30/07/2015 Dx. Bacteriológico - mód 6 - Dr. Esteban Riera - [email protected]1 Procesamiento bacteriológico de muestra de piel Esteban Riera Disertante Avalado por Organizado por Charla 02 Curso Diagnóstico Bacteriológico Mód. 6:“COMO PROCESAR E INTERPRETAR UN CULTIVO DE PIEL Y PARTES BLANDAS” Procesamiento de muestra • Guías Generales: 1) Muestras en hisopos: _ Homogeneizar en solución salina estéril y sembrar en medios de cultivo; hacer frotis; 2) Muestras en jeringa: _ inocular directo en medios; hacer frotis; _ Inocular en medios para anaerobios: Agar Brucella al 5% sangre oveja, vitamina K, Hemina; agregado amica y vanco; 2 Toma de muestra • Guías Generales: 3) Biopsias y tejidos: _ macerar la Bx. o tejido en mortero con arena estéril; 3 Procesamiento de muestra • GRAM _ para todas las muestras; _ presencia de PMN indica infección; _ presencia de CEP sugiere contaminación superficial; _ cantidades relativas de m.o.; _ Correlacionar el Gram con el cultivo; 4
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• CULTIVO en aerobiosis:_ Agar Sangre al 5% s. oveja;_ Agar Chocolate;_ Caldo BHI;_ Mc Conkey
Medios especiales:_ Anaerobios;_ Listeria (Oxford con supl atb);_ Micobacterias (Lowesten Jensen);
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Procesamiento de muestra
_ Evaluar cultivos a las 24 y 48 h;_ Cultivos para fastidiosos incubar hasta 5 días
adicionales;_ Informe preliminar a las 24 h, e informes
parciales y finales;_ Caldos incubar hasta 7 días;
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Procesamiento de muestra
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Interpretación del cultivoMedios de cultivo
Placas +Cdo -/+
Placas -Cdo +
Placas -Cdo -
Registrar tipo y cantidad de col
Gramdel cdo
Inf. Preliminar:estéril ≤ 24 h
Gram, ID preliminar Inf. Preliminar:“Escaso crec de…….aislado del cdo de enriquecimiento
Re-incubar
Inf. preliminar
ID y ATB
Inf. Final
Sub-cultivo en medios cultivo sólidos
negativoPositivo
MÉTODOS PARA IDENTIFICACIÓN_ PRUEBAS RÁPIDAS:
o Gram;o Catalasa;o Coagulasa en lámina;o Látex para S. aureus;o Oxidasa;o PYR (L-pyrrolidonyl-β-naftilamina);o Serología para Streptococcus β-hemolíticos;
Morfología de la colonia:_ 1-3 mm diám. en 24 h;_ 3-8 mm en 3 días;Excepciones:
24 a 36 h para detectar colonias de:S. aureus subsp anaerobios, S. lentus, S. auricularis, S. saccharolyticus, S. equorum, S. vitulus;
S. aureus variante pequeña: ¡48 h para ser visibles!
GRO STAPHYLOCOCCUS
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• GRO STAPHYLOCOCCUSMorfología de la colonia del S. aureus:_ pigmentadas (amarillo, dorado) o blanquecinas;_ lisa, borde entero, lig. elevadas;_ brillantes; apariencia cremosa;_ beta- o no-hemolíticas;
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• GRO STAPHYLOCOCCUSMorfología de la colonia de SCN:_ no pigmentadas; blanquecinas;_ lisa, borde entero, lig. Convexa, opaca;_ 2,5 a 6 mm diám. en 3 días;
Cocos gram-positivos catalasa positivos
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GRO MICROCOCCUS:Micrococcus luteus_ saprófito, frec. Contaminante de cultivos
inf. Pulmonares; inf. Urinarias; bacteremias: diseminación a distancia.
Staphylococcus aureus
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Significado clínico:
b) INFECCIONES NOSOCOMIALES: heridas quirúrgicas; neumonías asociadas a ventiladores; bacteremias asociado a catéteres;
Staphylococcus coagulasa negativos (SCN)
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Significado clínico de SCN: endocarditis y bacteremias:
S. caprae, S. saccharolyticus, S. simulans, S. warneri; Meningitis: S. epidermidis, S. haemolyticus Osteomielitis: S. warneri, S. simulans; ITU: S. xylosus, S. schleiferi; S. hominis, S. caprae. S. cohnii Inf. Heridas y articulaciones: S. scheliferi, S. caprae; Inf. Relacionada a cateter: S. schleiferi, S. warneri; Inf. Heridas y marcapasos: S. schleiferi;
Staphylococcus coagulasa negativos (SCN)
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Significado clínico de SCN en Veterinaria: S. intermedius: infecciones en perros
celulitis, otitis externa, pioderma, abcesos, tracto reproductor, mastitis, inf. Heridas;en el hombre: asociado a mordedura de animales
S. hyicus en cerdos, animales acuáticos;mastitis en bovinos;
MÉTODOS PARA IDENTIFICACIÓN de Staphylococcus spp.o Gram;o Catalasa;o Coagulasa en lámina;o Coagulasa en tubo;o Látex para S. aureus;o DNasa;
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Procedimiento de Identificación Staphylococcus spp.
Gram: cocos aislados, en duplos, tetradasy en racimos (Staphylé);
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Staphylococcus spp. Cultivo:
S. aureus: colonias blancas, cremosas, convexas,brillantes y lisas;
Colonias típicas de S. aureus en ASO:β-hemolíticas, color crema-doradas (aureus!);Proteína A de pared: aglutinación con látex(reacción cruzada con S. saprophyticus);
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Staphylococcus spp.
