a, en rojo) y proliferación. El daño del epitelio estimula
la proliferación (b, en verde). Las células nuevas se diferencian en diversos tipos celulares y reparan el daño (c), restaurando
un nuevo estado estacionario (a). Los daños permanentes o crónicos promueven la activación persistente de las células madre
y aumentan la probabilidad de mutaciones oncogénicas que auto-perpetuan la proliferación y la formación de tumores (d y e).
b d,e
Las células madre poseen un potencial replicativo ilimitado y son una fuente de renovación celular en los tejidos adultos
Skin epithelium
En la epidermis e intestino las células madre originan células de tránsito que se desplazan lateralmente y se dividen activamente,
amplificando la población. En la epidermis, las células en la base de las papilas reorientan el aparato mitótico de modo que una de
las células hijas pierde el contacto con la membrana basal y migra hacia estratos superficiales y se diferencia en distintos fenotipos.
En el epitelio intestinal, las células de tránsito se diferencian durante su desplazamiento hacia el ápice de las vellosidades.
stem cells
Paneth cells
transit
amplyfing cells
Goblet cells
enteroendocrine
cells
enterocyte
papila
control knock out del gen de β1
La bromodeoxiuridina (BrdU) es un análogo de timina que se incorpora en el ADN durante la fase S. En la figura se muestran
secciones de folículos pilosos de ratones control (A) y knock out (B) para b1-integrinas teñidos con anti-BrdU. Note que los folículos
normales presentan abundantes núcleos marcados (puntos en marrón) comparados a los del ratón deficiente en β1 integrinas
(asteriscos y flechas en B).
El nivel de proliferación celular de un tejido puede estudiarse determinando la incorporación de BrdU
La capacidad replicativa de las células epiteliales epidérmicas
correlaciona directamente con la expresión de b1 integrinas.
La incorporación de 3H-timidina y la citometría de flujo son otras técnicas experimentales para evaluar la proliferación celular
La incorporación de 3H-timidina ocurre en las células que están en
fase S flecha). (A) Autoradiografía de una sección histológica. (B)
Incorporación de la radioactividad en una población celular.
La citometría de flujo revela el
contenido de DNA de una población
celular y permite calcular el porcentaje
de células en fase G1, S y G2/M.
A Microscopía de una sección de epitelio
insulin IR Grb10 Erk Ciclinas D
B
(B).Células estimuladas a dividirse con
insulina fueron incubadas en presencia de
un péptido inhibidor o un péptido control.
Observe que la incorporación de 3H-timidina
disminuye con la ccion del inhibidor.
concentración (µg/ml)
control
péptido inhibidor
El nivel de proliferación de una
población celular también puede
evaluarse mediante la detección de
marcadores de proliferación como
PCNA, Ki-67, fosfo-histona 3, etc).
PCNA: cofactor de la ADN polimerasa y .Ki-67: proteína involucrada en la compactación de la cromatina
PRINCIPIOS GENERALES
DEL CICLO CELULAR
unidireccionalidad (secuencia temporal unívoca de eventos encadenados)
adaptabilidad (ajustable a las variaciones de las condiciones ambientales)
robustez (mantiene la fidelidad del proceso frente a perturbaciones
mutacionales y del medio ambiente)
Diversos mecanismos de control o “checkpoints” aseguran que la transición de una fase a la siguiente ocurra en las condiciones óptimas
Mecanismos irreversibles, de “switch”,
o de “todo o nada”, controlan 3
transiciones críticas del ciclo:
1- G1/S (duplicación del ADN)
2- G2/M (formación del huso mitótico)
3- Metafase-Anafase (distribución de
los cromosomas)
Complejos de CDK-ciclinas controlan los principales eventos moleculares de cada fase
fosforilación de Rb
hiperfosforilación de Rb,
Cdh1, p27
fosforilación de factores
de licenciamiento, ORC
mitógenos
E2Fs
fosforilación de la helicasa
MCM y sus activadores
fosforilación de factores
de licenciamiento,
ORC, MCM, Cdh1
APC/C, MAPs,
laminas,
nucleoporinas,
condensinas
proteínas de tráfico
vesicular
Los niveles de expresión de las diferentes ciclinasvarían de manera periódica durante el ciclo celular
Experimentos pioneros con embriones de erizos de mar y almejas permitieron identificar las ciclinas mitóticas
Durante el desarrollo embrionario temprano de estos organismos las células se dividen sincrónica y rápidamente alternando
fases de S y M. El análisis, en geles de poliacrilamida, de extractos proteicos de embriones preparados a distintos tiempos,
revela variaciones cíclicas en los niveles de ciclinas mitóticas (ciclinas B), con máximos al comenzar cada mitosis.
Adaptado de Hunt et al, JCB 1992
La desaparición de las ciclinas al finalizar la mitosis ocurre por su degradación en proteosomas.
ribonucleótido
reductasa
ciclina B
tiempo
Los máximos niveles de ciclinas mitóticas correlacionan con la máxima actividad de MPF (Maturation Promoting Factor),
una actividad citoplasmática de huevos maduros que al microinyectarse en ovocitos inmaduros promueve su maduración.
Alberts et al., BMC 2015
Duronio & Xiong CSHPB 2013
cofactor (Cdc20 & Cdh1)
Ubi ligase
Ubi
ligase
El complejo APC/C se activa por fosforilación y por la
unión de los cofactores Cdc20 y Cdh1 durante la mitosis.
Cdc20 y Cdh1 además determinan la especificidad de los
substratos. APC reconoce motivos específicos (degrones)
en las ciclinas de las fases S y M.
