VIRUS DE L’HEPATITE C & Marqueurs Stéphane Chevaliez Centre National de Référence Des Hépatites B, C et delta Laboratoire de Virologie & INSERM U955 Hôpital Henri Mondor Université Paris XII Créteil VIRUS DE L VIRUS DE L ’ ’ HEPATITE C HEPATITE C & Marqueurs & Marqueurs St St é é phane Chevaliez phane Chevaliez Centre National de R Centre National de R é é f f é é rence rence Des H Des H é é patites B, C et delta patites B, C et delta Laboratoire de Virologie & INSERM U955 Laboratoire de Virologie & INSERM U955 H H ôpital Henri Mondor ôpital Henri Mondor Universit Universit é é Paris XII Paris XII Cr Cr é é teil teil
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VIRUS DE L’HEPATITE C& Marqueurs
Stéphane Chevaliez
Centre National de RéférenceDes Hépatites B, C et delta
Laboratoire de Virologie & INSERM U955Hôpital Henri MondorUniversité Paris XII
Créteil
VIRUS DE LVIRUS DE L’’HEPATITE CHEPATITE C& Marqueurs& Marqueurs
StStééphane Chevaliezphane Chevaliez
Centre National de RCentre National de RééfféérencerenceDes HDes Héépatites B, C et deltapatites B, C et delta
Laboratoire de Virologie & INSERM U955Laboratoire de Virologie & INSERM U955HHôpital Henri Mondorôpital Henri MondorUniversitUniversitéé Paris XIIParis XII
CrCrééteilteil
Virus de l’Hépatite CI. Aspects VirologiquesVirus de lVirus de l’’HHéépatite Cpatite C
I. Aspects VirologiquesI. Aspects Virologiques
Virus de l’Hépatite CVirus de lVirus de l’’HHéépatite Cpatite C
•• Famille : Famille : FlaviviridaeFlaviviridae
•• Genre : Genre : HepacivirusHepacivirus
Phylogénie de la région codant la protéine NS5B
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
Adapted from Simmonds et al., 1999; 2001.
•• Famille : Famille : FlaviviridaeFlaviviridae
•• Genre : Genre : HepacivirusHepacivirus
•• HHôte naturel : Hommeôte naturel : Homme
•• Tropisme : HTropisme : H éépatocytepatocyte
Virus de l’Hépatite CVirus de lVirus de l’’HHéépatite Cpatite CVirus de l’Hépatite C et Marqueurs
Organisation StructuraleOrganisation StructuraleOrganisation StructuraleVirus de l’Hépatite C et Marqueurs
Organisation GénomiqueOrganisation GOrganisation GéénomiquenomiqueVirus de l’Hépatite C et Marqueurs
Moradpour et al., Nature Reviews Microbiology, 2007; 5: 453-463.
Protéines structurales Protéines non structurales
Fonction des Protéines du VHCFonction des ProtFonction des Protééines du VHCines du VHCVirus de l’Hépatite C et Marqueurs
Protéines VHC Fonction
Capside Nucléocapside
F/ARF ?
E1 Enveloppe, domaine de fusion
E2 Enveloppe, liaison au récepteur
P7/NS1 Canal ionique Ca-dépendant
NS2 Autoprotéase NS2-3
NS3 Sérine protéase
NTPase/hélicase
NS4A Cofacteur de NS3
NS4B Inducteur de la formation du "membranous web"
NS5A Indispensable à la réplication, transactivateur?
NS5B ARN polymérase ARN-dépendante
Protéine de CapsideProtProtééine de Capsideine de CapsideVirus de l’Hépatite C et Marqueurs
– Composant essentiel de la particule virale
(nucléocapside)
– Form é de deux domaines D1 et D2
– Interaction avec le m étabolisme lipidique
. Inhibition de la MTP et de la sécrétion des VLDL
. Interaction via le domaine D2 avec les gouttelettes lipidiques
– Rôle dans la pathogenèse
. Déterminant majeur des lésions hépatiques (stéatose, …)
Piodi et al., Hepatology 2008, 48(1): 16-27.
