Ch.3 Propriétés Et Analyses Des Protéines

7/26/2019 Ch.3 Proprits Et Analyses Des Protines

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Chapitre 3 Proprits et Analysesdes protines

1.Isolement des protinesA. Choix dune source de protines

.C. Stabilisation des protinesD. Dtection des protines

E. Stratie nrale de puri!ication deprotines


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2. Solubilit des protinesA. "n!luence de la concentration en selsB. "n!luence du p#

3. Separation par chromatographie

. ro a ora e ar c a e oB. Chro$atoraphie par !iltration sur elC. Chro$atoraphie da!!init


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4. ElectrophorseA. SDS%PA&EB. 'ocalisation isolectrique

5. Ultracentriugation

. race r ua o r ara )e


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!. "tection des protines

*orsquon puri!ie une protine+ on doit pou)oir la$esurer quantitati)e$ent et spci!ique$ent. En

consquence+ on doit disposer dune $thode de dosaespci!ique

.

aux en,y$es % dosae spectrophoto$trique+!luoro$trique ou radiochi$ique

b. -n peut dtecter des protines autres que desen,y$es en tirant parti de leur proprit de se lier des $olcules spci!iques /liands0 par exe$ple desrcepteurs


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c. *es techniques i$$unochi$iques sont tr1s sensible et

spci!iques. Ces $thodes utilisent des anticorpsproduites par le syst1$e i$$unitaire dun ani$al enrponse lin2ection dune protine tran1re /anticorps

pol#clonau$0

-n peut ale$ent obtenir des anticorps monoclonau$

cellule dun cancer du syst1$e i$$unitaire appelm#lome

-n dtecte la protine directe$ent en la !aisantprcipiter a)ec ces anticorps ou indirecte$ent pardosage immunoen%#mati&ue appel E'IS! /en%#me(lin)ed immunoabsorbent assa#0


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Substrate

Anticorpssecondaire

Produitcolor

*est immunoen%#mati&ue +E'IS!,

Anticorpsprimaire

Echantillon contenant diffrents antigens


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*eurs di!!rentes proprits physicochi$iques et biochi$iquessont $ises pro!it

Charactristiques Techniques

Solubilit 4. Solubilisation5 rci itation saline

-. Stratgie gnrale de puriication

des protines

Chare ionique 4. Chro$atoraphie par chane dions6. Electrophor1se3. 'ocalisation isolectrique

Caract1re polaire 4. Chro$atoraphiedadsorption

6. Chro$atoraphie en phase in)erse3. Chro$atoraphie par interactions

hydrophobes


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*eurs di!!rentes proprits physicochi$iques et biochi$iquessont $ises pro!it

Charactristiques Techniques

-. Stratgie gnrale de puriicationdes protines

Taille $olculaire 4. Dialyse et ultra!iltration6. Electrophor1se en el3. Chro$atoraphie par !iltration surel

Spci!icit de liaison 4. Chro$atoraphie da!!init


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2 S'U-I'I*E "ES /0*EIES

!. Inluence de la concentration en sels

*a solubilit dune protine !aible !orce ioniqueau$ente nrale$ent a)ec la concentration en sel+

appel 7salting in /solubilisation saline0 Pour des !orcesioniques le)es+ la solubilit des protines di$inue+appel 7salting out /prcipitation saline0


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-. Inluence du p2

*a solubilit dune

protine est au$ini$u$ quandp# 8 p". Cette

propr e or nedune $thode depuri!ication des

protines appelprcipitationisolectri&ue


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3 SE/!0!*I /!0 C0!*0!/IE*a solution de protines dissout dans la phase mobile est!iltre tra)ers dune colonne constitue dun supportsolide poreux9 la phase stationnaire

*es interactions des di!!rentes protines a)ec la phase

stationnaire ralentissent plus ou $oins leur $iration tra)ers le support

Si la !orce de rtention est de nature ionique+ latechnique de sparation est appele chromatographiepar change dions


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!. Chromatographie par change d5ions

Dans le processus dchane dions+ les ions lislectrostatique$ent un support insoluble etchi$ique$ent inerte sont re$placs de $ani1re

r)ersible par des ions en solution9

:sine;A% ; Protine% :sine;Protine% ; A%


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Chromatographie sur changeurs danions

Principe 9une protine a % une chare positi)e aux p# < p"

% une chare nati)e aux p# = p"

Elle peut donc >tre retenue sur un chaneur de cations ouun chaneur danions+ sui)ant le cas

Elle peut alors >tre lue par passae dun ta$poncontenant du sel en quantits croissantes

Echaneur danions 8 el porteur de chares !ixespositi)esEchaneur de cations 8 el porteur de chares !ixesnati)es