En contraste, el complejo SCF esta siempre activo y la regulación ocurre
a nivel de los substratos. SCF reconoce a los substratos (ej. cilina E) solo
cuando son fosforilados en secuencias específicas (fosfodegrones).
degrón
APC/C: Anaphase Promoting Complex/Cyclosome
SCF: Skp1/Cullin/F-box protein)
Dos complejos de ubiquitinación, SCF y APC/C, controlan transiciones irreversibles y la unidireccionalidad del ciclo
fosforilación
fosforilación
SCF
Reed, NRMCB 2003
SCF y APC promueven la degradación de ciclinas e inhibidores
transición G1 S (ej. inhibidores p21, p27, Sic1) son degradadas por SCF
ciclinas de G1 y G1/S son degradadas por SCF
transición G2 M (ej. quinasa inhibidora Wee1) es degradada por SCF
transición metafase anafase (ej. inhibidor securina) es degradado por APC-Cdc20
transición anafase telofase (ej. ciclinas S y M) y Geminina son degradadas por APC-Cdh1
APC/C: Anaphase Promoting Complex/Cyclosome
SCF: Skp1/Cullin/F-box protein)
ciclinas
de G1/S
La actividad de las Cdks es coordinada con la actividad degradativa de APC/C y SCF.
Mientras que los niveles de expresion de las ciclinas oscilan durante el ciclo celular, los niveles de Cdk son
relativamente constantes. La expresión de ciclinas es regulada a nivel transcripcional y post-traducción.
Las ciclinas S y M son degradadas al final de la mitosis por APC/C, y las ciclinas G1/S por SCF.
La actividad de CDK-ciclinas y APC/C se regulan mutuamente.
Lodish et al., MBC 2016
SCF
activity
Activity o
f C
DK
s
transición metafase-anafase
Cdh1
Las Cdk son Ser/Thr quinasas cuya función depende de la unión a una ciclina
(a) La Cdk no unida a ciclina es autoinhibida por un bucle flexible (T-loop) que bloquea el acceso del
substrato al sitio activo unido al ATP. (b) La unión de la ciclina a la Cdk induce cambios conformacionales
en el T-loop y en la hélice alfa 1, permitiendo la fosforilación de la Thr-160 y unión del substrato.
Las ciclinas cumplen dos funciones básicas:
1) activan las Cdks
2) determinan la especificidad por los substratos
Lodish et al., MBC 2016
Lodish et al., MBC 2016
La fosforilación de Cdk1 y 2 por CAK regula positivamente su actividad
La kinasa CAK fosforila la treonina 160 en el bucle flexible (T-loop) del dominio catalítico de Cdk1 y Cdk2
lo cual estabiliza una conformación de álta afinidad por el substrato y potencia ~ 150 veces su actividad.
(CAK)Cdk-Activating Kinasa
MPF (Mitosis Promoting Factor) = Cdk1-ciclinas B
CAK: Cdk-Activating Kinase
La fosforilación de Cdk 1 y 2 por Wee1 regula negativamente su actividad
s
Antes de comenzar la mitosis, las Cdk1 es fosforilada en el sitio activador (Thr160) por la kinasa CAK, y en uno o dos sitios
inhibidores (Thr14, Tyr15) por la kinasa Wee1. En este estado la Cdk tiene muy baja afinidad por el substrato y es inactiva.
Al final de la fase G2, Cdk1 es activada por la fosfatasa dual Cdc25 que remueve el fosfato del sitio inhibidor. Un
mecanismo similar regula a Cdk2.
Existen varias proteínas inhibidoras de Cdks o CKIs
Los inhibidores difieren en el rango de CDKs que inhiben y en el mecanismo de acción. Los inhibidores INK4
interaccionan directamente con las CDK4 y 6 e inhiben alostéricamente su asociación con las ciclinas D. Los inhibidores
CIP/KIP interaccionan con ambos componentes de los complejos CDK-ciclinas y su rango de inhibición es más amplio.
- INK4 Cdk4/6-ciclinas D
p15
p16
p18
p19
- senescencia
- TGFβ
- diferenciación
terminal
complejo CKI/CDK
CKI: Cdk Kinase Inhibitor
- p21CIP
- p27KIP1
- p57KIP2Cdk2-E/A
Cdk2-E
SCF-ubiquitina
caderinas
TGF-b
p53 - CIP/KIP
*cumplen una función similar
al inhibidor Sic1 en S. cerevisiae
*(-)
(+)
Cdk4/6-D
integrinas
complejo CKI/CDK/ciclina
Cdk
Las Cdk integran señalización de varias vías (“inputs”),
que regulan de manera positiva y negativa la actividad.
Alberts et al, MBC 2015
Los complejos Cdk-ciclinas fosforilan proteínas que controlan eventos específicos de las fases del
ciclo celular. Por ej. durante la fase M, Cdk1-ciclinas M fosforilan substratos requeridos para la
condensación de la cromatina, ruptura de la membrana nuclear, ensamble del huso mitótico, etc.
EXPERIMENTOS QUE
PERMITIERON IDENTIFICAR
REGULADORES CLAVES
DEL CICLO CELULAR
Descubrimiento de la actividad MPF (Maturation Promoting Factor)en anfibios
La microinyección del citoplasma de huevos maduros en ovocitos arrestados en G2 induce la mitosis y la
maduración a huevo sin necesidad de progesterona (b). El factor fue aislado y se denominó “Maturation Promoting
Factor” o MPF. Cuando el MPF es inyectado en células somáticas en interfase promueve la mitosis (c).
