Что должен знать генетик о химии ДНК и химических основах мутагенеза

Санкт-Петербург, 7-11 июня 2015 г.

Что должен знать генетик о химии ДНК и химических

основах мутагенеза Никита Николаевич Хромов-Борисов

8-952-204-89-49 (Теле2); 8-921-449-29-05 (МегаФон)

[email protected] http://independent.academia.edu/NikitaKhromovBorisov

https://www.researchgate.net/profile/Nikita_Khromov-Borisov http://www.slideshare.net/ssuserb22936

Мы живем в структурированном мире

• Если бы Вселенная состояла из одних бозонов (частиц с целым значением спина), то в одном квантовом состоянии находилось бы неограниченное количество одинаковых частиц и никакой структурированности не было бы.

• Структурированность нашей Вселенной обусловлена фермионами (частицами с полуцелым значением спина).

• Тогда в одном квантовом состоянии может находиться не более одной частицы (принцип Паули).

• Именно этот принцип (запрет Паули) ответственен за устойчивость электронных оболочек атомов и делает возможным существование сложных химических элементов.

2

• Мы живем в структурированном мире.

• Поэтому наиболее плодотворный путь познания Природы состоит в выявлении взаимоотношений между структурой и функцией, структурой и активностью на всех уровнях организации материи, начиная с атомов и молекул.

• Наука, в которой такие связи установлены, приобретает предсказательную силу.

• В частности, для понимания структуры и функции ДНК и химических основ мутагенеза необходимы твердые знания основ структурной химии.

3

Нужно знать ответы на вопросы:

• Чем обусловлено разнообразие химических элементов?

• Почему углерод четырехвалентен, хотя в основном состоянии он должен бы быть всего лишь двухвалентным?

• Почему азотистые основания в нуклеиновых кислотах двухмерные (плоские), а дезоксирибоза и остаток фосфорной кислоты трехмерные?

• Почему основная (каноническая) трехмерная структура ДНК - правозакрученная винтовая линия (спираль)?

• Какие места в компонентах ДНК наиболее «слабые», т.е. наиболее подвержены химическим изменениям, каким именно изменениям и под действием каких физических и химических агентов?

4

5

6

Джеймс Уотсон и Френсис Крик

James Dewey Watson, (род. 06.04.1928);

Francis Harry Compton Crick (08.06.1916 – 29.07.2004)

7

Френсис Крик с сыном Майклом, 1942 г.

8

19 марта 1953 г. Письмо Френсиса Крика 12-летнему сыну Майклу

• Мой дорогой Майкл,

• Джим Уотсон и я сделали возможно самое важное открытие.

• Мы построили модель для структуры дез-окси-рибо-нуклеиновой-кислоты (прочти это старательно), кратко называемой Д.Н.К.

• Ты наверное помнишь, что гены в хромосомах – которые несут наследственные факторы – сделаны из белка и Д.Н.К.

• Наша структура очень красива.

• Д.Н.К. можно представить как очень длинную цепь с торчащими вбок плоскими частями.

• Плоские части называются «основаниями».

• Формула выглядит вот так:

9

• Далее, у нас присутствуют две такие цепи, обвитые одна вокруг другой – каждая является спиралью.

• Цепь, составленная из сахара и фосфора, располагается на внешней стороне, а все основания, обращены вовнутрь.

• Я не могу нарисовать ее очень хорошо, но выглядит это примерно вот так:

• Сама модель выглядит куда более привлекательной.

10

• Наконец, захватывающая вещь состоит в том, что в то время как различных оснований 4, мы обнаруживаем, что мы можем составить из них только определенные пары.

• У этих оснований есть названия.

• Это Аденин, Гуанин, Тимин и Цитозин.

• Я буду называть их A, G, T и C.

• Теперь мы обнаруживаем, что пары, которые мы можем образовать – одно основание на одной цепи объединяется с основанием на другой – это только: A с T и G с C.