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Chromatographie dchanges dions a6ec lution par paliers


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"ispositi pour crer un gradient de concentration linaire


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-. Chromatographie par iltration sur gel

Dans la chromatographie par iltration sur gel+appele ale$ent chromatographie par e$clusionou par tamisage molculaire+ les protines sontspares selon leur taille et leur !or$e

a. 'a plupart des gels sont constitus de de$tran+Sephade$,7 dagarose ou de pol#acr#lamide

*a !iltration sur el est sou)ent utilise pour7dessaler une solution protique. Ainsi+ on peutli$iner le sul!ate da$$oniu$ dune protine qui a t

prcipite par ce sel


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Chromatographie par iltration sur gel


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b. 'a chromatographie par iltration sur gel peutser6ir 8 estimer les masses molculaires


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c. 'a dial#se est une orme de iltration molculaire

*a dialyse per$et de sparer les $olcules selon leurtaille+ en utilisant des $e$branes se$iper$ables dontles pores ont une taille in!rieure aux $acro$olcules


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C. Chromatographie d5ainit

Dans la chromatographie dainit7 un ligand qui se liespci!ique$ent la protine est !ix par co)alence une $atrice inerte et poreuse

uand une solution roti ue tra)erse ce atriel la

protine dintr>t se lie au liand i$$obilis+ tandisque les autres sortent de la colonne. -n peutrcuprer la protine dsire sous !or$e trs pure

en $odi!iant les conditions d

lution de sorte que laprotine se dtache de la $atricechro$atoraphique


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Chro$atoraphie da!!init

Principe 9:epose sur la relati)e spci!icit dinteraction dune protinepour certains liands

Exe$ple 9 a!!init de lhexo@inase pour lATP

*a protine sadsorbe sur un el sur lequel le liand est !ix de

Elle est ensuite lue en la)ant a)ec un $ilieu contenant du liand non!ix /ou en au$entant la concentration en sels+ ou en chaneantle p#0


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*iand !ix la $atrice

Protine ayantde la!!init pour

.

e an

Autresprotines


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4 E'EC*0/0ESESparation de soluts chars par $iration dans un cha$p lectrique

% la $iration dpend9de la chare de la protinede sa tailledu support /el plus ou $oins rticul+ papier0

%dans la !ocalisation isolectrique /lectrophor1se dans radient de p#0$iration dpend unique$ent du p"

%dans llectrophor1se SDS%PA&E+ la )itesse de $iration dpend% de la taille de sous%unit /protine dnature0

% du der de rticulation du el

Sodiu$ dodecyl sul!ate polyacryla$ide el electrophoresis


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!. S"S(/!E

*e SDS se lie tr1s !orte$entaux protines en leur con!rantune !or$e de btonnet. *esprotines lient en)iron une

$olcule de SDS pour deuxrsidus dacides a$ins

*a !orte chare nati)eappor e par e $asque achare intrins1que de laprotine. Par consquent+llectrophor1se de protines enel de polyacryla$ide contenant

du SDS /S"S(/!E ,les spareen !onction de leur $asse$olculaire et leur taille.


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S"S(/!E


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0elation logarithmi&ue entre la masse molculaire duneprotine et sa mobilit lectrophorti&ue relati6e en

S"S(/!E


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9:estern blot; < 9immunoempreinte;

:)lation dune protine laide dun anticorps spci!ique


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-. =ocalisation isolectri&ue

Si un $lane de protines est sou$is une lectrophor1se dansune $atrice ayant un radient de p# et dont le p# au$entelente$ent de lanode )ers la cathode+ chaque protine )a $irer

2usqu lendroit oF le p# est al son point isolectrique9


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Electrophorse sur gel en deu$ dimensions +lectrophorse 2",


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5 U'*0!CE*0I=U!*I

Lultracentrifugeuse, mis au point par The Svedberg en

1923, peut atteindre des vitesses de rotation de 80000 rpm( au-del de 120 000 g) et permet la sdimentation de

macromolcules. La masse dune particule peut tre

ca cu e part r e son coe c ent e s mentat on,

analogue la mobilit lectrophortique vue dans le

paragraphe prcdent mais en units Svedberg (S)

! Ul i i i


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!. Ultracentriugation prparati6e

Dans lGultracentriugation %onale+ une suspension protique estsoineuse$ent dpose au%dessus dGun gradient de densit desaccharose ou du chlorure de csiu$ . Au cours de lacentri!uation+ chaque particule tra)erse le radient en !onction de

son coe!!icient de sdi$entation9

(ltracentri!uation ,onale %utilis pour des co$plexes$acro$olculaires+ desparticules et des !ractions

$e$branaires

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