Characterizing the physical genome Pollack, JR & Iyer, VR. Nature Genetics Supplement. Vol 32. Dec 2002.

Characterizing the physical genome

Pollack, JR & Iyer, VR.

Nature Genetics Supplement. Vol 32. Dec 2002.

O genoma é uma estrutura EXTREMAMENTE dinâmica.

Genoma in silico = DNA

Genoma in vivo = DNA + proteínas!

Estrutura da cromatina

A expressão do genoma pode ser modificada por processos regulatórios, p.ex.

(1) metilação do DNA

(2) acetilação/desacetilação das histonas.

histona acetiltransferases (HATs) e histona desacetilases (HDACs)DNA metiltransferases (DNMT)

OS FATORES DE TRANSCRIÇÃO SÃO RECRUTADOS: INÍCIO DA TRANSCRIÇÃO.

Um mesmo fator pode regular diversos genes!

ELEMENTOS REGULATÓRIOS

Como as os fatores de transcrição, as modificações do DNA e a estrutura da cromatina atuam para especificar a expressão da informação genômica?

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP)

DNA-binding proteins are crosslinked to DNA with formaldehyde in vivo.

Isolate the chromatin. Shear DNA along with bound proteins into small fragments.

Bind antibodies specific to the DNA-binding protein to isolate the complex by precipitation.

Reverse the cross-linking to release the DNA and digest the proteins.

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP)

(1) abordagem direcionada: como um determinado fator de expressão regula a expressão de um determinado gene X?

- ChIP output = RT-PCR usando oligos gene X-específicos, primer walking no promotor.

(2) abordagem ampla: quais genes um determinado fator de expressão Y regula?

- ChIP output = clonagem e PCR usando oligos universais para sequenciamento, microarrays intergênicos.

Crosslink (formaldeído)

Sonicação

Anti-A

A

MBTAnti-A

A

MBTAnti-A

A

MBTAnti-A

Imunoprecipitação

Reverse crosslink

Purificação do DNA

INPUT

Curva padrão

DetecçãoPCR RT

0

2

4

6

8

10

12

14

R1 R2 R3 R4

regiões do promotorFo

ld ProtX IP

IgG (neg)

ChIP-on-chipCrosslink protein to DNA in vivo with formaldehyde  

Break open cells and shear DNA  

Immunoprecipitate (retira do pool aquelas sequencias não-ligadas ao Ab)

Reverse-crosslinks, blunt DNA and ligate to unidirectional linkers

Amplify and label (na amplificação há mais molde das sequências IP, e portanto Cy5 maior)

 Hybridize to array  

Novas abordagens utilizando os microarrays: alta resolução do genoma físico!

(1) Distribuição dos sítios de ligação de proteínas ao longo de todo o genoma.

(2) Mapeamento de modificações da cromatina e do DNA

(3) Estudo da replicação/recombinação do DNA

(4) Determinação de diferenças de cópias do DNA genômico (comparative genomic hybridization - CGH arrays)

Distribuição dos sítios de ligação de proteínas ao longo do genoma

Epitope tag: digoxigenin, biotin, cyanin, GFP

Cy5 = Tagged x Cy3 = noTag

Alternativas:

Cy5 = Ab contra ptn nativa x Cy3 = noIP

Cy5 = Ab contra ptn nativa x Cy3 = IPgene

Cy5 = IP glicose x Cy3 = IP metanol

Desvios da razão Cy5/Cy3 indicam alteração na ligação da ptn alvo naquele sítio do DNA genômico.

Mapeamento de modificações da cromatinaYeast: IP com anticorpo que reconhece residuos de lisina acetiladas.

Cy5 = IP wild x Cy3 = IPHDAs

ALTERNATIVA: E.coli Dam metilase: fusão de ptn de interesse com Dam cria padrão de metilação atípico no DNA-alvo da ptn.

Ao invés de imunoprecipitar, digerir com enzima de restrição sensível à metilação cria fragmentos que são isolados por fracionamento de tamanho e hibridados em microarrays:

Cy5 = ptn nativa x Cy3 = ptn-Dam

Sítio de restrição Dam

Mapeamento de modificações do DNA

Em mamíferos, o DNA genômico é metilado na maioria dos dinucleotídeos CpG, exceto nas chamadas (G+C)-rich-CpG islands – normalmente associadas a promotores funcionais.

REPRESSÃO DA TRANSCRIÇÃO: ocorre recrutamento de ptns que se ligam a metil-CpGs e histonas deacetilases (HDACs) silenciamento da expressão gênica pela cromatina.

Este padrão de metilação é mantido inclusive durante a replicação do DNA (a fita molde guia a metilação da fita nascente).

CÂNCER: padrão aberrante de metilação hipermetilação das ilhas de CpG silencia os tumoral supressor genes.

Mapeamento de modificações do DNAIlhas CpGs com padrão aberrantes de metilação NÃO SÃO reconhecidas pela enzima de restrição sensível a metilação.