Cultivo:Staphylococcus coagulasa negativos (SCN),
16 especies de importancia clínica; diferenciar S. epidermidis de los demás SCN en muestras de sitios estériles (ej. LCR, sangre, abcesos cerrados, etc.);S. saprophyticus patógeno urinario en la mujer;(Novobiocina 5 µg – resistente)
Conservar en frasco color caramelo (evitar exposición a la luz);
Mantener refrigerado; CONTROL DE CALIDAD ANTES DE USAR: control positivo: Staphylococcus spp control negativo: Streptococcus spp
realizar catalasa en cultivos de 18 – 24 h (cultivos viejos pueden perder capacidad enzimática!);
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CatalasaPrueba de catalasaMétodo en porta-objetos_ con ansa en punta recoger de la colonia sospechosa de Staphylococcus y colocar en un porta limpio; Nota: No arrastrar agar sangre con la colonia pues
¡la sangre es catalasa +!_ Agregar una gota de H2O2 al 30%;_ Interpretación: inmediata formación de burbuja
(gas de O2) es catalasa positivo;
Staphylococcus spp.
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Staphylococcus spp.
Coagulasa
o capacidad de un m.o. de coagular el plasma;o enzima termo-estable: coagulasa;o factor de virulencia;o Diferencia Staphylococcus coagulasa positivos
de los SCN;o Tipos de coagulasa:
coagulasa ligada (endo-enzima) y(prueba en lámina)coagulasa libre (exo-enzima)(prueba en tubo);
o Plasma comercial deshidratado;o Plasma fresco obtenido en el lab.:_ Centrifugar sangre entera y separar el sobrenadante (plasma) asépticamente en tubos estériles;_ Conservar plasma líquido refrigerado (4°C) hasta 1 semana o congelado (3 meses);
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CoagulasaReactivo: PLASMA¿qué tipo de sangre usar?Factor plasmático y la sensibilidad para detectar la coagulasa del Staphylococcusvaría con especia animal;
_ plasma conejo (recomendado): coágulo más firme y mayor velocidad de coagulación;_ plasma humano (aceptable);_ Otros plasmas menos sensibles: de cerdo, caballo, bovino, pollo y carnero;
oMétodo en tuboDetecta coagulasa ligada y coagulasa libre (o extracelular):
Coagulasa libre + F. plasmático ≈ trombina;trombina
Fibrinógeno Fibrina;
Coagulasa
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Método en tubo:
PROCEDIMIENTO:o Inocular Staph en un tubo hemólisis con 0,5 mL
de plasma (conejo, humano);o incubar a 35° - 37°C y examinar a las 4 h;o Si negativo a 4 h, re-incubar a temp. Ambiente el tubo
(evita lisis del coágulo por actividad de stafilokinasa);o observar a las 24 h.
Coagulasa
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Método en tubo:
INTERPRETACIÓN:_ Coagulasa positivo: plasma se vuelve gelatina (semisólido) o cualquier grado de formación de coágulo a las 4h ó 24 h (S. aureus);
_ Coagulasa negativo: sin formación de coágulo; el plasma se mantiene líquido en el tubo; Staphylococcus sp. (coagulasa negativo) (SCN);
Coagulasa NEG
POS
COAGULASA EN TUBO
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Método en tubo:
LIMITACIONES.
o Falsos positivos: en plasmas con citrato como anticoagulante;
cultivos mixtos de Staphylococcus y bacterias que utilizan citrato;o Falsos negativos: cepas de S. aureus productores de grandes cantidades de estafilokinasas:
o para cepas autoaglutinantes o adherentes;oMayoría S. aureus producen Proteína A, independientemente de coagulasa;o Látex recubierto con IGG + proteína A = aglutinación;o S. intermedius y S. hyicus pueden dar positivo
(raro en aislamientos clínicos);o S. saprophyticus puede dar positivo; pruebas adicionales en aislamientos de orina;o reactivos comerciales;o prueba rápida para definir S. aureus en muestras
clínicas;o costoso;
Proteína A
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o Para diferenciar S. saprophyticus de otros SCN;o reactivo: discos de Novobiocina (5 µg);o antibiograma a Novobiocinao Interpretación: diámetro halo inhibición ≤ 15 mm inidica resistencia e identificación presuntiva de S. saprophyticus;
Novobiocina
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o Para diferenciar S. epidermidis del resto de SCN;o S. epidermidis no fermenta ni trehalosa ni manitol al 2% en Caldo púrpura;o Resto de SCN fermentan la trehalosa o manitol o ambos;o ≥ 95% de exactitud;
Prueba de Trehalosa-Manitol
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Staphylococcus spp.
PROCEDIMIENTOo 200 µL de caldo trehalosa-manitol (al 2%) en tubos hemólisis;o inocular un inóculo denso de Staphylococcuscoagulasa negativa;o incubar a 35°C, 4-6 h(con agitación) o 24 h sin agitación;
Método:o Hervir una suspensión de Staphylococcus en BHI caldo durante 15 min.;o Enfriar y sembrar hoyos en Agar DNA;o Incubar a 35°C durante 1 a 2 ho Interpretación:
Reacción positiva: halo rosado o rojoalrededor el hoyo. El germen es S. aureus;Reacción negativa: halo claro, pequeño,alrededor el hoyo.
Prueba de termonucleasa Algoritmo de Diferenciación de Staphylococcus spp