Тогда на одной цепи, как мы можем видеть, можно иметь основания в любом порядке, но если их порядок фиксирован, то их порядок на другой цепи тоже фиксирован. Например, предположим, что первая цепь такая, как указано слева, то вторая должна быть такой, как справа.

11

• Это похоже на код.

• Если ты имеешь один набор букв, то ты сможешь выписать другие.

• Теперь предположим, что Д.Н.К. является кодом.

• То есть порядок этих оснований (букв) создает отличие одного гена от других (точно так же как одна печатная страница отличается от другой).

• Теперь ты можешь видеть, как Природа создает копии генов.

• Потому что когда две цепи расплетутся на две отдельные цепи, и если затем каждая цепь создаст на ней другую цепь, то поскольку A всегда объединится с T, а G с С, мы получим две копии той цепи, которую имели вначале.

12

• Другими словами, мы думаем, что мы нашли основной механизм копирования, с помощью которого живое происходит от живого.

• Красота нашей модели состоит в том, что ее форма такова, что могут образовываться только эти пары, хотя они могли бы образовываться и другим способом, если бы плавали свободно.

• Ты можешь понять, что мы очень рады.

• Через день или около того мы должны отослать письмо в Nature.

• Прочти это письмо внимательно, чтобы понять его.

• Когда вы вернетесь домой, мы покажем вам модель.

• С любовью, папа

13

Все на продажу

• Майкл Крик выставил это рукописное письмо на аукцион Кристи 10 апреля 2013 г.

• Письмо было приобретено по телефону анонимным покупателем за 5,3 миллиона долларов.

• С учетом дополнительных сборов, выручка составила чуть более $ 6 миллионов.

• Половина вырученных средств была передана Институту биологических исследований Солка в Сан-Диего, Калифорния, где Фрэнсис Крик, который умер в 2008 году, был профессором.

• Эта выручка побила рекорд письма, написанного Авраамом Линкольном, которое было продано в 2008 году за 3,4 млн. долл., включая налоговые сборы.

14

Уотсон и Крик – близнецы-братья или комплементарные и антипараллельные переплетения мысли?

15

Реконструкция модели ДНК 1953 г.

16

Урок 1

• Масштабные атомно-молекулярные модели – эффективный инструмент обучения и исследований.

17

Рентгенограмма, фото № 51 Розалинд Франклин

18

19

Розалинд Франклин (Rosalind Franklin) (25.07.1920 — 16.04.1958) — английский биофизик и учёный-

рентгенограф, занималась изучением структуры ДНК.

20

• Дж. Д. Бернал назвал снимки, полученные Франклин с помощью метода рентгеновской дифракции «одними из самых красивых снимков какого бы то ни было вещества, когда либо полученных до этого времени».

21

Джон Десмонд Бернал (John Desmond Bernal; 10.05.1901 — 15.09.1971)

• — английский физик, кристаллограф, биохимик и социолог науки, общественный деятель.

• Пионер рентгеновской кристаллографии.

• Наряду с Опариным разработал теорию возникновения жизни.

• Иностранный член АН СССР (20.06.1958), вице-президент Всемирной федерации научных работников, Президент Всемирного Совета Мира (1959—1965), лауреат Международной Сталинской премии «За укрепление мира между народами» (1953).

22

Морис Хьюг Фредерик Уилкинс (Maurice Hugh Frederick Wilkins; 15.12.1916 — 05.10.2004) — биофизик, лауреат Нобелевской премии по физиологии и медицине 1962 года (совместно с Джеймсом

Уотсоном и Фрэнсисом Криком) «за открытия, касающиеся молекулярной структуры нуклеиновых кислот и их значения для передачи информации в живой материи».

23

Урок 2

• Устанавливая структуру биомолекулы, желательно задумываться о ее биологическом предназначении, о ее биологической функции.

24

Различные уровни представления химических структур

25

26

27

Вторичная структура ДНК

28

29

Полиморфизм пространственной структуры ДНК: A, B и Z-формы

30

Полиморфизм пространственной структуры ДНК:

31

Урок 3 и его следствие

• ДНК – гибкая молекула и ее различные пространственные формы исполняют разные функции и по-разному реагируют с различными агентами.