El MPF identificado en Rana y Xenopus es el equivalente molecular al complejo de CDK1-ciclinas M
mitosis
Ovocito arrested
en G2
mitosis
(b) microinyección
de citoplasma
mitosis
célula en
interfase
Ovocito arrestado
en G2
release from the ovary
(ovulation)
Masui & Markert, J Exp Zool 1971
Lodish et al, MBC2004
bajos niveles de
actividad MPF
altos niveles de
actividad MPF
Huevo
arrestado
en meiosis II
(c) microinyección de MPF
La actividad MPF es máxima durante la profase y metafase de cada división
ovocito
huevo
Lodish et al, MBC2004
Dinámica de actividad del MPF durante la maduración de ovocitos de Xenopus, la fertilización
y las etapas iniciales del desarrollo embrionario.
↑Wee1,
↓Cdc25,↓Wee1,
↑Cdc25,
primer
arresto
segundo
arresto
tiempo
actividad de APC
↑Ca 2+
↑APC
cytostatic factor
El análisis genético en levaduras permitió identificar numerosos reguladores del ciclo celular
La levadura S. cerevisiae (budding yeast) es unicelular, tienen un genoma relativamente
pequeño, tiempo de duplicación corto (~90 min) y posee un estado de reproducción haploide.
Los genes cuyas mutaciones arrestan el ciclo celular se denominan “cell division cycle” genes
o cdc genes. Solo las mutaciones condicionales permiten la propagación de las células.
Las mutaciones sensibles a la temperatura resultan típicamente de cambios “missense” (mutación puntual de una base
que cambia el aminoácido). Usualmente preservan la función normal de la proteína a una temperatura baja o permisiva.
En esta condición las células se pueden propagar. El fenotipo de la mutación se manifiesta creciendo la levadura a una
cierta temperatura denominada no permisiva o restrictiva y producen el arresto del ciclo.
Cdc gene mutant
Mutantes de S. pombe permitieron identificar la única Cdk de estas levaduras: Cdc2
Las células de S. pombe se dividen por fisión del citoplasma (A). Las mutantes recesivas para el gen cdc2
(cdc2-) se alargan sin dividirse (B). En contraste, mutantes de ganancia de función (cdcD, dominantes)
entran prematuramente a la mitosis, sin crecer lo suficiente (C).
cepa salvaje,
tamaño normal
Lodish et al, MBC2004
Cdc2 de S. pombe es equivalente a Cdc28 de S. cerevisiae
fotos
Sergio Moreno
mutante dominante
mutante
recesiva
B
A
C
cdc2-
cdc2D
cdc2+
Mutantes de S. pombe también permitieron identificar genes reguladores de la actividad de Cdc2: Wee1 y Cdc25
Lodish et al, MBC2004
Fenotipos mutantes en S. pombe
inhibidor activador
modelo de
interpretación de
los resultados (cdc2-ciclB)
Modelo de acción de los principales reguladores de la actividad del MPF en S. pombe
* La treonina Thr161 de Cdc2 es homóloga a la Thr160 de la Cdk1 de vertebrados.
Estudios genéticos permitieron identificar 4 proteínas reguladoras de Cdc2: la ciclina mitótica Cdc13,
equivalente a la ciclina B de vertebrados; la quinasa Wee1, que fosforila el sitio inhibidor (Y15) en Cdc2; la
kinasa CAK, que fosforila el sitio activador T161; y la fosfatasa Cdc25, que defosforila Y15 y activa el
complejo Cdc2-Cdc13 .
Lodish et al, MBC2004
(Cdc13)
(Cdc2)sitio
inhibidorsitio
activador
defosforilación del
sitio inhibidor
EVENTOS DE LA FASE G1
- Reconocimiento del origen de replicación (OR). Los complejos ORC se
unen a los ORs y marcan los sitios de inicio de la duplicación del ADN.
- Licenciamiento del origen. Los adaptadores Cdc6 y Cdt1 son requeridos
para reclutar la helicasa Mcm al complejo ORC, formando el complejo de pre-
replicación que habilita al origen a iniciar la duplicación del ADN. Este proceso
solo ocurre en G1 y es bloqueado en el resto de las fases.
- Expresión de ciclinas de fase G1. Requiere de estimulación externa.
El complejo de pre-replicación se ensambla en el origen y en G1, una sola vez por ciclo
Lodish et al, MBC 2016; Sclafani & Holzen, ARG 2007
Tocilj et al, Elife 2017
Mcm
Cdc6
Cdk-S/M,
Geminina
↑APC-Cdh1Cdt1
Cdt1
G2
S
M
G1
Mcm loading
ORC es un complejo hexamérico que se asocia al OR. Factores de iniciación (Cdc6 y Cdt1) se unen al ORC y reclutan a la
helicasa Mcm formando el complejo de pre-replicación o pre-RC (“licenciamiento” del OR). Dos mecanismos inhiben el
licenciamiento fuera de G1: 1) La proteína Geminina interacciona con Cdt1 e inhibe el reclutamiento de Mcm; 2) los complejos
Cdk-S y Cdk-M fosforilan e inactivan a Cdc6 y Cdt1. Al final de la mitosis y comienzo de la fase G1, el complejo APC-Cdh1
degrada las ciclinas S, M y geminina permitiendo el ensamble de un nuevo pre-RC.
OR: Origin of Replication
ORC: Origin Recognition Complex (formado por 6 proteínas, ORC1-6).
