CÈL·LULES MARE PLURIPOTENTS I MEDICINA REGENERATIVA Begoña Aran Banc de Línies Cel·lulars Centre de Medicina Regenerativa de Barcelona
CÈL·LULES MARE PLURIPOTENTS I MEDICINA
REGENERATIVA
Begoña Aran
Banc de Línies Cel·lulars
Centre de Medicina Regenerativa de Barcelona
CÉLULAS MADRE
Se trata de células indiferenciadas que se han localizado en la masa celular interna del blastocisto, en algunos tejidos fetales, en el cordón umbilical y la placenta y en varios tejidos adultos.Son células pluripotentes (o en algunos casos totipotentes) que dan lugar a células y tejidos especializados.Su utilidad estriba en la utilización para tratamientos de patologías con pérdida de función celular
Células madre embrionarias: autorenovación y pluripotencialidad
Autorenovación DiferenciaciónDivisionasimétrica
CELULAS PLURIPOTENTES
• Células madre • CM embrionarias• CM fetales• CM adultas
• Células pluripotencia inducida (iPS)
Pluripotency
células madre adultas
• son células indiferenciadas que se hallan en tejidos adultos diferenciados y que son capaces de renovarse a sí mismas y diferenciarse en todos los tipos celulares diferenciarse en todos los tipos celulares del tejido del que provienen.
• algunas pueden ser pluripotentes.• se encuentran en hígado, médula osea,
pancreas, piel, cerebro, sangre…
células madre adultas
su frecuencia es baja, son difíciles deidentificar y purificar, su proliferación eslimitada y son difíciles de mantener en un estado indiferenciado.
células madre fetales
• se trata de tipos celulares primitivos que se hallan en el feto y que pueden desarrollarse en células madre neuronales, células madre hematopoyéticas (cordón umbilical y placenta), progenitoresplacenta), progenitoresde islotes pancreáticos.
células madre embrionariasson las que derivan de la masa celular interna(MCI) de un blastocisto (día +5/6 de desarrollo, ± 150 células). Las ± 150 células). Las células de la MCI dan lugar a las 3 líneas del embrión: ectodermo, mesodermo y endodermo.
MCI
In vivo
In vitro
Modelo de enfermedadesy desarrollo de fármacos
Estudio del desarrollo y organogénesis
Terapia celular
ENFERMEDADES CON PÉRDIDA DE FUNCIÓN CELULAR POTENCIALMENTE TRATABLES MEDIANTE TERAPIA BASADA EN CM
� Alteraciones neurodegenerativas� Accidentes vasculares� Lesiones medulares� Fallo cardíaco� Diabetes mellitus
Derivación células madre embrionarias
• Descongelación de los embriones (centros RA)• Cultivo embrionario*
los embriones en distinto estadío embrionario deben cultivarse hasta blastocisto
* Deben seguirse los protocolos utilizados en el laboratorio de FIV.
Eliminación de la zona pellucida
Eliminación del trofectodermo
Descongelación embriones
Cultivo hasta blastocisto
D+5/6
Derivación células madre embrionarias
zona pellucida
- 5mg/ml pronasa- Ac. Tyrode’s
Eliminación del trofectodermo
Monocapa de fibroblastos humanos (HFF-1) irradiados (CCD1112SkATCC), en placas cubiertas de gelatina (0.1%)Feeders cells
Siembra y cultivo del blastocisto o MCI sobre monocapa de fibroblastos humanos (HFF-1) irradiados, en placas cubiertas de gelatina (0.1%)
Derivación células madre embrionarias
CULTIVO
KO-DME Medium supplementado con:2 mmol/l Glutamax 0,05 mmol/l 2-mercaptoethanol 8 ng/ml basic fibroblast growth factor (FGF)1% non-essential amino acids20% KO-Serum Replacement 0,5% penicillin-streptomycin
Derivación ES[2]
p0 d4 (10x) p0 d7 (20x) p0 d9 (20x)p0 d4 (10x) p0 d7 (20x) p0 d9 (20x)
p1 d2 (4x) p1 d6 (4x )p0 d12 (10x)
Células somáticas de pluripotencia inducida (IPS)
• Paciente-compatible• No problemas éticos• Disponible en humanos• Pluripotentes
Fibroblastos
• Pluripotentes • Integración medianter vector
(virus)• Segura? Activación oncogenes,
transmisión línea germinal?CélulasES-like
Takahashi et al., 2007Nakagawa et al., 2007Park et al., 2007
Integración genes (virus)
Método reprogramación
Lentivirus/retrovirus mediated reprogramming methods are stillmajor approaches for generation of iPS
Modeling human disease with iPS cells
Modeling human disease with iPS cells
Modeling human disease with iPS cells
Modeling human disease with iPS cells
Modeling human disease with iPS cells
Fosfatasa alcalina
Actividad Telomerasa
Immunocitoquimica para marcadores de
Caracterización
Inmunocitoquimica para marcadores de pluripotencialidad
cariotipo
Microsatélites & HLA
para marcadores de diferenciación In vitro
Formación de cuerpos embrioideos
Inmunohistoquímica para marcadores de diferenciación In vivo(formación teratomas)
pluripotencialidad
DIFERENCIACIÓN
Proceso mediante el cual una célula madre indiferenciada se indiferenciada se transforma en células especializadas (diferenciadas) de un determinado tipo celular.