• Иными словами, реакции ДНК с различными агентами являются топохимическими и/или контекст-зависимыми.

32

Pyne A., Thompson R., Leung C., Roy D., Hoogenboom B.W. Single-molecule reconstruction of oligonucleotide secondary structure by atomic force

microscopy, Small, 2014; 10(16): 3257–3261

33

34

35

Пептиды активного долголетия и ревитализации

• Модель комплементарного взаимодействия пептида Ala-Glu-Asp-Gly с двойной спиралью ДНК (комплекс ДНК-пептид на промоторном участке гена теломеразы).

• Хавинсон В.Х., Анисимов В.Н. 35-летний опыт исследований пептидной регуляции старения. Успехи геронтологии, 2009. Т. 22. № 1. С. 11–23.

• Хавинсон В.Х. Пептидная регуляция старения. – СПб.: Наука. 2009.

Crick F.H.C. An error in model building. Nature, 1967; 213:798

36

Урок 4

• Без подтверждения структуры с помощью масштабных молекулярных моделей всяческие гипотетические построения почти наверняка обречены на провал.

• И выводы могут оказаться ложными.

37

Нумерация атомов в молекулах оснований

38

Примеры структур нуклеотидов

39

Аденин: 6-аминопурин

40

Гуанин: 2-амин-6-оксопурин

41

Тимин: 5-метилурацил (2,4-диоксо-5-метилпиримидин)

42

Цитозин: 2-оксо-4-аминопиримидин

43

Тимин и цитозин

44

Аденин и гуанин

45

D-рибоза и D-2-дезоксирибоза

46

Рибозо-5-фосфат

47

Почему основания плоские, а дезоксирибоза – нет?

Периодическая таблица элементов Д.И. Менделеева (фрагмент)

49

Ядерный синтез и происхождение элементов

• Вскоре после второй мировой войны Георгий Антонович Гамов (трижды нелауреат Нобелевской премии) предложил захватывающую своей красотой модель нуклеосинтеза, настоящую космическую поэму.

• Поэма начинается с первого крика (Большого взрыва) нашей Вселенной, когда вся ее материя сжата в илем — сверхплотный сгусток.

50

Ядерный синтез и происхождение элементов

• Из стихотворения Демьяна Бедного «До атомов добрались» (1928)

• СССР зовут страной убийц и хамов. Недаром. Вот пример: советский парень Гамов. Чего хотите вы от этаких людей?! Уже до атома добрался, лиходей!

Георгий Антонович Гамов (Джордж Гамов, George Gamow;

20.02(04.03)1904 — 19.08.1968)

51

CNO-цикл

Ханс Альбрехт Бете (Hans Albrecht Bethe; 02.07.1906 — 06.03.2005)

Карл Фридрих фон Вайцзеккер (Carl Friedrich von Weizsäcker; 28.06.1912 — 28.04.2007)

52

Происхождение углерода

• Исходя из факта высокого содержания углерода во Вселенной, астрофизик и писатель-фантаст Фред Хойл предсказал, что для ядерной реакции порождения углерода из гелия должны существовать очень специфическая энергия резонанса и спин.

• Более того, Хойл вычислил значения этой энергии (7.68 МэВ), ядерного спина и четности компаунд-состояния в ядре углерода, образованного тремя альфа-частицами.

• Эти его предсказания вскоре были блестяще подтверждены экспериментально.

• Это было доказательство от обратного.

Sir Fred Hoyle (24.06.1915 – 20.08.2001)

53

• Изменение уровня 12С всего лишь на 5% привело бы к катастрофе − дальнейший синтез элементов прекратился бы.

• Особенности протекания реакций ядерного синтеза привели к важнейшим следствиям:

• благодаря им во Вселенной оказалось одинаковое число ядер 12С и 160, что создало благоприятные условия для образования органических молекул, т.е. жизни.