Mcm: Mini chromosome maintenance (formado por 7 proteínas, Mcm1-7).
Klein & Assoian, JCS 2008
Una red compleja de señalización activa la transcripción de ciclina D
Las ciclinas D son las principales ciclinas de G1 en vertebrados. Diversos estímulos activan vías de señalización que regulan
la expresión/función de factores de transcripción que interaccionan con el promotor del gen de ciclina D.
La vía Ras MAPK induce la expresión de ciclinas D
ej. c-fos y c-jun genes
ej. cyclin D
La estimulación de la vía de Ras-Erk
induce la expresión de una primera
oleada de genes de expresión
temprana, que incluyen a los factores
de transcripción c-fos- c-Jun y ATF.
Estos regulan la expresión de genes de
expresión tardía, como por ej. ciclina D.
ej. c-fos gene
Estímulo: mitógenos (EGF)
ERK TCF c-Fos↑
MEC integrins JNK c-Jun↑c-Jun/c-Fos (AP-1) ciclina D ↑Cdk 4/6
cdk inhibitors
Estímulo: Adhesión a la MEC
TRANSICIÓN G1 S
- Requiere de la expresión de ciclinas G1/S
- Inhibición de los complejos Cdk-S
- Pasaje del punto “Start” o “Restriction point” e inactivación de
los inhibidores de Cdk-ciclinas de fase G1/S
Cdc28-ciclinas B5/6 en S. cerevisiae
Cdk2-ciclinas A en vertebradosCdk-ciclinas de fase S
Sic1 Cdc28-Clb5/6 (S. cerevisiae)
rb E2Fs ciclinas E (vertebrados)
p21/p27 Cdk2-E/A (vertebrados)
Whi5 SBF ciclinas Cln1 y 2 (S. cerevisiae)
inhibidores
Cdc28-ciclinas 1 y 2 en S. cerevisiae
Cdk2-ciclinas E en vertebradosCdk-ciclinas de fase G1/S
Mecanismos de retroalimentación positiva promueven la abrupta expresión de ciclinas G1/S y el pasaje de START en levaduras
SBF también induce la expresión de
ciclinas S. Sic1 es un inhibidor de
complejos Cdk-S y Cdk-M que se
expresa al final de la mitosis. Sic1
es fosforilado en múltiples sitios por
complejos Cdk-G1/S, evento que
permite su ubiquitinación por el
complejo SCF y su destrucción en
proteosomas. Los complejos Cdk-S
acumulados durante G1 y
desinhibidos en G1/S promueven el
inicio abrupto de la fase S.
En G1 el inhibidor transcripcional
Whi5 bloquea a los factores de
transcripción SBF. SBF inducen
la transcripción de ciclinas de
G1/S. Los complejos Cdk-G1
fosforilan e inactivan Whi5. A su
vez, los complejos Cdk-G1/S
fosforilan e inactivan Whi5
(feedback positivo).
La transición abrupta de G1 S depende de una compleja red de control
Red de circuitos que regulan la transición G1S en levaduras.
SBF: Swi4-Swi6 cell cycle box Binding Factor
Las ciclinas de G1 y G1/S son resistentes a la degradación por el complejo APC-Cdh1, el cual es activo en G1.
APC-Cdh1 degrada las ciclinas S y M por lo tanto existen mecanismos que inactivan Cdh1 durante S y M. Al
final de G1 los complejos Cdk-ciclinas G1/S activos fosforilan Cdh1 y lo inactivan. Esto permite la acumulación
de ciclinas S que en complejos Cdk-S fosforilan y mantienen inhibido a Cdh1.
Cdh1(APC inhibition)
El acoplamiento de bucles de retroalimentación positiva y negativa aseguran un mecanismo de “switch” transcripcional
Inhibidores transcripcionales de G1/S son inactivados por Cdk-G1. Este proceso gatilla la actividad transcripcional que promueve la
transición G1/S, incluyendo la expresión de ciclinas G1/S y la activación de Cdk-G1/S que refuerzan el proceso (retroalimentación
positiva) y el pasaje del punto de no retorno. La misma ola transcripcional induce la expresión de represores transcripcionales que
autoregulan el proceso (retroalimentación negativa) de modo que la transcripción de G1/S retorna a niveles basales en la fase S.
Bertoli et al, NRMCB 2013
Rb es funcionalmente equivalente a Whi5 de levaduras. Rb inhibe a los factores de transcripción E2Fs por dos
mecanismos diferentes: 1) interacción directa y bloqueo estérico de los factores E2Fs, 2) reclutamiento de la
histona deacetilasa HDAC al promotor de E2F inhibiendo su transcripción. Cdk4/6-ciclinas D fosforilan e
inactivan a Rb, permitiendo pasar el punto de no retorno, en el cual se activan mecanismos de retroalimentación
positivos y doble negativos que aseguran la expresión y activación de los factores E2Fs, y las ciclinas E y A.
Transición de G1 S en vertebrados
Células estimuladas con mitógenos fueron
micro-inyectadas a distintos tiempos post-
estímulo con anti-ciclina D (barras rojas) o con
IgG control (barras celestes) e incubadas con
bromo-deoxiuridina (BrdU). Note que el anti-
ciclina D inhibe la incorporación de BrdU hasta
las 12 h post-estímulo pero pierde su efecto
para las 16 h, indicando que el umbral de no
retorno en G1 se superó.