DIFERENCIACIÓN• Cambios en la expresión de genes mediante mecanismos epigenéticos
• Cambios fisiología: tamaño, forma, polaridad, actividad metabólica…metabólica…
• capacidad proliferativa diferenciación
c.madre c precursora c. diferenciada
CARACTERIZACIÓN: Diferenciación in vitro3 líneas germinales:
- Ectodermo: neuronas
- Mesodermo: cardiomiocitos
- Endodermo: tejido glandular
Embryoid bodies
Ectodermo Endodermo Mesodermo
DMEM/F 12
Neural basal medium
N2
B27
KO DMEM
FBS
Glutamax
Amino acidos no-esenciales
KO DMEM
FBS
Glutamax
Amino acidos no-esenciales
3 days in suspension in differentiation media
Glutamax
P/S
P/S
β-mercaptoetanol
P/S
β-mercaptoetanol
Ac. Ascórbico 0,5 mM
PA6 Gelatine
14-16 days 15-20 days
Diferenciación in vitro
Ectodermo: beta-tubulina
Diferenciación in vitro
Mesodermo: alfa-actinina y GATA4
Diferenciación in vitro
Endodermo: Alfa-feto proteina y FOXA2
CARACTERIZACIÓN: Diferenciación in vivo
Teratomas Ratones SCID de 8 semanas
1millón células
• intramuscular • intramuscular
• subcutáneo
• en algunos órganos
2 meses
CARACTERIZACIÓN: Diferenciación in vivo
Mesodermo (Cartilago) Endodermo (epitelio respiratorio)
Endodermo (epitelio respiratorio)
Mesodermo (Cartilago)
CARACTERIZACIÓN: Diferenciación in vivo
Diferenciación in vitro
Ectodermo: beta-tubulina
Diferenciación in vitro
Mesodermo: alfa-actinina y GATA4
Diferenciación in vitro
Endodermo: Alfa-feto proteina y FOXA2
Diferenciación de las CME
• ADIPOCITOS• ASTROCITOS• CARDIOMIOCITOS• CONDROCITOS
• PRECURSORES LINFOCITOS• MASTOCITOS• NEURONAS• OLIGODENDROCITOS
• CÉL. HEMATOPOYÉTICAS• CÉL. DENDRÍTICAS• CÉL. ENDOTELIALES• KERATINOCITOS• HEPATOCITOS
• OLIGODENDROCITOS• OSTEOBLASTOS• ISLOTES PANCREÁTICOS• MÚSCULO LISO• MÚSCULO ESTRIADO• TROFECTODERMO• GAMETOS
• Banqueo
• Registro en el Banco Nacional de Líneas Celulares
Criterios mínimos• Consentimiento informado• Trazabilidad• Aprobación Comité Ética
• Datos derivación (origen, métodos, etc)• Disponibilidad• Cariotipo• Modificación genética• Marcadores celulares de pluripotencia • Diferenciación a las 3 líneas germinales (in vitro y/o in vivo)
Terapia celular en medicina regenerativa
Trasplante de células diferenciadas , obtenidas a partir de CM, destinado a reparar tejidos en los que se ha perdido la funcionalidad.