VHC génotype 1b
xyz
xy
z
Piodi et al., Hepatology 2008, 48(1): 16-27.
Protéine NS3ProtProtééine NS3ine NS3Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
– Deux régions
. Sérine protéase (région N-terminale)
. NTPase/hélicase (région C-terminale)
– Modulateur de la réponse interféron via les TLR3
Inhibition de la Production d’IFN par NS3Inhibition de la Production dInhibition de la Production d’’IFN IFN par NS3par NS3
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
Protéine NS3ProtProtééine NS3ine NS3Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
– Deux régions
. Sérine protéase (région N-terminale)
. NTPase/hélicase (région C-terminale)
– Modulateur de la réponse interféron via les TLR3
– Cibles de molécules antivirales
. Telaprevir (VX-950, Vertex)
. Boceprevir (SCH503034, Merck)
. R7227 (ITMN191, Roche/Intermune)
OPM Database, University of Michigan, College of Pharmacy.
Site actifSite actif((His57, Asp 81, Ser139)
Telaprevir (VX-950)
Boceprevir (SCH 503034)
R7227 (ITMN 191)
-5
-4
-3
-2
-1
0
1
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Days on treatment
Log
HC
V R
NA
red
uctio
n fr
om b
asel
ine
Baseline
Placebo (n=6)
Telaprevir 450mg q8h(n=10)
Telaprevir 1250mg q12h (n=10)
Telaprevir 750mg q8h(n=8)
-4,41
-0,21
-2,21
-2,37
Reesink et al., Gastroenterology 2006, 131: 997-1002.
Activité Antivirale du TVRActivitActivitéé Antivirale du TVRAntivirale du TVRVirus de l’Hépatite C et Marqueurs
Lesburg et al., Nat struct Biol 1999, 6: 937-943; Bressanelli et al., Proc Natl Acad Sci USA 1999, 96: 13034-13039; Ago et al., Srructure Fold Des 1999, 7: 1417-1426.
Protéine NS5B: RdRpProtProtééine NS5B: RdRpine NS5B: RdRpVirus de l’Hépatite C et Marqueurs
Réplication
– Modèle du poliovirus. Virus à ARN monocaténaire de polarité positive
De Clercq., Nature Review Drug Discovery, 2007; 6: 1001-18
Réplication ViraleRRééplication Viraleplication ViraleVirus de l’Hépatite C et Marqueurs
• Epidémie à VHC au sein d’une unité d’hémodialyse en Grèce (" Papageorgiou General HospitalPapageorgiou General Hospital" , Thessaloniki), Thessaloniki)
• 17 patients hémodialysés contaminés en quelques mois
• Analyses génétique et phylogénique
• Etude de la réponse neutralisante– Système HCVpp
Lavillette et al., J Virol 2005;79:6023-34
Transmission Nosocomiale en GrèceTransmission Nosocomiale en GrTransmission Nosocomiale en GrèèceceVirus de l’Hépatite C et Marqueurs
Est-ce que le VHC est présent et en quelle quantité ?
Détermination du Génotype
Quel type de VHC est présent ?