Time after stimulation (h)
% B
rdU
-po
sitiv
e c
ells
Requerimiento de ciclinas D para inducir la fase S
Mid G1 Late G1
gen activoHDAC
/A
p27
función inhibida,
promotor inactivo
+
+
-
-
HDAC
-
EVENTOS DE FASE S
Activación de complejos Cdk-S
Activación del replisoma en los ORI
Inactivación de factores de licenciamiento
-Apertura del ADN. Las quinasas Cdk-S y DDK, activan la helicasa Mcm
y se abre la doble hebra del ADN. Este proceso solo ocurre en fase S.
- Copia del ADN. Ensamble del replisoma.
(2, 3) Cdk-S y DDK fosforilan componentes del pre-RC,
evento necesario para reclutar factores activadores de la
helicasa Mcm (Cdc45, GINS). Cdk-S fosforila e inactiva a
Cdh1, causando la inhibición de APC/Cdh1. Esto permite la
acumulación de Geminina y la inactivación de Cdt1.
(3, 4) Cdc45 recluta proteínas del replisoma (polimerasas,
primasas, ligasas, topoisomerasas, etc) y las proteínas Rpa
que protegen las hebras simples del DNA de la degradación
por nucleasas.
Cdk-S y Cdk-M fosforilan a los factores de iniciación Cdc6 y
Cdt1 impidiendo su re-asociación al ORC. Cdc6 y Cdt1
fosforilados son ubiquitinados por SCF y degradados o
exportados al citoplasma. Cdt1 es además inhibido por
Geminina. Estos mecanismos redundantes aseguran que
cada origen de replicación dispare la síntesis del DNA
una sola vez por ciclo.
La degradación de las ciclinas S/M y Geminina por APC-
Cdh1 al final de la mitosis y la actividad de fosfatasas
durante G1, permiten que los factores de iniciación de la
replicación ensamblen un nuevo pre-RC en el siguiente ciclo.
Fosforilación
ActivaciónGeminin
DDK: Dbf4-Dependent Kinase
RPA: Replication Protein A
Replisoma y duplicación bidireccional del ADN
E. coli tiene un solo OR para
duplicar el ADN (replicón). Los
cromosomas eucariotas
tienen varios ORC/replicones,
aproximadamente unos 600
en la levadura S. cerevisiae.
microscopía electrónica
El replisoma constituye un
complejo de proteínas
asociado a las horquillas de
replicación. Formado por
polimerasas (, , ),
adaptadores (RFC, PCNA,
GINS) y diferentes enzimas
y reguladores (GINS, Cdc45,
primasas, etc).
Lodish et al, MBC2004;
Leman & Noguchi, Genes 2013
PCNA: Proliferating Cell Nuclear Antigen
RFC: Replication Factor C
Las cromátides duplicadas se mantienen unidas porcomplejos proteicos denominados cohesinas
Las cohesinas son complejos formados por 4 proteínas, Smc1 y 3, pertenecen a la familia de proteínas SMC (Structural
Maintenance of Chromosomes), se asocian por los extremos formando una estructura que envuelve las dos cromátides.
Las proteínas Scc1 y 3 cierran y estabilizan la estructura. Scc1 es degradada por separasa previo a la Anafase.
Alberts et al, MBC 2015
cohesinas
(bisagra)
Scc1 ~ Rad21
TRANSICIÓN DE LA
FASE G2 M
Cdc28-ciclinas B1-4 (S. cerevisiae)
Cdk1-ciclina B (vertebrados)
Activación de complejos Cdk-M
Una red reguladora compleja produce la activación abrupta de Cdk-Men la transición G2/M
La fosfatasa Cdc25C es fosforilada y activada por la quinasa Polo en G2. Cdc25C defosforila el sitio inhibidor y activa Cdk-M.
Cdk-M fosforila y activa Cdc25C generando un circuito de retroalimentación positivo. Cdk-M además fosforila e inhibe a la
quinasa inhibidora Wee1 (circuito de retroalimentación doble negativo). Como consecuencia al final de G2 se produce un
aumento abrupto de la actividad de Cdk-M.
↑Polo kinase
ATM, ATR,
chk1 & 2
DNA no replicado
y/o dañado
inhibición,
ubiquitinación
y degradación
en proteosoma
p38
(stress
signaling)
incrementa expresión
en G2, activación y
translocación nuclear
Retroalimentación positiva y doble negativa asegura la amplificación de la actividad de los complejos Cdk-M
EVENTOS CONTROLADOS
POR CDK-M EN MITOSIS
Cdk-M
eventos
nucleares
fosforilación de laminas desensamble de la lámina nuclear
fosforilación de nucleoporinas desensamble de poros nucleares
fosforilación de proteínas de anclaje de la cromatina a la membrana
desestabilización de la envoltura nuclear y de la cromatina
fosforilación de condensinas empaquetamiento de la cromatina
eventos
citoplasmáticos
fosforilación de MAPs incremento del dinamismo de los MTs
fosforilación de proteínas del RE y Golgi inhibición del tráfico
y fragmentación del Golgi y RE.
Fosforilación de las laminas y ruptura de la envoltura nuclear
Los complejos Cdk-M fosforilan las laminas A, B y C evento
que induce la depolimerización de los filamentos intermedios
y el desensamble de la lámina nuclear. La lamina B
fosforilada permanece anclada a la membrana nuclear
interna por un ácido graso. La fosforilación de nucleoporinas
provocan el desensamble de los poros nucleares.
microscopía de barrido de la lámina nuclear
MPFCdk-M
complejo de condensinas
Modelo de empaquetamiento de la cromátide
Hirano, Cell 2016
Alberts et al 6th Ed
Las condensinas son complejos formados por 2 subunidades Smc2 y 4 que
forman una estructura de anillo articulado en el extremo de dimerización (hinge).