54

Урок 5

• Наука редко отвечает на вопрос «почему?»,

• чаще только на вопрос «как?».

55

Принцип Паули

• Принцип (запрет) Паули — один из фундаментальных принципов квантовой механики, согласно которому

• два и более тождественных фермиона (частиц с полуцелым спином) не могут одновременно находиться в одном квантовом состоянии.

• Принцип Паули помогает объяснить разнообразные физические явления.

• Следствием принципа является наличие электронных оболочек в структуре атома, из чего, в свою очередь, следует разнообразие химических элементов и их соединений.

56

Вольфганг Эрнст Паули (Wolfgang Ernst Pauli; 25.04.1900 — 15.12.1958) — лауреат Нобелевской

премии по физике за 1945 год.

57

Паули и Нильс Бор

58

Правило Хунда

• Определяет порядок заполнения

• орбиталей определённого подслоя и формулируется следующим образом:

• суммарное значение спинового квантового числа электронов данного подслоя должно быть максимальным.

• Сформулировано Фридрихом Хундом в 1925 году.

59

Мнемоническое правило «трамвайного вагона»

• Ты приглядись, решив присесть, К местам трамвайного вагона: Когда ряды пустые есть, Подсаживаться нет резона.

60

61

Фридрих Хунд (Friedrich Hund; 04.02.1896 — 31.03.1997) — немецкий физик. Участник разработки метода молекулярных орбиталей.

62

Почему углерод 4-валентен?

Электронная конфигурация атома углерода C

• Основное состояние:

• Возбужденное состояние:

64

Лайнус Карл Полинг (Linus Carl Pauling; 28.02.1901 — 19.08.1994) — американский химик, кристаллограф, лауреат двух Нобелевских премий: по

химии(1954) и премии мира (1962), а также Международной Ленинской премии «За укрепление мира между народами» (1970).

65

Гибридизация орбиталей

• Гибридизация орбиталей —гипотетический процесс смешения разных (s, p, d, f) орбиталей центрального атома многоатомной молекулы с возникновением одинаковых орбиталей, эквивалентных по своим характеристикам.

• Гибридизация орбиталей объясняет геометрию (пространственную структуру) молекул.

66

s и p-орбитали

67

sp3-гибрид

68

Метан

69

sp2-гибриды

70

sp -гибриды

71

http://www.mhhe.com/physsci/chemistry/essentialchemistry/flash/hybrv18.swf

72

Сравнение длин углерод-углеродных связей

73

σ-связь - ковалентная связь, образующаяся перекрыванием

электронных облаков «по осевой линии»

74

π-связь - ковалентная связь, образующаяся перекрыванием

p-атомных орбиталей

π-связь в этилене π-связи в бензоле

75

Этан, этилен, ацетилен и бензол

76

Урок 6

• Современная структурная химия исключительно плодотворно объясняет и предсказывает геометрию молекул.

77

Водородная связь

78

Пара A=T

79

Пара GC

80

Канонические пары Уотсона-Крика

81

Причины замены пар оснований:

таутомерия, ионизация, wobble или «Хугстин»?

Jerry Donohue (12.06.1920 – 13.02.1985)

• – американский физико-химик и теоретик.

• Подсказал Уотсону и Крику, какие таутомерные формы оснований ДНК являются преобладающими.

• “We are much indebted to Dr. Jerry Donohue for constant advice and criticism, especially on interatomic distances” (Watson, Crick, 1953)

83

Таутомерия

• Таутомери́я (от греч. ταύτίς — тот же самый и μέρος — мера) — явление обратимой изомерии, при которой два или более изомера легко переходят друг в друга.

• При этом устанавливается таутомерное равновесие, и вещество одновременно содержит молекулы всех изомеров (таутомеров) в определённом соотношении.

84

Таутомерия оснований нуклеиновых кислот

85

Таутомерные превращения тимина и гуанина

86

Таутомерия

87

Ионизация оснований

88

Гипотетический «таутомерный» механизм мутагенного действия 5-бромоурацила

89

Урок 7

• Таутомерный и ионизационный механизмы возникновения замен пар оснований – идеи, которые трудно доказать.