Tests Qualitatifs - Quantitatifs
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Intérêts de la Détection -Quantification de l’ARN VHCIntIntéérrêts de la Dêts de la Déétection tection --Quantification de lQuantification de l’’ARN VHCARN VHC
• Evaluation de la réplication virale chez des patients anticorps anti-VHC positifs
• Evaluation de la réponse virologique au cours du traitement standard
• Forces– Quantification indépendante du génotype– Tolérance de polymorphismes nucléotidiques– Faible volume de prise d’essai– Large intervalle de quantification linéaire
. ≥ 6,90 Log10 UI/mL
• Faiblesses– Faible sensibilité
. LLOD: 2,80 Log10 UI/mL
– Faux positifs dans les faibles valeurs – Méthode semi-automatisée (Siemens system 440 analyzer)– 12 contrôles par run
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Principe des TechniquesPrincipe des TechniquesPrincipe des Techniques
b-DNA PCRBranched DNA Polymerase chain reaction
Amplification du signal Amplification de la cible
Quantitative Quantitative
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Avantages Techniques de la PCR en Temps Réel
– Diminution du risque de contamination
– Amélioration de la sensibilité
– Augmentation de l’intervalle de quantification lin éaire
– Précision et reproductibilité
– Augmentation de d ébit à travers l’automatisation
– Diminution des co ûts
Stratégie diagnostique & suivi virologique
10 102 103 104 105 106 107 108
Cobas AmplicorHCV Monitor v2.0
SuperQuant
LCx HCV RNAAssay
Versant HCV RNA3.0 (bDNA)
Intervalles de QuantificationStratégie diagnostique & suivi virologique
Différences de QuantificationDifférences de QuantificationStratégie diagnostique & suivi virologique
Absence de Détection de l’ARN Viral de Patients Infectés par un VHC de Génotype 4Absence de Détection de l’ARN Viral de Patients Infectés par un VHC de Génotype 4
Quantification de Transcrits d’ARN Sauvages ou Mutés en Position 145 et/ou 165 Quantification de Transcrits d’ARN Sauvages ou Mutés en Position 145 et/ou 165
Chevaliez et al., Hepatology, 2009, 50(5): 1681.
HCV 5’NC sequence
Measured HCV RNA levels (Log10 IU/mL)
Real-time PCR assays bDNA assay
CTM m2000 Versant 3.0
Wild-type (G145 and A165)
5.73±0.13 6.05±0.10 6.43±0.01
Single mutant (G145 A and A165)
4.02±0.13 6.00±0.11 6.69±0.02
Single mutant (G145 and A165T)
4.28±0.35 5.88±0.20 6.30±0.02
Double mutant (G145 Aand A165 T)
<1.08* 5.95±0.25 6.60±0.18
*Target not detected
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Chevaliez et al., J Clin Microbiol, 2009,47(6):1726-32.
Quantification de l’ARN VHC(m2000, Abbott)Quantification de l’ARN VHC(m2000, Abbott)
Méthodes Moléculaires de GénotypageMMééthodes Molthodes Molééculaires de Gculaires de Géénotypagenotypage
• Séquençage direct des produits d’amplification 1
• Hybridation inverse des produits d’amplification su r support solide : Line Probe Assay (INNO -LiPA HCV, Innogenetics)
• PCR en temps réel à l’aide de primers et/ou sondes génotype spécifiques
• Autres m éthodes :– Restriction fragment length polymorphism analysis (RFLP)– Single-strand conformation polymorphism analysis (SSCP)– Spectrométrie de masse MALDI-TOF après miniséquençage
Arens et al., J Clin Virol, 2001; 22:11-29; Davidson et al., J Gen Virol 1995; 76: 1197-204; Lareu et al., 1997; Le Pogam et al., 1998; J Clin Microbiol; 36: 1461-3; Ilina et al., J Clin Miocrobiol, 2005; 43(6): 2810-15.
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Analyse Après Séquençage Direct
• The reference method
• Direct sequence analysis of NS5B or, eventually , E1 is used for accurate genotype and subtype determination
• Direct sequence analysis of the 5’UTR can be used in clinical practice.
Stratégie diagnostique & suivi virologique
TRUGENE® HCV 5’NC Genotyping (Siemens)
• One-step RT-PCR generating a 244-bp fragment
• PCR products are sequenced in both senses
• Forward and reverse sequences are aligned with prototype reference strain sequences from the GeneLibrarian database
• The HCV genotype is determined by sequence homology
Young et al., J Clin Microbil, 1993; 31: 882-86; Roos et al., J Cli Microbiol, 2000; 38(10): 3581-84; Germer et al., J Clin Microbiol, 2003; 41(10): 4855-577
Stratégie diagnostique & suivi virologique
• Pros– Reference method for HCV genotype and subtype
determination– Can be used, with the appropriate target region, for
. Identification of new subtypes
. Molecular epidemiology studies
– Assays are available for use in clinical practice
• Cons– Mixed genotype infections are not detected– Labor intensive and time-consuming– Costly
Analyse Après S équen çage DirectStratégie diagnostique & suivi virologique
• Line probe assay
• Based on reverse hybridization of PCR products onto genotype-specific probes
• Two generations of assays– 1st-generation assay: probes in the 5’UTR – 2nd-generation assay: probes in the 5’UTR and
• Pros– Easy to use and potential semi-automation (Auto-
LiPA)– Cheaper – Mixed genotype infections can be detected
• Cons– Should not be used for identification of new
subtypes or molecular epidemiology studies because of possible mis-subtyping
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Hybridation Inverse
Intérêts de la Détermination du Sous-Type ?IntIntéérrêts de la Dêts de la Déétermination du termination du SousSous--Type ?Type ?