En el extremo opuesto poseen un dominio ATPasa que interacciona con 3
subunidades (CAP G, H y D2). Mediante ciclos de unión e hidrólisis de ATP
producen el empaquetamiento de la cromatina. Esta función es promovida por la
fosforilación mediada por Cdk-M.
Activación de condensinas y empaquetamiento de la cromatina
Los complejos de condensinas/cohesinas se unen
a regiones específicas del ADN denominadas
SARs/MARs (scaffold/matrix-attachment regions).
SMC: Structural Maintenance of Chromosomes
bisagra
Cdk-M promueve el incremento en el dinamismo de los microtúbulos de metafase
Cdk-M fosforila catastrofinas y otras MAPs efecto que
incrementa la inestabilidad dinámica de los microtúbulos.
Las catastrofinas se unen a los extremos (+) de los microtúbulos provocando la disociación de
monómeros e incrementando la frecuencia de catástrofes (transición de elongación acortamiento).
La vida media de microtúbulos
de interfase es ~ 5-10 min y
disminuye a < 1 min en mitosis.
Cdk-M, Polo y Aurora promueven el ensamble del aparato mitótico
La estructura y dinámica del aparato mitótico depende de la actividad coordinada y combinatorial
de diferentes motores. La actividad de las kinesinas es regulada por la fosforilación mediada por
Cdk1-M, Polo y Aurora.
Alberts et al 6th Ed
Cdk-M
Cdk-M regula varios aspectos de mitosis: 1) duplicación y separación de centrosomas, 2) posicionamiento
y alineamiento del huso, 3) condensación y cohesión de los cromosomas, 4) orientación y función de los
cinetocoros, 5) elongación del huso y ensamble de la zona media en anafase.
2
5
4
1
3
Enserink & Kolodner, Cell Division 2010
Estudios genéticos en levaduras revelan un rol multifacético de Cdk-M en mitosis
El complejo Cdk-M fosforila e inactiva
a proteínas que estabilizan las
cisternas del Golgi, promoviendo la
desintegración del RE y Golgi.
Magnus et al MBC2004, Yeong, BioEssays 2013
Fragmentación del Golgi durante la mitosis y su re-ensamble al final de la misma.
Se visualiza la distribución de GFP-GalNac-T2, una glicosil transferasa del Golgi.
El tráfico anterógrado vesicular es inhibido durante la mitosis
TRANSICIÓN DE
METAFASE ANAFASE
Fosforilación y activación de APC/C por complejos Cdk-M
Unión del cofactor Cdc20 a APC/C
Degradación de securinas y ciclinas mitóticas.
Fujimitsu et al, Science 2016
Kernan et al, BBA 2018
Activación de APC/C en la transición Metafase/Anafase
SAC: Spindle Assembly Checkpoint
USP37: Enzima que deubiquitina a ciclina A de la fase S.
G1/S
A partir de G1/S, APC/C es inhibido por una variedad de mecanismos que involucran fosforilación e inactivación de Cdh1. Al
comienzo de la mitosis Cdc20 comienza a expresarse pero es inactivado en cinetocoros por el complejo de checkpoint del
ensamble del huso mitótico (SAC). En metafase/anafase, Cdk1-M fosforila APC/C incrementando su afinidad por Cdc20 que
es liberado del SAC. Al final de la mitosis, Cdc20 es degradado y la actividad de APC/C es mantenida en G1 por Cdh1.
APC/C
G2/M metafase/anafase anafase
Cdh1
Lodish et al, MBC 2016
Morales & Losada, COCB 2018
APC/C-Cdc20 activo inicia la transición Metafase-Anafase
La unión a la cromatina y la actividad de las cohesinas es
regulada por varios factores. Durante la duplicación del ADN
(fase S) las cohesinas son activadas por acetilación (Esco 1 y
2). Al inicio de mitosis, en vertebrados, la mayoría de las
cohesinas es desensamblada por fosforilación y solo
permanecen en los centrómeros. En metafase el huso
mitótico se encuentra en un estado de tensión generada por
microtúbulos de los polos opuestos anclados a los cinetocoros
de cada cromátide. La proteasa separasa es inhibida por la
proteína securina. La activación de APC-Cdc20 promueve la
ubiquitinación y degradación de securina en proteosomas. La
separasa activa cliva Scc1 y rompe el anillo de cohesinas,
permitiendo la separación de las cromátides en Anafase.
centrómeros
cromátides
G2S M
APC/C-Cdc20 y APC/C-Cdh1 degradan las ciclinas S y M al final de la mitosis
Lodish et al, MBC2004Cdh1: Cdc20 homology-1.
mitotic cyclin
Cdk
Cdk
Secuencia reconocida por APC en las ciclinas mitóticas
Esta secuencia no está presente en las ciclinas de G1 y
G1/S, por lo tanto no son blanco de APC-Cdh1.
Al final de la anafase la fosfatasa Cdc14 se activa y defosforila
Cdh1, permitiendo su unión al complejo APC/C y su activación.
APC/C-Cdh1 ubiquitina y promueve la degradación masiva de
las ciclinas M y S, Polo kinase, Cdc20, etc.
Cdh1 es fosforilado e
inhibido por complejos
Cdk-G1/S y Cdk-S, la
baja actividad de APC/C
permite la acumulación
de las ciclinas S y M.