• Таутомеры образуют неразделимую смесь.

• Ионизованные формы также трудно отделить от неионизованных.

90

Канонические (уотсоно-криковские) и wobble пары оснований

91

Woblle-пары, найденные в кристаллических структурах

92

Пары Уотсона-Крика и Хугстина

93

Пара Хугстина

94

Все возможные пары оснований: 28 или 29? (в основной таутомерной форме)

95

Неканонические пары O6-MeG с T, O6-MeG и G с O4-MeT

96

Урок 8

• «Конформационный» механизм неправильного спаривания оснований представляется наболее правдоподобным.

97

Спонтанные мутации

Природные радиоактивные изотопы – неизбежное зло

99

Мутации вследствие трансмутации

• Трансмутация в физике — превращение атомов одних химических элементов в другие в результате радиоактивного распада их ядер либо ядерных реакций.

• Радиоактивный β-распад изотопа 14С:

100

Урок 9

• Никакими силами и никогда мы не сможем избавиться от радиоактивных изотопов в природе.

101

Слабые места в ДНК

Фотохимическая димеризация тимина

103

Фотодимеризация тимина

104

Димер тимина

105

Основные стереоизомеры димеров тимина

106

Взаимное расположение тиминов можно описать расстоянием d между двойными связями С5-С6 и торзионным углом η между ними. Димеризуются

только те тимины, которые разворачиваются на 22°

Для образования димера тимина требуется возбуждение УФ-излучением в течение менее одной пикосекунды (10-15 с)

107

Пионер лазерной физики

• Владилен Степанович Летохов (10.11.1939 — 21.03.2009)

• Автор более 850 статей и 15 монографий, наиболее цитируемый советский ученый во всех областях науки за период 1973—1988 годов.

108

Урок 10

• Фотодимеризация тимина – яркая демонстрация топохимической природы реакций мутагена с ДНК.

109

Спектры поглощения ДНК и озона и спектры излучения солнца на уровне моря и в стратосфере

110

Урок 11

• Озоновый слой в стратосфере действительно надежно защищает нас от вредного мутагенно-канцерогенного действия коротковолнового УФ-излучения.

111

Еще одно слабое место в ДНК

5-метилцитозин – природное модифицированное основание, встречающееся в ДНК эукариот

113

Дезаминирование 5-метилцитозина

114

5-метилцитозин Тимин

Основные продукты окисления

115

Возможные типы спаривания 8-оксо-гуанина

116

Первичные участки химически-индуцированного поражения ДНК

117

Последствия дезаминирующего действия азотистой кислоты

118

Последствия реакции гидроксиламина и метилметансульфоната (MMS) с ДНК

119

ГАП – 6-N-гидрокслиаминопурин

120

Урок 12

• Основной (мажорный) продукт реакции агента с ДНК далеко не всегда является основной причиной его мутагенности.

• Чем мягче мутаген, тем больше его видовая и локусная специфичности.

121

Атомные заряды (электронные плотности) у отдельных оснований

122

Места нуклеофильной атаки

123

Основные сайты метилирования оснований ДНК и сахаро-фосфатного остова

124

Алкилирование гуанина: (A) – EMS; (B) - DMS

125

Сшиватели

Производные бис-β-хлорэтиламина, азотистые иприты

127

Диамминдихлороплатина (цисплатин)

128

Сшиватели

129

Сшиватели: HN2 (1), DEB (2) и DEO (3)

130

Делетогены и амплигены

Брюс Натан Эймз (Bruce Nathan Ames; р. 16.12.1928) – американский биохимик. Разработал систему быстрого и дешевого испытания мутагенности соединений,

называемый тестом Эймза.

132

133

Штамм Salmonella typhimurium TA102 с мутацией hisG428Ochre (TAA) в 207 положении белка и его ревертанты

134

Целевой сайт фланкирован двумя короткими прямым повторами 5’-AGAGC-3’, что является горячей точкой для возникновения делеций. ThiAla – тиазолилаланин.