Cy5 = tumor x Cy3 = normal

ALTERNATIVA: arrays de oligonucleotídeos permitem discriminar diretamente os dinucleotídeos CpG metilados e não metilados. COMO?

C[un] U

C[met] UX

Determinação de diferenças de cópias do DNA genômico (CGH arrays)

DNA sonicado proveniente de amostras distintas é marcado e hibridizado contra fragmentos de DNA CONHECIDOS (cobertura total de cromossomos). Fornece maior resolução (~1 OG) que metodologias convencionais.

Verde, deleções. Vermelho, amplificações.

Voltando ao ChIPFAK migra para núcleo quando cardiomiócito é estirado. O que ela vai fazer lá?

-Ratos sham x CoAo

- extração coração

- crosslinking DNA - ptn

- extrato nuclear

- sonicação Input

- imunoprecipitação anticorpo anti-FAK (2x)

- reversão do crosslinking

- isolar e purificar DNA

- clonagem

-sequenciamento

Southern blotting of sonicated genomic DNA. Lanes (each pulse refers to 10 seconds periods):1 – non sonicated;

2 – 4 pulses, 50% potency;

3 – 6 pulses, 50% potency;

4 – 8 pulses, 50% potency;

5 – 4 pulses, , 100 % potency;

6 – 6 pulses, 100% potency;

7 - 8 pulses, 100 % potency;

8 – 2 pulses, 50% potency;

9 – 2 pulses, 50% potency;

10 – 10 pulses, 50% potency.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

~2000 bp

~200 bp

1 2 MW

Lane 1: amplification product from an empty plasmid.

Lane 2: amplification product from an plasmid containing the FAK immunoprecipitaded Phospholamban gene fragment.

MW: molecular weight marker Lambda/HindIII.

Bp

23.130941665574361

23222027

~800

564

Sequenciamento do fragmento imunoprecipitado por FAK (clonado e identificado por RNWS-LD-COR-040-F06-UC.F) e busca por similaridade através de Blastn contra banco de dados do genoma de rato (Rattus norvegicus). Em verde, a região com similaridade com a sequencia depositada (ref|NW_047601.2|Rn20_WGA2123_3 Rattus norvegicus chromosome 20 genomic contig). E-value: e-110. Em negrito, a região codificante do gene (início da tradução no códon ATG destacado).

>RNWS-LD-COR-040-F06-UC.F date:2005-08-23.101956NCCAGGGGGGGTTTGTTTGTCCTGACAAGCACCGACGCTTTCTCAACCCAACGTTTTAGCCCGCCTTTTGACGAATACTTTTTCCAAGGNCGCCGAAAAGAGGGCAGCTTTCATTTGGCTGCCTGTTGCCAACTTTTTATCTATCACTTGACCACTTAGAAAAACTTGTCTCCCTACTTTTGCCTTCCTGGCATAATGGAAAAAGTGCAATACCTCACTCGCTCGNCTATCAGGAGAGCCTCCACTATTGAAATGCCTCAGCAAGCACGTCAGAATCTCCAGAACCTATTTATCAATTTCTGCCTCATCTTGATATGTCTGCTGCTGATCTGCATCATTGTGATGCTTCTGTGAAGAGCTGCCGCCACTCCAGACCTGCAACATGCCAACTCAGCTTAAAGCCGAGCACTCCGTCATGGGGGGAAGCAACGCACCGCTGCCTTTTCGGCTGAGAACAAGCTTTGTGGAGAGGGCACCGATTTAAGAGTGGAAACTAAAATTGTTTAGGCCAANGGGAATTCAATCTGGCTGGGAAACCTGGGAAAAACCAAAACTTTTACCAGNGGGCCTAAAATGGTGGCCATAAATGGGAGGCTGGCCAAAAATTTCCCTCCAACAAAGGGGCGCAAAAAAATTTGCTTTTTCCTAAAAATAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGGGAATTTTTTGGGGGGCCGCAAGAGGTTTTATTCCTTTTAAGGGGGGGGGTGATATTGTAGTCTTGGCCCTCGGGCCCGGGGTTTCCACAAACCCGGGGCCTGGGGGGGAAAAACACCACCGGTGGNGTAAACCCTCTTTTTTTGNTTTTGTGGGGGGGGAGCTTAAAANNNGNGNGNGGTANNNNGNGGNNNTNNNNNNNNNNNNNNNNTNAGNNGNNGGGNNGNGNNGNGNNNANNTGGTAGTGGCGTCGTTGTTTGGTGTTGTTGNCTGTGTAATTNCTCGTGTGGGTTTCTCTCTGTTGCTCNNCNGTCGCGTCGGTCGTGTTTGCGTTCTTCTCTCCCCTGTGGCTCGTCCTTGTTCCGTTTCCGTGTCNTTTGCTTTTCCTTCCTTTTGTCACTCTCGTTGCATT

cromossomo 20HIT FragmentoF06

HIT Proteína

ATG

BLASTn - Phospholamban [Pln] (Rattus norvegicus)