Terapia celular con CMPhacia la aplicación clínica:
PROBLEMAS TÉCNICOS
• Rechazo inmunológico• Formación de tumores • Optimización de protocolos de diferenciación y
purificación• Funcionalidad y viabilidad post-transplante• Aspectos metodológicos
PROBLEMAS TÉCNICOS
• Rechazo inmunológico• Formación de tumores • Optimización de protocolos de diferenciación y
purificaciónpurificación• Funcionalidad y viabilidad post-transplante• Aspectos metodológicos
TERAPIA CON CME Y RECHAZO INMUNOLÓGICO
Como evitarlo?• iPS• Uso de fármacos inmunosupresores• Uso de células HLA compatibles: bancos de CM• Inducción de inmunotolerancia: administración
previa de material embrionario o hematológico del donante
• CM procedentes de embriones clonados mediante transferencia nuclear
TERAPIA CON CME Y RECHAZO INMUNOLÓGICO
Como evitarlo?• iPS• Uso de fármacos inmunosupresores• Uso de células HLA compatibles: bancos de CM• Inducción de inmunotolerancia: administración
previa de material embrionario o hematológico del donante
• CM procedentes de embriones clonados mediante transferencia nuclear
Stojkovic et al, 2005
PROBLEMAS TÉCNICOS
• Rechazo inmunológico• Formación de tumores • Optimización de protocolos de diferenciación y
purificaciónpurificación• Funcionalidad y viabilidad post-trasplante• Aspectos metodológicos
PROBLEMAS TÉCNICOS
• Rechazo inmunológico• Formación de tumores • Optimización de protocolos de diferenciación y
purificaciónpurificación• Funcionalidad y viabilidad post-transplante• Aspectos metodológicos
PROBLEMAS TÉCNICOS
• Rechazo inmunológico• Formación de tumores • Optimización de protocolos de diferenciación y
purificaciónpurificación• Funcionalidad y viabilidad post-transplante• Aspectos metodológicos
Funcionalidad y viabilidad post-trasplante
• Es necesaria la integración y realización de conexiones necesarias para restablecer la funcionalidad del órgano.
• Estudio mecanismos control del crecimiento, migración, destino y diferenciación celular
• Estudios de restauración de la funcionalidad en modelos animales
• Órgano: varios tipos celulares
Estudios funcionalidad• Páncreas endocrino, ratones diabéticos. Soria, 2000;
Kroon, 2008.• Neuronas, enfermedad de Parkinson. Sonntag, 2007; Cho,
2008.• Precursores neuroectodérmicos, lesiones medulares.
Cummings, 2005; Keirstead, 2005; Nakamura, 2005; Cummings, 2005; Keirstead, 2005; Nakamura, 2005; Kumagai, 2009.
• Precursores miocárdicos, accidentes vasculares. Kehat, 2004; Menard, 2005; Laflamme, 2007; van Laake, 2009.
• Epitelio pigmentado de retina. Retinitis pigmentosa. Idelson, 2009.
• Neuronas estriadas. Enfermedad de Huntington. Aubry, 2008.
PROBLEMAS TÉCNICOS
• Rechazo inmunológico• Formación de tumores • Optimización de protocolos de diferenciación y
purificaciónpurificación• Funcionalidad y viabilidad post-transplante• Aspectos metodológicos
Aspectos metodológicos
• Estandarización protocolos: procedencia material, métodos de cultivo, preparación, almacenaje, banqueo, transporte.
• Eliminación xenobióticos• Condiciones GMP• Control de calidad• Control de calidad• Supervisión por comités externos de protocolos y
ensayos clínicos. Valoración riesgos.• Consentimiento informado
ISSCR: guidelines for clinical translation of stem cells.http://www.isscr.org/clinical_trans/pdfs/ISSCRGLClinicalTrans. pdf
Primeros ensayos clínicos
• Geron corp.: Oligodendrocitos derivados de CME, lesionados medularesmedulares
• Advanced Cell Technologies: Epitelio pigmentado de retina derivado de CME, distrofia macular de Stangerdt’s.
Moltes gràcies per la vostra atenció