Анализ ревертантов His+ у штамма TA102

Мутаген Доля различимых ревертантов, % Общее количество His+ ThiAlaSS His+ ThiAlaS His+ ThiAlaR

Спонтанно 27% 41% 32% 311

4NQO 100% 0% 159

DEO 22% 26% 52% 337

Заключение Ochre-супрессоры

Замены пар оснований в

TAA

Малые делеции

807

135

Ревертантов, индуцированных 4NQO, не дифференцировали по степени чувствительности к ThiAla

1,3- 1,6- и 1,8-динитропирены

136

У Streptomyces antibioticus они вызывают амплификацию кластера генов синтеза олеандомицина (Бехтерева Т.А. и др.)

Урок 13

• Делетогены и амплигены заслуживают пристального внимания.

137

Frederick Joseph de Serres, Jr. (24.09.1929 - 21.12.2014)

138

139

Khromov-Borisov N.N., Rogozin I.B., Henriques J.A.P. de Serres F.J. Similarity pattern analysis in mutational distributions. Mutation Research, 1999;

430:55–74

140

141

Урок 14

• Анализ и сравнение мутационных спектров – продуктивный подход к выявлению сходства и различий между мутагенами.

142

Ashby J. Fundamental structural alerts to potential carcinogenicity or noncarcinogenicity. Environmental

Mutagenesis, 1985; 7: 919-921.

143

Benigni R., Bossa C. Structural alerts of mutagens and carcinogens. Current Computer-Aided Drug Design, 2006, 2, 1-19

144

Три типа взаимодействия лиганда с дуплексом ДНК

145

Интеркаляция этидия между двумя парами G=C

146

Комплекс двух молекул дауномицина с ДНК

147

Комплекс дистамицина с ДНК

148

Ковалентное связывание антромицина с ДНК

149

Связывание калихеамицина с ДНК

150

Связывание есперамицина А с ДНК

151

Уроки

• 1. Масштабные атомно-молекулярные модели – эффективный инструмент обучения и исследований.

• 2. Устанавливая структуру биомолекулы, желательно задумываться о ее биологическом предназначении, о ее биологической функции.

• 3. Реакции ДНК с различными агентами являются топохимическими и/или контекст-зависимыми.

• 4. Без подтверждения структуры с помощью масштабных молекулярных моделей всяческие гипотетические построения почти наверняка обречены на провал.

• 5. Наука редко отвечает на вопрос «почему?», чаще только на вопрос «как?».

• 6. Современная структурная химия исключительно плодотворно объясняет и предсказывает геометрию молекул.

• 7. Таутомерный и ионизационный механизмы возникновения замен пар оснований – идеи, которые трудно доказать.

• 8. «Конформационный» механизм неправильного спаривания оснований представляется наболее правдоподобным.

•

152

• 9. Никакими силами и никогда мы не сможем избавиться от радиоактивных изотопов в природе.

• 10. Фотодимеризация тимина – яркая демонстрация топохимической природы реакций мутагена с ДНК.

• 11. Озоновый слой в стратосфере действительно надежно защищает нас от вредного мутагенно-канцерогенного действия коротковолнового УФ-излучения.

• 12. Основной (мажорный) продукт реакции агента с ДНК далеко не всегда является основной причиной его мутагенности.

• Чем мягче мутаген, тем больше его видовая и локусная специфичности.

• 13. Делетогены и амплигены заслуживают пристального внимания.

• 14. Анализ и сравнение мутационных спектров – продуктивный подход к выявлению сходства и различий между мутагенами.

153

Найдите ошибку

154

Памятник лабораторной мыши в новосибирском Академгородке

155

Слайды свободно доступны для всех

Никита Николаевич Хромов-Борисов [email protected]

http://independent.academia.edu/NikitaKhromovBorisov https://www.researchgate.net/profile/Nikita_Khromov-Borisov

http://www.slideshare.net/ssuserb22936 8-952-204-8949 8-921-449-2905