• DAA drugs may have different antiviral efficacies on different HCV genotype 1 subtypes in vitro and in vivo
• DAA drugs administration may be associated with different resistance profiles with different HCV genotype 1 subtypes in vitro and in vivo
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Activité Antivirale Sous-Type Dépendant
• BILB 1941, an NNI inhibitor of HCV RNA-dependent RNA polymerase, showed better antiviral efficacy in HCV subtype 1b than in subtype 1a
– In vitro, EC50s: 84 nM in subtype 1a vs 153 nM in subtype 1b
– In vivo, over 5 days of administration in HCV-infected patients
Erhardt et al., Antivir Ther 2009, 14: 23-32.
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Profil de Résistance Sous-Type Dépendant
• HCV genotype 1 subtype-specific resistance to telaprevir – In vitro, R155K substitutions are selected only in genotype
1a replicons– In vivo, amino acid substitutions at positions 36 and 155 are
selected only in patients infected with subtype 1a
• HCV genotype 1 subtype-specific fitness of variants resistant to HCV-796– In patients infected with subtype 1b, the C316Y substitution
is found alone in fit resistant variants– In patients infected with subtype 1a, the C316Y substitution
requires additional substitutions to gain full fitness
Kieffer et al., hepatology 2007, 46: 631-639; Sarrazin et al., Gastroenterology 2007, 132: 1767-1777;; Delano et al., 1st International Workshop on HepC Resistance and New Compounds 2006; McCown et al., Antimicrob Agents Chemother 2009.
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Importance de la Région Virale pour la Détermination du Sous-typeImportance de la RImportance de la Réégion Virale gion Virale pour la Dpour la Déétermination du Soustermination du Sous--typetype
Chevaliez et al., PLoS One 2009, 4(12): e820.
1st Generation of Line Probe Assay
(LiPA 1.0)
2nd Generation of Line Probe Assay
(LiPA 2.0)
RealTime HCV Genotype II
Sequence Analysis of the 5’NCR
GT 1a(n=237)
GT 1b(n=263)
77.6%(n=184)
90.5%(n=238)
70.5%(n=167)
91.3%(n=240)
97.5%(n=231)
96.2%(n=253)
93.2%(n=220)
88.6%(n=233)
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Intérêts des "Nouveaux" Tests Sérologiques ?IntIntéérrêts des "Nouveaux" êts des "Nouveaux" Tests Tests SSéérologiques ?rologiques ?
• Détection - quantification de l’antigène de capside (AgC)
• Test de détection des antigènes et des anticorps (combo)
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Antigène de Capside : Marqueur Indirect de la Réplication Virale
Bouvier-Alias et al., Hepatology 2002, 36(1): 211-218.
r = 0.92; p < 0.0001
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Intérêts de la Détection-Quantification de l’Ag de Capside• Diagnostic de l’infection virale C
– Marqueur sérologique précoce. Réduction de la fenêtre sérologique à environ 20 jours. Génotype-indépendant
– Facile à mettre en œuvre, rapide, bon marché (ELISA automatisée)
– Trousse commerciale
• Décision de traiter et Monitoring de l’efficacité du traitement – Marqueur indirect de la réplication virale
. 1 pg d’Ag C ≈ 8 000 UI/mL ARN
– Alternative aux méthodes moléculaires de quantification de l’ARN– Seuil de quantification équivalent à 20 000 UI/mL d’ARN
Bouvier-Alias et al., Hepatology 2002, 36(1): 211-218; Mehdi et al., Clin Biochem. 2008, 41(18):1493.