La inactivación de Cdk-M (MPF) y la actividad de fosfatasas es requerida para la reformación del núcleo y del sistema secretor
La inactivación de Cdk-M permite la activación demiosina y el desarrollo de la citoquinesis
La acción de fosfatasas es requerida para la inactivación de Cdk-M, eventos tardíos de la mitosis y citoquinesis
La fosfatasa Cdc14 defosforila substratos
necesarios para la formación del complejo
multiproteico en la zona media, que
estabiliza microtúbulos polares anti-
paralelos (en verde), y que marca el sitio
donde ocurrirá la citoquinesis.
Cdc14
Cdk-M
citoquinesis
Cdc14
nucleoloquinasas
(Cdc15)
Durante interfase y mitosis temprana la fosfatasa Cdc14 es retenida
inactiva en el nucleólo. Al final de la anafase es liberada y defosforila
al cofactor Cdh1, permitiendo su unión a APC/C y su activación.
APC-Cdh1
Cdc14 PRC1, kinesin MTs del huso intermedio
PRC1, kinesinas
levadura salvaje
mutante de cdc14
PRC1: Protein Regulator of Cytokinesis, es una MAP que se une a microtúbulos anti-paralelos polares y estabiliza la zona media.
células arrestadas en la citoquinesis
Green et al Annu Rev Cell Dev Biol 2012
Secuencia de eventos durante la citoquinesis en células animales
(a) En anafase, extremos (+) de
microtúbulos anti-paralelos
polares se superponen en la zona
ecuatorial del huso mitótico y son
estabilizados por Kinesinas
(KIF4) y PRC1. Un complejo
multi-proteico define la zona
media donde se ensambla el
anillo contráctil y se recluta RhoA.
(b) RhoA activa forminas y dirige el
ensamble de un anillo de actina y
miosina contráctil.
(c) Anillina y otras proteínas
“scaffold” anclan el complejo
contráctil a filamentos proteicos
de septinas asociados a la
membrana. El anillo contráctil
estrangula la célula y aproxima
las membranas.
(d) (e) La fusión de las membranas y
la absición requiere del ensamble
de filamentos de proteínas
ESCRT en las zonas flanqueantes
al cuerpo medio.
RhoA
Forminas
RhoK myosin
PRC1: Protein Regulator of Cytokinesis, PRC une a microtúbulos polares antiparalelos.
ESCRT: Endosomal Sorting Complexes Required for Transport
midbody
absición
REGULADORES POSITIVOS Y
NEGATIVOS DEL CICLO CELULAR
EN CÉLULAS DE MAMÍFEROS
Una red compleja de interacciones funcionales en G1 determina el arresto o transición de las células a la fase S
Johnson & Skotheim, 2013
p16β-catenin
cytokines
STATs
Tcf
ECMTGFβ
Alberts et al., BMC 2008
Proteínas reguladoras del ciclo celular
Proteínas reguladoras del ciclo celular
Lodish et al., MCB 2016
Resumen de eventos en S. cerevisiae
G1
Cdc28-Cln3
Cdc28-Cln1
Cdc28-Cln2
S
Sic1
temprana tardía
Cdc28-Clb5
Cdc28-Clb6
inactivas
Sic1
fosforilación
G2 M
anafase
APC
activo
Cdc28-Clb1
Cdc28-Clb2
Cdc28-Clb3
Cdc28-Clb4
Cdc28-Clb5
Cdc28-Clb6
proteólisis
APC
inactivofosforilado e inactivo activación
fosforilación
Whi5 SBF
↑transcripción
inactivación
inhibidor de
la fase S
Cdc28-Clb5
Cdc28-Clb6
activas
proteólisis
SCF Cdc28-Clb3
Cdc28-Clb4
activas síntesis
del DNA
Cdc7=DDK4
kinasa
complejos activos
ensamble de complejos
de pre-replicación
inhibición del ensamble de nuevos
complejos de pre-replicación
Cdc28-Clb1
Cdc28-Clb2
activas
telofase
inhibidor de
la anafase
↑transcripción
Cdc20
fosforilación
Cdc25
Wee
CAK
Cdh1
Cdh1
La nomenclatura corresponde mayormente a reguladores identificados en levaduras
Whi5 es un inhibidor transcripcional; SBF es un factor que promueve la transcripción de ciclinas de G1/S
APC
activo
Cdc28-Cln3
Cdc28-Cln1
Cdc28-Cln3
proteólisis
SCFCdc14
Nomenclatura comparada y eventos críticos
MPF ~ Cdc28-Cicl B ~ Cdc2-Cdc13 ~ Cdk1- cicl B
Xenopus S. cerevisiae S. pombe vertebrados
mid G1 Cln 3 Cdc28 D (1-4) Cdk4/6 ↑E2F, ↑SBF, ↓Whi5, ↓Rb
G1/S Cln 1, 2 Cdc28 E Cdk2 ↓APC, ↓Sic1, ↓Cdh1
S B 3-6 Cdc28 A Cdk2 ↑replicación del DNA, ↓Cdh1, ↓Cdt1
M B 1-4 Cdc28 B Cdk1 ↑APC, ↑huso mitótico, ↑división nuclear
ciclina Cdk ciclina Cdk función
S. cerevisiae vertebrados
CONTROL O "CHECKPOINTS"
EN EL CICLO CELULAR
señal sensor mediador o transductor efector
Marechal & Zou, CSHPB2013
Diversos tipos de daño al ADN desencadenan el funcionamiento coordinado de mecanismos de reparación y checkpoint
Sensors
Transducers
Effectors
PARP: Poly ADP-Ribosa-Polymerase
MRN: Mre11-Rad50-Nbs1
Las enzimas PARP y los complejos
MRN sensan cortes del DNA y marcan
el daño. PARP sintetiza cadenas de
poly-ADP-ribosa sobre histonas
próximas al daño. Estos complejos
iniciales reclutan y activan ATM.