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Détection Simultanée Ag/Ac (Test Combo)• Diagnostic de l’infection virale C
– Réduction de la fenêtre sérologique (~20 jours). ~60 jours avec les dernières générations de trousses anticorps. ~40 jours ave les trousses Combo
– Alternative aux méthodes de DGV– Facile à mettre en œuvre, rapide (ELISA automatisé)– Trousses commerciales
– Pas aussi sensible que les méthodes qualitative de détection de l’ARN et de détection de l’Ag de capside
Laperche et al. J Clin Micribiol 2005, 43(8): 3877-3883; Alzahrani AJ., J Med Virol 2008, 80(4): 603-6.
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Virus de l’Hépatite CIII. Diagnostic Virologique
Virus de l’Hépatite CIII. Diagnostic Virologique
Diagnostic de l’Infection AiguëDiagnostic de lDiagnostic de l’’Infection AiguInfection Aiguëë
Ac anti-VHC
-
-
+
+
ARN VHC*
-
+
-
+
* Technique sensible seuil de détection ≤ 10-15 UI/mL
Diagnostic
Absence d’infection aiguë
Infection aiguë C
Probablement pas d’infection aiguë
Difficile de conclure
Stratégie diagnostique & suivi virologique
• Facteurs supplémentaires à prendre en compte chez des populations à risque
– Niveaux de charges virales
– Variation de la charge virale 4 et 10 semaines après la suspicion de l’hépatite aiguë
– Activité sérique des transaminases
McGovern et al., CID 2009, 49: 1051-1060.
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Diagnostic de l’Infection AiguëDiagnostic de lDiagnostic de l’’Infection AiguInfection Aiguëë
Algorithme pour le Diagnostic de l’Hépatite Aiguë*
*population à risque (IDVU)
Suspicion d’hépatite aiguë
SéroconversionARN VHC
< 5Log10 UI/mLFluctuations ARN>1 Log10 UI/mL
Fluctuations ARN<1 Log10 UI/mL
ouARN VHC
> 5 Log10 UI/mL
Hépatite aiguëProbabilité
élevée
ALAT> 7xLSN ALAT> 7xLSN
Probabilitémodérée
Probabilitéfaible
McGovern et al., CID 2009, 49: 1051-1060.
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Diagnostic de l’Infection ChroniqueDiagnostic de lDiagnostic de l’’Infection ChroniqueInfection Chronique
– Détection des anticorps anti-VHC totaux par ELISA
– Recherche d ’ARN du VHC par un test sensible*
– Détection d ’ARN du VHC* si le test ELISA est n égatif chez des patients h émodialysés ou immunod éprim és
* Technique sensible seuil de détection ≤ 10-15 UI/mL
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Virus de l’Hépatite CIII. Prise en Charge Thérapeutique
Virus de l’Hépatite CIII. Prise en Charge Thérapeutique
Intérêts des Tests Virologiques en ThérapeutiqueIntIntéérrêts des Tests Virologiques en êts des Tests Virologiques en ThThéérapeutiquerapeutique
Optimisation du Traitement en Fonction de la Réponse VirologiqueOptimisation du Traitement en Optimisation du Traitement en Fonction de la RFonction de la Rééponse Virologiqueponse Virologique
• Outils virologiques sensibles– Sensibilité : 10-15 UI/mL– Evaluation de la réponse au traitement
• Répondeurs virologiques rapides– Raccourcissement de la durée de traitement
• Répondeurs virologiques précoces partiels– Allongement de la durée de traitement
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Raccourcissement de la Durée de Traitement
Réponses aux Semaines 4 et 12 : Facteur Pronostique de la RVS
RVR à S4 Absence de RVP à S24
Martinot-Peignoux et al., Ant Therapy 2009, 14: 501-511.
• Durée de traitement de 6 mois chez tous les patients avec une RVR ind épendamment du génotype
• Raccourcissement de la durée de traitement à 12 ou 16 semaines chez les patients infectés par une g énotype 2/3 avec un ARN ind étectable à S1 ou S2 (?)