transducers
PARP
Lodish et al 2016
Sistema de respuesta a alteraciones del ADN(DNA Damage Response, DDR, system)
ATM: Ataxia Telangiectasia Mutated
ATR: ATM-Rad3-Related
Chk1/2: Checkpoint 1/2
Mecanismos de control o "checkpoints" aseguran la correcta duplicación,integridad y distribución del DNA a las células hijas
ATM: Ataxia Telangiectasia Mutated
ATR: ATM-Rad3-Related
Chk1/2: Checkpoint 1/2
(fosfatasa)
ATM y ATR son Ser/Thr quinasas; ATM
sensa cortes de la doble hélice, ATR sensa
alteraciones que generan cadenas simples
(ej. horquillas de replicación detenidas).
ATM/ATR fosforilan y activan a las Ser/Thr
kinasas Chk1 y 2.
(fosfatasa)
(este mecanismo opera
en S. cerevisiae).
p53 es un efector clave de la respuesta al daño del ADN
“DNA Damage Response o DDR”
En condiciones normales, p53 es una proteína inestable,
ubiquitinada por la ubiquitina ligasa Mdm2 y degradada en
proteosomas. El daño del DNA activa ATM, ATR, Chk que
fosforilan a p53 y provocan su disociación de Mdm2. De
esta manera, p53 se acumula y activa la transcripción de
CKIs y factores de reparación del DNA.
Mecanismos transcripcionales y modificaciones post-traducción inducen el arresto del ciclo y la apoptosis
daño
del DNA
activación
de quinasas
Chk1 y Chk2
p53
estabilización
Pp21CIP Cdk2
inhibición de la actividad;
degradación en proteosoma
↑ proteínas proapoptóticas:
Bax, receptores de Fas, etc
sensores &
transductores
G1/S
Cdc25 G2/MCdk1
Cdk4/6 Rb E2F
P
P
transcripción
Una red de proteínas controla el anclaje de los microtúbulos polares al cinetocoro:
control “checkpoint” de metafase
MAD: Mitotic Arrest Deficient
BUB: Budding Uninhibited by Benzimidazole
El anclaje de los MTs a los cinetocoros de los
cromosomas duplicados genera tensión en los
cinetocoros. La actividad de la quinasa Aurora-B en
cinetocoros no ocupados o con baja tensión 1)
recluta y activa las proteínas Mad/Bub que
secuestran al cofactor Cdc20, y 2) desestabilizan el
anclaje MT-cinetocoro. En ésta condición APC/C
es inactivo. La ocupación de los cinetocoros por
los microtúbulos y la generación de tensión
bloquean la asociación de Mad/Bub. En éstas
condiciones Cdc20 puede unirse y activar a APC/C.
APC/C-Cdc20 ubiquitina al inhibidor de la anafase
y dispara la anafase.
sensors
Bub, Mad
mediador Cdc20
efector APC/C
securina
Mussachio & Salmon NRNCB 2007
Mad
Bub
inactive
prometafase, baja tensión
Bub y Mad2 activados en el cinetocoro
MadBub
Cdc20active
Alberts et al 6th Ed
La correcta segregación de cromosomas en anafase depende de mecanismos que detectan anclajes aberrantes de los
microtúbulos del huso al cinetocoro. La tensión generada por dichos anclajes es detectada por la quinasa Aurora-B, localizada
en la placa interior del cinetocoro. Tensión insuficiente en el cinetocoro promueve la fosforilación e inactivación del complejo
Ncd80 localizado en la capa externa del cinetocoro involucrado en el anclaje de los microtúbulos. En condiciones de tensión
normal, NCD80 no es fosforilado y media el anclaje fuerte de los MTs a los cinetocoros.
La tensión en los cinetocoros controla el anclaje de los MTs al cinetocoro“checkpoint” de metafase
Proteínas “scaffold” del cinetocoro reclutan a los componentes de señalización Bub y Mad en condiciones de baja tensión.
Mecanismos moleculares asociados a la senescencia celular
Lujambio, Bioessays, 2016
Las células senescentes adquieren un fenotipo secretorio
característico denominado SASP que involucra la
expresión y secreción de citoquinas inflamatorias (IL-6,
8), factores de crecimiento (ej. TGFβ) y metaloproteasas
(MMPs). SASP promueve la eliminación de las células
senescentes por macrófagos en diversos procesos como
reparación y remodelación de tejidos, tumorigenesis, etc.
SASP: Senescence-Associated Secretory Phenotype
Diversas condiciones fisiológicas (fin del potencial replicativo),
patológicas (oncogénesis) e injurias (daño al ADN) activan el
programa de senescencia. Los factores coloreados en marrón y
azul promueven o suprimen el ciclo celular, respectivamente.
MDM2: Mouse Double Minute 2
p14/ARF humano es equivalente to p19/ARF in ratón
Rb: Retinoblastoma
El gen supresor de tumores CDKN2a es un regulador de senescencia frecuentemente silenciado en tumores
Zhao et al, EBioMedicine, 2016
DNA
RNA
p14/ARF p16/INK4A
CDK4/6 cyclin D Rb
E2Fs
MDM2
p53 p21
S phase
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